Questo lavoro è stato supportato da una Investigator Award Burroughs Wellcome a YM e da un Brown-Coxe borsa post-dottorato presso la Yale University a MD.

Materiali: <ul><li> Campione di proteine ​​- lisozima (50 mg / ml) </li><li> Hanging goccia 24-ben vassoio </li><li> Seduto goccia 24-ben vassoio </li><li> Microbatch cristallizzazione 96 vassoio bene </li><li> Soluzioni di cristallizzazione (sia commerciale disponibile o fatti in casa) </li><li> Silicon grasso </li><li> Siringa da 5 ml senza Luer-Lock </li><li> Diapositive copertura siliconato </li><li> Nastro di tenuta ottico </li><li> Paraffina </li><li> 0,1-2 micropipetta microlitri con bassa ritenzione suggerimenti </li><li> Pinzetta </li><li> Salviette professionale </li></ul> 1. Hanging / seduta procedura Drop: <ol><li> Per una schermata iniziale si può usare schermi disponibili in commercio che sfruttano il metodo sparse incompleta matrice fattoriale delle condizioni di prova. Il metodo sparse matrice incompleta fattoriale è distorto da e selezionati da condizioni di cristallizzazione noto per macromolecole (Carter e Carter, 1979; Cudney et al, 1994;. Jancarik e Kim, 1991;. Jancarik et al, 1991). Se la condizione cristallizzazione è già noto, un sottile schermo può essere montato, variando la concentrazione precipitante e il pH intorno al colpo originale. Il precipitante più comunemente successo è polietilene glicole (PEG), seguito da solfato di ammonio. Insieme, questi due fattori precipitanti per conto di circa il 60% di tutti i fattori precipitanti macromolecolari registrato utilizzato per la cristallizzazione (Gilliland et al, 1994;. Kimber et al, 2003;.. Page et al, 2003). </li><li> Preparare le soluzioni di cristallizzazione. Di solito queste condizioni sono combinate da un agente precipitante, sale di qualche tipo e un buffer per impostare il pH. In alcuni casi gli additivi possono essere aggiunti specificatamente per la proteina di interesse. Tutti soluzione di riserva deve essere filtrata con filtro 0,22 micron. Alcuni della soluzione di riserva potrebbe essere molto viscoso (50% PEG, glicerolo, PEG-MME, ecc.) <ul><li> Preparare 1,5 mL di 0,6, 0,8, 1.0, 1.2, 1.4, 1.6 M NaCl ognuno a 0,1 M NaOAc pH 4.0, 4.3, 4.6 e 4.9 (totale di 24 soluzioni) </li></ul></li><li> Scongelare il campione di proteine ​​e tenere in ghiaccio. Scorte di proteine ​​deve essere conservato a -80 ° C, purché la proteina di interesse è sensibile a cicli di gelo / disgelo (in tal caso, conservare a 4 ° C). Concentrazioni di proteine ​​tipiche sono nel range di 5-50 mg / ml, con concentrazioni più elevate di solito dà risultati migliori. </li><li> Spin il campione 15min/18, 000xg / 4 ° C - alcune proteine ​​tendono ad aggregare e precipitare in parte dopo un passo disgelo. Questi aggregati possono promuovere precipitazione amorfo del resto delle molecole proteiche, pertanto rotazione completa in basso vi assicurerà solo le molecole solubili nel campione. Tenere proteine ​​in ghiaccio fino configurazione del vassoio. </li><li> Determinare la concentrazione di proteine ​​dalla sua assorbanza a 280 nm usando uno spettrofotometro UV. La concentrazione delle proteine ​​può essere calcolato dalla lettura di assorbanza e coefficiente di estinzione della proteina. Il coefficiente di estinzione può essere calcolato con lo strumento ProtParam ExPASy sul sito: <a href="http://ca.expasy.org/tools/protparam.html">http://ca.expasy.org/tools/protparam.html</a> </li><li> Riempire i pozzi del 24-ben appeso / seduto vassoio goccia con 500 ml di soluzione precipitante secondo lo schema di impostazione vassoio (Figura 2B). Creare un anello di grasso al silicone intorno al bordo del pozzo. L&#39;anello dovrebbe avere un piccolo spazio per evitare l&#39;accumulo di pressione dell&#39;aria, come il pozzo è sigillato. In gocce seduta, non c&#39;è bisogno di grasso in quanto il bene è sigillato con nastro (Figura 2A). </li><li> Prendere un vetrino coperchio e pulirlo con un getto d&#39;aria condensata, o un professionista pulire - la polvere evitando faciliterà l&#39;interpretazione della caduta di cristallizzazione ed eliminare contaminazioni. Per la seduta gocce, far scivolare il coperchio non vengono utilizzati. Invece, il bene contiene una mensola su cui si mescolano le proteine ​​e precipitante. </li><li> Mettere volumi uguali di campione proteine ​​e soluzione serbatoio sul vetrino di copertura. Volumi diversi di proteine ​​e precipitante può essere giudicato come parte del processo di ottimizzazione. L&#39;utilizzo di più proteine ​​di risultati precipitante in una netta concentrazione della proteina in calo dopo equilibrazione, che può essere auspicabile per diluire campioni di proteine, e di rallentare nucleazione cristallo o di crescita. Qualsiasi altra sostanza non volatili nella soluzione calo anche essere concentrati per lo stesso fattore. Quando la proteina pipettaggio e soluzioni serbatoio sul vetrino di copertura, essere estremamente attenti ad evitare la formazione di bolle. Ciò si verifica spesso quando l&#39;aria è soffiata fuori della pipetta. <ul><li> Hanging goccia: Carico 2 ml di 50 mg / ml di lisozima a pH 0,02 M NaOAc 4,9 al centro della diapositiva coperchio e aggiungere a questa 2 microlitri della soluzione del serbatoio. </li><li> Seduto goccia: Carico 2 ml di 50 mg / ml soluzione di lisozima al centro del ripiano e aggiungere it 2 ml di soluzione di riserva. </li></ul></li><li> Capovolgere il vetrino di copertura e adagiarla delicatamente verso il basso l&#39;anello di grasso sulla parte superiore del pozzo. Premere delicatamente in modo che l&#39;aria possa sfuggire al bene attraverso la tacca nel grasso di prcaso l&#39;accumulo di pressione nel pozzo e mantenere il ben chiusi. L&#39;accumulo di pressione dell&#39;aria nel pozzo può aumentare il vetrino di copertura, compromettendo la tenuta bene. Nel metodo goccia seduta, otticamente chiaro nastro trasparente viene utilizzato per coprire i pozzi. Quindi, in questo metodo di tenuta si svolgeranno ogni riga / colonna. </li><li> Passare al successivo e fino cassetto è completo. </li><li> Controllare il vassoio al momento della configurazione - eliminando le particelle di polvere e altre contaminazioni in grado di ridurre l&#39;identificazione falsi positivi dei cristalli proteici. </li><li> Utilizzare un foglio di punteggio per documentare l&#39;esperimento. </li><li> Posizionare il vassoio alla temperatura di incubazione desiderata, generalmente tra i 4 ° C e temperatura ambiente. 