Questo protocollo presenta il primo modello di ricerca che consente la coltivazione organotipica a lungo termine di cellule endoteliali corneali ottenuta con la preparazione di bottoni corneali divisi. Rimuovendo parzialmente gli strati corneali esterni, la perdita di cellule endoteliali è significativamente ridotta, consentendo la coltivazione di cellule endoteliali corneali per almeno 15 giorni. Pertanto, questo modello è prezioso per studiare gli effetti di sostanze specifiche o tecniche di interesse come soluzioni di irrigazione o dispositivi viscoelastici oftalmici sull'endotelio corneale.
Dopo aver ricevuto gli occhi di maiale che sono stati rimossi poco dopo la mortem, utilizzare forbici per gli occhi e forcep Colibri per rimuovere tutti gli adnex orbitali. Posizionare da cinque a sei occhi in una soluzione PBS di iodio al cinque per cento per un totale di cinque minuti per disinfettare correttamente le superfici oculari, con un'attenta agitazione una volta al minuto per garantire che le superfici siano completamente sommerse per ottenere una disinfezione completa. Dopo cinque minuti, trasferire gli occhi disinfettati su una tazza di PBS puro e mescolarlo accuratamente per lavare accuratamente la soluzione pbs di iodio dalle superfici oculari.
Prima di iniziare la dissezione, utilizzare un catetere smussato per riempire una siringa da cinque millilitri con due millilitri di siero di vitello fetale appena scongelato e filtrare il siero attraverso un filtro da 0,22 micrometri in 80 millilitri di mezzo di coltura privo di dextran. Agitare delicatamente la miscela per ottenere una distribuzione omogenea del siero e aggiungere tre millilitri del mezzo ad ogni pozzo di una piastra di coltura cellulare da 12 pozzi. Quando la piastra è pronta, trasferire un bulbo oculare in un porta bulbo oculare al microscopio chirurgico oftalmico con la cornea rivolta verso l'alto e utilizzare una siringa riempita con cloruro di sodio allo 0,9% per applicare una leggera aspirazione all'occhio sul supporto del bulbo oculare per fissare l'occhio in posizione.
Utilizzare una trefina contenente un intarsio standardizzato per tagliare superficialmente nella cornea centrale, non più profonda di 300 micrometri, e utilizzare le forcep Colibri e un bisturi mono impiego con una lama triangolare per tagliare e rimuovere il frammento parzialmente trephined della cornea orizzontalmente attraverso lo stroma. Posizionare superficialmente una sutura 10-0 nello stroma per consentire la differenziazione dell'endoteliale dal lato stromale durante gli esperimenti, senza penetrare l'endotelio corneale, e utilizzare una trefina senza intarsio per far avanzare la trefina tagliata a tutta profondità fino a raggiungere la camera oculare anteriore. Una netta caduta di resistenza e perdita di fluido dalla camera oculare anteriore può essere percepita dopo la completa penetrazione della cornea.
Posizionare il pulsante corneale diviso ottenuto contenente parte dello stroma, la membrana del Descemet e l'endotelio corneale in un unico pozzo della piastra da 12 pozzetti con il lato taggato rivolto verso il basso. Quindi etichettare ogni bene sulla piastra di coltura con un numero individuale per ogni pulsante corneale diviso per l'identificazione durante i follow-up. Una volta raccolti tutti i pulsanti corneali, posizionare la piastra da 12 po' in un incubatore di coltura cellulare a 37 gradi celsius, anidride carbonica al 5% e umidità del 95%, sostituendo il supernatante il giorno otto se viene superato un periodo di incubazione di sette giorni.
Per eseguire un esame non macchiato, aggiungere tre millilitri di soluzione salina bilanciata ipotonica ad ogni pozzo di una piastra da 12 po ', e posizionare con cura un singolo pulsante corneale diviso in ogni pozzo per indurre gonfiore delle cellule endoteliali corneali e migliorare la visibilità delle cellule per il conteggio. Dopo uno o due minuti, utilizzare una fotocamera al microscopio per acquisire almeno tre immagini di tre diverse aree dell'endotelio per ottenere un'impressione rappresentativa delle condizioni effettive dell'endotelio corneale e aggiungere una barra di scala con la lunghezza reale su scala di 100 micrometri per un'analisi successiva. Per evitare danni osmotici, trasferire il pulsante corneale diviso dalla soluzione dopo un massimo di cinque minuti di nuovo nel mezzo di coltura.
