The authors acknowledge the Microscopy core facility at the Faculty of Health Sciences, Link&#246;ping University for providing access to advanced imaging systems; Karl-Eric Magnusson (Emeritus Scientist) at the Dept. of Clinical and Experimental Medicine, Link&#246;ping University for providing access to Imaris 3D/4D image processing software (Bitplane, Switzerland); and S. Braian for his help with the lung model cartoon. This work was supported by funds from the Swedish Research Council (Alternatives to animal research, 2012-1951) and Swedish Research Council (2012-3349) to M.L. and Swedish Foundation for Strategic Research to S.B. S.B. receive grants from the Karolinska Institutet, Swedish Research Council, the Swedish International Development Cooperation Agency (Sida) and the Swedish Civil Contingencies Agency (MSB), and the Swedish Heart and Lung Foundation (HLF). M.S. received grants from the Karolinska Institutet and Stockholm County Council.

Nota: sangue periferico umano da donatori anonimi sani acquistati presso la banca del sangue di Linköping University Hospital, in Svezia è stato utilizzato come fonte di cellule immunitarie per questo studio. Questo protocollo è stato progettato per gli inserti mm 6 pozzetti 24. Adattamento diretto in altri formati e non è raccomandato in quanto i contratti tipo di tessuto sia verticalmente che orizzontalmente durante lo sviluppo. 1. Preparazione dei Materiali, Media e Cultura di batteri / linee cellulari <ol><li> Cultura di batteri: <ol><li> Far crescere la tensione micobatteri M. tuberculosis H37Rv portando il plasmide pFPV2 esprimere costitutivamente la proteina fluorescente verde (GFP), in Middlebrook 7H9 mezzo contenente 0,05% Tween-80, 0,5% glicerolo, kanamicina (20 mcg / ml), e completato con Middlebrook albumina, destrosio e catalasi arricchimento ( Middlebrook ADC arricchimento), a 37 ° C con 5% di CO 2 per 7-10 giorni. Nota: Tutti passo sperimentales coinvolgendo vivo virulenta M. ceppi di tubercolosi devono essere eseguite in una struttura BSL-3. </li></ol></li><li> Preparare Modified Eagle Medium (DMEM) terreno completo di 1x Dulbecco (supplementato con piruvato 1 mM di sodio, 2 mM L-glutammina, 100 U / ml di penicillina, 100 pg / ml streptomicina, HEPES 10 mM, 0,1 mM aminoacidi non essenziali e 10 % di calore-inattivato siero fetale bovino (FBS)). Preparare anche antibiotici gratis terreno completo DMEM. </li><li> Preparare 1x Essential Medium (MEM) terreno minimo completa (1 mM sodio piruvato, 2 mM L-glutammina, 100 U / ml di penicillina, 100 mg / ml di streptomicina, 10 mM HEPES, 0,1 mM aminoacidi non essenziali e 10% calore inattivato siero fetale bovino (FBS)). </li><li> Preparazione di fibronectina / boccette collagene rivestite (totale 10 ml): <ol><li> Pipetta fosfato 1x 8,8 ml di soluzione fisiologica sterile (PBS) in una provetta pulita. Aggiungere 1 ml di siero albumina bovina (1 mg / ml), 100 microlitri di tipo I collagene bovino (3 mg / ml) e 100 microlitri ricombinante human fibronectina (1 mg / ml). </li><li> Miscelare la soluzione ruotando il tubo capovolto 5 volte. Boccette sono rivestiti con una soluzione di fibronectina / collagene (1 ml di T-25 e 2 ml di un pallone T-75). Lasciare O / N a 37 ° C. Dopo l&#39;incubazione, rimuovere la soluzione e memorizzare le fiasche rivestite a RT. Nota: La soluzione raccolta può essere conservato a 4 ° C e riutilizzato per tre volte. Bagagli per più di 2 settimane può causare il liquido a diventare marrone (formazione di cristalli), dove al momento deve essere scartata. </li></ol></li><li> Cultura dei fibroblasti: <ol><li> Crescere e mantenere MRC-5, (una linea cellulare di fibroblasti polmonari umane derivate da tessuto polmonare normale di 14 settimane feto di sesso maschile), in DMEM completo in 5% CO 2 a 37 ° C. Utilizzare i fibroblasti a passaggi 24-26 e crescere fino a 70-80% confluenti. Nota: MRC-5 linea cellulare al passaggio&gt; 30 tendono a perdere la morfologia e non è raccomandato nel modello del tessuto. </li></ol></li><li> Cultura di cellule epiteliali:<ol><li> Ottenere 16HBE14o- (16HBE), una linea di cellule epiteliali bronchiali umane immortalato che conserva la morfologia differenziata e la funzione di normale epiteli delle vie aeree umane, (questo è stato un regalo da Dr. Dieter Gruenert, Mt. Zion Cancer Center, University of California, San Francisco , USA. 10). Cellule Cultura 16HBE in fibronectina / flaconi collagene rivestite e mantenere le cellule in completa MEM nel 5% di CO 2 a 37 ° C. </li></ol></li><li> Preparazione di 5x DMEM <ol><li> Preparare 5x DMEM sciogliendo 13,4 g di polvere DMEM e 3,7 g di bicarbonato di sodio in 150 ml di acqua distillata sterile. Regolare il pH del terreno a 7,3, portare al volume di 200 ml e filtrare utilizzando 0,22 micron filtro a membrana. Raccogliere il mezzo filtrato in un contenitore sterile e conservato fino al momento dell&#39;uso a RT. </li></ol></li></ol> 2. Preparazione di fibroblasti Collagene-integrati <ol><li> Scongelare aliquote congelate di FBS e L-glutammina in un bagno di 37 ° C Acque.Dopo lo scongelamento conservare i campioni in ghiaccio. Posizionare sodio bicarbonato (71,2 mg / ml) e gentamicina (50 mg / ml) a 4 ° C. Pre-cool 50 ml provette e pipette sterili 10 ml a 4 ° C. Nota: Tutti i materiali utilizzati (eccetto il 5x DMEM) sono raffreddati in ghiaccio prima dell&#39;uso e tutte le fasi vengono eseguite su ghiaccio. Collagene di tipo I bovini (1,1 mg / ml) deve essere mantenuto freddo, come questo impedisce solidificazione del collagene. </li><li> Preparare i fibroblasti: <ol><li> Warm tripsina in un bagno d&#39;acqua ° C 37 e incubare quantità sufficiente con fibroblasti polmonari (MRC-5), le cellule per 10 min a 5% di CO 2 a 37 ° C. Neutralizzare la tripsina aggiungendo 1x DMEM completo. Aspirare la sospensione cellulare e centrifugare a 300 xg per 5 min. Aspirare il surnatante e risospendere le cellule in 2,3 x 10 5 cellule / ml in DMEM completo. Collocare le cellule in ghiaccio fino al momento dell&#39;uso. </li></ol></li><li> Preparare la pre-mix: <ol><li> Aggiungere il seguente in una provetta con l&#39;etichetta &quot;pre-mix&quot;; 395ml di 5x DMEM, 40 microlitri L-glutammina, 120 microlitri NaHCO3 (71,2 mg / ml), 440 microlitri FBS, 5 ml Gentamicina (50 mg / ml), Volume totale 1.000 ml, quindi agitare la pre-mescolare bene e mettere su ghiaccio. Nota: I volumi indicati sono per un 24 millimetri 6-bene inserto cultura. Calcolare gli importi specifici richiesti per il numero totale di inserti, ma aggiungere un extra per essere sicuri, basta pre-mix è preparato. </li></ol></li><li> Preparare la miscela di collagene