Questo lavoro è stato sostenuto dal contratto US Research Projects Agency Defense N66001-12-C-4039 a YS, un finanziamento della Alfred P. Sloan Foundation per RSL, e US National Institutes of concede Salute HG003224 R01 e R21 CA130266 a FPRFPR era supportato anche da una borsa di studio presso l&#39;Istituto canadese per la ricerca avanzata e per l&#39;eccellenza di ricerca del Canada programma di sedie.

1. Generazione di ProMonsters <ol><li> Preparare la cassetta universale sostituzione GFP, amplificando un tetO 2-GFP marcatore e il marcatore URA3 dal plasmide pYOGM012 (resistenza all&#39;ampicillina) utilizzando primer con le sequenze: GGATCCCCGGGTTAATTAAGGCGCGCCAGATCTGTTTAGCTTGCC CAAGCTCCTCGAGTAATTCG e GGCGTTAGTATCGAATCGACAGCAGTATAGCGACCAGCATTCAC GTACCGGGTAATAACTGATATAAT (regioni in grassetto fornire omologia con le regioni a fianco della cassetta KanMX4 permettendo la sostituzione mirata). La reazione PCR deve essere effettuata con Phusion polimerasi, tampone HF, e il 3% dimetilsolfossido (New England Biolabs) a partire dalla concentrazione di stampo di DNA di 0,5 ng / pl. Il programma PCR è di 98 ° C per 30 sec e 35 cicli di 98 ° C per 10 sec, 49 ° C per 30 sec e 72 ° C per 1,5 min. Il volume di reazione deve essere&gt; 50 pl per fornire abbastanza DNA per ciascun esperimento di trasformazione. Abbiamo purificareil prodotto utilizzando un QIAquick PCR Purification Kit (Qiagen) con ~ 50 pl della reazione PCR trasformati per colonna, ma saltando la fase di purificazione può aumentare la resa dei trasformanti. In alternativa, rilasciare un frammento contenente il tetO 2-GFP e marcatori URA3, nonché regioni omologhe per KanMX4 targeting, digerendo il plasmide pYOGM057 (resistenza all&#39;ampicillina) utilizzando l&#39;enzima di restrizione EcoRI (New England Biolabs). La concentrazione di DNA in questa reazione dovrebbe essere ~ 30 ng / mL. Il volume di reazione deve essere&gt; 34 microlitri. Per integrare la cassetta GFP in una regione diversa KanMX4, regolare la regione omologia dei primer PCR sopra per le opportune sequenze omologhe. </li><li> Trasformare un un ceppo aploide della collezione KanMX4 eliminazione diretta lievito 12 con la cassetta universale eliminazione GFP. In seguito il protocollo da Woods e Gietz 13 0,34 microlitri dellaCampione di DNA (prodotto di PCR purificato o non purificato digestione di restrizione) deve essere usato per ogni esperimento trasformazione. Piastra un quinto trasformazione della miscela su un CAA-Ura piastra (0,67% base azotata di lievito, 2% di glucosio, 0,6% di acido Casamino, 0,0025% emisolfato adenina, 0,005% triptofano, e 2% agar). </li><li> Streak i trasformanti su un nuovo CAA-Ura piastra per ottenere colonie isolate. </li><li> Trasferire le cellule da una colonia su un piatto YPDA contenente 200 ug / ml di G418 per confermare l&#39;assenza di crescita. Per confermare il successo dell&#39;integrazione GFP, seguire la procedura (1.5) - (1.9) per eseguire colonia PCR. </li><li> Aggiungere cellule prelevate da una colonia in 2 ml di tampone di lisi (0,1 M fosfato di sodio, pH 7,4, 1 zymolyase unità da ZymoResearch) in una provetta da 0,2 ml PCR o un pozzetto di una piastra a 96 pozzetti. Mescolare pipettando la soluzione in e fuori di una punta di pipetta. </li><li> Overlay con una goccia (circa 20 pl) di olio minerale con un Pipetman P200 (Gilson). </li><li> Incubare la miscela a 37 °C per 20 minuti e poi a 95 ° C per 10 min. </li><li> Diluire il lisato con 50 microlitri di acqua. Mescolare pipettando la soluzione in e fuori dieci volte. </li><li> Analizzare 1 ml del lisato utilizzando 10 ul reazioni di PCR con (A) un primer forward che ricombina con la regione fiancheggiante monte accoppiato con un primer del CCTGAGAAAGCAACCTGACC sequenza (285 bp dall&#39;inizio della cassetta), (B) un inverso primer che si ricombina con la regione a valle accoppiato con un primer del GCATTGGGTCAACAGTATAG sequenza (375 bp dall&#39;estremità), (C) due primer che annealing a KanMX4 con le sequenze CGTACTCCTGATGATGCATG e GACGAAATACGCGATCGCTG (181 bp), e (D) due primer che ricottura alla sequenza wild-type del gene mirato (Figura 4). (D) è importante perché circa l&#39;8% dei ceppi appartenenti alle collezioni di eliminazione sono noti per contenere aneuploidia 14. Un trasformante corretta dovrebbe essere positivo (A) e (B), e negativa con (C) e (D). </li><li> Per introdurre unGMToolkit nel trasformante, aggiungere circa 250.000 cellule dal ceppo trasformato e 250.000 cellule di entrambi RY0146 (contenente GMToolkit-a) o RY0148 (contenente GMToolkit-α) in una provetta da 1,6 ml Eppendorf. Vortex. I genotipi di RY0146 e RY0148 sono MATα lyp1Δ his3Δ1 leu2Δ0 ura3Δ0 met15Δ0 can1Δ :: GMToolkit-a [CMVpr-rtTA KanMX4 STE2pr-Sp-his5] e MATα lyp1Δ his3Δ1 leu2Δ0 ura3Δ0 met15Δ0 can1Δ :: GMToolkit-α [CMVpr-rtTA NatMX4 STE3pr- LEU2], rispettivamente. pr denota promotore. Numero di cellulare deve essere definita sulla base della densità ottica della cultura precedente. </li><li> Centrifugare a 800 xg per 2 minuti. </li><li> Rimuovere il surnatante. </li><li> Per consentire il ricambio dell&#39;aria, un foro sul coperchio utilizzando una puntina trattato con etanolo al 70%. </li><li> Aggiungere 50 ml di YPDA media (1% estratto di lievito, 2% peptone, 2% di glucosio, e 0,003% hemisulfat adeninae). Vortex. </li><li> Centrifugare a 800 xg per 5 min. </li><li> Porre il tubo in una scatola umida. Questo può essere realizzato con una scatola vuota punta, uno stand piccolo suggerimento, e un tovagliolo di carta bagnato. </li><li> Incubare la casella notte a 30 ° C. </li><li> Selezionare diploidi accoppiati dalla prima strisciando le celle di un CAA-Ura piastra. Incubare la piastra a 30 ° C