20 ° C è più comunemente successo. Fare attenzione a maneggiare il vassoio con delicatezza ed evitare qualsiasi agitazione. Prestare attenzione durante l&#39;apertura e la chiusura della porta dell&#39;incubatore. Vibrazioni o variazioni di temperatura durante il trasferimento o l&#39;incubazione, può impedire la crescita dei cristalli o incidere negativamente sulla qualità di cristallo. Una scossa materiale assorbente (ad esempio: imballaggio schiuma) possono essere utilizzati come imbottiture sotto i vassoi di cristallo. </li><li> Controllare il vassoio per cristalli il giorno successivo, e poi ogni pochi giorni, sempre la movimentazione dei vassoi con cura. Documento tutte le risultanze e morfologie goccia in un foglio specifico punteggio vassoio. Cristalli di solito prendono 2-5 giorni a comparire, anche se a volte i cristalli appaiono molto prima (quasi immediatamente) o versione successiva (fino a diversi mesi!). Una volta che le condizioni di cristallizzazione sono stati identificati e il tasso di crescita dei cristalli è noto, è meglio lasciare i vassoi indisturbato fino a quando i cristalli sono apparsi e cresciuto ad almeno la metà della loro dimensione finale. Lasciando indisturbati i vassoi in grado di ridurre il numero di eventi di nucleazione cristallo, producendo quindi un numero inferiore di grandi cristalli. </li></ol> 2. Microbatch procedura: <ol><li> Campione di proteine ​​e la preparazione sono precipitanti come descritto sopra. </li><li> Air spruzzare un vassoio microbatch nuovo per evitare la polvere e altre particelle di grandi dimensioni. </li><li> Nella barra delle applicazioni microbatch, riempire l&#39;olio di paraffina fino a 3 mm di altezza (quanto basta per coprire i pozzi). Rimuovere l&#39;accesso del petrolio. </li><li> Carico di 1 ml di soluzione proteica (50 mg / mL lisozima) nell&#39;olio pre-riempita bene - assicurarsi di pipetta la soluzione direttamente al fondo del pozzo (Figura 2A). </li><li> Carico di 1 ml di soluzione precipitante nel pozzo secondo lo schema di impostazione vassoio (Figura 2B) - assicurarsi che la goccia scende sul fondo del pozzo e si fonde con la goccia proteine. </li><li> Passare al successivo e fino cassetto è completo. </li><li> Seguire i passi 11-14 del pensile / seduto procedura goccia. </li></ol> 3. Rappresentante dei risultati: Cristallizzazione è generalmente indicato come il collo di bottiglia della cristallografia a raggi X. Un sparse schermo a matrice incompleta fattoriale delle condizioni precipitanti produce tipicamente diversi tipi di aggregazione delle proteine ​​e delle precipitazioni, tra i quali grandi cristalli singoli. Se la proteina o precipitante concentrazioni troppo elevate si può vedere la materia marrone senza forma e dimensioni diverse (precipitazioni amorfo). Quando la soluzione è sottosaturato, il calo sarà spesso del tutto chiaro e privo di qualsiasi tipo di precipitazione. La Figura 3 mostra alcuni esempi di fenomeni di precipitazione e cristalli (Dessau et al., 2006). Fenomeni di precipitazione di più con l&#39;interpretazione più dettagliate sono disponibili all&#39;indirizzo <a href="http://xray.bmc.uu.se/terese/tutorials.html">http://xray.bmc.uu.se/terese/tutorials.html</a> . <img src="/files/ftp_upload/2285/2285fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. Il principio di cristallizzazione delle proteine. Il principio di cristallizzazione delle proteine. In un esperimento di diffusione del vapore (A) volumi uguali di precipitante e proteine ​​sono presenti nel menu. L&#39;acqua si diffonderà fuori e sia il precipitante e la concentrazione delle proteine ​​sarà raddoppiata fino a quando l&#39;equilibrio è raggiunto tra la caduta e la soluzione serbatoio. In cristallizzazione batch (B) la concentrazione di proteine ​​e precipitante non cambiano durante l&#39;esperimento. Punto A - Proteine ​​soggiorni sottosaturato non cristalli si possono formare, punto B - nucleazione proteine ​​si verifica, cristalli iniziò a formarsi e la concentrazione di proteine ​​in soluzione scende a saturazione. Punto C - proteina precipita, ma i cristalli può ancora crescere. (C) cristallizzazione dialisi utilizzando un gel inserito capillare. Di cristalli come il sale diffonde fuori il campione (e / o diffonde precipitante nel campione di proteine) attraverso la spina gel. <img src="/files/ftp_upload/2285/2285fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2. Schema di esperimenti tipici cristallizzazione delle proteine. (A) Le procedure per la sospensione goccia diffusione del vapore, seduto goccia diffusione del vapore, e la cristallizzazione delle proteine ​​microbatch. In ogni caso, un piccolo volume di campione di proteine ​​concentrate viene mescolato con un volume uguale o minore di precipitant soluzione e lasciato equilibrare. (B) Per la cristallizzazione di pollo lisozima, un 24-ben vassoio è impostato con varie concentrazioni di cloruro di sodio (il precipitante) e con 0,1 M di acetato di sodio, come il buffer a pH diversi (4,0-4,9). <img src="/files/ftp_upload/2285/2285fig3.jpg" alt="Figura 3" /> Figura 3. Risultati tipici di un esperimento di cristallizzazione delle proteine. (A) precipitazione amorfo. Quando le proteine ​​o precipitanti (o entrambi) sono in alta concentrazione. (B) separazione di fase. Proteine ​​o di detersivo può separare ad una fase diversa quando mescolato con alcuni fattori precipitanti ad alta concentrazione. (C) i cristalli proteici Rod a forma di AtCSN7 ottenuto in polietilene glicole 8000 e acetato di magnesio (Dessau et al., 2006). (D) cristalli di lisozima ottenuto in 1,0 M di NaCl e sodio acetato pH 4.9. (E) In gocce saturi di solito rimangono chiare. Fotografia di Moshe Dessau.