acellulare: <ol><li> Per ogni cultura aggiungere 1 ml di miscela di collagene acellulare. Aggiungere il seguente ad un tubo conico da 50 ml su ghiaccio nell&#39;ordine dato; 686 ml di 1,1 mg / ml di collagene, 250 microlitri premiscelazione e 64 microlitri 1x DMEM completo per un volume totale di 1000 ml. Mescolare bene la soluzione garantendo bolle d&#39;aria. Lavorare velocemente e aggiungere il collagene sulla parete del tubo per evitare bolle d&#39;aria. </li><li> Aggiungere 1 ml della miscela strato acellulare all&#39;inserto collocato nella piastra 6 bene. Non aggiungere qualsiasi supporto al pozzo esterno dell&#39;inserto. Incubate per 30 minuti in un incubatore a 37 °. Assicurarsi che la miscela acellulare copre l&#39;intero inserto senza bolle d&#39;aria. </li></ol></li><li> Preparare la miscela di collagene cellulare: <ol><li> Miscelare componenti dello strato cellulare in una provetta conica da 50 ml tenuti in ghiaccio nel seguente ordine; 2 ml di collagene, 615 ml di pre-mix, 58 ml di 1x DMEM completo e 327 ml di sospensione cellulare fibroblasti polmonari (MRC-5) per compensare il volume totale a 3.000 ml. Ogni cultura richiede 3 ml di miscela di collagene cellulare. PUNTO CRITICO: Assicurarsi di mescolare il collagene e premiscelato attentamente prima aggiunta della sospensione cellulare. Ciò neutralizzare il pH del collagene per evitare effetti tossici sui fibroblasti. </li><li> Aggiungere lo strato cellulare (3 ml) al di sopra dello strato di collagene acellulare e incubare per 2 ore in un incubatore a 37 °. Lavorare velocemente e aggiungere il collagene sulla parete del tubo per evitare bolle d&#39;aria. </li><li> A seguito di polimerizzazione, aggiungere 2 ml di DMEM completo a tegli inferiore della piastra 6 e (sotto l&#39;inserto) e incubare per 24 ore. NOTA: Se la polimerizzazione non si è verificato, eliminare gli inserti piatto contenente la matrice di collagene e fibroblasti-start-daccapo. La causa più probabile è un errore in aggiunta o il volume non corretta di uno dei reagenti sopra elencati. </li></ol></li></ol> 3. Cultura continuo della Matrix Fibroblast collagene <ol><li> Sollevare delicatamente l&#39;inserto utilizzando una pinza pulita e aspirare il mezzo di coltura dal fondo del pozzo. Aggiungere 2 ml DMEM completo al fondo del pozzo seguito da 2 ml DMEM completo all&#39;interno dell&#39;inserto. Evitare l&#39;introduzione di bolle d&#39;aria sotto l&#39;inserto, in modo da evitare la diffusione di nutrienti tra le camere esterne ed interne. Rimuovere le bolle d&#39;aria con una punta micropipetta. </li><li> Modificare il terreno di coltura (dentro e sotto l&#39;inserto) ogni due giorni e la cultura per circa 5-7 giorni. Fare attenzione nel rimuovere il supporto dal inserto. Per evitare contact con la matrice fibroblasti-collagene, inclinare leggermente l&#39;inserto utilizzando una pinza pulita e aspirare i media dalle pareti dell&#39;inserto. PUNTO CRITICO: I fibroblasti della matrice di collagene dovrebbe ottenere un fenotipo allungata, e rimodellare il collagene, che poi i contratti. In circa 5-7 giorni, la matrice ha contratto per formare una piattaforma (10-14 mm di diametro) al centro dell&#39;inserto. La matrice contratta è pronto per l&#39;uso nella fase successiva. Per ottenere una contrazione uniforme della matrice è fondamentale che i fibroblasti sono ben miscelati con il collagene prima semina (Fase 2.6.1). </li></ol> 4. Semina delle cellule immunitarie (Infected / non infetti Monocita-macrofagi Miscela) Nota: Le seguenti operazioni sperimentali implicano micobatteri virulenti e, pertanto, devono essere eseguite in una struttura BSL-3. <ol><li> Preparazione dei monociti e macrofagi primari: <ol><li> Isolare monociti del sangue periferico da donatore di sangue utilizzando un isticapannone protocollo. Isolare monociti nello stesso giorno come la creazione di modello e la cultura dei tessuti e li differenziarsi in macrofagi per circa 7 giorni prima infezione da M. la tubercolosi. NOTA: Questo garantirà sia i macrofagi e la matrice di collagene dei fibroblasti-contratto sono disponibili dopo 7 giorni. Isolare anche monociti freschi che verranno aggiunti insieme con i macrofagi infetti. </li></ol></li><li> Preparazione di M. tubercolosi -infected macrofagi <ol><li> Raccogliere i batteri in coltura, lavare con PBS 1x contenente lo 0,05% di Tween-80, risospendere in-antibiotico libera DMEM completo, passano attraverso un tronco di sterili 27 ago G per disperdere grumi batteriche e misurare la densità ottica. Nota: pre-determinare la M. tuberculosis formanti colonia equivalenti unità di densità ottica in laboratorio. Questo darà una stima del numero di batteri da utilizzare per l&#39;infezione. </li><li> Incubare le macrofagi per 4 ore con &lt;em&gt; M. tubercolosi molteplicità di infezione (MOI) 10). Dopo l&#39;infezione, lavare 3x con PBS 1x per rimuovere i batteri extracellulari. Utilizzare macrofagi infettati coltivate nello stesso modo ma senza M. tuberculosis, come controlli. </li><li> Staccare i macrofagi dalla piastra di coltura mediante trattamento con EDTA 2 mM per 10 min a 37 ° C e risospese le cellule in DMEM privo di antibiotico completo. </li></ol></li><li> Etichettatura dei monociti Nota: Isolamento e etichettatura dei monociti possono essere eseguite in panchina BSL-2 e poi prese in BSL-3 impianto per l&#39;ulteriore elaborazione. <ol><li> Stain monociti preparate (2 x 10 7 cellule) con una concentrazione finale di 2 mM PKH26 colorante rosso per 5 min, secondo le istruzioni del produttore. Lavare 3x e risospendere le cellule con DMEM senza antibiotico completo ad una densità di 1 x 10 7 cellule / ml. </li></ol></li><li> L&#39;aggiunta di cellule immunitarie di fibroblasti di collagene matrice <ol><li> Laopo 5-7 giorni di coltura della matrice fibroblasti-collagene, aspirare terreni di coltura dalle camere esterne ed interne e aggiungere 1,5 ml di DMEM fresco privo di antibiotici completo alla camera esterna. </li><li> Preparare una monociti-macrofagi etichettati (infetti infetti /) miscela con un rapporto di MO: MQ (5: 1) in 50 microlitri DMEM completo. Per 50.000 macrofagi, monociti prendere 250.000 etichettati. </li><li> Aggiungere 50 microlitri MO: miscela MQ alla matrice fibroblasti-collagene e incubare per 1 ora a 5% di CO 2 a 37 ° C. Dopo l&#39;incubazione, aggiungere delicatamente 2 ml di coltura nell&#39;inserto e incubare per altre 24 ore in 5% di CO 2 a 37 ° C. Nota: Poiché le cellule aggiunte sono vagamente collegati, aggiunta dei media dovrebbe essere lento aggiungendo delicatamente sulle pareti dell&#39;inserto. </li></ol></li></ol> 5. Semina