Questo metodo consente di coltivare batteri in un ambiente che innesca una fisiologia cellulare e una morfologia del biofilm simili a quella che si vede nelle infezioni polmonari da fibrosi cistica. I polmoni sono un rifiuto nell'industria della carne, quindi non ci sono preoccupazioni etiche. Il modello offre una piattaforma per imitare l'infezione umana senza la necessità di un modello animale vivo.
Questa tecnica offre ai ricercatori un nuovo modo di migliorare i farmaci candidati per il potenziale di entrare e distruggere i biofilm che si formano nei polmoni da fibrosi cistica. Con l'ulteriore sviluppo e convalida, crediamo che il modello EVPR potrebbe avere un potenziale uso per test specializzati e individualizzati di suscettibilità agli antibiotici. Ottenere i polmoni immediatamente dopo la macellazione e trasportarli in laboratorio in una scatola fredda domestica.
Lavorare su una superficie sterilizzata e sotto una fiamma. Posizionare i polmoni su un tagliere di plastica pulito coperto con foglio di alluminio autoclavato e verificare che i bronchili rimangano intatti. I polmoni non sono adatti all'uso se ci sono stati danni al mattatoio o durante il trasporto.
Scaldare un coltello pallet sotto una fiamma e toccare molto brevemente il coltello nell'area del polmone che circonda il bronchiolo per sterilizzare la superficie del tessuto. Tagliare il tessuto superficiale che circonda il bronchiolo utilizzando una lama di rasoio montata su sterile, facendo incisioni parallele al bronchiolo per prevenire eventuali danni. Una volta esposto il bronchiolo, rendere visibile un'incisione trasversale attraverso il bronchiolo nel punto più alto.
Utilizzando forcep sterili, tenere leggermente l'estremità libera del bronchiolo e tagliare via qualsiasi tessuto indesiderato rimanente utilizzando una lama di rasoio montata su sterile. Effettuare un'incisione finale della sezione trasversale attraverso il bronchiolo prima che qualsiasi ramificazione sia visibile per rimuovere il bronchiolo dai polmoni. Posizionare il bronchiolo nel primo lavaggio DMEM RPMI 1640.
Lasciare nel lavaggio e raccogliere ulteriori sezioni di bronchiolo dallo stesso polmone per produrre sezioni di tessuto sufficienti per l'esperimento pianificato. Posizionare eventuali sezioni bronchiolari aggiuntive dallo stesso polmone nel lavaggio e lasciarle nel lavaggio per almeno due minuti. Rimuovere i bronchioli dal primo lavaggio e posizionare i campioni in una piastra di Petri sterile.
Tenere leggermente ogni bronchiolo con forcelle sterili, facendo attenzione a non danneggiare il tessuto. Rimuovere il maggior tempo possibile i tessuti molli rimanenti e tagliare il tessuto a strisce larghe cinque millimetri utilizzando forbici sterili per la dissezione. Posizionare tutte le strisce di tessuto bronchiolare nel secondo lavaggio DMEM RPMI 1640.
Lasciarli nel lavaggio per almeno due minuti, quindi rimuovere le strisce di tessuto dal secondo lavaggio utilizzando forcelle sterili e posizionarle in una piastra di Petri pulita e sterile. Rimuovere tutti i tessuti molli rimanenti attaccati al bronchiolo e tagliare le strisce in quadrati usando forbici sterili per la dissezione. Aggiungere il terzo DMEM RPMI 1640 lavare nella piastra di Petri e mescolare leggermente i pezzi di tessuto nel lavaggio ruotando la piastra.
Versare il terzo lavaggio dalla piastra di Petri senza rimuovere i pezzi di tessuto. Quindi aggiungere il lavaggio SCFM finale, assicurando che tutti i pezzi di tessuto siano coperti. Sterilizzare il tessuto in SCFM sotto la luce UV per cinque minuti.
Utilizzare forcelle sterili per trasferire ogni pezzo di tessuto bronchiolare sterilizzato in singoli pozzi di una piastra da 24 pozzetti contenente tamponi di agarosio SCFM. Per infettare ogni pezzo di tessuto con l'affaticamento batterico desiderato, toccare una colonia cresciuta su una piastra di agar con la punta di un ago calibro 29 attaccato a una siringa sterile per insulina da 0,5 millilitri, quindi toccare la colonia sul pezzo di tessuto, pungendo delicatamente la superficie. Per i controlli non infetti, pungere delicatamente la superficie del pezzo di tessuto con la punta dell'ago, quindi utilizzare una pipetta per aggiungere 500 microlitri di SCFM ad ogni pozzo.
