Ringraziamo Kristin Johnson per il lavoro grafico.

Tutti i protocolli che coinvolgono gli animali sono presentati ed approvati dalla Care and Use Committee Animal Istituzionale presso il Children Hospital di Boston e sono condotte in conformità con le raccomandazioni della Associazione per la valutazione e l&#39;accreditamento del Laboratorio di Animal Care (AAALAC). Assicurarsi di utilizzare la strumentazione sterile e techniqure asettica durante l&#39;esecuzione della procedura. 1 Preparazione di Pellet <ol><li> Pesare 10 mg di sucralfato e 60 mg di hydron con la spatola unbent sterile. Mettere in provette da microcentrifuga separati. </li><li> Posizionare un 1 centimetro quadrato di maglia in un piatto sterile 10 cm. Inverti così maglia poggia sul coperchio superficiale. Mettere da parte. </li><li> Aggiungere 500 ml di etanolo al hydron e vortex per almeno 10 min. </li><li> Aggiungere la quantità appropriata di fattore di crescita (standard: 20 mg per bFGF, 50 mg di VEGF) per il sucralfato e vortice brevemente. Fattore di crescita Conservare in un-80 ° C congelatore ad una concentrazione di 1 mg / ml. Volumi di liquidi aggiunti dovrebbero essere un minimo di 20 microlitri per assicurare il sucralfato è completamente inumidito, ma non dovrebbe superare i 50 ml. Maggiore il volume rende l&#39;evaporazione del liquido nel passaggio successivo difficile. </li><li> Mettere il composto sucralfato nell&#39;evaporatore centrifuga inserita bassa finchè il composto è completamente asciutta, normalmente 30-50 min a seconda del volume di liquido utilizzato. <ol><li> Controllare la miscela per umidità residua con l&#39;estremità rastremata di una spatola sterile. La miscela deve sentirsi &quot;croccante&quot;. </li></ol></li><li> Utilizzare l&#39;estremità rastremata della spatola per rompere la miscela sucralfato all&#39;interno del tubo. </li><li> Aggiungere 10 ml di hydron al sucralfato. <ol><li> A causa della natura viscosa di Hydron, tagliare l&#39;estremità da una punta di pipetta 200 microlitri e quindi disegnare e rilasciare i 10 ml prima di pipettare di nuovo e aggiungere al sucralfato. </li></ol></li><li> Utilizzare rapidamente battibecco piegatoUla per mescolare il hydron e sucralfato e togliere dal tubo. <ol><li> Raccogliere il composto lungo il lato inferiore della punta della spatola piegata e poi ruotare il tubo mentre si disegna la spatola lungo la parete del tubo. La miscela si asciuga rapidamente in modo che questo passo deve essere fatto in modo efficiente. </li></ol></li><li> Stendere il composto su la maglia preparata con pinze per tenerlo in posizione. La miscela deve essere uno strato uniforme e riempire nei fori della mesh. </li><li> Immergere la spatola piegata nella hydron provetta contenente e usarlo cappotto entrambi i lati della maglia. </li><li> Posizionare la maglia rivestito appoggiata sul fianco contro bordo del piatto e permettere l&#39;essiccazione a temperatura ambiente per 30-45 min. </li><li> Mettere le maglie di -20 ° C congelatore o procedere immediatamente alla fase successiva. Tenere maglia all&#39;interno piatto. </li><li> Porre la capsula 35 millimetri all&#39;interno della capsula di Petri grande, coperchio. Utilizzare la coppia di pinze per tirare attentamente le fibre della maglia a parte sopra il piatto da 35 mm. Pellets Stray cun essere raccolti dal piatto più grande alla fine. <ol><li> Controllare pellet per uniformità nel campo di applicazione. Il processo produce circa 250 pellet così la dose standard per pastiglia per bFGF e VEGF è di 80 ng e 200 ng rispettivamente. </li></ol></li><li> Conservare pellets in piastra da 35 mm a -20 ° C freezer per un massimo di 3 mesi. </li></ol> 2. impianto chirurgico di Pellet <ol><li> Impostare una zona chirurgica sotto microscopio operatorio. </li><li> Anestetizzare il mouse con avertin (400-500 mg / kg, intraperitoneale) e posizionare il mouse sotto il microscopio in modo occhio è visibile. Eseguire pizzico punta a garantire sufficiente livello di anestesia. </li><li> Anestetizzare l&#39;occhio del mouse mettendo 1 goccia di soluzione proparacaina cima bulbo oculare. Attendere 20-30 secondi e tamponare con un tampone di garza. </li><li> Proptose l&#39;occhio mouse con il # 1 offuscato gioiellerie pinza essendo certo di lasciare la pelle tra le pinze e gli occhi. E &#39;importante per giudicare la pressione applicata correttamente.60; Tenendo l&#39;occhio troppo saldamente farà a diventare rossa e irritata, mentre anche perdere una presa permetterà all&#39;occhio di muoversi