delle cellule epiteliali del polmone (16HBE) Nota: Le seguenti operazioni devono essere eseguite in una struttura BSL-3. <ol><li> Seed polmone ecellule pithelial (16HBE) sulla parte superiore del MO: MQ-fibroblasti-collagene strato. Per eseguire questa, prima dissociarsi 16HBE cellule dal pallone trattando con tripsina (come al punto 2.2.1.) E risospendere a 4 x 10 6 cellule / ml in DMEM-antibiotico gratuito. </li><li> Aspirare il mezzo di coltura all&#39;interno e all&#39;esterno dell&#39;inserto. Poi aggiungere 1,5 ml DMEM senza antibiotico completo nel fondo del pozzo esterno dell&#39;inserto. </li><li> Aggiungere 50 ml di 16HBE sulla parte superiore della cella-fibroblasto immunitario matrice di collagene. Lasciare agire per 2 minuti nella cappa e incubare per 1 ora a 37 ° C incubatore con 5% di CO 2. Dopo l&#39;incubazione, aggiungere delicatamente 2 ml di DMEM senza antibiotico completo all&#39;interno dell&#39;inserto e coltura a 37 ° C per 3 giorni. Il passo coltura facilita la proliferazione delle cellule epiteliali del modello di tessuto. Nota: Come cellule aggiunte sono debolmente attaccati, aggiunta di media dovrebbe essere lento e delicato facendo scorrere attraverso le pareti dell&#39;inserto. </li></ol> 6. Aria esposizione del polmone 3DModello Nota: Dopo il giorno 5 dopo aggiunta di macrofagi infetti, i modelli di tessuto sono dotate di aria esposte e le seguenti operazioni devono essere eseguite in una struttura BSL-3. <ol><li> Aspirare il mezzo di coltura all&#39;interno e all&#39;esterno dell&#39;inserto. Nota: In questa fase surnatanti possono essere raccolti per la rilevazione dei fattori secreti. Centrifuga, sterile filtro e conservare supernatanti a -70 ° C. </li><li> Aggiungere 1,8 ml DMEM privo di antibiotici completi nella camera esterna e incubare in 5% CO 2 a 37 ° C incubatore per 2 giorni. Non aggiungere la cultura dei media all&#39;interno dell&#39;inserto. NOTA: Air-sollevamento del modello di tessuto facilita la formazione di epiteli stratificati e secrezione di muco, che fornisce la forza per il tessuto e somiglianza fisiologica al tessuto polmonare umano. </li></ol> 7. Raccolta e Montaggio del tessuto Modello 3D Polmone Nota: Le seguenti operazioni devono essere eseguite in una struttura BSL-3.<ol><li> Il giorno 7 dopo l&#39;impianto di macrofagi infetti, i modelli di tessuto sono pronte per la raccolta. Rimuovere i terreni di coltura interamente dal modello di tessuto. Fissare il modello di tessuto con 4% paraformaldeide per 30 minuti al buio a temperatura ambiente. Questo passaggio uccide i batteri e corregge la morfologia dei tessuti / delle cellule per ulteriori elaborazioni. </li><li> Usando un bisturi, separare la membrana dall&#39;inserto bene. Trasferire la membrana contenente il tessuto ad un pozzetto contenente PBS 1x. </li><li> Tagliare e rimuovere i lati del modello di tessuto con un bisturi pulito. Poi tagliare il modello di tessuto in 4 pezzi quadrati approssimativamente uguali. Trasferire un pezzo di tessuto su un vetrino SuperFrost. Conservare i pezzi di tessuto in 1x PBS a 4 ° C. </li><li> Asciugare il tessuto per 5 minuti e montare usando prolungare oro antifade con DAPI e vetrino. Lasciare le diapositive senza disturbare al buio a temperatura ambiente fino a secco. Nota: Lo spessore del tessuto può variare tra il centro e la periferia, che potrebbe causare lievi Tilting del vetrino. Per evitare questo, un distanziatore (per esempio parafilm) può essere posizionato in un angolo del vetrino. </li><li> Applicare lo smalto ai bordi del vetrino e lasciarlo asciugare. Immergere i vetrini in etanolo al 70% per renderli sicuri per portare fuori dalla struttura BSL-3. </li></ol> 8. Visualizzazione, acquisizione e analisi quantitativa 3D <ol><li> Visualizzare i vetrini di tessuto usando un microscopio confocale con sistema laser che emettono rispettivamente a 488 nm per l&#39;eccitazione di GFP (canale verde), 420 nm per DAPI (blu) e 555 nm per i monociti PKH26 marcati (rosso). </li><li> Acquisire immagini 3D ad una risoluzione di 512x512 con Z-stack copre almeno dello spessore di 20 micron e avente 1 - 1.5 micron separazione tra pile. Acquisire 5-10 diversi settori che coprono l&#39;intero pezzo di tessuto. Nota: Utilizzare la configurazione come Nyqvist per le impostazioni ottimali di risoluzione ottica (lunghezza d&#39;onda, laser di potenza / esposizione, dimensione dei pixel e zoom). Evitare under o sopra la saturazione dei pixel. </li><li> Analizzare le immagini confocale con il software di elaborazione delle immagini 3D. Per 3D quantificazione dei gruppi di cellule, i seguenti passaggi sono consigliati per l&#39;analisi ottimale. </li><li> Aprire il software di elaborazione delle immagini 3D e caricare l&#39;immagine. Misurare le dimensioni degli oggetti da analizzare nell&#39;immagine, per esempio, le dimensioni di un nucleo, monociti individuale e singoli batteri. Queste osservazioni sono utili per la definizione o il filtraggio degli oggetti. </li><li> Utilizzando uno strumento di regolazione del display, ottimizzare volume rendering regolando ciascun canale per contrasto, la luminosità e si fondono l&#39;opacità. Questo passaggio è quello di minimizzare l&#39;interferenza di rumore in volume rendering. Nota: correzione gamma può portare alla manipolazione delle immagini e, quindi, dovrebbe essere evitato. </li><li> Creare superfici scegliendo il canale rosso (monociti) e impostare la soglia (selezione automatica o manuale). Se necessario, utilizzare filtri per limitare la selezione dei monociti rosso o escludere la background. Analogamente, per creare superfici verde (M. tuberculosis) e blu (nuclei) canali come descritto sopra. </li><li> Esportare i dati in file Ms-Excel. È possibile esportare un particolare parametro o tutti i dati. I parametri che sono rilevanti per l&#39;analisi dei cluster cellulare sono di volume, intensità, numero di oggetti, numero di voxel e sfericità. </li><li> Salvare ed esportare le immagini in un formato immagine adatto preferibilmente TIFF. NOTA: Le animazioni può essere fatta anche utilizzando il menu di animazione e salvato come un file multimediale. </li><li> Salvare le impostazioni di analisi di ciascun canale utilizzando l&#39;opzione Add parametri e può essere recuperato in seguito usando la funzione Ricostruisci. Contemporaneamente analizzare più file utilizzando lo strumento di elaborazione in batch. Nota: Le immagini da confrontare devono essere acquisiti, elaborati e analizzati allo stesso modo. Per esempio un immagine a 8 bit (256 intero) non deve essere confrontata un&#39;immagine a 12 bit (4096 intero) con. </li></ol>

