Gli autori desiderano ringraziare Catherine Alford per suggerimenti su metodi di dissociazione cellulare e Kevin Weller, David Flaherty e Bretagna Matlock per il supporto nel Resource Citometria a Flusso in comune presso la Vanderbilt University Medical Center e Melissa A. Musser per l&#39;assistenza artistica con illustrazioni. Ringraziamo Drs. Jack Mosher e Sean Morrison per consigli sulla realizzazione di isolamento dei progenitori neuronali. Il VMC Resource Citometria a Flusso in comune è sostenuta dalla Vanderbilt Ingram Cancer Center (P30 CA68485) e la Vanderbilt Digestive Disease Research Center (P30 DK058404). Questo lavoro è stato sostenuto da un finanziamento da US National Institutes of sovvenzioni Salute DK064251, DK086594 e DK070219.

1. Preparazione di Media (Tutte le fasi fatto in cappa di coltura di tessuti) <ol><li> Combina il seguente: 44 L-15 ml media, 0,5 ml 100X penicillina / streptomicina (P / S), 0,5 ml 100 mg / ml di albumina sierica bovina (BSA), 0,5 ml HEPES 1M, 5 ml di acqua Tissue Culture Grade. Assicurarsi di mescolare BSA e P / S bene prima di aggiungere. Questo volume dovrebbe essere adeguato per la dissociazione di un massimo di cinque tipi diversi tessuti. Questo supporto sarà utilizzato nel passaggio 3,4 per preparare le soluzioni di raffreddamento rapido per l&#39;uso dopo dissociazione enzimatica del tessuto. </li><li> Media filtrante sebbene 0,22 micron polieteresulfone (PES) del filtro. </li><li> Preparare la soluzione Balanced Salt 1X Hank (HBSS) e fosfato 1X Buffered Saline (PBS) provenienti dalle scorte di 10X usando cultura dell&#39;acqua dei tessuti di qualità. Filtrare su filtro 0,22 micron PES. Grandi volumi di questi reagenti possono essere preparate in anticipo e conservato a 4 ° C, aliquotando piccoli volumi in una cappa coltura tissutale come necessario. </li><li> Riempire più provette da 15 ml coniche con 1x HBSS (numero di tubi per eguagliare il numero di tessuti si ha intenzione di sub-dissezione), mantenendo i tubi su ghiaccio. </li></ol> 2. Dissezione <ol><li> Eutanasia cronometrato del mouse in stato di gravidanza in conformità con la cura degli animali istituzionali e protocolli delle commissioni di utilizzo autorizzati e trasferimento in utero di 60 o 100 mm Petri contenente ghiacciata 1X PBS. </li><li> Rimuovere embrioni da utero e l&#39;eutanasia per decapitazione in ghiacciato 1X PBS. Schermo individualmente sotto l&#39;illuminazione a fluorescenza, dividendosi in positivo transgenici e wild-type (WT) nontransgenic piscine. Mantenere gli embrioni in ghiacciato 1X PBS in tutta la dissezione. </li><li> Sotto un microscopio da dissezione, sub-sezionare il tratto urogenitale. Tenere l&#39;embrione in atto a livello degli arti anteriori con pinze sottili. Rimuovere il visceri dal fegato fino al tubercolo genitale inserendo pinza a livello del diaframma poi bruscamente tirando gli organi interni basso e lontano dalla parete del corpo dorsale. </li><li> Ulteriori sub-sezionare il tessuto diinteresse dal tessuto circostante (Figura 1). Collocare ciascuna singolarmente sub-sezionato tipo di tessuto in una provetta da 15 ml contenente ghiaccio HBSS freddo 1X. Pool ogni tipo di tessuto insieme secondo fenotipo embrionale (ossia tutte le GFP + campioni di intestino fetale sono raggruppate in un unico tubo 15 ml). </li><li> In parallelo, sezionare i tessuti comparabili da wild-type embrioni da utilizzare per i controlli di compensazione in citometria a flusso. </li></ol> 3. La dissociazione dei tessuti Subdissected <ol><li> Pellet sub-sezionato tessuto mediante centrifugazione a 210 centrifuga relativa (RCF), 4 ° C per 5 min. Dopo la centrifugazione, aspirare fuori come HBSS il più possibile. </li><li> Risospendere il precipitato di tessuto in Accumax (Innovative Cell Technologies, Inc), avendo cura di cambiare puntali per pipette tra ciascun campione per evitare la contaminazione incrociata dei tipi di tessuto. La quantità di Accumax aggiunto può essere scalato per quantità maggiori o minori di tessuto. Tipicamente per 1-5 Campioni dell&#39;intestino fetale, 1 ml di Accumax verrebbe utilizzato ma piscine tessuto più grandi richiedono un maggior volume per ottenere dissociazione. </li><li> Porre le provette 37 ° C in bagno d&#39;acqua per 20-45 min a seconda fase del tessuto che viene isolato (per es 13,5 intestino DPC 20 min, 15,5 intestino DPC 35 min). A metà se il tempo dissociazione, manualmente rompere il tessuto battendo il tubo contro il lato del bagno d&#39;acqua (o qualsiasi superficie solida) e da &quot;sfogliare&quot; il tubo (come si shake down un vecchio termometro a mercurio). Alla fine del tempo di dissociazione ripetere la shake giù operazione più volte per dissociare ulteriormente il campione. Per i campioni più fragili, ridurre il vigorousness del shake down e di utilizzare invece triturazione pipetta durante il Passo 3,5 per raggiungere un adeguato livello di dissociazione. I tempi