Questo protocollo ci permette di eseguire una manipolazione genetica in vivo in un modello animale chiave che ci permette di studiare l'espansione e la piegatura di una neocorteccia in via di sviluppo. Il principale vantaggio di questo metodo è nell'utilizzare un'elevata specificità spaziale e temporale nel colpire quelle cellule staminali neurali che sono il tipo di cellula chiave per lo sviluppo cerebrale. Prima di iniziare la procedura, tirare i capillari in vetro su un estrattore a micro pipetta e utilizzare le forcep per tagliare la parte distale del capillare per regolare il diametro della punta capillare.
Il giorno 33 embrionale, aggiungere l'appropriata concentrazione di DNA in PBS, integrata con 0,1%Fast Green con miscelazione delicata, e posizionare un furetto femminile incinta a 3 ore, anestetizzato, su un tavolo operativo con un riscaldatore. Confermare il livello appropriato di sedazione toccando la pelle perioculare e pizzicando la pelle tra la seconda e la terza o la terza e la quarta dita dei piedi di entrambi gli arti posteriori. L'isoflurane può causare effetti avversi, tra cui nausea e vertigini.
Quando si maneggia l'isoflurane in forma liquida, utilizzare l'attrezzatura di protezione. Durante l'intervento chirurgico, utilizzare contenitori appropriati per catturare il gas. Iniettare l'animale per via sottocutanea con analgesico, antibiotico e glucosio e posizionare un unguento sugli occhi dell'animale.
Utilizzare i tosaerba per radere l'addome e pulire la pelle esposta con una soluzione di acqua, sapone e iodio. Quindi, asciugare la pelle con tamponi di garza e disinfettare con alcool e scrub allo iodio. Per l'elettroporazione in utero, posizionare un drappo sterile sull'animale e utilizzare un bisturi per fare un'incisione cutanea di circa 5 centimetri alla linea alba.
Usa le forbici per tagliare lo strato muscolare e posizionare tamponi di garza intorno al sito di incisione. Bagnare la garza con PBS e posizionare l'utero sui tamponi. Utilizzando una pipetta con una punta lunga, caricare uno dei capillari di vetro tirato con 5 microlitri di soluzione di DNA per embrione da iniettare.
Attaccare il capillare caricato a un supporto e collegare l'altro lato del supporto a un tubo e a un boccaglio. Individuare la testa del primo embrione e posizionare una sorgente luminosa in fibra ottica accanto alla testa. Utilizzando l'iride pigmentata come punto di riferimento, penetrare nella pelle, nel cranio e nel tessuto cerebrale con la punta del capillare di vetro e utilizzare la pipettazione della bocca per facilitare la consegna di 3-5 microlitri della soluzione di iniezione nel ventricolo di uno degli emisferi cerebrali.
Poiché la soluzione iniettata contiene lo 0,1% di Verde veloce, un'iniezione riuscita comporterà una colorazione verde scuro del ventricolo iniettato, che ora sarà visibile come struttura a forma di rene. Dopo l'iniezione, posizionare gli elettrodi di pinzetta sull'utero sopra la testa dell'embrione con il polo positivo sopra l'area da prendere di mira e il polo negativo sotto l'area iniettata. Impostare la lunghezza dell'impulso dell'elettroporate su 50 millisecondi, la tensione dell'impulso su 100 volt, l'intervallo di impulsi su un secondo e il numero di impulsi su cinque.
Una volta impostati tutti i parametri, premere Pulse" e far cadere rapidamente diverse gocce di PBS caldo sull'embrione elettroporato. Quando tutti gli embrioni sono stati elettroporati, riportare l'utero alla cavità peritoneale e utilizzare una sutura 4-0 per chiudere lo strato muscolare con il peritoneo. Chiudere la pelle in modo simile e coprire la ferita con spray all'alluminio.
Quindi riportare l'animale nella sua gabbia con una fonte di calore e monitorare fino alla piena recumbency. Quattro giorni dopo l'elettroporazione al giorno 37 embrionale, la maggior parte delle cellule mirate e la loro progenie si trovano ancora nelle zone germinali e le cellule sono raramente osservate ulteriormente basalmente all'interno della piastra corticale. L'identità del progenitore può essere esaminata per immunofluorescenza per marcatori di cellule cicliche, come il PCNA, mentre un sottoinsieme di progenitori sottoposti a mitosi può essere mostrato da marcatori come fosfo-istone 3.
Al giorno zero postnatale, otto giorni dopo l'elettroporazione, la progenie delle cellule mirate si diffuse in tutti gli strati istologici. Usando una combinazione di marcatori del fattore di trascrizione, possono essere rivelate diverse popolazioni di progenitori basali. Ad esempio, Sox2 è un marcatore di cellule progenitrici prolifeative, incluso il glia radiale basale.
E la proteina cerebrale T-box 2 è un marcatore dei progenitori basali neurogenici, che sono principalmente progenitori intermedi. Entro il giorno 16 postnatale, la maggior parte delle cellule mirate smette di dividersi e differenziarsi in neuroni e glia, con la neocorteccia del giorno postnatale del furetto 16 che mostra il caratteristico schema pieghevole. L'elettroporazione in utero degli embrioni di furetto è un metodo estremamente potente per studiare la funzione dei geni.
Ci ha permesso di studiare i geni che sono stati implicati nell'espansione della neocorteccia nell'evoluzione, compresi i geni specifici dell'uomo. E usando questo potente metodo, siamo stati davvero in grado di scoprire le caratteristiche chiave di come funzionava probabilmente l'espansione evolutiva della neocorteccia umana.