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L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+necrosis+factor+neutralization+results+in+disseminated+disease+in+acute+and+latent+Mycobacterium+tuberculosis+infection+with+normal+granuloma+structure+in+a+cynomolgus+macaque+model.">Tumor necrosis factor neutralization results in disseminated disease in acute and latent Mycobacterium tuberculosis infection with normal granuloma structure in a cynomolgus macaque model.</a> Arthritis Rheum. 62, 340-350 (2010).</li><li>Rahman, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compartmentalization+of+immune+responses+in+human+tuberculosis:+few+CD8++effector+T+cells+but+elevated+levels+of+FoxP3++regulatory+t+cells+in+the+granulomatous+lesions.">Compartmentalization of immune responses in human tuberculosis: few CD8+ effector T cells but elevated levels of FoxP3+ regulatory t cells in the granulomatous lesions.</a> Am J Pathol. 174, 2211-2224 (2009).</li></ol>

The authors declare no competing financial interests.

The ability to recruit and form organized cell clusters at the site of infection is the hallmark of human TB 11. These dynamic structures known as tubercle granulomas primarily consist of immune cells (macrophages, monocytes, T-cells and B-cells) and multi-nucleated giant cells surrounding M. tuberculosis. The role of the granuloma has long been considered to wall off the infection, preventing local spread of bacteria. However, more recent studies show that granuloma formation is critical for early bacterial survival, growth and dissemination 12. A strategy of new studies is to identify molecules or pathways that could efficiently be targeted to inhibit the cellular migration in granuloma formation and/or TB dissemination. 
A caveat for novel studies on TB is the lack of models that recapitulate human TB. The most widely used experimental animals do not form true granuloma upon M. tuberculosis infection, and are therefore not appropriate choices for studies of TB 13-16. Non-human primates have the closest resemblance to human TB 17, but are not the preferred choice owing to high operational costs and ethical issues. Human TB is a complex immunological process and is difficult to model in vitro. Cell cultures of monolayers or co-cultures lack the 3D environment and tissue responses. Therefore, we have developed an innovative lung tissue model based on human primary immune cells and human lung-specific cell lines 8,9. The model displays characteristic features of human lung tissue, including epithelia with evenly integrated macrophages, formation of extracellular matrix, stratified epithelia and mucus secretion 9. 
The 3D human lung tissue model has several benefits over the in vitro single or co-cultures seeded on tissue culture plates or transwell inserts. First, the human lung-specific cells (fibroblasts and epithelial cells) are not commonly included in the in vitro single or co-cultures. Second, the immune cells and lung-specific cells are embedded in a 3D physiological context (collagen rich extra-cellular matrix products). The response of cells to a stimulus/infection and the migratory behaviour of cells, for instance formation of a granuloma, differ significantly between a 2D and 3D environment. Furthermore, the described method enables the 3D visualization and robust 3D quantitative analysis that provides pivotal information on spatial distribution and intricate cellular interactions. 
Experimental infection in the model tissue with M. tuberculosis resulted in clustering of macrophages at the site of infection, reminiscent of early TB granuloma (Figure 2 and 3). We have recently demonstrated that mutant strains defective in the ability to secrete the virulence factor ESAT-6 or Mycobacterium bovis BCG that lacks ESAT-6 did not induce the clustering of monocytes (no early granuloma), in contrast to the virulent M. tuberculosis 9. These data are consistent with the observations made from Mycobacterium marinum-infected zebrafish embryos, whose transparency allows for elegant live imaging of granuloma formation 12. As there is no gold-standard model for TB, we took advantage of the surgically resected tissue biopsies from TB patients for validation of the method 9. Our in vitro tissue model shares several characteristics with the lung and lymph node biopsies from TB patients, including the aggregation of macrophages in granuloma, the presence of both intra- and extracellular bacteria 18 and induction of necrosis 11. 
Although the described model has physiological relevance to human TB and has several advantages over other in vitro models, it has some limitations. For instance, out of more than 20 collagen proteins identified in humans, only type I is included to the model to mimic the extra-cellular matrix. However, type I collagen is a complex mixture of extra-cellular matrix products and is the most abundant collagen in the human body. Further, we have demonstrated the presence of collagen IV and several extra-cellular matrix proteins such as tropoelastin, vimentin and laminin, which are produced by the epithelial cells and fibroblasts in the tissue model, indicating the synthesis of new collagen 8. Presently, the lung tissue model only has monocytes and macrophages, besides lung-specific cells. It lacks neutrophils and lymphocytes that are also known to be present in the granuloma. Remarkably the model is not limited to the introduction of additional immune cells and is of interest to explore how they contribute to the complex cellular interactions in human TB. Implantation of primary alveolar macrophages, skin-specific cells and lung carcinoma cells has already been tested in the model. Since our objective was to use a model that closely resembles human TB, introduction of mouse cells have not been attempted.
In summary, the lung tissue model has implications for both basic mechanistic and applied studies. Potential applications of the lung model include the study of innate immunity, investigating mechanistic aspects of host defences such as phagosomal maturation, autophagy, production of cytokines, chemokines and anti-microbial peptides, and functional characterization of individual cell types. Strikingly, the in vitro tissue model allows manipulation of one or more cells types and provides a relevant tissue micro-environment, not only for studies on TB, but for a variety of infectious and non-infectious diseases that affect the lungs.

Negli esseri umani, le risposte alle infezioni, infiammazioni dei tessuti, il reclutamento cellulare, rimodellamento del tessuto e la regolazione dell&#39;omeostasi tissutale sono eventi complessi che coinvolgono diversi tipi di cellule. Quindi, questi processi sono meglio studiati nell&#39;ambiente tessuto locale. In precedenza, questo è stato soprattutto possibile utilizzando modelli sperimentali animali. Tuttavia, gli animali da esperimento ampiamente utilizzati tengono molti limiti come spesso rispondono a patogeni in un modo diverso da esseri umani e mostrano anche un diverso corso della malattia 1. Un essere umano nel modello di tessuto polmonare in vitro contiene le possibilità di studiare risposte immunitarie specifiche del polmone umano. Tubercolosi infezione umana (TB) è principalmente una malattia che colpisce i polmoni. Mycobacterium tuberculosis (M. tuberculosis), l&#39;agente eziologico della tubercolosi, raggiunge il polmone attraverso le goccioline di aerosol che vengono trasportati allo spazio alveolari, dove i batteri sono inghiottiti da dendri polmonarecellule tic e macrofagi alveolari come parte della risposta immunitaria innata all&#39;infezione 2,3. Fagocitosi del patogeno porta alla compartimentazione del bug all&#39;interno di un fagosoma e idealmente provoca la neutralizzazione e l&#39;uccisione del patogeno da parte dei fagociti. Fino al 50% di individui esposti a M. la tubercolosi si ritiene di essere in grado di eliminare l&#39;infezione attraverso la risposta immunitaria innata 4. Altri risultati di infezione sono rinvio della sistema immunitario adattativo in una fase successiva, l&#39;infezione latente o nel peggiore dei casi la malattia cronica attiva 5. In precedenza ci sono stati modelli di tessuto in vitro per lo studio di tubercolosi umana. Singole culture cellulari di macrofagi umani o altre cellule del sangue periferico sono stati spesso usati 6,7. Lo svantaggio di questo approccio è che non possono riflettere le dinamiche di tipi cellulari diversi operano insieme in un tessuto polmonare esposto a M. tubercolosi </em&gt;. Quindi, vi è la necessità di un modello in vitro per poter eseguire studi funzionali e meccanicistici sulla tubercolosi. La cella a base di modello di tessuto polmonare umano in vitro qui descritta è stata istituita dal nostro gruppo per gli studi sulle funzioni delle cellule dendritiche 8. Abbiamo adattato questo metodo per lo studio di TB. Il modello di tessuto polmonare umano qui presentata è composta da cellule epiteliali e fibroblasti 8 tessuto-specifici. Queste cellule sono coltivate in una matrice di collagene sulla cima di una membrana porosa in un inserto transwell e formano strutture simili a normale tessuto polmonare umano (Figura 1). Se esposto all&#39;aria le cellule iniziano a secernere muco sul lato apicale 8. Mediante l&#39;impianto di macrofagi primari umani infettati con M. la tubercolosi al modello, abbiamo osservato come le cellule immunitarie migrano nel tessuto e formano prime fasi di granulomi TB 9. Questo è il primo modello di tessuto umano described per la tubercolosi e pone uno strumento promettente per studiare le risposte immunitarie innate di tubercolosi e altre malattie del polmone. Fino ad oggi, abbiamo usato solo monociti e macrofagi come cellule immunitarie del modello, ma il livello di complessità può essere aumentata con l&#39;inserimento di ulteriori tipi di cellule in questione. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/53084/53084fig1.jpg" /> Figura 1. schema Schema del modello di tessuto polmonare. (A) Il modello è composto da cellule epiteliali specifici polmonari umani, M. tubercolosi -infected macrofagi primari e colorante rosso monociti etichettati seminate su collagene incorporato fibroblasti preparati su un filtro transwell. L&#39;esposizione del modello di tessuto all&#39;aria avvia la produzione di proteine ​​della matrice extracellulare, secrezione di muco e stratificazione dall&#39;epitelio. Il modello di tessuto 3D così sviluppato è uno strumento utile per lo studio M. infezione tubercolare in un ambiente che cloassomiglia Sely un polmone umano. (B) immagini microscopiche rappresentativi dei diversi passaggi della preparazione del modello di tessuto. (C) Struttura completa della sezione di tessuto modello polmonare. Scala -. 100 micron <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53084/53084fig1large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a>