tipici di dissociazione per 14,5 e 15,5 DPC DPC LUT sono 35 e 45 min, rispettivamente. </li><li> Mentre il tessuto è in incubazione Accumax, make up Quenching cosìluzioni, chiamato Quench e Quench 1:5. Quench è fatto con l&#39;aggiunta di 45 microlitri 5 mg / ml DNasi I a 6 ml L-15 Media. Quench 01:05 è fatta con l&#39;aggiunta di 45 microlitri 5 mg / ml DNasi I 30 ml L-15 Media. </li><li> Alla fine di dissociazione, spostare provette da 15 ml su ghiaccio e subito aggiungere 1 ml Quench in ciascun tubo. IMPASTARE ciascun campione su e giù finché il tessuto è quasi completamente dissociato (Figura 2). Ci saranno ancora alcuni piccoli pezzi di tessuto presente nella soluzione. Il raggiungimento di un campione del tutto omogeneo non è né facilmente realizzabile né auspicabile in quanto può portare a scarsa vitalità delle cellule. </li><li> Mantenere campione su ghiaccio per quanto possibile per il resto del protocollo. Assicurarsi di utilizzare un nuovo puntale per pipetta quando pipettando su Quench o Quench 01:05 per evitare la contaminazione incrociata dei campioni. </li></ol> 4. Filtraggio sospensione cellulare <ol><li> Utilizzo di pinze che sono stati immersi in 70% etanolo, posizionare un 3 cm quadrati di 38 um membrana maglia di nylon (Sefar America) sulla bocca di un nuovo tubo di 15 ml. Celle filtranti attraverso la rete pipettando nella centro della membrana usando punte strette foro. Se la membrana si satura mentre filtraggio, rimuoverlo, asciugare la bocca del tubo con un Kimwipe, e utilizzare un nuovo pezzo di maglia di nylon per filtrare il resto della sospensione cellulare. Una volta che tutte le cellule sono stati filtrati, usare 1 ml Quench 1:5 a sciacquare il tubo e filtrare tutte le cellule rimanenti. </li><li> Quando il filtro è completa, o quando si sostituisce una membrana intasato, utilizzare forcipe per arrotolare i lati della maglia e pulire la membrana attraverso superiore del tubo per rimuovere eventuali gocce di cellule sospese. </li><li> Pellet sospensione cellulare mediante centrifugazione a 210rcf, 4 ° C per 5 min. Aspirare off surnatante e risospendere pellet in 1 ml Quench 1:5. </li><li> Sospensione cellulare attraverso il filtro rete di nylon in 5 provette di polistirene ml. Lavare tubo di 15 ml con 1 ml Quench 1:5 e filtro per catturare tutte le cellule rimanenti. </li></ol> 5. Preparazione dei campioni per FACS <ol&gt; <li> Se si utilizza lo stesso tessuto per l&#39;ordinamento e per i controlli di compensazione, trasferire 1/10 ° a 1/20 del volume esimo campione ad un nuovo tubo 5 ml polistirene da utilizzare per i controlli di compensazione. Dividere il wild-type campione di tessuto in due parti. Una parte viene macchiata di tipo selvatico (WT solo) mentre la seconda metà avrà 7-Aminoactinomycin D (7-AAD, un intercalatore fluorescente escluso dalle cellule vivi utilizzati come &quot;viabilità macchia&quot;) aggiunto ad esso (7-AAD solo ). Questi singoli controlli sono necessari per consentire la compensazione di eventuali sovrapposizioni tra le spettrali emissione di fluorofori discreti al selezionatore di flusso. Ad esempio, per un reporter fluorescente come EGFP, necessari controlli dovrebbe includere: EGFP solo, non marcate cellule in peso, e un tubo colorato con 7-AAD solo (figura 3). </li><li> Riempire tutte le provette da 5 ml contenenti sospensione cellulare con Quench 1:5 e centrifugare a 210rcf, 4 ° C per 5 min. Aspirare il surnatante, lasciando circa 200 ul di liquidoin provetta. </li><li> Diluire 7-AAD 1:1000 in Quench 1:5. Aggiungi 7-AAD diluizione colorazione a 7-AAD controllo della compensazione solo e campioni da ordinati. Non aggiungere 7-AAD alla EGFP solo o WT controlli di compensazione solo. Volume di 7-AAD da aggiungere variano in base alla quantità di materiale di partenza e dimensione del pellet cellulare ottenuto. Dopo 7-AAD è stato aggiunto a tubi appropriati, i campioni sono pronti per essere ordinati. <table border="1"><tbody><tr><td> Tessuto </td><td> Esempio Pool Size </td><td> Volume 7-AAD da aggiungere * provetta </td></tr><tr><td> 15,5 DPC Intestino </td><td> 1-5 </td><td> 200 pl </td></tr><tr><td> 15,5 DPC LUT </td><td> 1-5 </td><td> 150 pl </td></tr></tbody></table> Tabella 1. Quantità di 7-AAD aggiunto dissocia tessuti diversi * l&#39;ammontare totale finale in ciascun tubo varia da una quantità variabile dal 50-100 pl poiché l&#39;aspirazione di media è unn processo approssimativo ed eseguito per evitare il pellet. Volumi finali non sono misurate in modo da minimizzare la manipolazione di cellule in soluzione. </li><li> Preparare le provette di raccolta per catturare le cellule per l&#39;isolamento di RNA con l&#39;aggiunta di 0,75 ml TRIzol-LS ai tubi microcentrifuga 1,5 ml. </li><li> Se la raccolta di cellule per la coltura in vitro, anziché isolamento RNA, cellule ordinamento direttamente in automantenimento media in piastre da 6 pozzetti di coltura, rivestito con fibronectina e riempito con mezzi come descritto in precedenza. 