durante la chirurgia. </li><li> Utilizzare la 30 ° microknife a fare un&#39;incisione nella cornea ca. 1 mm dal limbus. L&#39;incisione deve essere di 1-2 mm di lunghezza. Incisione dovrebbe essere profondo abbastanza per penetrare oltre lo strato epiteliale in midstroma ma non così profondo alla rottura l&#39;occhio. </li><li> Utilizzare il coltello von Graef per fare una tasca perpendicolare alla incisione. <ol><li> Far scorrere il coltello sotto lo strato corneo al sito di incisione e lavorare delicatamente coltello e spostarlo lungo l&#39;incisione per allargare lo spazio, formando così la tasca. Aiuta a spostare il mouse così da poter lavorare con la curvatura dell&#39;occhio. Fare attenzione a non spingere verso il basso con la punta per evitare la rottura all&#39;occhio. </li></ol></li><li> Bagnare pinza del # 5 del gioielliere con proparacaina e prendere una pallina da fuori di piatto. Mettere una pallina sull&#39;occhio. </li&gt; <li> Inumidire il coltello von Graef con proparacaina e trasferire alcuni di liquido sul pellet per renderla gommosa e flessibile. Rimuovere l&#39;umidità in eccesso con un tampone di garza o un batuffolo di cotone. </li><li> Inserire il pellet nella tasca con il coltello von Graef a spingere dentro sotto lo strato di cornea. Una volta che tutto il pellet è all&#39;interno, eseguire la parte piatta di von Graef coltello sul sito per controllare che il pellet è sicuro. </li><li> Cappotto l&#39;occhio con tripla pomata antibiotica. </li><li> Capovolgere il mouse e ripetere chirurgia nell&#39;occhio opposto. </li></ol> 3 Quantificazione di neovascolarizzazione corneale. Lasciare gli animali a sviluppare le navi per un periodo di tempo. Il giorno di vascello classificazione dipende dal fattore di crescita utilizzato. BFGF Grade il giorno 5 e il VEGF più debole il giorno 6 Il giorno di impianto è il giorno 0. <ol><li> Anestetizzare il mouse con avertin (400-500 mg / kg, intraperitoneale). </li><li> Usate il microscopio lampada a fessura per grading. Un oculare ha un reticolo, linee all&#39;interno dell&#39;oculare usato come un aiuto di misura per quantificare la lunghezza nave e distanza intorno circonferenza dell&#39;occhio che le navi hanno germogliato. <ol><li> Tenere il mouse davanti a portata, posizionare il mouse in modo occhio è visto in oculare con pellet direttamente avanti. Stabilizzare la testa tra il pollice e l&#39;indice così la pelle è stretta sul viso e degli occhi è leggermente proptosed. </li></ol></li><li> Inserire l&#39;asse y del reticolo lungo il vaso limbare direttamente sotto pellet. Misurare la lunghezza delle navi ramificazione verso l&#39;alto verso pellet. Annotare questa misura in decimi di millimetro e designa lunghezza della nave (VL) (Figura 1A). </li><li> Girare il mouse o il reticolo in modo che la distanza intorno all&#39;occhio che queste navi hanno germogliato diventa chiaro. E &#39;più facile pensare l&#39;occhio come un orologio con intervalli di 1 a 12 Designa quest&#39;ora numero orologio (CH) (Figura 1B). Può essere un numero intero o frazioni di 0,25 (ad esempio, 2, 2.25, 2.5 o 2.75). Nota: CH è soggettiva. Ad esempio, alcuni possono misurare la distanza intorno all&#39;occhio per includere tutte le navi germogliati dal limbus, mentre altri possono smettere di misurare nel punto in cui la lunghezza della nave è la metà massimale. Il fattore importante è essere coerenti con il modo si sceglie di grado. </li></ol><img alt="Figura 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51375/51375fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51375/51375fig1.jpg" /> Figura 1 Quantificazione della neovascolarizzazione corneale. (A) 80 ng bFGF pellet impiantato nel topo C57BL / 6J mostrando lampada a fessura reticolo orientato a misurare la lunghezza della nave. VL = 0,9 mm. (B) stesso occhio mostrando lampada a fessura reticolo ruotato per misurare ora d&#39;orologio. CH = 3.25. Zona della nave calcolata = 1.84 mm 2. Queste immagini sono state digitalmente migliorato per consentire l&#39;aggiunta di schema reticolo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51375/51375fig1highres.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere l&#39;immagine ingrandita.</a> <ol start="5"><li> Calcolare l&#39;area vaso (VA) utilizzando la seguente formula, che si basa sulla superficie di un ovale (nota, è utile tenere questo in mente quando classificazione.) VA espresso in millimetri quadrati. La formula è la seguente: Lunghezza Vessel x Orologio ora x 0,2 π = area Vessel </li></ol>