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Cell culture inserts</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>353092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well culture plates</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>353046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MRC-5 cells, lung fibroblasts</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>ATCC#CCL-171</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>16HBE cells, lung epithelial cells</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Gift from Dr. Dieter Gruenert, Mt. Zion Cancer Center, University of California, San Fransisco, USA&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 x Dulbecco&#8217;s modified Eagle&#8217;s medium (5 x DMEM)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12800-082</td>
			<td>Made from powder but add 5 times less water. Adjust pH to 7.3 and filter it using a 0.2 &#181;m filter.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s modified Eagle&#8217;s medium with glucose (DMEM) 1x</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>41965-039</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minimum Essential Medium (MEM) 1x with Earle&#8217;s salts</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M4655</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-Essential Amino Acids Solution, 100x</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11140-035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine 200 mM (100x)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25030-024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Pyruvate</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11360-039</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3 (71.2 mg/ml)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Prepared in house</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat inactivated Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10270-106</td>
			<td>Heat inactivated for 30 min, 56 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin (50 mg/ml)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15750-060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hepes buffer solution 1M</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15630-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin Streptomycin (Pen Strep)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lymphoprep</td>
			<td>Axis-Shield</td>
			<td>7801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrapure 0.5 M EDTA</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15575</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Collagen PA treated (500 ml)</td>
			<td>Organogenesis</td>
			<td>200-055</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pure col purified Bovine Collagen solution (100 ml)</td>
			<td>Advanced biomatrix</td>
			<td>5005-B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Extracellular matrix protein, Fibronectin (1 mg)</td>
			<td>BD</td>
			<td>354008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary human monocytes/macrophages</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Isolated from human whole blood or buffy coats.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PKH26 Red fluorescent cell linker</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>MINI26</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mycobacterium tuberculosis H37Rv expressing green fluorescent protein</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>M. tuberculosis H37Rv wild type was transformed with the pFPV2 plasmid constitutively expressing GFP.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Middlebrook 7H9 medium&#160;</td>
			<td>Difco</td>
			<td>271310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BBL Middlebrook ADC Enrichment</td>
			<td>BBL</td>
			<td>211887</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-80</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kanamycin B sulfate (20 &#181;g/ml)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B5264</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prolong Gold anti=-fade reagent with DAPI</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>P36935</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin -EDTA</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LSM700 Confocal microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iMaris Scientific 3D/4D image processing software, version 7.6.8</td>
			<td>Bitplane AG</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a 3d human lung tissue model for functional studies on mycobacterium tuberculosis infection

La tubercolosi (TB) detiene ancora una grave minaccia per la salute delle persone in tutto il mondo, e non vi è la necessità di modelli di costo-efficienti ma affidabili per aiutarci a capire i meccanismi della malattia e avanziamo le scoperte di nuove opzioni di trattamento. In vitro su colture cellulari di monostrati o co-colture hanno la (3D) ambiente tridimensionale e le risposte del tessuto. Qui, descriviamo un innovativo modello in vitro di un tessuto polmonare umano, che promette di essere uno strumento efficace per lo studio delle complesse vicende che si verificano durante l&#39;infezione da Mycobacterium tuberculosis (M. tuberculosis). Il modello di tessuto 3D consiste di cellule epiteliali e fibroblasti tessuto-specifici, che sono coltivate in una matrice di collagene sulla cima di una membrana porosa. Dopo esposizione all&#39;aria, le cellule epiteliali e secernere muco stratificano sul lato apicale. Con l&#39;introduzione di macrofagi primari umani infettati con M. tuberculosis alla modalità tessutil, abbiamo dimostrato che le cellule immunitarie migrano nel tessuto infetto e formano prime fasi di tubercolosi granuloma. Queste strutture ricapitolano la caratteristica distintiva di tubercolosi umana, il granuloma, che è fondamentalmente diverso o meno comunemente osservato in modelli sperimentali animali diffuse. Questo metodo di coltura organotipica consente la visualizzazione 3D e analisi quantitativa robusto che fornisce informazioni chiave sulle caratteristiche spaziali e temporali di interazioni delle cellule-patogeno ospite. Nel loro insieme, il modello di tessuto polmonare fornisce un tessuto micro-ambiente fisiologicamente rilevanti per gli studi sulla tubercolosi. Quindi, il modello tessuto polmonare ha potenziali implicazioni per entrambi gli studi meccanicistici e applicata di base. È importante sottolineare che il modello consente l&#39;aggiunta o la manipolazione di tipi di cellule individuali, che si allarga quindi il suo uso per la modellazione di una varietà di malattie infettive che colpiscono i polmoni.

Un modello di tessuto polmonare 3D per la tubercolosi umana può essere efficacemente utilizzato per studiare le interazioni ospite-patogeno a M. tubercolosi. Le operazioni di base di questo metodo, immagini rappresentative microscopiche di diversi passi e una struttura microscopica generale di una sezione di tessuto sono illustrate in Figura 1. Il modello ha diversi componenti del tessuto polmonare umano, compresi fibroblasti, cellule epiteliali bronchiali e monociti primari / macrofagi incorporato nell&#39;ambiente tessuti 3D. Oltre che incorporano componenti del tessuto polmonare umano, il modello assomiglia condizioni fisiologiche e cioè la stratificazione degli epiteli e secrezione di muco. Un esempio per l&#39;uso del modello tessuto polmonare nel monitoraggio un&#39;infezione TB è presentato in figura 2. Per visualizzare il M. tubercolosi migrazione cellulare -immune e interazione, abbiamo introdotto i macrofagi infettati con M. tubercolosi che esprimono GFP(verde), insieme con i monociti PKH26 marcati appena isolate (rosso) nel modello di tessuto (blu, DAPI macchiato per nuclei). Il giorno 7 dopo l&#39;aggiunta di M. tubercolosi cellule -infected al modello di tessuto, microscopia confocale rivela il clustering dei monociti rossi al sito di infezione (verde) (Figura 2), che imita le lesioni segno distintivo di tubercolosi umano 9. Una serie di immagini rappresentative per la visualizzazione 3D di M. tubercolosi -infected modello di tessuto e la quantificazione di gruppi di cellule è illustrato nella figura 3. La visualizzazione 3D offre la flessibilità all&#39;utente di interagire, di esaminare e quantificare diverse funzionalità in un&#39;immagine 3D. La disposizione spaziale dei batteri verde e cluster monociti rosso può essere visto dalla vista apicale, rotazione e laterale come illustrato in figura 3B, che rivela raggruppamento di monociti nel sito di M. tubercolosi. I cluster non erano observito in tessuti non infetti (Figura 3A). Abbiamo quantificato il formato e il numero di gruppi di cellule monociti e trovato che la dimensione (volume) di gruppi di cellule è aumentata (p &lt;0,001), mentre il numero di singoli monociti diminuita (p &lt;0.01) in M. tubercolosi tessuti infetti rispetto ai modelli di tessuto non infetti (Figura 3C e 3D). Questi dati conferma la nostra precedente scoperta della formazione di granulomi presto in M. infezione tubercolare osservato in modelli tessuto polmonare analizzati nelle sezioni di tessuto 2D 9. I nostri dati suggeriscono che il modello di tessuto fornisce un habitat naturale per indagare 3D all&#39;host complesso cellulo M. rete di comunicazione tubercolosi. Abbiamo anche trovato che la visualizzazione 3D e l&#39;analisi quantitativa sono strumenti migliori per studiare le caratteristiche del modello di tessuto (Figura 3). Quantificazione di un cluster di cellule (granuloma per esempio) spesso stretc<html> hes a diversi strati cellulari e possono essere completamente catturato da un&#39;analisi quantitativa 3D. Inoltre, la visualizzazione delle caratteristiche precise spaziali e temporali di singole celle o batteri nel modello permette studi di live-imaging migrazione e di monitoraggio in un laboratorio designato. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/53084/53084fig2.jpg" /> Figura 2. monociti nel modello di tessuto di cluster intorno virulenta M. la tubercolosi. immagini confocali rappresentativi di non infetti e M. tubercolosi modello di tessuto infetto è presentato. I pannelli dal verde (M. da tubercolosi GFP), rosso (monociti PKH26 marcato), blu (nuclei DAPI-colorati) e canali uniti mostrano il reclutamento dei monociti nel tessuto infetto rispetto ai tessuti non infetti. Scale - 100 micron.large.jpg &quot;style =&quot; font-size: 14px; line-height: 28px; &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/53084/53084fig3.jpg" /> Figura 3. Visualizzazione 3D e analisi quantitativa di modello di tessuto forniscono informazioni utili. Immagini rappresentative della visualizzazione 3D di tutto il modello di tessuto (A) del tessuto infetto, (B) infettati con M. la tubercolosi, attraverso sezionamento ottico utilizzando Zeiss LSM700 microscopio confocale e analisi quantitativa dal software di elaborazione delle immagini Imaris (versione 7.6.8). Queste immagini sono state acquisite a 20 ingrandimenti, 14 z-stack coprono uno spessore di 19,5 micron tessuto con 1,5 micron intervallo, permettendo la visualizzazione da apicale, orizzontale di rotazione, vista verticale e laterale di rotazione (A e B). (C) Quaanalisi ntitative di gruppi di cellule monociti rivelano migliorata (p &lt;0,0001) formato dei primi grappoli di granulomi dopo M. infezione tubercolare quando confrontato con assenza di infezione. (D) Quantificazione del numero dei monociti mostrato un calo (p &lt;0.01) nel tessuto infetto rispetto al tessuto non infetto, ribadendo più cluster nel tessuto infetto. Verde - M. la tubercolosi-GFP, Rosso - monociti PKH26-etichettati, Blu - nuclei delle cellule, Scala -. 100 micron <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53084/53084fig3large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a>