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	<li>Bergfors, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Protein crystallization : techniques, strategies, and tips : a laboratory manual. , (1999).</li><li>Carter, C. W., Carter, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+crystallization+using+incomplete+factorial+experiments.">Protein crystallization using incomplete factorial experiments.</a> J Biol Chem. 254, 12219-12223 (1979).</li><li>Cudney, R., Patel, S., Weisgraber, K., Newhouse, Y., McPherson, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Screening+and+optimization+strategies+for+macromolecular+crystal+growth.">Screening and optimization strategies for macromolecular crystal growth.</a> Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 50, 414-423 (1994).</li><li>Dessau, M., Chamovitz, D. A., Hirsch, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression,+purification+and+crystallization+of+a+PCI+domain+from+the+COP9+signalosome+subunit+7+(CSN7).">Expression, purification and crystallization of a PCI domain from the COP9 signalosome subunit 7 (CSN7).</a> Acta Crystallogr Sect F Struct Biol Cryst Commun. 62, 1138-1140 (2006).</li><li>Gilliland, G. L., Tung, M., Blakeslee, D. M., Ladner, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biological+Macromolecule+Crystallization+Database,+Version+3.0:+new+features,+data+and+the+NASA+archive+for+protein+crystal+growth+data.">Biological Macromolecule Crystallization Database, Version 3.0: new features, data and the NASA archive for protein crystal growth data.</a> Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 50, 408-413 (1994).</li><li>Jancarik, J., Kim, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sparse+matrix+sampling:+a+screening+method+for+crystallization+of+proteins.">Sparse matrix sampling: a screening method for crystallization of proteins.</a> J Appl Cryst. 23, 409-411 (1991).</li><li>Jancarik, J., Scott, W. G., Milligan, D. L., Koshland, D. E., Kim, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystallization+and+preliminary+X-ray+diffraction+study+of+the+ligand-binding+domain+of+the+bacterial+chemotaxis-mediating+aspartate+receptor+of+Salmonella+typhimurium.">Crystallization and preliminary X-ray diffraction study of the ligand-binding domain of the bacterial chemotaxis-mediating aspartate receptor of Salmonella typhimurium.</a> J Mol Biol. 221, 31-34 (1991).</li><li>Kimber, M. S., Vallee, F., Houston, S., Necakov, A., Skarina, T., Evdokimova, E., Beasley, S., Christendat, D., Savchenko, A., Arrowsmith, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Data+mining+crystallization+databases:+knowledge-based+approaches+to+optimize+protein+crystal+screens.">Data mining crystallization databases: knowledge-based approaches to optimize protein crystal screens.</a> Proteins. 51, 562-568 (2003).</li><li>Lorber, B., Sauter, C., Theobald-Dietrich, A., Moreno, A., Schellenberger, P., Robert, M. C., Capelle, B., Sanglier, S., Potier, N., Giege, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+growth+of+proteins,+nucleic+acids,+and+viruses+in+gels.">Crystal growth of proteins, nucleic acids, and viruses in gels.</a> Prog Biophys Mol Biol. 101, 13-25 (2009).</li><li>McPherson, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Crystallization of biological macromolecules. , (1999).</li><li>McPherson, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Introduction+to+protein+crystallization.">Introduction to protein crystallization.</a> Methods. 34, 254-265 (2004).</li><li>Page, R., Grzechnik, S. K., Canaves, J. M., Spraggon, G., Kreusch, A., Kuhn, P., Stevens, R. C., Lesley, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shotgun+crystallization+strategy+for+structural+genomics:+an+optimized+two-tiered+crystallization+screen+against+the+Thermotoga+maritima+proteome.">Shotgun crystallization strategy for structural genomics: an optimized two-tiered crystallization screen against the Thermotoga maritima proteome.</a> Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 59, 1028-1037 (2003).</li></ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