<ol>
	<li>Gospodarowicz, D., Moran, J., Braun, D., Birdwell, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clonal+growth+of+bovine+vascular+endothelial+cells:+fibroblast+growth+factor+as+a+survival+agent.">Clonal growth of bovine vascular endothelial cells: fibroblast growth factor as a survival agent.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 73, 4120-4124 (1976).</li><li>Glaser, B. M., D'Amore, P. A., Seppa, H., Seppa, S., Schiffmann, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adult+tissues+contain+chemoattractants+for+vascular+endothelial+cells.">Adult tissues contain chemoattractants for vascular endothelial cells.</a> Nature. 288, 483-484 (1980).</li><li>Kubota, Y., Kleinman, H. K., Martin, G. R., Lawley, T. 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K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dose-dependent+response+of+FGF-2+for+lymphangiogenesis.">Dose-dependent response of FGF-2 for lymphangiogenesis.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (32), 11658-11663 (2004).</li><li>Udagawa, T., Birsner, A. E., Wood, M., D'Amato, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chronic+suppression+of+angiogenesis+following+radiation+exposure+is+independent+of+hematopoietic+reconstitution.">Chronic suppression of angiogenesis following radiation exposure is independent of hematopoietic reconstitution.</a> Cancer Res. 67 (5), 2040-2045 (2007).</li><li>Turner, P. V., Albassam, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Susceptibility+of+rats+to+corneal+lesions+after+injectable+anesthesia.">Susceptibility of rats to corneal lesions after injectable anesthesia.</a> Med Comp. 55 (2), 175-182 (2005).</li><li>Calderone, L., Grimes, P., Shalev, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+reversible+cataract+induced+by+xylazine+and+by+ketamine-xylazine+anesthesia+in+rats+and+mice.">Acute reversible cataract induced by xylazine and by ketamine-xylazine anesthesia in rats and mice.</a> Exp. Eye Res. 42, 331-337 (1986).</li></ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ci sono diversi passaggi critici in esecuzione di un test corneale successo. Il primo è fare pellet uniformi in grado di essere impiantati e stimolando i vasi. Le parti più importanti di preparazione pellet sono 1) con fattore di crescita senza vettore; 2) garantire una buona miscela di fattore di crescita con il sucralfato e hydron e 3) spostando la miscela finale rapidamente ma con cura dal tubo eppendorf alla maglia in cui sono espressi i pellet. Si consiglia di pellet &quot;virtuali&quot; essere fatte senza fattor...