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A 3D Human Lung Tissue Model for Functional Studies on Mycobacterium tuberculosis Infection

Human tuberculosis infection is a complex process, which is difficult to model in vitro. Here we describe a novel 3D human lung tissue model that recapitulates the dynamics that occur during infection, including the migration of immune cells and early granuloma formation in a physiological environment.

Un 3D Polmone umano tessuto modello per studi funzionali su<em&gt; Mycobacterium tuberculosis</em&gt; Infezione

Tuberculosis (TB) still holds a major threat to the health of people worldwide, and there is a need for cost-efficient but reliable models to help us ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

A 3D Human Lung Tissue Model for Functional Studies on Mycobacterium tuberculosis Infection

18.8K Views.  Linköping University. Human tuberculosis infection is a complex process, which is difficult to model in vitro. Here we describe a novel 3D human lung tissue model that recapitulates the dynamics that occur during infection, including the migration of immune cells and early granuloma formation in a physiological environment.

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Sample Preparation of Mycobacterium tuberculosis Extracts for Nuclear Magnetic Resonance Metabolomic Studies

Mycobacterium tuberculosis is a major cause of mortality in human beings on a global scale. The emergence of both multi- (MDR) and extensively-(XDR) drug-resistant strains threatens to derail current disease control efforts. Thus, there is an urgent need to develop drugs and vaccines that are more effective than those currently available. The genome of M. tuberculosis has been known for more than 10 years, yet there are important gaps in our knowledge of gene function and essentiality. Many studies have since used gene expression analysis at both the transcriptomic and proteomic levels to determine the effects of drugs, oxidants, and growth conditions on the global patterns of gene expression. Ultimately, the final response of these changes is reflected in the metabolic composition of the bacterium including a few thousand small molecular weight chemicals. Comparing the metabolic profiles of wild type and mutant strains, either untreated or treated with a particular drug, can effectively allow target identification and may lead to the development of novel inhibitors with anti-tubercular activity. Likewise, the effects of two or more conditions on the metabolome can also be assessed. Nuclear magnetic resonance (NMR) is a powerful technology that is used to identify and quantify metabolic intermediates. In this protocol, procedures for the preparation of M. tuberculosis cell extracts for NMR metabolomic analysis are described. Cell cultures are grown under appropriate conditions and required Biosafety Level 3 containment,1 harvested, and subjected to mechanical lysis while maintaining cold temperatures to maximize preservation of metabolites. Cell lysates are recovered, filtered sterilized, and stored at ultra-low temperatures. Aliquots from these cell extracts are plated on Middlebrook 7H9 agar for colony-forming units to verify absence of viable cells. Upon two months of incubation at 37 &deg;C, if no viable colonies are observed, samples are removed from the containment facility for downstream processing. Extracts are lyophilized, resuspended in deuterated buffer and injected in the NMR instrument, capturing spectroscopic data that is then subjected to statistical analysis. The procedures described can be applied for both one-dimensional (1D) 1H NMR and two-dimensional (2D) 1H-13C NMR analyses. This methodology provides more reliable small molecular weight metabolite identification and more reliable and sensitive quantitative analyses of cell extract metabolic compositions than chromatographic methods. Variations of the procedure described following the cell lysis step can also be adapted for parallel proteomic analysis.

Sample Preparation of Mycobacterium tuberculosis Extracts for Nuclear Magnetic Resonance Metabolomic Studies

The metabolomic profile of Mycobacterium tuberculosis is determined after growth in broth cultures. Conditions can be varied to test the effects of nutritional supplements, oxidants, and anti-tuberculosis agents on the metabolic profile of this microorganism. Procedure for extract preparation is applicable for both 1D 1H and 2D 1H-13C NMR analyses.

Preparazione del campione di<em&gt; Mycobacterium tuberculosis</em&gt; Estratti di studi di risonanza magnetica nucleare metabolomica

Mycobacterium tuberculosis is a major cause of mortality in human beings on a global scale. The emergence of both multi- (MDR) and extensively-(XDR) ...

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Immunologia e infezioni

Growth of Mycobacterium tuberculosis Biofilms

Mycobacterium tuberculosis, the etiologic agent of human tuberculosis, has an extraordinary ability to survive against environmental stresses including antibiotics. Although stress tolerance of M. tuberculosis is one of the likely contributors to the 6-month long chemotherapy of tuberculosis 1, the molecular mechanisms underlying this characteristic phenotype of the pathogen remain unclear. Many microbial species have evolved to survive in stressful environments by self-assembling in highly organized, surface attached, and matrix encapsulated structures called biofilms 2-4. Growth in communities appears to be a preferred survival strategy of microbes, and is achieved through genetic components that regulate surface attachment, intercellular communications, and synthesis of extracellular polymeric substances (EPS) 5,6. The tolerance to environmental stress is likely facilitated by EPS, and perhaps by the physiological adaptation of individual bacilli to heterogeneous microenvironments within the complex architecture of biofilms 7.
In a series of recent papers we established that M. tuberculosis and Mycobacterium smegmatis have a strong propensity to grow in organized multicellular structures, called biofilms, which can tolerate more than 50 times the minimal inhibitory concentrations of the anti-tuberculosis drugs isoniazid and rifampicin 8-10. M. tuberculosis, however, intriguingly requires specific conditions to form mature biofilms, in particular 9:1 ratio of headspace: media as well as limited exchange of air with the atmosphere 9. Requirements of specialized environmental conditions could possibly be linked to the fact that M. tuberculosis is an obligate human pathogen and thus has adapted to tissue environments. In this publication we demonstrate methods for culturing M. tuberculosis biofilms in a bottle and a 12-well plate format, which is convenient for bacteriological as well as genetic studies. We have described the protocol for an attenuated strain of M. tuberculosis, mc27000, with deletion in the two loci, panCD and RD1, that are critical for in vivo growth of the pathogen 9. This strain can be safely used in a BSL-2 containment for understanding the basic biology of the tuberculosis pathogen thus avoiding the requirement of an expensive BSL-3 facility. The method can be extended, with appropriate modification in media, to grow biofilm of other culturable mycobacterial species.
Overall, a uniform protocol of culturing mycobacterial biofilms will help the investigators interested in studying the basic resilient characteristics of mycobacteria. In addition, a clear and concise method of growing mycobacterial biofilms will also help the clinical and pharmaceutical investigators to test the efficacy of a potential drug.

Growth of Mycobacterium tuberculosis Biofilms

Mycobacterium tuberculosis forms drug tolerant biofilms when cultured in certain conditions. Here we describe methods for culturing M. tuberculosis biofilms and determining the frequency of drug tolerant persisters. These protocols will be useful for further studies into the mechanisms of drug tolerance in M. tuberculosis.

Crescita Mycobacterium tuberculosis I biofilm

Mycobacterium tuberculosis, the etiologic agent of human tuberculosis, has an extraordinary ability to survive against environmental stresses including ...

