Tradizionalmente, i macrofagi sono stati difficili da studiare nei saggi di chemiotassi in tempo reale perché le cellule si muovono lentamente. Questo protocollo fornisce un mezzo per immaginire macrofagi che migrano in gradiente chemiotattico per un massimo di sei ore o più. Rispetto ai test implantari come i test di trasferimento, questa tecnica ha i vantaggi che la morfologia dei macrofagi può essere osservata e parametri come la velocità cellulare e l'efficienza chemiotattica possono essere misurati.
I macrofagi sono coinvolti in molte malattie infiammatorie e questa tecnica può essere utile per studiare farmaci progettati per inibire la chemiotassi. Può anche essere applicato ad altri tipi di cellule come i monociti umani. Quando si tenta questa tecnica per la prima volta, è meglio praticare il riempimento delle camere chemiotassi prima di lavorare con le cellule.
Uno degli aspetti più importanti della tecnica è evitare bolle d'aria. Inizia pre-riempiendo i canali di collegamento di una o due diapositive di chemiotassi con RPMI 1640 HEPES Medium modificato preparato secondo le indicazioni manoscritte. Posizionare uno scivolo in un piatto di coltura cellulare e impostare il piatto su un blocco di alluminio riscaldato a 37 gradi Celsius.
Quindi inserire le spine nelle porte uno e quattro. Utilizzare una punta di pipetta smussata da 200 microlitri per depositare 15 microlitri dell'RPMI 1640 HEPES Medium modificato nella porta di riempimento tre. Quindi, inserire la punta del tubo nella porta due e aspirare 15 microlitri a una velocità moderatamente veloce, che pre-riempirà il canale di collegamento e i due canali di alimentazione di fianco.
Coprire le porte di riempimento due e tre con tappi e posizionare lo scivolo chemiotaxis su un rack in una camera di umidità chiusa all'interno di un incubatore altrimenti asciutto e privo di anidride carbonica a 37 gradi Celsius. Per isolare i macrofagi, inserire un catetere di plastica calibro 24 nella cavità peritoneale di un topo sacrificato di tre o quattro mesi e utilizzare una siringa di plastica da cinque millilitri per lavare la cavità con la soluzione di sale tamponato di Hank ghiacciata senza calcio o magnesio. Dopo aver raccolto il mezzo lavato in un tubo, centrifugarlo a 300 volte G per 6,5 minuti.
Scartare il supernatante e sospendere di nuovo le celle in 200 microlitri di mezzo RPMI 1640 modificato. Diluire un'aliquota della sospensione delle cellule da uno a 20. Quindi utilizzare un dispositivo di conteggio per contare le celle.
Diluire le cellule a una concentrazione finale di 10 per 10 alle sei celle per millilitro e mantenerle a 37 gradi Celsius in un blocco di alluminio riscaldato. Pipettare la sospensione cellulare su e giù cinque volte per ridurre l'accumulo e depositare delicatamente 10 microlitri sulla porta tre della camera di chemiotassi. Posizionare la punta della pipetta nella porta due e disegnare lentamente la sospensione della cella nel canale di collegamento.
Non appena la sospensione cellulare è stata introdotta, rimuovere le spine alle porte uno e quattro per arrestare il flusso e posizionare i tappi su tutte e quattro le porte di riempimento. Quindi, posizionare le diapositive chemiotassi nella camera di umidità di 37 gradi Celsius per due o tre ore. Ispezionare l'area di osservazione con un microscopio invertito.
Quindi posizionare le spine nelle porte di riempimento una e due e verificare se la porta di riempimento tre è riempita verso l'alto con mezzo e priva di bolle d'aria. Se necessario, utilizzare un ago sterile per siringhe calibro 27 per spodedare le bolle d'aria. Successivamente, aspirare 60 microlitri di mezzo con una pipetta meccanica da 100 microlitri e posizionare la punta nella porta di riempimento tre.
Utilizzare l'anello di impostazione del volume per iniettare lentamente e costantemente il mezzo nel serbatoio fino a raggiungere la parte superiore della porta di riempimento quattro dopo uno o due minuti. Per riempire il secondo serbatoio, spostare la spina dalla porta uno e inserirla lentamente nella porta tre. Aspirare 50 microlitri di mezzo e posizionare la punta della pipetta nella porta quattro e iniettare lentamente il mezzo nel secondo serbatoio in modo che raggiunga la parte superiore della porta di riempimento uno dopo uno o due minuti.
Aggiungere 495 microlitri di tubo microcentro a due millilitri e aggiungere cinque microlitri di blu brevetto cinque. Aggiungere brevemente la miscela, quindi aggiungere nuovamente 5,4 microlitri del complemento di topo ricombinante C5a e vortice per mescolare. Assicurarsi che la depressione superficiale nella parte superiore della porta uno sia priva di mezzi e depositare 15 microlitri del complemento blu C5a contenente mezzo.
Quindi inserire una punta della pipetta da 200 microliter nella porta di riempimento quattro e ruotare lentamente l'anello di impostazione del volume per disegnare il mezzo nel serbatoio opposto. Disegnare l'aria nella breve colonna verticale della porta di riempimento uno fino a quando l'interfaccia fluido-aria non è a metà della colonna. Quindi collegare la porta uno prima di sollevare delicatamente la pipetta dalla porta quattro, assicurandosi che lo scivolo rimanga in posizione e collegare lentamente la porta quattro.
Per eseguire l'imaging time lapse, posizionare lo scivolo chemiotassi sul palco di un microscopio invertito dotato di un incubatore di palcoscenico e immaginare l'area di osservazione con una lente obiettiva a contrasto di fase 10X, concentrandosi sulla lamellipodia macrofago. La diapositiva chemiotassi utilizzata per la microscopia video time lapse dei macrofagi peritoneali del mouse ha tre camere chemiotassi, ognuna delle quali ha quattro porte di riempimento. Le cellule venivano seminate nell'area di osservazione di ogni camera.
E dopo un'incubazione di due o tre ore, le camere furono lentamente riempite di mezzo. Quando le cellule nell'area di osservazione sono state ispezionate, fino a due terzi delle cellule erano state lavate via. Generalmente, le cellule B-1 debolmente aderenti furono lavate via, e le cellule rimanenti erano prevalentemente macrofagi.
Per distinguere i macrofagi dalle cellule B, le cellule appena isolate sono state etichettate con anticorpi specifici. I macrofagi erano etichettati con fluorescenza verde, le cellule B con il rosso e i nuclei cellulari con blu. La migrazione dei macrofagi è stata studiata introducendo il complemento C5a, un chemioattratrante, in uno dei due bacini idrici.
Sono state registrate le tracce di migrazione dei macrofagi che migrano in una sfumatura Del complemento C5. Il punto iniziale di ogni traccia di migrazione è stato normalizzato in X uguale a zero e Y è uguale a zero per creare un plottaggio di migrazione. Quindi, sono state calcolate la velocità cellulare e l'efficienza chemiotattica dei singoli macrofagi.
Questa tecnica è stata utile per studiare i ruoli delle subunità proteiche G, e rho GTPasi, e la motilità dei macrofagi nella chemiotassi.