Il processo di angiogenesi, la formazione di nuovi vasi sanguigni formano quelle preesistenti, è molto complesso ed è regolato da diversi fattori endogeni che controllano le diverse fasi di germinazione nave e morfogenesi. L&#39;angiogenesi è attivato a causa di un cambiamento di equilibrio tra fattori pro e anti-angiogenici, un equilibrio che mantiene normalmente la vascolarizzazione in stato di quiescenza. Angiogenesi negli adulti si verifica in determinate condizioni fisiologiche, come durante il ciclo ovarico femminile o nei processi di riparazione come la guarigione delle ferite e la rigenerazione dei tessuti. Tuttavia, è anche una caratteristica di molte patologie tra cui tumori, malattie autoimmuni e malattie infiammatorie. Il coinvolgimento di angiogenesi in queste condizioni fisiologiche e patologiche rende un tema importante per la ricerca e un bersaglio attraente per la terapia. A causa della complessità di angiogenesi e il coinvolgimento di vari ceLLS e fattori nel processo, comprese le cellule endoteliali, periciti, cellule circolanti e cellule stromali, in vitro modelli restano limitate e non possono ricapitolare il microambiente unico in vivo. Il principale test in vitro di angiogenesi sono in gran parte concentrati sull&#39;osservazione effetti diretti sulle cellule endoteliali e misurare alcuni passi nel processo angiogenetico in condizioni controllate. Questi test includono la quantificazione della proliferazione delle cellule endoteliali 1, 2 migrazione, formazione rete 3, la formazione del tubo 4 e germinazione da sferoidi 5. Ex vivo i modelli, a differenza di quelli in vitro, sono più complessi e integrare più tipi di cellule dei tessuti, un esempio è il test dell&#39;anello aortico 6. Tuttavia, come altri sistemi, non può catturare il contributo delle cellule circolanti e lo stroma naturale delle cellule endoteliali come esiste in vivo. Tentatividi studiare l&#39;angiogenesi in condizioni di flusso per imitare l&#39;impostazione in vivo vengono eseguite con sistemi microfluidici 7, tuttavia anche questi test, anche se molto migliorata, sono ancora in grado di spiegare tutti i comparti esistenti in vivo. A causa delle limitazioni del ex vivo in modelli angiogenesi in vitro e in vivo modelli rimangono le scelte più affidabili per Studi angiogenesi. Esempi di questi modelli includono l&#39;impianto di camere trasparenti, &quot;finestre&quot;, che consentono la visualizzazione di crescita dei vasi sanguigni sotto il microscopio 8, impianti sottocutanei iniettabili come matrigel e vaso formazione nei tessuti normali come mouse orecchio e la membrana corioallantoidea pollo (CAM ). Tuttavia, uno dei modelli di angiogenesi più accettabili e quantitativi in vivo è il test MICROPOCKET neovascolarizzazione corneale qui descritta, che sfrutta la natura avascolarecornea come &quot;schermo&quot; per visualizzare e valutare la nuova crescita angiogenico 9. Qui si descrive il test MICROPOCKET corneale come sviluppato nei topi. Inizialmente il modello è stato utilizzato per misurare non specifici stimoli angiogenici in cornee di coniglio. Ciò è stato fatto introducendo pezzi tumorali nell&#39;umore acqueo della camera anteriore dell&#39;occhio di coniglio e misurato neoplastica neovascolarizzazione 11. Tuttavia, il test è stato successivamente evoluto per studiare gli effetti di specifici fattori di crescita 10 per specificare e standardizzare l&#39;effetto angiogenico meglio. Al fine di rilasciare il fattore di crescita nell&#39;occhio, pellet lento rilascio contenenti quantità note di fattori di crescita angiogenici sono stati usati al posto dei tessuti. La disponibilità di proteine ​​purificate ricombinanti angiogenici come il bFGF e VEGF attivato il loro uso come obiettivi specifici di modulaters angiogenesi 12. Inizialmente, il test è statoin gran parte utilizzato nei conigli, che sono più facili da lavorare con causa delle loro dimensioni, ma in seguito il modello è stato tradotto in topi; un modello animale più piccolo e meno costoso. Il passaggio da coniglio topi fornito un importante vantaggio di poter utilizzare animali geneticamente manipolati, creando così una nuova area di ricerca sulle componenti genetiche che influenzano l&#39;angiogenesi 13. Oltre all&#39;utilizzo più accettabile di dosaggio cornea nello studio angiogenesi, altri processi biologici possono anche indagati mediante saggi modificati. Ad esempio, gli studi di linfoangiogenesi sono stati resi possibili attraverso l&#39;impianto di pellet a basso dosaggio bFGF che hanno permesso la visualizzazione dei vasi linfatici attraverso marcatori molecolari specifici 14. Inoltre, questo test ha fornito un mezzo per valutare gli effetti delle radiazioni sulla angiogenesi 15. In somma, la corneale test MICROPOCKET angiogenesi è una quantitativa, rappresentanteroducible, la valutazione flessibile di angiogenesi in vivo. Uno dei principali vantaggi di questo test è che la misurazione delle navi di fondo è inutile perché i vasi crescono su un tessuto avascolare naturalmente. Descriviamo qui il protocollo di questo saggio nei dettagli e discutere diversi scenari che possono verificarsi. Il test consiste di 3 segmenti discreti. Qui descriveremo la preparazione di crescita pellet fattore-inclusive, il successivo impianto chirurgico e, infine, il metodo utilizzato per quantificare la crescita neovascolare risultante.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="612">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Section 1: Pellet preparation</td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Sucralfate</td>
			<td style="width:111px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">#S0652</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Hydron (aka Poly(2-Hema))</td>
			<td style="width:111px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">#P3932-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Ethanol</td>
			<td style="width:111px;">Pharmco Products Inc</td>
			<td style="width:119px;">#111000200CSGL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Growth factors:</td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Must be carrier-free (no bovine serum albumin(BSA))</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">&#160;Fibroblast growth factor (FGF)</td>
			<td style="width:111px;">PeproTech</td>
			<td style="width:119px;">#AF-100-18B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Vascular endothelial growth factor (VEGF)</td>
			<td style="width:111px;">R &#38; D Systems</td>
			<td style="width:119px;">#293-VE-050/CF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">35 mm dish</td>
			<td style="width:111px;">Becton-Dickson</td>
			<td style="width:119px;">#353001</td>
			<td>Used for storage of pellets</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">10 cm petri dish</td>
			<td style="width:111px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">#25384-342</td>
			<td>Used as work surface for preparing pellets</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Mesh</td>
			<td style="width:111px;">Sefar America</td>
			<td style="width:119px;">#03--300/51</td>
			<td>300 um nitex nylon, cut into cm square pieces and sterilzed in autoclave</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Spatulas</td>
			<td style="width:111px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">#21-401-10</td>
			<td>Use tapered end of one to break up pellet mixture. Bend tapered end of other to help remove mixture from microcentrifuge tube.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Microcentrifuge tubes</td>
			<td style="width:111px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">#05-408-146</td>
			<td>One for hydron, one for sucralfate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Jewelers forceps, #5</td>
			<td style="width:111px;">Ambler Surgical</td>
			<td style="width:119px;">#2315E</td>
			<td>Need 2 for pulling mesh apart</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Centrifugal evaporator</td>
			<td style="width:111px;">ThermoSavant</td>
			<td style="width:119px;">DNA110 SpeedVac</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;"></td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Section 2: Surgical implantation of pellets</td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Operating microscope</td>
			<td style="width:111px;">Zeiss</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">2.5% Avertin</td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>General anesthetic</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Proparacaine hydrochloride ophthalmic solution 0.5%</td>
			<td style="width:111px;">Falcon</td>
			<td>NDC# 6131401601</td>
			<td>Eye anesthetic</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Triple Antibiotic Ophthalmic Ointment</td>
			<td style="width:111px;">Bausch &#38; Lomb</td>
			<td style="width:119px;">NDC# 2420878055</td>
			<td>Contains neomycin, polymixin and bacitracin</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Ophthalmic microknife, 5 mm</td>
			<td style="width:111px;">Surgistar</td>
			<td style="width:119px;">#924501</td>
			<td>30 degree angle</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">von Graef knife</td>
			<td style="width:111px;">Ambler Surgical</td>
			<td style="width:119px;">#3401E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Jewelers forceps, #1</td>
			<td style="width:111px;">Ambler Surgical</td>
			<td style="width:119px;">#2301E</td>
			<td>Must be blunted with sharpening stone for proptosing eye</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Jewelers forceps, #5</td>
			<td style="width:111px;">Ambler Surgical</td>
			<td style="width:119px;">#2305E</td>
			<td>For picking up pellets and placing on eye</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Small curved scissors</td>
			<td style="width:111px;">Ambler Surgical</td>
			<td style="width:119px;">#5636E</td>
			<td>For trimming whiskers</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Gauze</td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>For blotting eye after proparacaine</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;"></td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Section 3: Grading of Corneal Neovascularization</td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">2.5% Avertin</td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>General anesthetic</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Slit lamp</td>
			<td style="width:111px;">Nikon</td>
			<td style="width:119px;">FS-2</td>
			<td>Needs an ocular with a reticule to assist in measuring</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