Flow Cytometric Isolation of Primary Murine Type II Alveolar Epithelial Cells for Functional and Molecular Studies

Throughout the last years, the contribution of alveolar type II epithelial cells (AECII) to various aspects of immune regulation in the lung has been increasingly recognized. AECII have been shown to participate in cytokine production in inflamed airways and to even act as antigen-presenting cells in both infection and T-cell mediated autoimmunity 1-8. Therefore, they are especially interesting also in clinical contexts such as airway hyper-reactivity to foreign and self-antigens as well as infections that directly or indirectly target AECII. However, our understanding of the detailed immunologic functions served by alveolar type II epithelial cells in the healthy lung as well as in inflammation remains fragmentary. Many studies regarding AECII function are performed using mouse or human alveolar epithelial cell lines 9-12. Working with cell lines certainly offers a range of benefits, such as the availability of large numbers of cells for extensive analyses. However, we believe the use of primary murine AECII allows a better understanding of the role of this cell type in complex processes like infection or autoimmune inflammation. Primary murine AECII can be isolated directly from animals suffering from such respiratory conditions, meaning they have been subject to all additional extrinsic factors playing a role in the analyzed setting. As an example, viable AECII can be isolated from mice intranasally infected with influenza A virus, which primarily targets these cells for replication 13. Importantly, through ex vivo infection of AECII isolated from healthy mice, studies of the cellular responses mounted upon infection can be further extended.
Our protocol for the isolation of primary murine AECII is based on enzymatic digestion of the mouse lung followed by labeling of the resulting cell suspension with antibodies specific for CD11c, CD11b, F4/80, CD19, CD45 and CD16/CD32. Granular AECII are then identified as the unlabeled and sideward scatter high (SSChigh) cell population and are separated by fluorescence activated cell sorting 3.
In comparison to alternative methods of isolating primary epithelial cells from mouse lungs, our protocol for flow cytometric isolation of AECII by negative selection yields untouched, highly viable and pure AECII in relatively short time. Additionally, and in contrast to conventional methods of isolation by panning and depletion of lymphocytes via binding of antibody-coupled magnetic beads 14, 15, flow cytometric cell-sorting allows discrimination by means of cell size and granularity. Given that instrumentation for flow cytometric cell sorting is available, the described procedure can be applied at relatively low costs. Next to standard antibodies and enzymes for lung disintegration, no additional reagents such as magnetic beads are required. The isolated cells are suitable for a wide range of functional and molecular studies, which include in vitro culture and T-cell stimulation assays as well as transcriptome, proteome or secretome analyses 3, 4.

We describe the rapid isolation of primary murine type II alveolar epithelial cells (AECII) by flow cytometric negative selection. These AECII show high viability and purity and are suitable for a wide range of functional and molecular studies regarding their role in respiratory conditions such as autoimmune or infectious diseases.

Flusso Isolamento citometrica di primari murini di tipo II cellule alveolari epiteliali per gli studi funzionali e molecolari

Throughout  the last years, the contribution of alveolar type II epithelial cells (AECII)  to various aspects of immune regulation in the lung has been ...

An Experimental Model to Study Tuberculosis-Malaria Coinfection upon Natural Transmission of Mycobacterium tuberculosis and Plasmodium berghei

Coinfections naturally occur due to the geographic overlap of distinct types of pathogenic organisms. Concurrent infections most likely modulate the respective immune response to each single pathogen and may thereby affect pathogenesis and disease outcome. Coinfected patients may also respond differentially to anti-infective interventions. Coinfection between tuberculosis as caused by mycobacteria and the malaria parasite Plasmodium, both of which are coendemic in many parts of sub-Saharan Africa, has not been studied in detail. In order to approach the challenging but scientifically and clinically highly relevant question how malaria-tuberculosis coinfection modulate host immunity and the course of each disease, we established an experimental mouse model that allows us to dissect the elicited immune responses to both pathogens in the coinfected host. Of note, in order to most precisely mimic naturally acquired human infections, we perform experimental infections of mice with both pathogens by their natural routes of infection, i.e. aerosol and mosquito bite, respectively.

An Experimental Model to Study Tuberculosis-Malaria Coinfection upon Natural Transmission of Mycobacterium tuberculosis and Plasmodium berghei

Tuberculosis and malaria are two of the most prevalent infections in humans and major causes of morbidity and mortality in impoverished populations in the tropics. We established an experimental model system to study outcome of malaria-tuberculosis coinfection in mice after challenge with both pathogens via their natural route of infection.

Un modello sperimentale per studiare la tubercolosi, la malaria coinfezione sulla trasmissione naturale di Mycobacterium tuberculosis E Plasmodium berghei</i

Coinfections naturally occur due to the geographic overlap of distinct types of pathogenic organisms. Concurrent infections most likely modulate the ...

Demonstrating a Multi-drug Resistant Mycobacterium tuberculosis Amplification Microarray

Simplifying microarray workflow is a necessary first step for creating MDR-TB microarray-based diagnostics that can be routinely used in lower-resource environments. An amplification microarray combines asymmetric PCR amplification, target size selection, target labeling, and microarray hybridization within a single solution and into a single microfluidic chamber. A batch processing method is demonstrated with a 9-plex asymmetric master mix and low-density gel element microarray for genotyping multi-drug resistant Mycobacterium tuberculosis (MDR-TB). The protocol described here can be completed in 6 hr and provide correct genotyping with at least 1,000 cell equivalents of genomic DNA. Incorporating on-chip wash steps is feasible, which will result in an entirely closed amplicon method and system. The extent of multiplexing with an amplification microarray is ultimately constrained by the number of primer pairs that can be combined into a single master mix and still achieve desired sensitivity and specificity performance metrics, rather than the number of probes that are immobilized on the array. Likewise, the total analysis time can be shortened or lengthened depending on the specific intended use, research question, and desired limits of detection. Nevertheless, the general approach significantly streamlines microarray workflow for the end user by reducing the number of manually intensive and time-consuming processing steps, and provides a simplified biochemical and microfluidic path for translating microarray-based diagnostics into routine clinical practice.

Demonstrating a Multi-drug Resistant Mycobacterium tuberculosis Amplification Microarray

An amplification microarray combines asymmetric PCR amplification and microarray hybridization into a single chamber, which significantly streamlines microarray workflow for the end user. Simplifying microarray workflow is a necessary first step for creating microarray-based diagnostics that can be routinely used in lower-resource environments.

Dimostrazione di un multi-resistente ai farmaci<em&gt; Mycobacterium tuberculosis</em&gt; Amplificazione Microarray

Simplifying microarray workflow is a necessary first step for creating MDR-TB microarray-based diagnostics that can be routinely used in lower-resource ...

A Novel Microdissection Approach to Recovering Mycobacterium tuberculosis Specific Transcripts from Formalin Fixed Paraffin Embedded Lung Granulomas

Microdissection has been used for the examination of tissues at DNA, RNA, and protein levels for over a decade. Laser capture microscopy (LCM) is the most common microdissection technique used today. In this technique, a laser is used to focally melt a thermoplastic membrane that overlies a dehydrated tissue section1. The tissue section composite is then lifted and separated from the membrane. Although this technique can be used successfully for tissue examination, it is time consuming and expensive. Furthermore, the successful completion of procedures using this technique requires the use of a laser, thus limiting its use. A new more affordable and practical microdissection approach called mesodissection is a possible solution to the pitfalls of LCM. This technique employs the MESO-1/MeSectr system to mill the desired tissue from a slide mounted tissue sample while concurrently dispensing and aspirating fluid to recover the desired tissue sample into a consumable mill bit. Before the dissection process begins, the user aligns the formalin fixed paraffin embedded (FFPE) slide with a hematoxylin and eosin stained (H&#38;E) reference slide. Thereafter, the operator annotates the desired dissection area and proceeds to dissect the appropriate segment. The program generates an archived image of the dissection. The main advantage of mesodissection is the short duration needed to dissect a slide, taking an average of ten minutes from set up to sample generation in this experiment. Additionally, the system is significantly more cost effective and user friendly. A slight disadvantage is that it is not as precise as laser capture microscopy. In this article we demonstrate how mesodissection can be used to extract RNA from slides from FFPE granulomas caused by Mycobacterium tuberculosis (Mtb).