per un giorno. </li><li> Prendendo cellule dal bulk zona, striscia fuori per rendere colonie isolate su piastre YPDA (1% estratto di lievito, 2% peptone, glucosio 2%, 0,003% emisolfato adenina, e 2% agar) contenenti 200 pg / ml di G418 per selezionare diploidi contenente GMToolkit-a o 100 pg / ml nourseothricin (Nat) 15 per la selezione diploidi contenenti GMToolkit-α. </li><li> Incubare la piastra a 30 ° C per 3 giorni. </li><li> Partendo da una colonia isolata, trasferire la maggior parte delle cellule a 500 pl di mezzo GNA senza agar (estratto di lievito 1%, 3% brodo nutriente Difco, e il 5% di glucosio, glucosio autoclave e il resto della tha componenti separatamente come 2 × soluzioni per evitare caramellizzazione) in un 5 ml provetta con il coperchio allentato. </li><li> Ruotare il tubo orizzontalmente per cinque ore a 30 ° C. L&#39;asse di rotazione deve essere parallela all&#39;asse longitudinale del tubo. </li><li> Verificare che le colonie utilizzati in (1.21) sono Ura + strisciando fuori su un CAA-Ura piastra. </li><li> Centrifugare la provetta a 800 xg per 2 minuti. Eliminare il surnatante. </li><li> Aggiungere 500 pl di mezzo di sporulazione minima (1% acetato di potassio, acetato di zinco 0,005%; filtro-sterilizzare). Vortex. </li><li> Centrifugare la provetta a 800 xg per 2 minuti. Eliminare il surnatante. </li><li> Repeat (1.25) - (1.26) due volte. </li><li> Aggiungere 1 ml di mezzo di sporulazione minima supplementato con 7,5 ug / ml lisina, 7,5 ug / ml leucina, 5 pg / ml istidina, 5 pg / ml di metionina, e 1,25 mg / ml uracile (per aumentare il tasso di sporulazione dei ceppi auxotrophic) . Vortex. </li><li> Ruotare il tubo a temperatura ambiente per un giorno. </li><li> Ruotare il tubo a 30 ° C per 2 giorni. </li><li> Centrifugare 125 pl di questa miscela in una provetta da 1,6 ml Eppendorf a 800 xg per 2 min. Eliminare il surnatante. </li><li> Aggiungere 50 ml di soluzione zymolyase (100 mM tampone fosfato di sodio, pH 7,4, 1 M sorbitolo, e due unità da zymolyase ZymoResearch). Mescolare pipettando la soluzione in e fuori di una punta di pipetta. </li><li> Incubare a 30 ° C per 1 ora. </li><li> Aggiungere 50 ml di 0,02% NP-40. Mescolare pipettando la soluzione in e fuori di una punta di pipetta. </li><li> Lasciare il tubo a temperatura ambiente per cinque minuti. </li><li> Aggiungere 500 ml di acqua. </li><li> Mettere la provetta in ghiaccio. </li><li> Sonicare questa miscela due volte l&#39;impostazione di uscita 1 (impostazione più debole) per 15 secondi con un 3,2 mm microtip con Sonifier 450 (Branson). Tra i due cicli di sonicazione, mettere il tubo in ghiaccio per riportare la temperatura a ~ 0 ° C. </li><li> Centrifugare le provette a 800 xg per 5 min. Eliminare il surnatante. </li><li> Aggiungere 200 ml di SC-Ura-His(A) o SC-Ura-Leu (α) medio, a seconda che la croce è per incorporare GMToolkit-a o GMToolkit-α. Per preparare i mezzi di comunicazione, rendono SC-Ura-His-Leu medio (0,67% base di azoto di lievito, 2% di glucosio, 0,01% arginina, acido aspartico 0,01%, 0,01% di acido glutammico, isoleucina 0,01%, 0,01% di lisina, metionina 0,01% , 0,01% fenilalanina, serina 0,08%, 0,04% treonina, tirosina 0,002%, 0,03% valina, 0.0025% adenina, triptofano 0,005%, 0,003% adenina e triptofano 0,005%) e integrare con istidina sterile o leucina prima dell&#39;uso al concentrazione finale di 0,01%. </li><li> Praticare un foro sul coperchio utilizzando una puntina trattato con etanolo al 70%. </li><li> Ruotare il tubo orizzontalmente a 30 ° C per 2 giorni. L&#39;asse di rotazione deve essere parallela all&#39;asse longitudinale del tubo. </li><li> Streak le celle di un SC-Ura-His o SC-Ura-Leu piastra di agar (gli stessi ingredienti di cui sopra più 2% di agar, acido aspartico e treonina deve essere aggiunto dopo unutoclaving, aggiungere o istidina leucina prima di versare) per rendere colonie isolate per i ceppi ProMonster. </li></ol> 2. Ciclismo sessuale <ol><li> Ruotare una coltura di un ceppo di GFP stabilito delezione in 100 pl di SC-His (a) o SC-Leu (α) secondo il tipo di accoppiamento a 30 ° C per una notte con un 1,6 ml provetta Eppendorf. Per il ricambio dell&#39;aria, fare un foro con una puntina da disegno trattato con etanolo al 70%. Ruotare il tubo orizzontalmente. L&#39;asse di rotazione deve essere parallela all&#39;asse longitudinale del tubo. È possibile attraversare ceppi multipli tramite accoppiamento in massa. Quando un campione viene ordinato direttamente utilizzato per questo scopo, coltivare le cellule in 200 pl a 30 ° C per 2 giorni. Per preparare il mezzo, aggiungere uracile (concentrazione finale: 0,0025%) e istidina (0,01%) o leucina (0,01%) per SC-Ura-His-Leu medie. </li><li> Mescolare 250.000 a-cellule aploidi e 250.000 α-cellule aploidi di ceppi di delezione GFP in un 1,6 ml Eppendorf tubo. Vortex. </li><li> Mate queste cellule seguendo i passaggi da (1.11) - (1.17). </li><li> Trasferire 10 microlitri della miscela di accoppiamento per mezzo GNA 500 microlitri contenente 200 ug / ml di G418 e 100 pg / ml Nat in 5 ml di una provetta di coltura con un coperchio allentato. La partenza OD 600 è circa 0,1. </li><li> Ruotare la coltura a 30 ° C per 24 ore. Questo permette la selezione di diploidi perché solo diploidi contenente sia KanMX4 in GMToolkit-a e NatMX4 in GMToolkit-α può crescere in presenza di G418 e Nat (Figura 3). </li><li> Trasferire 20 microlitri della cultura di un giorno a 500 ml di fresca GNA contenente G418 e Nat. La partenza OD 600 è circa 0,2. </li><li> Ruotare il tubo a 30 ° C per 5 ore per portare le cellule alla fase log (OD 600 di ~ 1). </li><li> Seguire i passi (1.24) - (1.38) per le sporulare diploidi e isolare spore. </li><li> Suddividere