In questo articolo descrivere e dimostrare generali attuali protocolli per la cristallizzazione della proteina. Dal momento che un multi-step procedura ci sono alcune considerazioni bisogna essere a conoscenza. Quando si lavora con volumi molto piccoli (0,5-2 mL), essiccazione della caduta a causa dell&#39;evaporazione è una preoccupazione importante. Pertanto, si raccomanda di lavorare in un ambiente ben controllato (con flusso aria bassa, alta umidità e controllo della temperatura stretto) e di adottare una tecnica ...

<table border="1">
		<tbody>
<tr>
<td>New Item</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Lysozyme</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-aldrich</td>
<td>L6876-1G</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>24 well VDX Plate</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Hampton research</td>
<td>HR3-142</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>24 well Cryschem Plate</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Hampton research</td>
<td>HR3-158</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Dow Corning Vacuum Grease</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Hampton research</td>
<td>HR3-510</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Siliconized glass circle coverslides</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Hampton research</td>
<td>HR3-231</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>100% paraffin oil</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Hampton research</td>
<td>HR3-411</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>1.88 inch wide Crystal Clear Sealing Tape</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Hampton research</td>
<td>HR3-511</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>96 Well Imp@ct Plate (Microbatch plate)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Hampton research</td>
<td>HR3-098</td>
<td>&nbsp;</td>	</tr>	</tbody>
		</table>

protein crystallization for x-ray crystallography

Utilizzando la struttura tridimensionale delle macromolecole biologiche di dedurre il loro funzionamento è uno dei più importanti campi della biologia moderna. La disponibilità di strutture risoluzione atomica fornisce una comprensione profonda e unica funzione della proteina, e aiuta a svelare i meccanismi interni della cellula vivente. Ad oggi, l&#39;86% del Protein Data Bank (rcsb-PDB) le voci sono strutture macromolecolari che sono stati determinati con cristallografia a raggi X. Per ottenere cristalli adatti per studi cristallografici, la macromolecola (ad esempio proteine, acidi nucleici, proteine-proteine ​​o complessi di proteine-acidi nucleici complesso) deve essere purificato all&#39;omogeneità, o il più vicino possibile alla omogeneità. L&#39;omogeneità della preparazione è un fattore chiave per ottenere cristalli che diffrangere ad alta risoluzione (Bergfors, 1999; McPherson, 1999). Cristallizzazione richiede portando la macromolecola di sovrasaturazione. Il campione deve quindi essere concentrati per la massima concentrazione possibile, senza causare aggregazione o precipitazione della macromolecola (di solito 2-50 mg / mL). Presentazione del campione di agente precipitante in grado di promuovere la nucleazione dei cristalli di proteine ​​nella soluzione, che può portare a grandi tridimensionali cristalli crescente dalla soluzione. Esistono due tecniche principali per ottenere cristalli: diffusione del vapore acqueo e cristallizzazione batch. Nella diffusione del vapore, una goccia contenente una miscela di soluzioni precipitante e proteine ​​è sigillato in una camera con precipitante puro. Il vapore acqueo diffonde poi fuori della goccia fino alla osmolarità della goccia e il precipitante sono uguali (Figura 1A). La disidratazione della goccia provoca una lenta concentrazione di proteine ​​e precipitante fino a quando l&#39;equilibrio è raggiunto, idealmente nella zona di nucleazione cristallina del diagramma di fase. Il metodo si basa sul lotto portando la proteina direttamente nella zona di nucleazione da proteica con la giusta quantità di precipitante (Figura 1B). Questo metodo è di solito eseguita in una paraffina / miscela olio minerale per prevenire la diffusione di acqua dalla caduta. Qui ci dimostrano due tipi di apparato sperimentale per la diffusione del vapore, appeso goccia e goccia seduti, oltre a cristallizzazione lotto sott&#39;olio.