A Novel Microdissection Approach to Recovering Mycobacterium tuberculosis Specific Transcripts from Formalin Fixed Paraffin Embedded Lung Granulomas

Microdissection has been extensively employed for the examination of DNA, RNA, and protein within tissue. Laser capture microscopy (LCM) is the most commonly used method, but a new milling technique, mesodissection, is recently available. We demonstrate RNA extraction from mesodissected formalin fixed paraffin embedded tissue slides of Mycobacterium tuberculosis granulomas.

Un nuovo approccio Microdissezione per recuperare<em&gt; Mycobacterium tuberculosis</em&gt; Trascrizioni specifici da formalina paraffina fisso incorporato Lung granulomi

Microdissection has been used for the examination of tissues at DNA, RNA, and protein levels for over a decade. Laser capture microscopy (LCM) is the most ...

System for Efficacy and Cytotoxicity Screening of Inhibitors Targeting Intracellular Mycobacterium tuberculosis

Mycobacterium tuberculosis, the causative agent of tuberculosis (TB), is a leading cause of morbidity and mortality worldwide. With the increased spread of multi drug-resistant TB (MDR-TB), there is a real urgency to develop new therapeutic strategies against M. tuberculosis infections. Traditionally, compounds are evaluated based on their antibacterial activity under in vitro growth conditions in broth; however, results are often misleading for intracellular pathogens like M. tuberculosis since in-broth phenotypic screening conditions are significantly different from the actual disease conditions within the human body. Screening for inhibitors that work inside macrophages has been traditionally difficult due to the complexity, variability in infection, and slow replication rate of M. tuberculosis. In this study, we report a new approach to rapidly assess the effectiveness of compounds on the viability of M. tuberculosis in a macrophage infection model. Using a combination of a cytotoxicity assay and an in-broth M. tuberculosis viability assay, we were able to create a screening system that generates a comprehensive analysis of compounds of interest. This system is capable of producing quantitative data at a low cost that is within reach of most labs and yet is highly scalable to fit large industrial settings.

System for Efficacy and Cytotoxicity Screening of Inhibitors Targeting Intracellular Mycobacterium tuberculosis

We have developed a modular high-throughput screening system for discovering novel compounds against Mycobacterium tuberculosis, targeting intracellular and in-broth growing bacteria as well as cytotoxicity against the mammalian host cell.

Sistema per l&#39;efficacia e la citotossicità Proiezione di inibitori di targeting intracellulare<em&gt; Mycobacterium tuberculosis</em

Mycobacterium tuberculosis, the causative agent of tuberculosis (TB), is a leading cause of morbidity and mortality worldwide. With the increased spread ...

Analysis of 18FDG PET/CT Imaging as a Tool for Studying Mycobacterium tuberculosis Infection and Treatment in Non-human Primates

Mycobacterium tuberculosis remains the number one infectious agent in the world today. With the emergence of antibiotic resistant strains, new clinically relevant methods are needed that evaluate the disease process and screen for potential antibiotic and vaccine treatments. Positron Emission Tomography/Computed Tomography (PET/CT) has been established as a valuable tool for studying a number of afflictions such as cancer, Alzheimer&#39;s disease, and inflammation/infection. Outlined here are a number of strategies that have been employed to evaluate PET/CT images in cynomolgus macaques that are infected intrabronchially with low doses of M. tuberculosis. Through evaluation of lesion size on CT and uptake of 18F-fluorodeoxyglucose (FDG) in lesions and lymph nodes in PET images, these described methods show that PET/CT imaging can predict future development of active versus latent disease and the propensity for reactivation from a latent state of infection. Additionally, by analyzing the overall level of lung inflammation, these methods determine antibiotic efficacy of drugs against M. tuberculosis in the most clinically relevant existing animal model. These image analysis methods are some of the most powerful tools in the arsenal against this disease as not only can they evaluate a number of characteristics of infection and drug treatment, but they are also directly translatable to a clinical setting for use in human studies.

Analysis of 18FDG PET/CT Imaging as a Tool for Studying Mycobacterium tuberculosis Infection and Treatment in Non-human Primates

Here, we present a protocol to describe the analysis of 18F-FDG PET/CT imaging in non-human primates that have been infected with M. tuberculosis to study disease process, drug treatment, and disease reactivation.

Analisi di 18FDG PET/CT Imaging come strumento per studiare l'infezione di tubercolosi del micobatterio e trattamento in primati Non umani

Mycobacterium tuberculosis remains the number one infectious agent in the world today. With the emergence of antibiotic resistant strains, new clinically ...

Imaging Mycobacterium tuberculosis in Mice with Reporter Enzyme Fluorescence

Reporter enzyme fluorescence (REF) utilizes substrates that are specific for enzymes present in target organisms of interest for imaging or detection by fluorescence or bioluminescence. We utilize BlaC, an enzyme expressed constitutively by all M. tuberculosis strains. REF allows rapid quantification of bacteria in lungs of infected mice. The same group of mice can be imaged at many time points, greatly reducing costs, enumerating bacteria more quickly, allowing novel observations in host-pathogen interactions, and increasing statistical power, since more animals per group are readily maintained. REF is extremely sensitive due to the catalytic nature of the BlaC enzymatic reporter and specific due to the custom flourescence resonance energy transfer (FRET) or fluorogenic substrates used. REF does not require recombinant strains, ensuring normal host-pathogen interactions. We describe the imaging of M. tuberculosis infection using a FRET substrate with maximal emission at 800 nm. The wavelength of the substrate allows sensitive deep tissue imaging in mammals. We will outline aerosol infection of mice with M. tuberculosis, anesthesia of mice, administration of the REF substrate, and optical imaging. This method has been successfully applied to evaluating host-pathogen interactions and efficacy of antibiotics targeting M. tuberculosis.

Imaging Mycobacterium tuberculosis in Mice with Reporter Enzyme Fluorescence

We describe the optical imaging of mice infected with Mycobacterium tuberculosis (M. tuberculosis) using reporter enzyme fluorescence (REF). This protocol facilitates the sensitive and specific detection of M. tuberculosis in pre-clinical animal models for pathogenesis, therapeutics and vaccine research.

Tubercolosi del micobatterio in topi con fluorescenza enzima Reporter di imaging

Reporter enzyme fluorescence (REF) utilizes substrates that are specific for enzymes present in target organisms of interest for imaging or detection by ...

Modeling Tuberculosis in Mycobacterium marinum Infected Adult Zebrafish

Mycobacterium tuberculosis is currently the deadliest human pathogen causing 1.7 million deaths and 10.4 million infections every year. Exposure to this bacterium causes a wide disease spectrum in humans ranging from a sterilized infection to an actively progressing deadly disease. The most common form is the latent tuberculosis, which is asymptomatic, but has the potential to reactivate into a fulminant disease. Adult zebrafish and its natural pathogen Mycobacterium marinum have recently proven to be an applicable model to study the wide disease spectrum of tuberculosis. Importantly, spontaneous latency and reactivation as well as adaptive immune responses in the context of mycobacterial infection can be studied in this model. In this article, we describe methods for the experimental infection of adult zebrafish, the collection of internal organs for the extraction of nucleic acids for the measurement of mycobacterial loads and host immune responses by quantitative PCR. The in-house-developed, M. marinum-specific qPCR assay is more sensitive than the traditional plating methods as it also detects DNA from non-dividing, dormant or recently dead mycobacteria. As both DNA and RNA are extracted from the same individual, it is possible to study the relationships between the diseased state, and the host and pathogen gene-expression. The adult zebrafish model for tuberculosis thus presents itself as a highly applicable, non-mammalian in vivo system to study host-pathogen interactions.

Modeling Tuberculosis in Mycobacterium marinum Infected Adult Zebrafish

Here, we present a protocol to model human tuberculosis in an adult zebrafish using its natural pathogen Mycobacterium marinum. Extracted DNA and RNA from the internal organs of infected zebrafish can be used to reveal the total mycobacterial loads in the fish and the host&#39;s immune responses with qPCR.

Modellazione di tubercolosi in Zebrafish adulto infettato di Mycobacterium marinum

Mycobacterium tuberculosis is currently the deadliest human pathogen causing 1.7 million deaths and 10.4 million infections every year. Exposure to this ...