la sospensione di cellule in due sporigeni 300-plparti e mettere ciascuno in un separato da 1,5 ml provetta Eppendorf. </li><li> Centrifugare le provette a 800 xg per 5 min. Eliminare il surnatante. </li><li> Per il pellet di un tubo, aggiungere 100 ml di SC-Il suo mezzo per selezionare una-aploidi. Al pellet di altro tubo, aggiungere 100 microlitri di SC-Leu medie per selezionare α-aploidi. </li><li> Ruotare le provette a 30 ° C per una notte. Il finale OD 600 deve essere inferiore a 0,5. Se OD 600 tende ad essere troppo alto, prova a coltura a temperatura ambiente. </li><li> Per indurre GFP, aggiungere 100 microlitri di fresco SC-His (a) o SC-Leu (α) contenente 20 mg / ml di doxiciclina. La concentrazione finale di doxiciclina è di 10 mcg / ml. Vortex. </li><li> Ruotare le provette a 30 ° C per 2 giorni. </li></ol> 3. Citometria a Flusso <ol><li> Aggiungere 900 pl di prefiltrata tampone TE (pH 7,5) contenente 10 ug / ml di doxiciclina al 5 ml provetta di polipropilene (BD Falcon # 352.063) con il tappo scambiato con un cellularetappo filtro da 5 ml in polistirene (BD Falcon # 352235). Tubi in polipropilene sono adatti per citometria a flusso. Il tappo filtro è desiderato per rimuovere le particelle più grandi. </li><li> Posizionare delicatamente 75 ml di tampone TE con doxiciclina sulla cellula-filtro cap. </li><li> Aggiungere 25 ml di cellule indotte alla soluzione sul tappo. </li><li> Mentre si preme la punta della Pipetman contro la maglia, spara tutta la soluzione combinata attraverso il filtro. </li><li> Premere verso il basso il coperchio filtro e il tubo di vortice. </li><li> Preparare le provette di raccolta (1,6 ml provette Eppendorf) riempiti con 200 ml di SC-His o SC-Leu. </li><li> Avviare il cell sorter e regolare le impostazioni in base al manuale del produttore. </li><li> Vortex sia il tubo di raccolta (per rivestire la parete con il mezzo) e la provetta contenente le cellule prima di caricarle sul cell sorter. </li><li> Acquisire dati citometria a flusso del campione. Un ceppo non contenenti GFP può essere un controllo negativo. </li><li> Disegna cancelli per l&#39;ordinamento. (A)Per evitare di aggregati di cellule, che potrebbero presentano alta intensità GFP, eliminare valori anomali con larghezza di impulso sproporzionatamente grande per forward scatter (FSC) con un terreno di larghezza di impulso e l&#39;altezza di impulso per MoFlo sorter o sproporzionatamente piccola altezza FSC usando un diagramma di altezza FSC e FSC area per FACSAria sorter (Figura 5, in alto a sinistra del pannello). (B) dal grande FSC (area) è previsto per aggregati di cellule, soltanto in cellule inferiore al 20% in FSC, evitando regioni con il minor dispersione FSC e laterale (SSC) valori dove detriti cellulari è spesso trovato (figura 5, in alto a destra del pannello). (C) SSC (area) e GFP segnale (area) sono spesso correlati positivamente. Perché semplicemente tenendo brillanti cellule indicate le porte sopra avrebbe anche arricchito di cellule con un alto valore SSC, disegnare un cancello lungo la periferia della popolazione usando un diagramma dell&#39;intensità GFP e SSC a prendere una percentuale simile di brillanti cellule da ciascun punto dell&#39;asse SSC (Figura 5, bottom-sinistra lo schema). La popolazione selezionata in (C) dovrebbe essere 0,1-1% della popolazione selezionata in (B). </li><li> Ordina 200 cellule nel tubo di raccolta tenuto conto dei criteri di cui (3.10). Per un processo in massa o per altri progetti richiedono una popolazione più complesso, ordinare altre cellule come necessario. </li><li> Vortex il tubo di raccolta per coprire le celle filtrate con terreno. </li><li> Piastra un sottogruppo di cellule (per esempio, 50 celle) su una piastra YPDA per la genotipizzazione. </li><li> Incubare la piastra a 30 ° C per 2 giorni. </li><li> Fai un lisato per ~ 12 colonie seguendo la procedura (1.5) - (1.8). </li><li> Trasferire le cellule residue sulla punta utilizzata in (1.5) in un posto su un piatto contenente YPDA G418 e Nat toccando delicatamente la piastra con la punta. Aploidi selezionati non dovrebbero crescere su questa piastra. Diploidi può avere copie GFP più e possono quindi essere più luminoso. Questo test può mostrare l&#39;efficienza della selezione aploide. </li><li> Per la genotipizzazione, analisi 1 ml del lisato con 10 microlitri PCR reaction con un primer forward che si appaia alla regione fiancheggiante monte di ogni gene soppresso accoppiato con un primer del CCTGAGAAAGCAACCTGACC sequenza. Multiplex PCR reazioni, se possibile (condizioni può essere determinata utilizzando lisati di singoli mutanti). PCR può essere fatto in un 96 - o 384 pozzetti. Quest&#39;ultimo formato è adatto per il volume di reazione di soli 5 microlitri. Formare gli array di PCR Master Mix differenti in primers e aggiunta di lisati cellulari di queste miscele possono essere effettuati utilizzando pipetta multicanale o un robot di manipolazione dei liquidi. Suggerimento cambiamenti sono facoltativi quando si aggiunge il lisato stesso a diverse miscele di PCR. </li><li> Analizzare prodotti di PCR. Il Gel XL sistema Ultra V-2 elettroforesi (Labnet) è compatibile con il caricamento del campione utilizzando pipette multicanale. </li><li> Sulla base di informazioni da (3.16) e (3.18), identificare aploidi probabile che hanno voluto genotipi. </li><li> Stabilire questi ceppi su un piatto fresco (YPDA, CAA-Ura, o SC-Ura-His/Leu). Inoltre, li congelare in25% glicerolo a -80 ° C. Test aggiuntivi come conferma l&#39;assenza di sequenze wild-type per geni eliminati e pulsed-field gel elettroforesi sono raccomandati. </li><li> Ripetere ciclismo sessuale da (2.1) con ceppi utili. </li></ol>