2,6,7 </li></ol> 6. Citometria a Flusso <ol><li> Al citofluorimetro, valutare la compensazione controlli prima, avendo cura di lavare di nuovo tra ciascun campione per evitare la contaminazione. Utilizzare i profili dei campioni di compensazione per impostare tensioni / cancelli per l&#39;ordinamento. Si noti che se le cellule positive nel tessuto desiderato sono presenti in numero di limitazione, un tessuto distinto può essere utilizzato per stabilire le impostazioni di compensazione finché l&#39;intensità di fluorescenza e la dimensione della cellatra i campioni sono paragonabili. </li><li> Impostare i parametri di compensazione e cancelli per evitare le cellule morte che occupano 7-AAD dye e raccogliere le cellule che presentano alta intensità di fluorescenza GFP rispetto ai controlli non colorati (Figura 4). </li><li> Ordinare massimamente 25.000 cellule in ciascuna provetta. L&#39;ordinamento deve essere effettuata presso la pressione più bassa possibile con un ugello largo foro e bassa portata (ad esempio, 17psi, 100 ugelli um, 3000 eventi al secondo) per preservare la vitalità neuronale progenitore. Per i tipi di isolare le cellule EGFP + svolgiamo le nostre isolamenti su un BD Biosciences FACSAriaII utilizzando un laser 488nm 20mW per eccitare il reporter EGFP. </li><li> Se i campioni di cellule contengono concentrazioni elevate, si consiglia di diluire la sospensione cellulare inoltre, si avvale 1:1000 7-AAD macchia per raggiungere efficienze di cattura più elevati durante l&#39;ordinamento. </li><li> Vortex ogni provetta delle cellule catturato in TRIzol-LS subito dopo l&#39;ordinamento. </li></ol> 7. Risultati rappresentativi Tissue dissociazione per produrre un sospensioni cellulari per l&#39;ordinamento di flusso è un delicato equilibrio tra adeguata digestione enzimatica ed evitare l&#39;eccessiva digestione che può portare a Viabilità di cellule basse. Un esempio di tessuto desiderato livello di dissociazione è mostrato in Figura 2. Nel tessuto opportunamente digerito pezzi prima triturazione manuali di organi sub-sezionati sono ancora ben evidente (Figura 2b, 2f). In tessuti che vengono trattate enzimaticamente per troppo tempo un periodo di tempo o eccessivamente alta concentrazione di enzima, la sospensione risultante manchino pezzi residui grandi quantità di tessuto (figura 2d, 2h). Adeguata dissociazione e filtraggio manuale produrre profili di ordinamento in citometria a flusso che mostrano tipicamente superiore al 90% di cellule vitali e mostrano alti livelli di espressione di EGFP (Figura 4). Popolazioni cellulari ottenuti con questo metodo illustrano beneeconomico-finanziaria e può essere catturata per la cultura o la successiva analisi dell&#39;espressione genica mediante gating per la cattura di EGFP + progenitori neuronali. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/4188/4188fig1.jpg" /> Figura 1. Distribuzione dei TH-EGFP + progenitori neuronali LUT del mouse fetale. Whole-mount tratto urogenitale a 15.5 dpc visto ventralmente sotto illuminazione in campo chiaro (a) rispetto alla distribuzione delle cellule EGFP + etichettati da TH-EGFP espressione del transgene identificato con l&#39;illuminazione a fluorescenza (b). TH-EGFP espressione è presente in ghiandole surrenali (a) e nei gangli celiaco trova medialmente (cg). Laterale (c) vista di 15,5 DPC TH-EGFP sotto-sezionati mostre vescica fluorescenza da espressione del transgene nei gangli pelvica (pg), la parete della vescica (bla) e l&#39;uretra (u). In vista dorsale (d) EGFP celle + sono evidenti nell&#39;uretra anteriore dorsale. Altre etichette: reni (k), del testicolo (t), della vescica (bla) e tubercolo genitale (gt). <imgalt = &quot;Figura 2&quot; src = &quot;/ files/ftp_upload/4188/4188fig2.jpg&quot; /&gt; Figura 2. Immagini brightfield del 15 LUT DPC fetale (a) e intestino (e), rispettivamente, ripresa metà del periodo di incubazione dissociazione, alla fine dell&#39;incubazione dissociazione prima interruzione (b, f), dopo la rottura manuale (c, g), e in un campione che è stato troppo dissociata (d, h). <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/4188/4188fig3.jpg" /> Figura 3. Schema illustra compensazione controlli necessari per stabilire rigorosi parametri di gating FACS. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/4188/4188fig4.jpg" /> Figura 4. Immagine rappresentativa di profili di ordinamento di flusso a 14,5 DPC (a) e 15,5 DPC (b). Popolazione di colore è composta da singole cellule basate sulla dispersione in avanti e laterale che sono morti ed etichettati da7-AAD fluorescenza. Grigio popolazione è composta da cellule di singoletto a base di scatter in avanti e laterale che hanno escluso 7-AAD e sono quindi vitali. Verde popolazione gated è indicato dal box &quot;GFP +&quot; area ed è costituito da singole celle sono esclusi 7-AAD (vitale) e presentano fluorescenza EGFP.