the corneal micropocket assay: a model of angiogenesis in the mouse eye

Il mouse corneale MICROPOCKET test è un test robusto e quantitativa in vivo per valutare l&#39;angiogenesi. Utilizzando pellet a lento rilascio standardizzate, contenenti fattori di crescita specifici che innescano la crescita dei vasi sanguigni in tutta la cornea naturalmente avascolare, angiogenesi può essere misurato e quantificato. In questo test la risposta angiogenica è generato nel corso di diversi giorni, a seconda del tipo e della dose di fattore di crescita utilizzato. L&#39;induzione di neovascolarizzazione è comunemente attivata tramite fattore fondamentale di crescita dei fibroblasti (bFGF) o fattore di crescita vascolare endoteliale (VEGF). Combinando questi fattori di crescita con sucralfato e hydron (poly-HEMA (poli (metacrilato di 2-idrossietil))) e colare il composto in pellet, possono essere impiantati chirurgicamente nell&#39;occhio topo. Questi pellet uniformi lentamente rilasciano i fattori di crescita nell&#39;arco di cinque o sei giorni (bFGF o VEGF, rispettivamente) consentendo risposta angiogenica sufficiente richiesta per zona nave quantification utilizzando una lampada a fessura. Questo test può essere utilizzato per diverse applicazioni, tra cui la valutazione dei farmaci modulatori angiogenici o trattamenti così come il confronto tra diversi background genetici che influenzano l&#39;angiogenesi. Un investigatore esperto dopo aver praticato questo test può impiantare una pallina in meno di 5 minuti per occhio.

Risultati tipici per bFGF e VEGF pellet nelle normali basse angiogenici C57BL / 6J sono mostrati in Figura 2A e B, rispettivamente. Figura 2E mostra la distribuzione normale di zona della nave (VA) nel C57BL / ceppo 6J con diverse dosi di questi crescita fattori. 80 ng pellet bFGF normalmente producono un VA di circa 2,0 mm 2, se i valori in un intervallo di 1,8-2,4 mm 2 sono accettabili. 200 ng pellet VEGF in genere causano una risposta di circa 0...

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The Corneal Micropocket Assay: A Model of Angiogenesis in the Mouse Eye

Il protocollo descrive il dosaggio micropocket corneale come sviluppato nei topi.

Il corneale MICROPOCKET Assay: Un modello di angiogenesi nel Eye mouse

The mouse corneal micropocket assay is a robust and quantitative in vivo assay for evaluating angiogenesis. By using standardized slow-release pellets ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

16.6K Views.  Boston Children's Hospital.  Il protocollo descrive il dosaggio micropocket corneale come sviluppato nei topi. 

Video: The Corneal Micropocket Assay: A Model of Angiogenesis in the Mouse Eye

Isolation and Expansion of the Adult Mouse Neural Stem Cells Using the Neurosphere Assay

Isolation and expansion of the putative neural stem cells (NSCs) from the adult murine brain was first described by Reynolds and Weiss in 1992 employing a chemically defined serum-free culture system known as the neurosphere assay (NSA). In this assay, the majority of differentiated cell types die within a few days of culture but a small population of growth factor responsive precursor cells undergo active proliferation in the presence of epidermal growth factor (EGF) and/ basic fibroblastic growth factor (bFGF). These cells form colonies of undifferentiated cells called neurospheres, which in turn can be subcultured to expand the pool of neural stem cells. Moreover, the cells can be induced to differentiate, generating the three major cell types of the CNS i.e. neurons, astrocytes, and oligodendrocytes. This assay provides an invaluable tool to supply a consistent, renewable source of undifferentiated CNS precursors, which could be used for in vitro studies and also for therapeutic purposes.
This video demonstrates the NSA method to generate and expand NSCs from the adult mouse periventricular region, and provides technical insights to ensure one can achieve reproducible neurosphere cultures. The procedure includes harvesting the brain from the adult mouse, micro-dissection of the periventricular region, tissue preparation and culture in the NSA. The harvested tissue is first chemically digested using trypsin-EDTA and then mechanically dissociated in NSC medium to achieve a single cell suspension and finally plated in the NSA. After 7-10 days in culture, the resulting primary neurospheres are ready for subculture to reach the amount of cells required for future experiments.

This video protocol demonstrates the neurosphere assay method to generate and expand neural stem cells from the adult mouse periventricular region, and provides technical insights to ensure one can achieve reproducible neurosphere cultures.

Isolamento ed espansione della cellule staminali neurali del mouse utilizzando il saggio neurosfere

Isolation and expansion of the putative neural stem cells (NSCs) from the adult murine brain was first described by Reynolds and Weiss in 1992 employing a ...