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Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Come abbiamo sviluppato l&#39;approccio verde mostro, eravamo preoccupati con la possibilità di ricombinazione tra i diversi cassetti di ricambio GFP, con conseguente riarrangiamento del genoma. Attenuare contro questa possibilità è la selezione per le cellule che hanno superato con successo a vari cicli di accoppiamento e meiosi. Cellule recanti genomi riarrangiati dovrebbero essere meno misura dopo l&#39;accoppiamento di cellule senza un riarrangiamento identica. In effetti, non abbiamo osservato alcuna instabilit?...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome del reagente o strumento </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td><td> Commenti (opzionale) </td></tr><tr><td> G418 </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A1720 </td><td> Sciogliere in acqua e filtro-sterilizzare (0,2 micron filtro). Image concentrazione: 200 mg / ml. Conservare a 4 ° C. </td></tr><tr><td> ClonNAT (nourseothricin) </td><td> WERNER BioAgents </td><td> 5001000 </td><td> Sciogliere in acqua e filtro-sterilizzare (0,2 micron filtro). Image concentrazione: 100 mg / ml. Conservare a 4 ° C. </td></tr><tr><td> Doxycycline </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> D9891 </td><td> Sciogliere in etanolo al 50% e filtro-sterilizzare (0,2 micron filtro). Foto di concentrazione: 10 mg / ml. Fai fresco ogni quattro settimane. Scudo da luce utilizzando un foglio di alluminio e conservare a 4 ° C. </td></tr><tr><td> Zymolyase </td><td> ZymoResearch </td><td> E1005 </td><td></td></tr><tr><td> Difco lievito di azoto di base w / o aminoacidi </td><td> BD </td><td> 291940 </td><td></td></tr><tr><td> Revolver (rotatore per tubi) </td><td> Labnet </td><td> H5600 </td><td></td></tr><tr><td> Enduro XL Gel elettroforesi unità </td><td> Labnet </td><td> E0160 </td><td></td></tr><tr><td> Sonifier 450 </td><td> Branson </td><td> 101-063-198 </td><td></td></tr><tr><td> Microtip per Sonifier 450 </td><td> Branson </td><td> 101-148-062 </td><td></td></tr><tr><td> FACSAria cella sorter </td><td> BD </td><td></td><td></td></tr><tr><td> MoFlo cella sorter </td><td> Beckman-Coulter </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Biomek FX o robot equivalente </td><td> Beckman Coulter </td><td></td><td> Facoltativo. Per la realizzazione di PCR di genotipizzazione. </td></tr></tbody> &lt;/ Table&gt;