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	<li>Gong, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+gene+expression+atlas+of+the+central+nervous+system+based+on+bacterial+artificial+chromosomes.">A gene expression atlas of the central nervous system based on bacterial artificial chromosomes.</a> Nature. 425, 917-925 (2003).</li><li>Morrison, S. J., White, P. M., Zock, C., Anderson, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prospective+identification,+isolation+by+flow+cytometry,+and+in+vivo+self-renewal+of+multipotent+mammalian+neural+crest+stem+cells.">Prospective identification, isolation by flow cytometry, and in vivo self-renewal of multipotent mammalian neural crest stem cells.</a> Cell. 96, 737-749 (1999).</li><li>Kruger, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+crest+stem+cells+persist+in+the+adult+gut+but+undergo+changes+in+self-renewal,+neuronal+subtype+potential,+and+factor+responsiveness.">Neural crest stem cells persist in the adult gut but undergo changes in self-renewal, neuronal subtype potential, and factor responsiveness.</a> Neuron. 35, 657-669 (2002).</li><li>Bixby, S., Kruger, G. M., Mosher, J. T., Joseph, N. M., Morrison, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-intrinsic+differences+between+stem+cells+from+different+regions+of+the+peripheral+nervous+system+regulate+the+generation+of+neural+diversity.">Cell-intrinsic differences between stem cells from different regions of the peripheral nervous system regulate the generation of neural diversity.</a> Neuron. 35, 643-656 (2002).</li><li>Walters, L. C., Cantrell, V. A., Weller, K. P., Mosher, J. T., Southard-Smith, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+background+impacts+developmental+potential+of+enteric+neural+crest-derived+progenitors+in+the+Sox10Dom+model+of+Hirschsprung+disease.">Genetic background impacts developmental potential of enteric neural crest-derived progenitors in the Sox10Dom model of Hirschsprung disease.</a> Human Molecular Genetics. , (2010).</li><li>Corpening, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+live+imaging+of+enteric+progenitors+based+on+Sox10-Histone2BVenus+transgene+expression.">Isolation and live imaging of enteric progenitors based on Sox10-Histone2BVenus transgene expression.</a> Genesis. 49, 599-618 (2011).</li><li>Morrison, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Isolation of fetal rat neural crest stem cells (NCSC) from gut and sciatic nerve. , (2012).</li><li>Skarnes, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+conditional+knockout+resource+for+the+genome-wide+study+of+mouse+gene+function.">A conditional knockout resource for the genome-wide study of mouse gene function.</a> Nature. 474, 337-342 (2011).</li><li>Harding, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+GUDMAP+database--an+online+resource+for+genitourinary+research.">The GUDMAP database--an online resource for genitourinary research.</a> Development. 138, 2845-2853 (2011).</li><li>Joseph, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enteric+glia+are+multipotent+in+culture+but+primarily+form+glia+in+the+adult+rodent+gut.">Enteric glia are multipotent in culture but primarily form glia in the adult rodent gut.</a> J. Clin. Invest. 121, 3398-3411 (2011).</li><li>Newgreen, D. F., Murphy, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+crest+cell+outgrowth+cultures+and+the+analysis+of+cell+migration.">Neural crest cell outgrowth cultures and the analysis of cell migration.</a> Methods Mol. Biol. 137, 201-211 (2000).</li></ol>