Sterilizzare una membrana sigillante traspirante per ogni piastra da 24 pozzetti sotto la luce ultravioletta per 10 minuti. Rimuovere il coperchio dalla piastra da 24 pozzi e sostituirlo con la membrana traspirante, quindi incubare le piastre a 37 gradi Celsius senza tremare. Impostare set replicati di pezzi polmonari da almeno due polmoni indipendenti, utilizzando un set per un controllo negativo e un set per ogni concentrazione di antibiotico da testare.
Dopo 48 ore di incubazione, ispezionare visivamente i pezzi di tessuto non infetti per la crescita di batteri endogeni, il che causerebbe la torbidità del mezzo intorno a queste sezioni. Se si osserva una crescita tipica della specie di studio selezionata, riavviare l'esperimento con polmoni freschi. Se le sezioni di tessuto non infette non mostrano crescita batterica nulla o minima, preparare una piastra di lavaggio da 24 po 'e una piastra di trattamento da 24 porci.
Ogni pozzo della piastra di trattamento dovrebbe contenere 500 microlitri di SCFM fresco senza antibiotici o con l'antibiotico di interesse. Rimuovere ogni pezzo di tessuto infetto dalla piastra di incubazione con forcelle sterilizzate a fiamma. Ruotarlo brevemente in un pozzo fresco della piastra di lavaggio per rimuovere eventuali cellule batteriche non associate a biofilm e trasferirlo nel pozzo appropriato della piastra di trattamento.
Sigillare la piastra di trattamento con una membrana fresca traspirante, quindi incubarla a 37 gradi Celsius senza tremare per 18-24 ore. Utilizzare forcep sterilizzati a fiamma per rimuovere ogni pezzo polmonare dalla piastra da 24 pozzetti e metterlo in un tubo sterile di omogeneizzazione a due millilitri contenente un millilitro di PBS e un grammo di perline metalliche. Perline battere per 40 secondi a quattro metri al secondo.
Diluire serialmente l'omogeneato polmonare usando PBS e placcarlo sull'agar LB per determinare le unità di formazione della colonia in pezzi di tessuto individuali, non trattati e trattati con antibiotici. Se coltivati nel polmone di suino ex vivo o EVPL, i biofilm di P.aeruginosa e S.aureus dimostrano una maggiore tolleranza agli antibiotici rispetto alla suscettibilità nei test standard del MIC di brodo e del disco approvati dall'industria utilizzando supporti standard. I vari effetti di diversi antibiotici su un biofilm stabilito dall'EVPL sono distinguibili.
Ad esempio, l'uccisione di P.aeruginosa si ottiene in EVPL con ciprofloxacina MIC da 4 a 16X, ma non con cloramfenicolo MIC da 4 a 8X. Le popolazioni di S.aureus che sono suscettibili al linezolid nel saggio del disco sono in grado di sopravvivere alle concentrazioni bersaglio-siero e più alte nell'EVPL. Anche un saggio ottimizzato in vitro non è in grado di prevedere con precisione la suscettibilità della P.aeruginosa alla colistina nell'EVPL.
La quantità di antibiotico necessaria per ottenere tre log 10 di uccisione di batteri coltivati con EVPL è spesso significativamente superiore al MIC o all'MBEC calcolata da saggi standard in vitro. Oltre a distinguere le differenze tra agenti antimicrobici, questo modello può evidenziare i cambiamenti di suscettibilità in diverse fasi di crescita batterica e per diversi intervalli di dosamento degli antibiotici. La crescente tolleranza dei biofilm P.aeruginosa al meropenem man mano che maturano è mostrata qui.
La sopravvivenza dello S.aureus è stata misurata a 4 e 24 ore dopo l'esposizione alla flucloxacillina, rendendo possibile osservare le differenze nella riduzione del numero di cellule batteriche nel tempo e tra gli isolati. Le variazioni della carica batterica spesso aumentano con tempi di coltura prolungati. Questo può essere visto nel controllo non trattato dopo lo sviluppo di biofilm di 48 ore e un'ulteriore esposizione di 24 ore per tenere conto dell'intervallo di dosamento degli antibiotici.
È fondamentale mantenere un'eccellente tecnica sterile durante tutta la dissezione, quindi si consiglia di eseguire la dissezione in un laboratorio o in un'area del laboratorio che non si utilizza mai per il lavoro di microbiologia. Di recente abbiamo usato il modello per esplorare l'ingresso della colistina nel biofilm e il modello ha un buon potenziale per l'uso nella ricerca per migliorare la fornitura di farmaci nei biofilm.