the green monster process for the generation of yeast strains carrying multiple gene deletions

Fenotipi di una delezione del gene sono spesso rivelati solo quando la mutazione viene testato in un contesto particolare genetica o 1,2 condizione ambientale. Ci sono esempi in cui molti geni devono essere eliminati per smascherare le funzioni del gene nascoste 3,4. Nonostante il potenziale di scoperte importanti, interazioni genetiche che coinvolgono tre o più geni sono in gran parte inesplorate. Ricerche esaustive di multi-mutanti interazioni sarebbe impraticabile a causa del gran numero di possibili combinazioni di delezioni. Tuttavia, studi di insiemi di geni selezionati, quali giochi di paraloghi con una maggiore possibilità di scambio priori una funzione comune, sarebbe informativo. Nel lievito Saccharomyces cerevisiae, knockout gene è realizzato sostituendo un gene con un marcatore selezionabile tramite ricombinazione omologa. Poiché il numero di marcatori è limitata, sono stati sviluppati metodi per rimuovere e riutilizzare il sam<html> 5,6,7,8,9,10 e marcatore. Tuttavia, sequenzialmente mutazioni ingegneria multipli utilizzando questi metodi richiede tempo perché il tempo richiesto scale linearmente con il numero di delezioni da generare. Qui si descrive il metodo Verde Monster per routine ingegnerizzazione molteplici delezioni nel lievito 11. In questo metodo, una proteina verde fluorescente (GFP) reporter integrato in delezioni viene utilizzato per quantitativamente ceppi etichette secondo il numero delle delezioni contenuti in ogni ceppo (Figura 1). Cicli ripetuti di assortimento di GFP-segnate delezioni tramite accoppiamento lievito e meiosi accoppiato con citometria a flusso arricchimento di ceppi che trasportano più di queste delezioni portare all&#39;accumulo di delezioni in ceppi (Figura 2). Esecuzione di più processi in parallelo, con ogni processo che incorpora uno o più delezioni per round, riduce il tempo richiesto per la costruzione ceppo. contenuto &quot;&gt; Il primo passo è quello di preparare aploidi singolo mutanti chiamato &#39;ProMonsters,&#39; ciascuno dei quali porta un reporter GFP in un luogo cancellato e uno dei &#39;toolkit&#39; loci-sia-una GMToolkit verde Monster o GMToolkit-α al . can1Δ locus (Figura 3) utilizzando ceppi della collezione delezione lievito 12, GFP-marcate delezioni possono essere convenientemente generato sostituendo il comune KanMX4 cassetta esistente in questi ceppi con un universale GFP - URA3 frammento Ogni GMToolkit contiene:. sia l&#39;una - o α-accoppiamento di tipo-specifico marcatore di selezione aploide 1 ed esattamente uno dei due marcatori che, quando entrambi sono presenti GMToolkits, collettivamente permettere una selezione di diploidi. Il secondo passo è quello di effettuare il ciclismo sessuale attraverso cui loci cancellare possono essere combinate in una singola cellula dal assortimento casuale e / o recomb meioticaminazione che accompagna ogni ciclo di accoppiamento e la sporulazione.

Quando un ceppo aploide portare quattro eliminazioni GFP segnalati (ycl033cΔ yer042wΔ ykl069wΔ yol118cΔ) è stata incrociata con un α-ceppo aploide portare quattro eliminazioni (ycl033cΔ ydl242wΔ ydl227cΔ yer042wΔ), con due eliminazioni (ycl033cΔ yer042wΔ) condiviso da due ceppi, da un rappresentante risultato è stato ottenuto. La miscela di accoppiamento è stato coltivato in terreno contenente YPDA G418 e Nat per selezionare diploidi. Le diploidi risultanti sono ...

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The Green Monster Process for the Generation of Yeast Strains Carrying Multiple Gene Deletions

Il metodo Green Monster consente l&#39;assemblaggio rapido di delezioni multiple contrassegnati con un reporter gene codificante proteina fluorescente verde. Questo metodo si basa sulla guida ceppi di lievito attraverso cicli ripetuti di assortimento sessuale di delezioni e basato sulla fluorescenza arricchimento di cellule che trasportano più eliminazioni.

Il processo di Green Monster per la generazione di ceppi di lieviti trasporto gene delezioni multiple

Phenotypes  for a gene deletion are often revealed only when the mutation is tested in a  particular genetic background or environmental condition1,2. ...

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Research

JoVE Journal

Biology

14.2K Views.  J. Craig Venter Institute. Il metodo Green Monster consente l'assemblaggio rapido di delezioni multiple contrassegnati con un reporter gene codificante proteina fluorescente verde. Questo metodo si basa sulla guida ceppi di lievito attraverso cicli ripetuti di assortimento sessuale di delezioni e basato sulla fluorescenza arricchimento di cellule che trasportano più eliminazioni.

