L'inizio dell'apoptosi è mediato dall'attivazione di caspasi su piattaforme molecolari marcatori. Presentiamo il rilevamento del complesso di morte cellulare di iniziazione chiave DISC, che funge da piattaforma per l'attivazione della caspasi-8. Il vantaggio di questa tecnica è che consente il rilevamento dell'assemblaggio e la composizione del complesso DISC oltre a fornire informazioni sulla lavorazione della caspasi-8 in questo complesso.
Inizia l'esperimento con cellule che sono dall'80% al 90% confluenti e aderenti al piatto. Scartare il mezzo e aggiungere mezzo fresco alle cellule aderenti. Quindi stimolare le cellule con la concentrazione selezionata di CD95L tenendo la piastra ad angolo e pipettando il ligando nel mezzo senza toccare le cellule aderenti.
Per raccogliere le cellule, posizionare la capsula cellulare sul ghiaccio. Aggiungere 10 millilitri di PBS freddo alla sospensione cellulare e raschiare le cellule attaccate dalla piastra. Raccogliere la sospensione cellulare in un tubo da 50 millilitri.
Lavare la capsula con 10 millilitri di PBS freddo due volte e aggiungere la soluzione di lavaggio nello stesso tubo da 50 millilitri. Quindi centrifugare la sospensione cellulare a 500 volte G per cinque minuti a quattro gradi Celsius. Dopo aver scartato il surnatante, risospese il pellet cellulare in un millilitro di PBS freddo.
Quindi trasferire la sospensione cellulare in un tubo da 1,5 millilitri. Centrifugare la sospensione cellulare e risospespare nuovamente il pellet cellulare in un millilitro di PBS freddo. Ripetere nuovamente la centrifugazione, quindi risospesciare il pellet cellulare in un millilitro di tampone di lisi e incubarlo per 30 minuti sul ghiaccio.
Dopo l'incubazione, centrifugare il lisato alla massima velocità per 15 minuti a quattro gradi Celsius, quindi trasferire il surnatante in un tubo pulito. Scartare il pellet e raccogliere un campione di 50 microliti di lisato in un altro tubo per determinare la concentrazione proteica. Per l'immunoprecipitazione, aggiungere due microlitri di anticorpo anti-APO1 e 10 microlitri di perline di sefarosio di proteina A preparate al lisato.
Aggiungere 10 microlitri delle sole perline a un tubo separato contenente il lisato per fungere da controllo delle perline. Incubare la miscela contenente il lisato, gli anticorpi e le perle di sefarosio della proteina A durante la notte a quattro gradi Celsius con una miscelazione delicata. Il giorno seguente, centrifugare la miscela a 500 volte G per quattro minuti a quattro gradi Celsius.
Dopo aver scartato il surnatante, lavare le perline aggiungendo un millilitro di PBS freddo e scartando il surnatante dopo la centrifugazione. Ripetere questo passaggio almeno tre volte. Dopo aver scartato l'ultimo lavaggio PBS, aspirare le perline preferibilmente con una siringa Hamilton da 50 microlitri.
Per eseguire il Western blot, aggiungere 20 microlitri di buffer di carico 4X alle perline e riscaldare a 95 gradi Celsius per 10 minuti. Allo stesso tempo, riscaldare i controlli lisati a 95 gradi Celsius per cinque minuti. Caricare i lisati, gli immunoprecipipitanti e uno standard proteico su un gel SDS al 12,5% e funzionare con una tensione costante di 80 volt.
Al termine del gel, trasferire le proteine dal gel SDS a una membrana di nitrocellulosa. Al termine del trasferimento, posizionare la membrana cancellata in una scatola e incubarla per un'ora in soluzione bloccante sotto delicata agitazione, quindi lavare la membrana tre volte per cinque minuti con PBST. Per rilevare le proteine, aggiungere il primo anticorpo primario alla diluizione indicata alla membrana e incubarlo durante la notte a quattro gradi Celsius con una delicata agitazione.
Il giorno successivo, lavare la membrana con tre lavaggi PBST di cinque minuti, quindi incubare la membrana con 20 millilitri di anticorpo secondario con un leggero scuotimento per un'ora a temperatura ambiente. Lavare nuovamente la membrana tre volte con PBST. Dopo aver scartato l'ultimo lavaggio PBST, aggiungere circa un millilitro di substrato di perossidasi di rafano alla membrana e rilevare il segnale di chemioluminescenza.
La stimolazione delle cellule HeLa-CD95 del cancro cervicale con CD95L ha determinato un alto livello di formazione di CD95 DISC monitorato tramite immunoprecipitazione CD95. CD95, FADD, procaspasi-8, procaspasi-10 e c-FLIPS sono stati osservati in queste immunoprecipitazioni CD95 che indicano un'efficiente formazione di DISC. I prodotti di scissione di p43-FLIP e p22-FLIP sono stati rilevati nelle immunoprecipitazioni, indicando l'attivazione della caspasi-8.
Le cellule HeLa-CD95 che sovraesprimono c-FLIP long sono state utilizzate per l'analisi della formazione di CD95 DISC. Analogamente alle cellule HeLa-CD95 parentali, nessun reclutamento di FADD, procaspasi-9, procaspasi-10, proteine c-FLIP e PARP1 è stato rilevato nelle immunoprecipitazioni da queste cellule senza trattamento con CD95L. Le cellule T primarie attivate erano caratterizzate da alti livelli di CD95, FADD, procaspasi-8, procaspasi-10 e c-FLIPS nelle immunoprecipitazioni anti-CD95.
Questa tecnica consente l'analisi della formazione molecolare di DISC, compresa l'elaborazione della caspasi-8 al DISC. Tutte le fasi di lavaggio sono molto importanti. Inoltre, i punti di stimolazione e i tempi di incubazione dovrebbero essere presi sul serio.
Questo è l'unico modo per misurare l'assieme sul complesso DISC. Tuttavia, per misurare l'attivazione della caspasi-8, si possono anche implementare saggi di attività della caspasi-8. Questo approccio ci ha permesso di ottenere nuove informazioni sull'iniziazione dell'apoptosi.