Per eseguire un esame macchiato, posizionare i bottoni corneali divisi nelle singole piastre di Petri, lato endoteliale verso l'alto, e utilizzare una pipetta per far cadere lentamente la soluzione blu di Trypam dello 0,25% su ogni endotelio corneale per 90 secondi per campione. Successivamente, sciacquare accuratamente i pulsanti tre volte in cloruro di sodio allo 0,9% in un piccolo bicchiere di vetro prima di utilizzare una pipetta per far cadere lentamente la soluzione di Alizarin Red S sull'endotelia per 90 secondi. Quindi immagini i campioni come appena dimostrato.
Per preparare le immagini per la densità cellulare e la valutazione morfologica, aprire le immagini in un appropriato programma software di editing grafico e proiettare un quadrato con una lunghezza laterale reale su larga scala di 100 micrometri sull'immagine. Per ritagliare la barra di ridimensionamento, usate lo strumento selezione rettangolare per confinare con la barra di scala e selezionare Modifica e ritaglia. Fare clic su file e nuovo e selezionare Appunti.
Prendere nota dei pixel corrispondenti per le altre immagini e fare clic su OK. Fare di nuovo clic su file e nuovo e inserire la larghezza e la lunghezza del quadrato di conteggio in pixel nella finestra popup in base alla lunghezza della barra di scala. Selezionare il bianco come colore di sfondo e fare clic su OK per selezionare tutto e copiare l'immagine selezionata. Selezionare l'immagine dell'endotelio corneale e incollare il quadrato sull'endotelio corneale.
Selezionare il livello quadrato e impostare l'opacità su 30%Quindi fare clic su OK e salvare l'immagine con il quadrato proiettato con la lunghezza della diapositiva true-to-scale di 100 micrometri. Per valutare la densità delle celle endoteliali, aprite le immagini con i quadrati proiettati in ImageJ e aprite il plug-in del contatore delle celle. Per contare le celle all'interno del quadrato, fare clic su inizializza per contare le celle endoteliali su due lati del quadrato e registrare il risultato.
Per valutare i parametri morfologici, contare la riunione congiunta di almeno quattro celle per bordo cellulare, il caratteristico aspetto a forma di rosetta e le aree rosso alizarina all'interno dei quadrati proiettati. In un periodo di 15 giorni, i pulsanti corneali divisi dimostrano un costante declino della densità cellulare endoteliale, con una percentuale media settimanale di perdita di cellule endoteliali del 4,90% La colorazione dello strato cellulare endoteliale il giorno 15 consente l'analisi morfologica delle cellule corneali, con cifre di riforma che co rappresentano circa il sette% dei bordi cellulari che si fondono, una mediana di circa una formazione di rosetta per millimetro quadrato per campione , e circa 13 perdite puntuali di cellule per millimetro al quadrato. Qui, si possono osservare immagini rappresentative dell'endotelio corneale durante la valutazione microscopica in soluzione di sale bilanciato ipotonico e dopo la colorazione con Tripano blu e Alizarina Rossa S.
Se i bottoni corneali divisi vengono coltivati con il lato endoteliale rivolto verso il basso, è previsto un ampio danno cellulare endoteliale. I bottoni corneali non divisi subiscono un aumento significativo della perdita cellulare endoteliale a causa del gonfiore stromale, causando la piegatura della membrana di Descemet per 15 giorni di coltivazione, mentre i bottoni corneali divisi mostrano un endotelio corneale ampiamente conservato dopo 15 giorni di coltivazione, come evidenziato da aree puntuali sparse macchiate di Alizarin Rosso, indicative di singole cellule distrutte. Per ridurre al minimo la perdita cellulare, è necessario fare attenzione a non toccare l'endotelio corneale in tutte le fasi di questo protocollo.