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A Rapid Technique for the Visualization of Live Immobilized Yeast Cells

We present here a simple, rapid, and extremely flexible technique for the immobilization and visualization of growing yeast cells by epifluorescence microscopy. The technique is equally suited for visualization of static yeast populations, or time courses experiments up to ten hours in length. My microscopy investigates epigenetic inheritance at the silent mating loci in S. cerevisiae. There are two silent mating loci, HML and HMR, which are normally not expressed as they are packaged in heterochromatin. In the sir1 mutant background silencing is weakened such that each locus can either be in the expressed or silenced epigenetic state, so in the population as a whole there is a mix of cells of different epigenetic states for both HML and HMR. My microscopy demonstrated that there is no relationship between the epigenetic state of HML and HMR in an individual cell. sir1 cells stochastically switch epigenetic states, establishing silencing at a previously expressed locus or expressing a previously silenced locus. My time course microscopy tracked individual sir1 cells and their offspring to score the frequency of each of the four possible epigenetic switches, and thus the stability of each of the epigenetic states in sir1 cells. See also  Xu et al., Mol. Cell 2006.

A rapid technique for the visualization of growing immobilized yeast cells, here applied to fluorescent reporters at the silent mating loci HML and HMR

Una tecnica rapida per la visualizzazione di Live cellule di lievito immobilizzato

We present here a simple, rapid, and extremely flexible technique for the immobilization and visualization of growing yeast cells by epifluorescence ...

Ricerca

Biologia

The Preparation of Primary Hematopoietic Cell Cultures From Murine Bone Marrow for Electroporation

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser MXcell  electroporation system and Gene Pulser  electroporation buffer were specifically developed to transfect nucleic acids into mammalian cells and difficult-to-transfect cells, such as primary and stem cells.This video demonstrates how to establish primary hematopoietic cell cultures from murine bone marrow, and then prepare them for electroporation in the MXcell system. We begin by isolating femur and tibia. Bone marrow from both femur and tibia are then harvested and cultures are established. Cultured bone marrow cells are then transfected and analyzed.

This procedure describes how to establish primary hematopoietic cell cultures from murine bone marrow and is followed by transfection using the Gene Pulser MXCell electroporation system.

La preparazione di colture primarie di cellule emopoietiche dal midollo osseo murino per elettroporazione

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser ...

Single-Molecule Imaging of Nuclear Transport

The utility of single molecule fluorescence microscopy approaches has been proven to be of a great avail in understanding biological reactions over the last decade. The investigation of molecular interactions with high temporal and spatial resolutions deep within cells has remained challenging due to the inherently weak signals arising from individual molecules. Recent works by Yang et al. demonstrated that narrow-field epifluorescence microscopy allows visualization of nucleocytoplasmic transport at the single molecule level. By the single molecule approach, important kinetics, such as nuclear transport time and efficiency, for signal-dependent and independent cargo molecules have been obtained. Here we described a protocol for the methodological approach with an improved spatiotemporal resolution of 0.4 ms and 12 nm. The improved resolution enabled us to capture transient active transport and passive diffusion events through the nuclear pore complexes (NPC) in semi-intact cells. We expect this method to be used in elucidating other binding and trafficking events within cells.

Single molecule microscopy approch provided novel insights into nuclear transport.

Singola molecola Imaging dei trasporti nucleari

The utility of single molecule fluorescence microscopy approaches has been proven to be of a great avail in understanding biological reactions over the ...

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more than a decade. Here, we present methods for the isolation of the recombinant Tribolium castaneum TERT (TcTERT) and the reconstitution of the active T. castaneum telomerase ribonucleoprotein (RNP) complex in vitro.
Telomerase is a specialized reverse transcriptase1 that adds short DNA repeats, called telomeres, to the 3' end of linear chromosomes2 that serve to protect them from end-to-end fusion and degradation. Following DNA replication, a short segment is lost at the end of the chromosome3 and without telomerase, cells continue dividing until eventually reaching their Hayflick Limit4. Additionally, telomerase is dormant in most somatic cells5 in adults, but is active in cancer cells6 where it promotes cell immortality7.
The minimal telomerase enzyme consists of two core components: the protein subunit (TERT), which comprises the catalytic subunit of the enzyme and an integral RNA component (TER), which contains the template TERT uses to synthesize telomeres8,9. Prior to 2008, only structures for individual telomerase domains had been solved10,11. A major breakthrough in this field came from the determination of the crystal structure of the active12, catalytic subunit of T. castaneum telomerase, TcTERT1.
Here, we present methods for producing large quantities of the active, soluble TcTERT for structural and biochemical studies, and the reconstitution of the telomerase RNP complex in vitro for telomerase activity assays. An overview of the experimental methods used is shown in Figure 1.

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more than a decade. Here, we present methods for the isolation of the recombinant Tribolium castaneum TERT (TcTERT) and the reconstitution of the active T. castaneum telomerase ribonucleoprotein (RNP) complex in vitro.

Ricostituzione in vitro di Active T. castaneum telomerasi

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more ...