Non ci sono conflitti di interesse dichiarati.

Linee giornalista del mouse che esprimono giornalisti fluorescenti sono sempre ampiamente disponibili attraverso molteplici sforzi nella genetica murina comunità 1,8,9. Come risultato il metodo dissociazione illustrato qui può essere ampiamente utilizzato per l&#39;isolamento di distinti sottotipi neuronali basato su neurotrasmettitore o pattern di espressione del recettore da entrambi i tessuti fetali o adulto. Mentre ci sono ottimizzate questo metodo basato su espressione di un reporter fluorescente trans...

The authors middle initials were omitted from the publication of <a href="http://www.jove.com/video/4188">An Optimized Procedure for Fluorescence-activated Cell Sorting (FACS) Isolation of Autonomic Neural Progenitors from Visceral Organs of Fetal Mice</a>.

Erratum: An Optimized Procedure for Fluorescence-activated Cell Sorting (FACS) Isolation of Autonomic Neural Progenitors from Visceral Organs of Fetal Mice

<table border="1"><tbody><tr><td> Reagente Nome </td><td> Venditore </td><td> Numero di catalogo </td><td> Comments </td></tr><tr><td> Accumax </td><td> Sigma (MFR: Cell Technologies innovative) </td><td> A7089-100ML </td><td> Conservare congelato in aliquote da 1 ml </td></tr><tr><td> DNasi I </td><td> Sigma </td><td> D-4527 </td><td> Conservati congelati a -20 ° C 5 mg / ml in 1xHBSS, (Usato in Quench, Quench 01:05) </td></tr><tr><td> 10X PBS pH 7,4 </td><td> Gibco </td><td> 70011-044 </td><td> Portare a 1x con acqua grado coltura tissutale poi filtrare sterile </td></tr><tr><td> 10X HBSS w / o Ca o Mg </td><td> Gibco </td><td> 14185-052 </td><td> Portare a 1x con acqua grado coltura tissutale poi filtrare sterile </td></tr><tr><td> Leibovitz L-15 </td><td> Gibco </td><td> 21083027 </td><td></td></tr><tr><td> Penicillina / streptomicina 100X </td><td> Gibco </td><td>15140-133 </td><td> Conservare aliquote a -20 ° C </td></tr><tr><td> BSA </td><td> Sigma </td><td> A3912-100G </td><td> Conservare aliquote a -20 ° C, 100 mg / ml in acqua </td></tr><tr><td> Biowhittaker 1M in HEPES 0,85% NaCl </td><td> Lonza </td><td> 17-737E </td><td></td></tr><tr><td> 38 micron NITEX Nylon Mesh Membrane </td><td> Sefar l&#39;America </td><td> 3-38/22 </td><td> Tagliare a ~ 3 cm quadrati. UV trattare durante la notte a sterilizzare in cappa coltura tissutale. </td></tr><tr><td> 7-AAD </td><td> Invitrogen </td><td> A1310 </td><td> 1 mg / ml </td></tr><tr><td> TRIzol LS </td><td> Invitrogen </td><td> 10296-028 </td><td></td></tr><tr><td> 5 ml in polistirolo tubi </td><td> Falco </td><td> 352058 </td><td></td></tr><tr><td> Provette da 15 ml coniche </td><td> Corning </td><td> 430790 </td><td></td></tr><tr><td> Belle dissettore </td><td> Strumenti scientifici Belle </td><td> 11251-30 </td><td> Dumont # 5 forcep, Dumoxel, standard punta 0.1x0.06mm </td></tr><tr><td> Dissezione Spoon </td><td> Strumenti scientifici Belle </td><td> 10370-18 </td><td></td></tr></tbody></table>

an optimized procedure for fluorescence-activated cell sorting (facs) isolation of autonomic neural progenitors from visceral organs of fetal mice