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Neuroscienze

Establishing Embryonic Mouse Neural Stem Cell Culture Using the Neurosphere Assay

In mammalians, stem cells acts as a source of undifferentiated cells to maintain cell genesis and renewal in different tissues and organs during the life span of the animal. They can potentially replace cells that are lost in the aging process or in the process of injury and disease. The existence of neural stem cells (NSCs) was first described by Reynolds and Weiss (1992) in the adult mammalian central nervous system (CNS) using a novel serum&#8208;free culture system, the neurosphere assay (NSA). Using this assay, it is also feasible to isolate and expand NSCs from different regions of the embryonic CNS. These in vitro expanded NSCs are multipotent and can give rise to the three major cell types of the CNS. While the NSA seems relatively simple to perform, attention to the procedures demonstrated here is required in order to achieve reliable and consistent results. This video practically demonstrates NSA to generate and expand NSCs from embryonic day 14-mouse brain tissue and provides technical details so one can achieve reproducible neurosphere cultures. The procedure includes harvesting E14 mouse embryos, brain microdissection to harvest the ganglionic eminences, dissociation of the harvested tissue in NSC medium to gain a single cell suspension, and finally plating cells in NSA culture. After 5-7 days in culture, the resulting primary neurospheres are passaged to further expand the number of the NSCs for future experiments.

This video protocol demonstrates the application of the neurosphere assay for the isolation and expansion of neural stem cells from the ganglionic eminences of embryonic day 14-mouse brain.

Stabilire embrionali di topo Neural Stem Cell Culture del saggio di neurosfere

In mammalians, stem cells acts as a source of undifferentiated cells to maintain cell genesis and renewal in different tissues and organs during the life ...

Dissection of a Mouse Eye for a Whole Mount of the Retinal Pigment Epithelium

The retinal pigment epithelium (RPE) lies at the back of the mammalian eye, just under the neural retina, which contains the photoreceptors (rods and cones). The RPE is a monolayer of pigmented cuboidal cells and associates closely with the neural retina just above it. This association makes the RPE of great interest to researchers studying retinal diseases. The RPE is also the site of an in vivo assay of homology-directed DNA repair, the pun assay. The mouse eye is particularly difficult to dissect due to its small size (about 3.5mm in diameter) and its spherical shape. This article demonstrates in detail a procedure for dissection of the eye resulting in a whole mount of the RPE. In this procedure, we show how to work with, rather than against, the spherical structure of the eye. Briefly, the connective tissue, muscle, and optic nerve are removed from the back of the eye. Then, the cornea and lens are removed. Next, strategic cuts are made that result in significant flattening of the remaining tissue. Finally, the neural retina is gently lifted off, revealing an intact RPE, which is still attached to the underlying choroid and sclera. This whole mount can be used to perform the pun assay or for immunohistochemistry or immunofluorescent assessment of the RPE tissue.

A formal demonstration of the dissection of a mouse eye, resulting in a whole mount of the retinal pigment epithelium.

Dissezione di un occhio mouse per un monte intero di dell&#39;epitelio pigmentato retinico

The retinal pigment epithelium (RPE) lies at the back of the mammalian eye, just under the neural retina, which contains the photoreceptors (rods and ...

An Optic Nerve Crush Injury Murine Model to Study Retinal Ganglion Cell Survival

Injury to the optic nerve can lead to axonal degeneration, followed by a gradual death of retinal ganglion cells (RGCs), which results in irreversible vision loss. Examples of such diseases in human include traumatic optic neuropathy and optic nerve degeneration in glaucoma. It is characterized by typical changes in the optic nerve head, progressive optic nerve degeneration, and loss of retinal ganglion cells, if uncontrolled, leading to vision loss and blindness.
The optic nerve crush (ONC) injury mouse model is an important experimental disease model for traumatic optic neuropathy, glaucoma, etc. In this model, the crush injury to the optic nerve leads to gradual retinal ganglion cells apoptosis. This disease model can be used to study the general processes and mechanisms of neuronal death and survival, which is essential for the development of therapeutic measures. In addition, pharmacological and molecular approaches can be used in this model to identify and test potential therapeutic reagents to treat different types of optic neuropathy.
Here, we provide a step by step demonstration of (I) Baseline retrograde labeling of retinal ganglion cells (RGCs) at day 1, (II) Optic nerve crush injury at day 4, (III) Harvest the retinae and analyze RGC survival at day 11, and (IV) Representative result.

This protocol shows how to retrogradely label retinal ganglion cells, and how to subsequently make an optic nerve crush injury in order to analyze retinal ganglion cell survival and apoptosis. It is an experimental disease model for different types of optic neuropathy, including glaucoma.

Una lesione del nervo ottico Modello Crush murini per studiare la sopravvivenza delle cellule gangliari della retina

Injury to the optic nerve can lead to axonal degeneration, followed by a gradual death of retinal ganglion cells (RGCs), which results in irreversible ...

Detection of Neuritic Plaques in Alzheimer's Disease Mouse Model

Alzheimer's disease (AD) is the most common neurodegenerative disorder leading to dementia. Neuritic plaque formation is one of the pathological hallmarks of Alzheimer's disease. The central component of neuritic plaques is a small filamentous protein called amyloid &beta; protein (A&beta;)1, which is derived from sequential proteolytic cleavage of the beta-amyloid precursor protein (APP) by &beta;-secretase and &gamma;-secretase. The amyloid hypothesis entails that A&gamma;-containing plaques as the underlying toxic mechanism in AD pathology2. The postmortem analysis of the presence of neuritic plaque confirms the diagnosis of AD. To further our understanding of A&gamma; neurobiology in AD pathogenesis, various mouse strains expressing AD-related mutations in the human APP genes were generated. Depending on the severity of the disease, these mice will develop neuritic plaques at different ages. These mice serve as invaluable tools for studying the pathogenesis and drug development that could affect the APP processing pathway and neuritic plaque formation. In this protocol, we employ an immunohistochemical method for specific detection of neuritic plaques in AD model mice. We will specifically discuss the preparation from extracting the half brain, paraformaldehyde fixation, cryosectioning, and two methods to detect neurotic plaques in AD transgenic mice: immunohistochemical detection using the ABC and DAB method and fluorescent detection using thiofalvin S staining method.