Genome-wide Gene Deletions in Streptococcus sanguinis by High Throughput PCR

Transposon mutagenesis and single-gene deletion are two methods applied in genome-wide gene knockout in bacteria 1,2. Although transposon mutagenesis is less time consuming, less costly, and does not require completed genome information, there are two weaknesses in this method: (1) the possibility of a disparate mutants in the mixed mutant library that counter-selects mutants with decreased competition; and (2) the possibility of partial gene inactivation whereby genes do not entirely lose their function following the insertion of a transposon. Single-gene deletion analysis may compensate for the drawbacks associated with transposon mutagenesis. To improve the efficiency of genome-wide single gene deletion, we attempt to establish a high-throughput technique for genome-wide single gene deletion using Streptococcus sanguinis as a model organism. Each gene deletion construct in S. sanguinis genome is designed to comprise 1-kb upstream of the targeted gene, the aphA-3 gene, encoding kanamycin resistance protein, and 1-kb downstream of the targeted gene. Three sets of primers F1/R1, F2/R2, and F3/R3, respectively, are designed and synthesized in a 96-well plate format for PCR-amplifications of those three components of each deletion construct. Primers R1 and F3 contain 25-bp sequences that are complementary to regions of the aphA-3 gene at their 5' end. A large scale PCR amplification of the aphA-3 gene is performed once for creating all single-gene deletion constructs. The promoter of aphA-3 gene is initially excluded to minimize the potential polar effect of kanamycin cassette. To create the gene deletion constructs, high-throughput PCR amplification and purification are performed in a 96-well plate format. A linear recombinant PCR amplicon for each gene deletion will be made up through four PCR reactions using high-fidelity DNA polymerase. The initial exponential growth phase of S. sanguinis cultured in Todd Hewitt broth supplemented with 2.5% inactivated horse serum is used to increase competence for the transformation of PCR-recombinant constructs. Under this condition, up to 20% of S. sanguinis cells can be transformed using ~50 ng of DNA. Based on this approach, 2,048 mutants with single-gene deletion were ultimately obtained from the 2,270 genes in S. sanguinis excluding four gene ORFs contained entirely within other ORFs in S. sanguinis SK36 and 218 potential essential genes. The technique on creating gene deletion constructs is high throughput and could be easy to use in genome-wide single gene deletions for any transformable bacteria.

Genome-wide Gene Deletions in Streptococcus sanguinis by High Throughput PCR

An efficient genome-wide single gene mutation method has been established using Streptococcus sanguinis as a model organism. This method has achieved via high throughput recombinant PCRs and transformations.

Genome-wide gene delezioni in<em&gt; Streptococcus sanguinis</em&gt; Da Throughput PCR ad alta

Transposon  mutagenesis and single-gene deletion are two methods applied in genome-wide  gene knockout in bacteria 1,2. Although transposon mutagenesis is ...

Budding Yeast Protein Extraction and Purification for the Study of Function, Interactions, and Post-translational Modifications

Homogenization by bead beating is a fast and efficient way to release DNA, RNA, proteins, and metabolites from budding yeast cells, which are notoriously hard to disrupt. Here we describe the use of a bead mill homogenizer for the extraction of proteins into buffers optimized to maintain the functions, interactions and post-translational modifications of proteins. Logarithmically growing cells expressing the protein of interest are grown in a liquid growth media of choice. The growth media may be supplemented with reagents to induce protein expression from inducible promoters (e.g. galactose), synchronize cell cycle stage (e.g. nocodazole), or inhibit proteasome function (e.g. MG132). Cells are then pelleted and resuspended in a suitable buffer containing protease and/or phosphatase inhibitors and are either processed immediately or frozen in liquid nitrogen for later use. Homogenization is accomplished by six cycles of 20 sec&#160;bead-beating (5.5 m/sec), each followed by one minute incubation on ice. The resulting homogenate is cleared by centrifugation and small particulates can be removed by filtration. The resulting cleared whole cell extract (WCE) is precipitated using 20% TCA for direct analysis of total proteins by SDS-PAGE followed by Western blotting. Extracts are also suitable for affinity purification of specific proteins, the detection of post-translational modifications, or the analysis of co-purifying proteins. As is the case for most protein purification protocols, some enzymes and proteins may require unique conditions or buffer compositions for their purification and others may be unstable or insoluble under the conditions stated. In the latter case, the protocol presented may provide a useful starting point to empirically determine the best bead-beating strategy for protein extraction and purification. We show the extraction and purification of an epitope-tagged SUMO E3 ligase, Siz1, a cell cycle regulated protein that becomes both sumoylated and phosphorylated, as well as a SUMO-targeted ubiquitin ligase subunit, Slx5.

The preparation of high quality yeast cell extracts is a necessary first step in the analysis of individual proteins or entire proteomes. Here we describe a fast, efficient, and reliable homogenization protocol for budding yeast cells that has been optimized to preserve protein functions, interactions, and post-translational modifications.

Germogliamento lievito proteine ​​estrazione e purificazione per lo Studio della funzione, interazioni e modificazioni post-traduzionali

Homogenization by bead beating is a fast and efficient way to release DNA, RNA, proteins, and metabolites from budding yeast cells, which are notoriously ...

Nanogold Labeling of the Yeast Endosomal System for Ultrastructural Analyses

Endosomes are one of the major membrane sorting checkpoints in eukaryotic cells and they regulate recycling or destruction of proteins mostly from the plasma membrane and the Golgi. As a result the endosomal system plays a central role in maintaining cell homeostasis, and mutations in genes belonging to this network of organelles interconnected by vesicular transport, cause severe pathologies including cancer and neurobiological disorders. It is therefore of prime relevance to understand the mechanisms underlying the biogenesis and organization of the endosomal system. The yeast Saccharomyces cerevisiae has been pivotal in this task. To specifically label and analyze at the ultrastructural level the endosomal system of this model organism, we present here a detailed protocol for the positively charged nanogold uptake by spheroplasts followed by the visualization of these particles through a silver enhancement reaction. This method is also a valuable tool for the morphological examination of mutants with defects in endosomal trafficking. Moreover, it is not only applicable for ultrastructural examinations but it can also be combined with immunogold labelings for protein localization investigations.

Yeast, Saccharomyces cerevisiae, has been a key model organism to identify and study genes regulating the biogenesis and functions of the endosomal system. Here we present a detailed protocol for the specific labeling of the endosomal compartments for ultrastructural studies.