Durante lo sviluppo cresta neurale (NC) di derivazione progenitori neuronali migrano dal tubo neurale per formare gangli autonomo negli organi viscerali come l&#39;intestino e delle basse vie urinarie. Sia durante lo sviluppo e nei tessuti maturi queste cellule sono spesso disperse in tutta tessuti in modo che l&#39;isolamento delle popolazioni discrete mediante metodi come la cattura laser micro-dissezione è difficile. Possono comunque essere visualizzati direttamente tramite l&#39;espressione di giornalisti fluorescenti guidati da regioni regolatorie dei geni specifici neuroni, come la tirosina idrossilasi (TH). Noi descriviamo un metodo ottimizzato per alte rese di + TH vitale progenitori neuronali da tessuti di topo fetali viscerali, inclusi intestino e inferiore del tratto urogenitale (LUT), basata su fluorescenza dissociazione e selezione delle cellule attivate (FACS). Il gene codifica per la Th enzima limitante per la produzione di catecolamine. Enterici progenitori neuronali cominciano a esprimere TH durcorso del loro migrazione nell&#39;intestino fetale 1 e TH è anche presente in un sottoinsieme di adulti neuroni gangli pelvico 2-4. La prima comparsa di questa linea e la distribuzione di questi neuroni in altri aspetti della LUT, e il loro isolamento non è stata descritta. Progenitori neuronali che esprimono TH possono essere facilmente visualizzati tramite espressione di EGFP in topi portatori del transgene costrutto Tg (Th-EGFP) DJ76Gsat/Mmnc 1. Abbiamo ripreso espressione di questo transgene nei topi fetali per documentare la distribuzione dei TH + celle nella LUT sviluppando a 15,5 dopo il coito giorni (DPC), che designa la mattina del rilevamento Plug come 0,5 DPC, e ha osservato che un sottoinsieme di progenitori neuronali nel coalescenza pelvica gangli express EGFP. Per isolare LUT TH + progenitori neuronali, abbiamo ottimizzato metodi che sono stati inizialmente utilizzati per purificare le cellule della cresta neurale staminali da intestino del mouse fetale 2-6. Sforzi precedenti per isolare NC-derivati ​​popolazioni invocatidigestione con un cocktail di collagenasi e tripsina per ottenere sospensioni cellulari per citometria a flusso. Nelle nostre mani questi metodi di sospensioni di cellule prodotte dal LUT con la vitalità relativamente bassa. Data la già bassa incidenza dei progenitori neuronali nei tessuti fetali LUT, abbiamo deciso di ottimizzare i metodi di dissociazione tali che la sopravvivenza delle cellule si dissocia in finale sarebbe aumentato. Abbiamo determinato che la dissociazione dolce in Accumax (Cell Technologies innovative, Inc), manuale di filtraggio, e il flusso di smistamento a basse pressioni ci hanno permesso di ottenere la sopravvivenza sempre maggiore (&gt; 70% delle cellule totali) con rese successivi di progenitori neuronali sufficiente per l&#39;analisi a valle. Il metodo che descriviamo può essere generalmente applicato a isolare una varietà di popolazioni di neuroni da entrambi i tessuti fetali o adulto di topo.

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An Optimized Procedure for Fluorescence-activated Cell Sorting FACS Isolation of Autonomic Neural Progenitors from Visceral Organs of Fetal Mice

Una procedura ottimizzata per purificare neurali cresta progenitori neuronali derivate da tessuti fetali del mouse è descritto. Questo metodo sfrutta espressione da alleli reporter fluorescenti per isolare popolazioni discreti fluorescenza selezione delle cellule attivate (FACS). La tecnica può essere applicata per isolare sottopopolazioni neuronali durante lo sviluppo o da tessuti adulti.

Una procedura ottimizzata per fluorescenza selezione delle cellule attivate (FACS) Isolamento del Sistema Nervoso Autonomo progenitori neurali da organi viscerali di topi fetali

During development neural crest (NC)-derived neuronal progenitors migrate away from the neural tube to form autonomic ganglia in visceral organs like the ...

an-optimized-procedure-for-fluorescence-activated-cell-sorting-facs

Research

JoVE Journal

Neuroscience

An Optimized Procedure for Fluorescence-activated Cell Sorting (FACS) Isolation of Autonomic Neural Progenitors from Visceral Organs of Fetal Mice

13.6K Views.  Vanderbilt University School of Medicine. Una procedura ottimizzata per purificare neurali cresta progenitori neuronali derivate da tessuti fetali del mouse è descritto. Questo metodo sfrutta espressione da alleli reporter fluorescenti per isolare popolazioni discreti fluorescenza selezione delle cellule attivate (FACS). La tecnica può essere applicata per isolare sottopopolazioni neuronali durante lo sviluppo o da tessuti adulti.

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Generation of Neural Stem Cells from Discarded Human Fetal Cortical Tissue

Neural stem cells (NSCs) reside along the ventricular zone neuroepithelium during the development of the cortical plate. These early progenitors ultimately give rise to intermediate progenitors and later, the various neuronal and glial cell subtypes that form the cerebral cortex. The capacity to generate and expand human NSCs (so called neurospheres) from discarded normal fetal tissue provides a means with which to directly study the functional aspects of normal human NSC development 1-5. This approach can also be directed toward the generation of NSCs from known neurological disorders, thereby affording the opportunity to identify disease processes that alter progenitor proliferation, migration and differentiation 6-9. We have focused on identifying pathological mechanisms in human Down syndrome NSCs that might contribute to the accelerated Alzheimer's disease phenotype 10,11. Neither in vivo nor in vitro mouse models can replicate the identical repertoire of genes located on human chromosome 21. 
Here we use a simple and reliable method to isolate Down syndrome NSCs from aborted human fetal cortices and grow them in culture. The methodology provides specific aspects of harvesting the tissue, dissection with limited anatomical landmarks, cell sorting, plating and passaging of human NSCs. We also provide some basic protocols for inducing differentiation of human NSCs into more selective cell subtypes.