Crystallization is usually referred to as the bottleneck of X-ray crystallography. A sparse matrix incomplete factorial screen of precipitating conditions typically produces many different types of protein aggregation and precipitation, among them large single crystals. If the protein or precipitant concentrations are too high one can see brown matter with no distinct shape and size (amorphous precipitation). When the solution is undersaturated, the drop will often be completely clear and devoid of any kind of precipitat...

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Protein Crystallization for X-ray Crystallography

La struttura 3-D di una molecola fornisce una comprensione unica del funzionamento molecola. Il metodo principale per la determinazione della struttura a quasi atomico risoluzione è cristallografia a raggi X. Qui, dimostra i metodi attuali per ottenere cristalli tridimensionali di qualunque macromolecola dato che sono adatti per la determinazione della struttura di cristallografia a raggi X.

Cristallizzazione delle proteine ​​per la cristallografia a raggi X

Using the three-dimensional structure of biological macromolecules to infer how they function is one of the most important fields of modern biology. The ...

protein-crystallization-for-x-ray-crystallography

Research

JoVE Journal

Biology

63.0K Views.  Yale University. La struttura 3-D di una molecola fornisce una comprensione unica del funzionamento molecola. Il metodo principale per la determinazione della struttura a quasi atomico risoluzione è cristallografia a raggi X. Qui, dimostra i metodi attuali per ottenere cristalli tridimensionali di qualunque macromolecola dato che sono adatti per la determinazione della struttura di cristallografia a raggi X.

Video: Protein Crystallization for X-ray Crystallography

Non-invasive 3D-Visualization with Sub-micron Resolution Using Synchrotron-X-ray-tomography

Little is known about the internal organization of many micro-arthropods with body sizes below 1 mm. The reasons for that are the small size and the hard cuticle which makes it difficult to use protocols of classical histology. In addition, histological sectioning destroys the sample and can therefore not be used for unique material. Hence, a non-destructive method is desirable which allows to view inside small samples without the need of sectioning.
We used synchrotron X-ray tomography at the European Synchrotron Radiation Facility (ESRF) in Grenoble (France) to non-invasively produce 3D tomographic datasets with a pixel-resolution of 0.7&micro;m. Using volume rendering software, this allows us to reconstruct the internal organization in its natural state without the artefacts produced by histological sectioning. These date can be used for quantitative morphology, landmarks, or for the visualization of animated movies to understand the structure of hidden body parts and to follow complete organ systems or tissues through the samples.

We used synchrotron X-ray tomography at the European Synchrotron Radiation Facility (ESRF) to non-invasively produce 3D tomographic datasets with a pixel-resolution of 0.7&micro;m. Using volume rendering software, this allows the reconstruction of internal structures in their natural state without the artefacts produced by histological sectioning.

Non invasive di visualizzazione 3D con sub-micron Risoluzione Utilizzando sincrotrone a raggi-X, la tomografia

Little is known about the internal organization of many micro-arthropods with body sizes below 1 mm. The reasons for that are the small size and the hard ...

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Biologia

Staining of Proteins in Gels with Coomassie G-250 without Organic Solvent and Acetic Acid

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents (Methanol, Ethanol or 2-Propanol) and acetic acid are used for fixation, staining and destaining of proteins in a gel after SDS-PAGE. To speed up the procedure, heating the staining solution in the microwave oven for a short time is frequently used. This usually results in evaporation of toxic or hazardous Methanol, Ethanol or 2-Propanol and a strong smell of acetic acid in the lab which should be avoided due to safety considerations. In a protocol originally published in two patent applications by E.M. Wondrak (US2001046709 (A1), US6319720 (B1)), an alternative composition of the staining solution is described in which no organic solvent or acid is used. The CBB is dissolved in bidistilled water (60-80mg of CBB G-250 per liter) and 35 mM HCl is added as the only other compound in the staining solution. The CBB staning of the gel is done after SDS-PAGE and thorough washing of the gel in bidistilled water. By heating the gel during the washing and staining steps, the process can be finished faster and no toxic or hazardous compunds are evaporating. The staining of proteins occurs already within 1 minute after heating the gel in staining solution and is fully developed after 15-30 min with a slightly blue background that is destained completely by prolonged washing of the stained gel in bidistilled water, without affecting the stained protein bands.

A short protocol for protein staining with Coomassie Brilliant Blue (CBB) G-250 in polyacrylamide gels is described without using organic solvents or acetic acid as in the classical staining procedures with CBB.

La colorazione delle proteine ​​in gel con Coomassie G-250, senza solventi organici acido acetico e

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents ...