Detection of Neuritic Plaques in Alzheimer&#039;s Disease Mouse Model

One of the pathological characteristics of AD is the formation of Amyloid &#x03B2; protein positive neuritic plaques. In this protocol we describe two methods to detect neuritic plaques in transgenic AD model mice: immunohistochemical detection using the ABC and DAB method and fluorescent detection using thioflavin S staining method.

Rilevazione di placche neuritiche nel modello di malattia di Alzheimer mouse

Alzheimer's disease (AD) is the most common neurodegenerative disorder leading to dementia. Neuritic plaque formation is one of the pathological hallmarks ...

Whole Mount Immunofluorescent Staining of the Neonatal Mouse Retina to Investigate Angiogenesis In vivo

Angiogenesis is the complex process of new blood vessel formation defined by the sprouting of new blood vessels from a pre-existing vessel network. Angiogenesis plays a key role not only in normal development of organs and tissues, but also in many diseases in which blood vessel formation is dysregulated, such as cancer, blindness and ischemic diseases. In adult life, blood vessels are generally quiescent so angiogenesis is an important target for novel drug development to try and regulate new vessel formation specifically in disease. In order to better understand angiogenesis and to develop appropriate strategies to regulate it, models are required that accurately reflect the different biological steps that are involved. The mouse neonatal retina provides an excellent model of angiogenesis because arteries, veins and capillaries develop to form a vascular plexus during the first week after birth. This model also has the advantage of having a two-dimensional (2D) structure making analysis straightforward compared with the complex 3D anatomy of other vascular networks. By analyzing the retinal vascular plexus at different times after birth, it is possible to observe the various stages of angiogenesis under the microscope. This article demonstrates a straightforward procedure for analyzing the vasculature of a mouse retina using fluorescent staining with isolectin and vascular specific antibodies.

Whole Mount Immunofluorescent Staining of the Neonatal Mouse Retina to Investigate Angiogenesis In vivo

The neonatal murine retina provides a well characterized physiological model of angiogenesis, which permits investigations of the roles of different genes or drugs that modulate angiogenesis in an in vivo context. Immunofluorescent staining to accurately visualize the vascular plexus is pivotal to the success of these types of studies.

Tutta Monte immunofluorescenza del mouse Retina neonatale per Indagare Angiogenesi<em&gt; In vivo</em

Angiogenesis  is the complex process of new blood vessel formation defined by the sprouting  of new blood vessels from a pre-existing vessel network. ...

Isolation and Culture of Endothelial Cells from the Embryonic Forebrain

Embryonic brain endothelial cells can serve as an important tool in the study of angiogenesis and neurovascular development and interactions. The two vascular networks of the embryonic forebrain, pial and periventricular, are spatially distinctive and have different origins and growth patterns. Endothelial cells from the pial and periventricular vascular networks have unique gene expression profiles and functions. Here we present a step-by-step protocol for isolation, culture, and verification of pure populations of endothelial cells from the periventricular vascular network (PVECs) of the embryonic forebrain (telencephalon). In this approach, telencephalon devoid of pial membrane obtained from embryonic day 15 mice is minced, digested with collagenase/dispase, and dispersed mechanically into a single cell suspension. PVECs are purified from cell suspension using positive selection with anti-CD-31/PECAM-1 antibody conjugated to MicroBeads using a strong magnetic separation method. Purified cells are cultured on collagen 1&#160;coated culture dishes in endothelial cell culture medium until they become confluent and further subcultured. PVECs obtained with this protocol exhibit cobblestone and spindle shaped phenotypes, as visualized by phase-contrast light microscopy and fluorescence microscopy. Purity of PVEC cultures was established with endothelial cell markers. In our hands, this method reliably and consistently yields pure populations of PVECs. This protocol will benefit studies aimed at gaining mechanistic insights into forebrain angiogenesis, understanding PVEC interactions, and cross-talks with neuronal cell types and holds tremendous potential for therapeutic angiogenesis.

This video demonstrates an easy and reliable strategy for preparation of pure cultures of endothelial cells from the embryonic forebrain within 10-12 days and will be useful for research focused on many aspects of cerebral angiogenesis.

Isolamento e coltura di cellule endoteliali dal embrionali Forebrain

Embryonic brain endothelial cells can serve as an important tool in the study of angiogenesis and neurovascular development and interactions. The two ...