A simple and reliable method on isolation and culture of neural stem cells from discarded human fetal cortical tissue is described. Cultures derived from known human neurological disorders can be used for characterization of pathological cellular and molecular processes, as well as provide a platform to assess pharmacological efficacy.

Generazione di cellule staminali neurali da scartate tessuto fetale umano corticale

Neural stem cells (NSCs) reside along the ventricular zone neuroepithelium during the development of the cortical plate. These early progenitors ...

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Neuroscienze

Isolation and Culture of Neural Crest Cells from Embryonic Murine Neural Tube

The embryonic neural crest (NC) is a multipotent progenitor population that originates at the dorsal aspect of the neural tube, undergoes an epithelial to mesenchymal transition (EMT) and migrates throughout the embryo, giving rise to diverse cell types 1-3. NC also has the unique ability to influence the differentiation and maturation of target organs4-6. When explanted in vitro, NC progenitors undergo self-renewal, migrate and differentiate into a variety of tissue types including neurons, glia, smooth muscle cells, cartilage and bone. 
NC multipotency was first described from explants of the avian neural tube7-9. In vitro isolation of NC cells facilitates the study of NC dynamics including proliferation, migration, and multipotency. Further work in the avian and rat systems demonstrated that explanted NC cells retain their NC potential when transplanted back into the embryo10-13. Because these inherent cellular properties are preserved in explanted NC progenitors, the neural tube explant assay provides an attractive option for studying the NC in vitro. 
To attain a better understanding of the mammalian NC, many methods have been employed to isolate NC populations. NC-derived progenitors can be cultured from post-migratory locations in both the embryo and adult to study the dynamics of post-migratory NC progenitors11,14-20, however isolation of NC progenitors as they emigrate from the neural tube provides optimal preservation of NC cell potential and migratory properties13,21,22. Some protocols employ fluorescence activated cell sorting (FACS) to isolate a NC population enriched for particular progenitors11,13,14,17. However, when starting with early stage embryos, cell numbers adequate for analyses are difficult to obtain with FACS, complicating the isolation of early NC populations from individual embryos. Here, we describe an approach that does not rely on FACS and results in an approximately 96% pure NC population based on a Wnt1-Cre activated lineage reporter23. 
The method presented here is adapted from protocols optimized for the culture of rat NC11,13. The advantages of this protocol compared to previous methods are that 1) the cells are not grown on a feeder layer, 2) FACS is not required to obtain a relatively pure NC population, 3) premigratory NC cells are isolated and 4) results are easily quantified. Furthermore, this protocol can be used for isolation of NC from any mutant mouse model, facilitating the study of NC characteristics with different genetic manipulations. The limitation of this approach is that the NC is removed from the context of the embryo, which is known to influence the survival, migration and differentiation of the NC2,24-28.

Isolation of embryonic neural crest from the neural tube facilitates the use of in vitro methods for studying migration, self-renewal, and multipotency of neural crest.

Isolamento e la coltura delle cellule della cresta neurale da Embryonic Murine tubo neurale

The embryonic neural crest (NC) is a multipotent progenitor population that originates at the dorsal aspect of the neural tube, undergoes an epithelial to ...

A Quantitative Cell Migration Assay for Murine Enteric Neural Progenitors

Neural crest cells (NCC) are a transient and multipotent cell population that originates from the dorsal neural tube and migrates extensively throughout the developing vertebrate embryo. In addition to providing peripheral glia and neurons, NCC generate melanocytes as well as most of the cranio-facial skeleton. NCC migration and differentiation is controlled by a combination of their axial origin along the neural tube and their exposure to regionally distinct extracellular cues. Such contribution of extracellular ligands is especially evident during the formation of the enteric nervous system (ENS), a complex interconnected network of neural ganglia that locally controls (among other things) gut muscle movement and intestinal motility. Most of the ENS is derived from a small initial pool of NCC that undertake a long journey in order to colonize - in a rostral to caudal fashion - the entire length of the prospective gut. Among several signaling pathways known to influence enteric NCC colonization, GDNF/RET signaling is recognized as the most important. Indeed, spatiotemporally controlled secretion of the RET ligand GDNF by the gut mesenchyme is chiefly responsible for the attraction and guidance of RET-expressing enteric NCC to and within the embryonic gut. Here, we describe an ex vivo cell migration assay, making use of a transgenic mouse line possessing fluorescently labeled NCC, which allows precise quantification of enteric NCC migration potential in the presence of various growth factors, including GDNF.