Nanogold Etichettatura del Sistema lievito endosomiale per le analisi ultrastrutturali

Endosomes are one of the major membrane sorting checkpoints in eukaryotic cells and they regulate recycling or destruction of proteins mostly from the ...

Isolating Potentiated Hsp104 Variants Using Yeast Proteinopathy Models

Many protein-misfolding disorders can be modeled in the budding yeast Saccharomyces cerevisiae. Proteins such as TDP-43 and FUS, implicated in amyotrophic lateral sclerosis, and &#945;-synuclein, implicated in Parkinson&#8217;s disease, are toxic and form cytoplasmic aggregates in yeast. These features recapitulate protein pathologies observed in patients with these disorders. Thus, yeast are an ideal platform for isolating toxicity suppressors from libraries of protein variants. We are interested in applying protein disaggregases to eliminate misfolded toxic protein conformers. Specifically, we are engineering Hsp104, a hexameric AAA+ protein from yeast that is uniquely capable of solubilizing both disordered aggregates and amyloid and returning the proteins to their native conformations. While Hsp104 is highly conserved in eukaryotes and eubacteria, it has no known metazoan homologue. Hsp104 has only limited ability to eliminate disordered aggregates and amyloid fibers implicated in human disease. Thus, we aim to engineer Hsp104 variants to reverse the protein misfolding implicated in neurodegenerative disorders. We have developed methods to screen large libraries of Hsp104 variants for suppression of proteotoxicity in yeast. As yeast are prone to spontaneous nonspecific suppression of toxicity, a two-step screening process has been developed to eliminate false positives. Using these methods, we have identified a series of potentiated Hsp104 variants that potently suppress the toxicity and aggregation of TDP-43, FUS, and &#945;-synuclein. Here, we describe this optimized protocol, which could be adapted to screen libraries constructed using any protein backbone for suppression of toxicity of any protein that is toxic in yeast.

Yeast proteinopathy models are valuable tools to assess the toxicity and aggregation of proteins implicated in disease. Here, we present methods for screening Hsp104 variant libraries for toxicity suppressors. This protocol could be adapted to screen any protein library for toxicity suppressors of any protein that is toxic in yeast.

L&#39;isolamento potenziato Hsp104 Varianti Utilizzando lievito Proteinopathy modelle

Many protein-misfolding disorders can be modeled in the budding yeast Saccharomyces cerevisiae. Proteins such as TDP-43 and FUS, implicated in amyotrophic ...

Generation of Genomic Deletions in Mammalian Cell Lines via CRISPR/Cas9

The prokaryotic clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/CRISPR-associated (Cas) 9 system may be re-purposed for site-specific eukaryotic genome engineering. CRISPR/Cas9 is an inexpensive, facile, and efficient genome editing tool that allows genetic perturbation of genes and genetic elements. Here we present a simple methodology for CRISPR design, cloning, and delivery for the production of genomic deletions. In addition, we describe techniques for deletion, identification, and characterization. This strategy relies on cellular delivery of a pair of chimeric single guide RNAs (sgRNAs) to create two double strand breaks (DSBs) at a locus in order to delete the intervening DNA segment by non-homologous end joining (NHEJ) repair. Deletions have potential advantages as compared to single-site small indels given the efficiency of biallelic modification, ease of rapid identification by PCR, predictability of loss-of-function, and utility for the study of non-coding elements. This approach can be used for efficient loss-of-function studies of genes and genetic elements in mammalian cell lines.

CRISPR/Cas9 is a robust system to produce disruption of genes and genetic elements. Here we describe a protocol for the efficient creation of genomic deletions in mammalian cell lines using CRISPR/Cas9.

Generazione di Genomic eliminazioni in linee cellulari di mammiferi via CRISPR / Cas9

The prokaryotic clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/CRISPR-associated (Cas) 9 system may be re-purposed for site-specific ...

Applications of pHluorin for Quantitative, Kinetic and High-throughput Analysis of Endocytosis in Budding Yeast

Green fluorescent protein (GFP) and its variants are widely used tools for studying protein localization and dynamics of events such as cytoskeletal remodeling and vesicular trafficking in living cells. Quantitative methodologies using chimeric GFP fusions have been developed for many applications; however, GFP is somewhat resistant to proteolysis, thus its fluorescence persists in the lysosome/vacuole, which can impede quantification of cargo trafficking in the endocytic pathway. An alternative method for quantifying endocytosis and post-endocytic trafficking events makes use of superecliptic pHluorin, a pH-sensitive variant of GFP that is quenched in acidic environments. Chimeric fusion of pHluorin to the cytoplasmic tail of transmembrane cargo proteins results in a dampening of fluorescence upon incorporation of the cargo into multivesicular bodies (MVBs) and delivery to the lysosome/vacuole lumen. Thus, quenching of vacuolar fluorescence facilitates quantification of endocytosis and early events in the endocytic pathway. This paper describes methods using pHluorin-tagged cargos for quantification of endocytosis via fluorescence microscopy, as well as population-based assays using flow cytometry.

Accurate quantification of vesicular trafficking events often provides key insights into roles for specific proteins and the effects of mutations. This paper presents methods for using superecliptic pHluorin, a pH-sensitive GFP variant, as a tool for quantification of endocytic events in living cells using quantitative fluorescence microscopy and flow cytometry.

Le domande di pHluorin per quantitativa, Cinetica e high-throughput analisi di endocitosi in germogliamento lievito

Green fluorescent protein (GFP) and its variants are widely used tools for studying protein localization and dynamics of events such as cytoskeletal ...