A Simple Behavioral Assay for Testing Visual Function in Xenopus laevis

Measurement of the visual function in the tadpoles of the frog, Xenopus laevis, allows screening for blindness in live animals. The optokinetic response is a vision-based, reflexive behavior that has been observed in all vertebrates tested. Tadpole eyes are small so the tail flip response was used as alternative measure, which requires a trained technician to record the subtle response. We developed an alternative behavior assay based on the fact that tadpoles prefer to swim on the white side of a tank when placed in a tank with both black and white sides. The assay presented here is an inexpensive, simple alternative that creates a response that is easily measured. The setup consists of a tripod, webcam and nested testing tanks, readily available in most Xenopus laboratories. This article includes a movie showing the behavior of tadpoles, before and after severing the optic nerve. In order to test the function of one eye, we also include representative results of a tadpole in which each eye underwent retinal axotomy on consecutive days. Future studies could develop an automated version of this assay for testing the vision of many tadpoles at once.

A Simple Behavioral Assay for Testing Visual Function in Xenopus laevis

Xenopus laevis tadpoles prefer swimming on the white side of a black/white tank. This behavior is guided by their vision. Based on this behavior, we present a simple assay to test the visual function of tadpoles.

Un test comportamentale semplice for Testing Funzione visiva in<em&gt; Xenopus laevis</em

Measurement of the visual function in the tadpoles of the frog, Xenopus laevis, allows screening for blindness in live animals. The optokinetic response ...

Telomerase Activity in the Various Regions of Mouse Brain: Non-Radioactive Telomerase Repeat Amplification Protocol (TRAP) Assay

Telomerase, a ribonucleoprotein, is responsible for maintaining the telomere length and therefore promoting genomic integrity, proliferation, and lifespan. In addition, telomerase protects the mitochondria from oxidative stress and confers resistance to apoptosis, suggesting its possible importance for the surviving of non-mitotic, highly active cells such as neurons. We previously demonstrated the ability of novel telomerase activators to increase telomerase activity and expression in the various mouse brain regions and to protect motor neurons cells from oxidative stress. These results strengthen the notion that telomerase is involved in the protection of neurons from various lesions. To underline the role of telomerase in the brain, we here compare the activity of telomerase in male and female mouse brain and its dependence on age. TRAP assay is a standard method for detecting telomerase activity in various tissues or cell lines. Here we demonstrate the analysis of telomerase activity in three regions of the mouse brain by non-denaturing protein extraction using CHAPS lysis buffer followed by modification of the standard TRAP assay.
In this 2-step assay, endogenous telomerase elongates a specific telomerase substrate (TS primer) by adding TTAGGG 6 bp repeats (telomerase reaction). The telomerase reaction products are amplified by PCR reaction creating a DNA ladder of 6 bp increments. The analysis of the DNA ladder is made by 4.5% high resolution agarose gel electrophoresis followed by staining with highly sensitive nucleic acid stain.
Compared to the traditional TRAP assay that utilize 32P labeled radioactive dCTP&#39;s for DNA detection and polyacrylamide gel electrophoresis for resolving the DNA ladder, this protocol offers a non-toxic time saving TRAP assay for evaluating telomerase activity in the mouse brain, demonstrating the ability to detect differences in telomerase activity in the various female and male mouse brain region.

Telomerase Activity in the Various Regions of Mouse Brain: Non-Radioactive Telomerase Repeat Amplification Protocol TRAP Assay

Telomerase is expressed in the neonatal brain and also in distinct regions of the adult brain. We present a non-toxic time saving TRAP assay for the analysis of telomerase activity in various regions of the mouse brain and detection of differences in telomerase activity between male and female mouse brains.

La telomerasi attività nelle varie regioni del cervello di topo: telomerasi non radioattivo Repeat Amplification Protocol (TRAP) Assay

Telomerase, a ribonucleoprotein, is responsible for maintaining the telomere length and therefore promoting genomic integrity, proliferation, and ...

A Volumetric Method for Quantification of Cerebral Vasospasm in a Murine Model of Subarachnoid Hemorrhage

Subarachnoid hemorrhage (SAH) is a subtype of hemorrhagic stroke. Cerebral vasospasm that occurs in the aftermath of the bleeding is an important factor determining patient outcome and is therefore frequently taken as a study endpoint. However, in small animal studies on SAH, quantification of cerebral vasospasm is a major challenge. Here, an ex vivo method is presented that allows quantification of volumes of entire vessel segments, which can be used as an objective measure to quantify cerebral vasospasm. In a first step, endovascular casting of the cerebral vasculature is performed using a radiopaque casting agent. Then, cross-sectional imaging data are acquired by micro computed tomography. The final step involves 3-dimensional reconstruction of the virtual vascular tree, followed by an algorithm to calculate center lines and volumes of the selected vessel segments. The method resulted in a highly accurate virtual reconstruction of the cerebrovascular tree shown by a diameter-based comparison of anatomical samples with their virtual reconstructions. Compared with vessel diameters alone, the vessel volumes highlight the differences between vasospastic and non-vasospastic vessels shown in a series of SAH and sham-operated mice.

The goal of this article is to present a method that allows a 3-dimensional reconstruction of the cerebrovascular tree in mice after micro computed tomography and determination of volumes of entire vessel segments that can be used to quantify cerebral vasospasm in murine models of subarachnoid hemorrhage.

Un metodo volumetrico per la quantificazione di Vasospasm cerebrale in un modello murino di emorragia subaracnoidea

Subarachnoid hemorrhage (SAH) is a subtype of hemorrhagic stroke. Cerebral vasospasm that occurs in the aftermath of the bleeding is an important factor ...