Using the GELFREE 8100 Fractionation System for Molecular Weight-Based Fractionation with Liquid Phase Recovery

The GELFREE 8100 Fractionation System is a novel protein fractionation system designed to maximize protein recovery during molecular weight based fractionation. The system is comprised of single-use, 8-sample capacity cartridges and a benchtop GELFREE Fractionation Instrument. During separation, a constant voltage is applied between the anode and cathode reservoirs, and each protein mixture is electrophoretically driven from a loading chamber into a specially designed gel column gel. Proteins are concentrated into a tight band in a stacking gel, and separated based on their respective electrophoretic mobilities in a resolving gel. As proteins elute from the column, they are trapped and concentrated in liquid phase in the collection chamber, free of the gel. The instrument is then paused at specific time intervals, and fractions are collected using a pipette. This process is repeated until all desired fractions have been collected. If fewer than 8 samples are run on a cartridge, any unused chambers can be used in subsequent separations.
This novel technology facilitates the quick and simple separation of up to 8 complex protein mixtures simultaneously, and offers several advantages when compared to previously available fractionation methods. This system is capable of fractionating up to 1mg of total protein per channel, for a total of 8mg per cartridge. Intact proteins over a broad mass range are separated on the basis of molecular weight, retaining important physiochemical properties of the analyte. The liquid phase entrapment provides for high recovery while eliminating the need for band or spot cutting, making the fractionation process highly reproducible1.

The accompanying video describes the use of the GELFREE 8100 Fractionation System, which partitions complex protein samples on the basis of molecular weight and recovers the fractions in liquid phase. The video describes how the technology works, how it is used, and provides resultant data, with polyacrylamide gel electrophoresis analysis of fractionated bovine liver homogenate.

Utilizzando il sistema GELFREE 8100 Frazionamento per peso molecolare basata su Frazionamento con recupero della fase liquida

The GELFREE 8100 Fractionation System is a novel protein fractionation system designed to maximize protein recovery during molecular weight based ...

Assessing Two-dimensional Crystallization Trials of Small Membrane Proteins for Structural Biology Studies by Electron Crystallography

Electron crystallography has evolved as a method that can be used either alternatively or in combination with three-dimensional crystallization and X-ray crystallography to study structure-function questions of membrane proteins, as well as soluble proteins. Screening for two-dimensional (2D) crystals by transmission electron microscopy (EM) is the critical step in finding, optimizing, and selecting samples for high-resolution data collection by cryo-EM. Here we describe the fundamental steps in identifying both large and ordered, as well as small 2D arrays, that can potentially supply critical information for optimization of crystallization conditions.
By working with different magnifications at the EM, data on a range of critical parameters is obtained. Lower magnification supplies valuable data on the morphology and membrane size. At higher magnifications, possible order and 2D crystal dimensions are determined. In this context, it is described how CCD cameras and online-Fourier Transforms are used at higher magnifications to assess proteoliposomes for order and size.
While 2D crystals of membrane proteins are most commonly grown by reconstitution by dialysis, the screening technique is equally applicable for crystals produced with the help of monolayers, native 2D crystals, and ordered arrays of soluble proteins. In addition, the methods described here are applicable to the screening for 2D crystals of even smaller as well as larger membrane proteins, where smaller proteins require the same amount of care in identification as our examples and the lattice of larger proteins might be more easily identifiable at earlier stages of the screening.

Evaluating two-dimensional (2D) crystallization trials for the formation of ordered membrane protein arrays is a highly critical and difficult task in electron crystallography. Here we describe our approach in screening for and identifying 2D crystals of predominantly small membrane proteins in the range of 15 &#x2013; 90kDa.

Valutazione bidimensionale Prove di cristallizzazione delle proteine ​​di membrana per piccoli studi di biologia strutturale di Cristallografia Electron

Electron crystallography has evolved as a method that can be used either alternatively or in combination with three-dimensional crystallization and X-ray ...

Crystallization of Membrane Proteins in Lipidic Mesophases

Membrane proteins perform critical functions in living cells related to signal transduction, transport and energy transformations, and, as such, are implicated in a multitude of malfunctions and diseases. However, a structural and functional understanding of membrane proteins is strongly lagging behind that of their soluble partners, mainly, due to difficulties associated with their solubilization and generation of diffraction quality crystals. Crystallization in lipidic mesophases (also known as in meso or LCP crystallization) is a promising technique which was successfully applied to obtain high resolution structures of microbial rhodopsins, photosynthetic proteins, outer membrane beta barrels and G protein-coupled receptors. In meso crystallization takes advantage of a native-like membrane environment and typically produces crystals with lower solvent content and better ordering as compared to traditional crystallization from detergent solutions. The method is not difficult, but requires an understanding of lipid phase behavior and practice in handling viscous mesophase materials. Here we demonstrate a simple and efficient way of making LCP and reconstituting a membrane protein in the lipid bilayer of LCP using a syringe mixer, followed by dispensing nanoliter portions of LCP into an assay or crystallization plate, conducting pre-crystallization assays and harvesting crystals from the LCP matrix. These protocols provide a basic guide for approaching in meso crystallization trials; however, as with any crystallization experiment, extensive screening and optimization are required, and a successful outcome is not necessarily guaranteed.

The protocols describe the essential steps for obtaining diffraction quality crystals of a membrane protein starting from reconstitution of the protein in a lipidic cubic phase (LCP), finding initial conditions with LCP-FRAP pre-crystallization assays, setting up LCP crystallization trials and harvesting crystals.

Cristallizzazione delle proteine ​​di membrana lipidica in Mesophases

Membrane proteins perform critical functions in living cells related to signal transduction, transport and energy transformations, and, as such, are ...

High-throughput Crystallization of Membrane Proteins Using the Lipidic Bicelle Method

Membrane proteins (MPs) play a critical role in many physiological processes such as pumping specific molecules across the otherwise impermeable membrane bilayer that surrounds all cells and organelles. Alterations in the function of MPs result in many human diseases and disorders; thus, an intricate understanding of their structures remains a critical objective for biological research. However, structure determination of MPs remains a significant challenge often stemming from their hydrophobicity. 
MPs have substantial hydrophobic regions embedded within the bilayer. Detergents are frequently used to solubilize these proteins from the bilayer generating a protein-detergent micelle that can then be manipulated in a similar manner as soluble proteins. Traditionally, crystallization trials proceed using a protein-detergent mixture, but they often resist crystallization or produce crystals of poor quality. These problems arise due to the detergent&prime;s inability to adequately mimic the bilayer resulting in poor stability and heterogeneity. In addition, the detergent shields the hydrophobic surface of the MP reducing the surface area available for crystal contacts. To circumvent these drawbacks MPs can be crystallized in lipidic media, which more closely simulates their endogenous environment, and has recently become a de novo technique for MP crystallization.
Lipidic cubic phase (LCP) is a three-dimensional lipid bilayer penetrated by an interconnected system of aqueous channels1. Although monoolein is the lipid of choice, related lipids such as monopalmitolein and monovaccenin have also been used to make LCP2. MPs are incorporated into the LCP where they diffuse in three dimensions and feed crystal nuclei. A great advantage of the LCP is that the protein remains in a more native environment, but the method has a number of technical disadvantages including high viscosity (requiring specialized apparatuses) and difficulties in crystal visualization and manipulation3,4. Because of these technical difficulties, we utilized another lipidic medium for crystallization-bicelles5,6 (Figure 1). Bicelles are lipid/amphiphile mixtures formed by blending a phosphatidylcholine lipid (DMPC) with an amphiphile (CHAPSO) or a short-chain lipid (DHPC). Within each bicelle disc, the lipid molecules generate a bilayer while the amphiphile molecules line the apolar edges providing beneficial properties of both bilayers and detergents. Importantly, below their transition temperature, protein-bicelle mixtures have a reduced viscosity and are manipulated in a similar manner as detergent-solubilized MPs, making bicelles compatible with crystallization robots. 
Bicelles have been successfully used to crystallize several membrane proteins5,7-11 (Table 1). This growing collection of proteins demonstrates the versatility of bicelles for crystallizing both alpha helical and beta sheet MPs from prokaryotic and eukaryotic sources. Because of these successes and the simplicity of high-throughput implementation, bicelles should be part of every membrane protein crystallographer&prime;s arsenal. In this video, we describe the bicelle methodology and provide a step-by-step protocol for setting up high-throughput crystallization trials of purified MPs using standard robotics.

Bicelles are lipid/amphiphile mixtures that maintain membrane proteins (MPs) within a lipid bilayer but have unique phase behavior that facilitates high-throughput screening by crystallization robots. This technique has successfully produced a number of high-resolution structures from both prokaryotic and eukaryotic sources. This video describes protocols for generating the lipidic bicelle mixture, incorporating MPs into the bicelle mixture, setting up crystallizations trials (manually as well as robotically) and harvesting crystals from the medium.

Cristallizzazione high-throughput di proteine ​​di membrana con il metodo lipidica Bicelle

Membrane proteins (MPs) play a critical role in many physiological processes such as pumping specific molecules across the otherwise impermeable membrane ...

3D Printing of Preclinical X-ray Computed Tomographic Data Sets

Three-dimensional printing allows for the production of highly detailed objects through a process known as additive manufacturing. Traditional, mold-injection methods to create models or parts have several limitations, the most important of which is a difficulty in making highly complex products in a timely, cost-effective manner.1 However, gradual improvements in three-dimensional printing technology have resulted in both high-end and economy instruments that are now available for the facile production of customized models.2 These printers have the ability to extrude high-resolution objects with enough detail to accurately represent in vivo images generated from a preclinical X-ray CT scanner. With proper data collection, surface rendering, and stereolithographic editing, it is now possible and inexpensive to rapidly produce detailed skeletal and soft tissue structures from X-ray CT data. Even in the early stages of development, the anatomical models produced by three-dimensional printing appeal to both educators and researchers who can utilize the technology to improve visualization proficiency. 3, 4 The real benefits of this method result from the tangible experience a researcher can have with data that cannot be adequately conveyed through a computer screen. The translation of pre-clinical 3D data to a physical object that is an exact copy of the test subject is a powerful tool for visualization and communication, especially for relating imaging research to students, or those in other fields. Here, we provide a detailed method for printing plastic models of bone and organ structures derived from X-ray CT scans utilizing an Albira X-ray CT system in conjunction with PMOD, ImageJ, Meshlab, Netfabb, and ReplicatorG software packages.

Using modern plastic extrusion and printing technologies, it is now possible to quickly and inexpensively produce physical models of X-ray CT data taken in a laboratory. The three -dimensional printing of tomographic data is a powerful visualization, research, and educational tool that may now be accessed by the preclinical imaging community.

La stampa 3D di preclinica X-tomografia computerizzata a raggi Data Set

Three-dimensional printing allows for the production of highly detailed objects through a process known as additive manufacturing.  Traditional, ...

Improving the Success Rate of Protein Crystallization by Random Microseed Matrix Screening

Random microseed matrix screening (rMMS) is a protein crystallization technique in which seed crystals are added to random screens. By increasing the likelihood that crystals will grow in the metastable zone of a protein's phase diagram, extra crystallization leads are often obtained, the quality of crystals produced may be increased, and a good supply of crystals for data collection and soaking experiments is provided. Here we describe a general method for rMMS that may be applied to either sitting drop or hanging drop vapor diffusion experiments, established either by hand or using liquid handling robotics, in 96-well or 24-well tray format.

Here we describe a general method for random microseed matrix screening. This technique is shown to significantly increase the success rate of protein crystallization screening experiments, reduce the need for optimization, and provide a reliable supply of crystals for data collection and ligand-soaking experiments.

Migliorare il tasso di successo di cristallizzazione della proteina da Random Microseed Matrix Screening

Random microseed matrix screening  (rMMS) is a protein crystallization technique in which seed crystals are added  to random screens. By increasing the ...

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and the inherent instability of many membrane proteins once solubilized in detergents. A protocol is described that combines ligation independent cloning of membrane proteins as GFP fusions with expression in Escherichia coli detected by GFP fluorescence. This enables the construction and expression screening of multiple membrane protein/variants to identify candidates suitable for further investment of time and effort. The GFP reporter is used in a primary screen of expression by visualizing GFP fluorescence following SDS polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE). Membrane proteins that show both a high expression level with minimum degradation as indicated by the absence of free GFP, are selected for a secondary screen. These constructs are scaled and a total membrane fraction prepared and solubilized in four different detergents. Following ultracentrifugation to remove detergent-insoluble material, lysates are analyzed by fluorescence detection size exclusion chromatography (FSEC). Monitoring the size exclusion profile by GFP fluorescence provides information about the mono-dispersity and integrity of the membrane proteins in different detergents. Protein: detergent combinations that elute with a symmetrical peak with little or no free GFP and minimum aggregation are candidates for subsequent purification. Using the above methodology, the heterologous expression in E. coli of SED (shape, elongation, division, and sporulation) proteins from 47 different species of bacteria was analyzed. These proteins typically have ten transmembrane domains and are essential for cell division. The results show that the production of the SEDs orthologues in E. coli was highly variable with respect to the expression levels and integrity of the GFP fusion proteins. The experiment identified a subset for further investigation.

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

A streamlined approach to screening for the expression of recombinant membrane proteins in Escherichia coli based on fusion to green fluorescent protein is presented.

Green Fluorescent Protein-base Espressione Proiezione di proteine ​​di membrana in<em&gt; Escherichia coli</em

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and ...

Efficient Mammalian Cell Expression and Single-step Purification of Extracellular Glycoproteins for Crystallization

Production of secreted mammalian proteins for structural and biophysical studies can be challenging, time intensive, and costly. Here described is a time and cost efficient protocol for secreted protein expression in mammalian cells and one step purification using nickel affinity chromatography. The system is based on large scale transient transfection of mammalian cells in suspension, which greatly decreases the time to produce protein, as it eliminates steps, such as developing expression viruses or generating stable expressing cell lines. This protocol utilizes cheap transfection agents, which can be easily made by simple chemical modification, or moderately priced transfection agents, which increase yield through increased transfection efficiency and decreased cytotoxicity. Careful monitoring and maintaining of media glucose levels increases protein yield. Controlling the maturation of native glycans at the expression step increases the final yield of properly folded and functional mammalian proteins, which are ideal properties to pursue X-ray crystallography. In some cases, single step purification produces protein of sufficient purity for crystallization, which is demonstrated here as an example case.

This is a quick, cost-efficient protocol for the production of secreted, glycosylated mammalian proteins and subsequent single-step purification with sufficient yields of homogenous protein for X-ray crystallography and other biophysical studies.

Efficiente Espressione cellulari di mammifero e Passo singolo Purificazione di extracellulare glicoproteine ​​per cristallizzazione

Production of secreted mammalian proteins for structural and biophysical studies can be challenging, time intensive, and costly. Here described is a time ...

Cristallizzazione delle proteine ​​per la cristallografia a raggi X

Cristallizzazione delle proteine per la cristallografia a raggi X