We present an ex vivo cell migration assay that allows precise quantification of enteric neural crest cell migration potential in the presence of various growth factors.

Un saggio di migrazione cellulare quantitativa per murini enterici neurali Progenitori

Neural crest cells (NCC) are a transient and multipotent cell population that originates from the dorsal neural tube and migrates extensively throughout ...

One Mouse, Two Cultures: Isolation and Culture of Adult Neural Stem Cells from the Two Neurogenic Zones of Individual Mice

The neurosphere assay and the adherent monolayer culture system are valuable tools to determine the potential (proliferation or differentiation) of adult neural stem cells in vitro. These assays can be used to compare the precursor potential of cells isolated from genetically different or differentially treated animals&#160;to determine the effects of exogenous factors on neural precursor cell proliferation and differentiation and to generate neural precursor cell lines that can be assayed over continuous passages. The neurosphere assay is traditionally used for the post-hoc identification of stem cells, primarily due to the lack of definitive markers with which they can be isolated from primary tissue&#160;and has the major advantage of giving a quick estimate of precursor cell numbers in brain tissue derived from individual animals. Adherent monolayer cultures, in contrast, are not traditionally used to compare proliferation between individual animals, as each culture is generally initiated from the combined tissue of between 5-8 animals. However, they have the major advantage that, unlike neurospheres, they consist of a mostly homogeneous population of precursor cells and are useful for following the differentiation process in single cells. Here, we describe, in detail, the generation of neurosphere cultures and, for the first time, adherent cultures from individual animals. This has many important implications including paired analysis of proliferation and/or differentiation potential in both the subventricular zone (SVZ) and dentate gyrus (DG) of treated or genetically different mouse lines, as well as a significant reduction in animal usage.

Here we describe a detailed protocol for the simultaneous generation of neural precursor cell cultures, as either adherent monolayers or neurospheres, from the subventricular zone and dentate gyrus of individual adult mice.

Un mouse, due culture: isolamento e la coltura di Adult Neural Stem Cells dalle due zone neurogena Mice individuale

The neurosphere assay and the adherent monolayer culture system are valuable tools to determine the potential (proliferation or differentiation) of adult ...

Using Fluorescence Activated Cell Sorting to Examine Cell-Type-Specific Gene Expression in Rat Brain Tissue

The brain is comprised of four primary cell types including neurons, astrocytes, microglia and oligodendrocytes. Though they are not the most abundant cell type in the brain, neurons are the most widely studied of these cell types given their direct role in impacting behaviors. Other cell types in the brain also impact neuronal function and behavior via the signaling molecules they produce. Neuroscientists must understand the interactions between the cell types in the brain to better understand how these interactions impact neural function and disease. To date, the most common method of analyzing protein or gene expression utilizes the homogenization of whole tissue samples, usually with blood, and without regard for cell type. This approach is an informative approach for examining general changes in gene or protein expression that may influence neural function and behavior; however, this method of analysis does not lend itself to a greater understanding of cell-type-specific gene expression and the effect of cell-to-cell communication on neural function. Analysis of behavioral epigenetics has been an area of growing focus which examines how modifications of the deoxyribonucleic acid (DNA) structure impact long-term gene expression and behavior; however, this information may only be relevant if analyzed in a cell-type-specific manner given the differential lineage and thus epigenetic markers that may be present on certain genes of individual neural cell types. The Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS) technique described below provides a simple and effective way to isolate individual neural cells for the subsequent analysis of gene expression, protein expression, or epigenetic modifications of DNA. This technique can also be modified to isolate more specific neural cell types in the brain for subsequent cell-type-specific analysis.

The goal of this protocol is to use the fluorescence activated cell sorting (FACS) technique to sort specific types of neural cells for subsequent analysis of cell-type-specific gene expression, epigenetic markers, and or protein expression.

Usando fluorescenza cellulare attivo Ordinamento per esaminare Cell-Type-specifica espressione genica nel cervello di ratto tessuto

The brain is comprised of four primary cell types including neurons, astrocytes, microglia and oligodendrocytes. Though they are not the most abundant ...

Cell Sorting of Neural Stem and Progenitor Cells from the Adult Mouse Subventricular Zone and Live-imaging of their Cell Cycle Dynamics

Neural stem cells (NSCs) in the subventricular zone of the lateral ventricles (SVZ) sustain olfactory neurogenesis throughout life in the mammalian brain. They successively generate transit amplifying cells (TACs) and neuroblasts that differentiate into neurons once they integrate the olfactory bulbs. Emerging fluorescent activated cell sorting (FACS) techniques have allowed the isolation of NSCs as well as their progeny and have started to shed light on gene regulatory networks in adult neurogenic niches. We report here a cell sorting technique that allows to follow and distinguish the cell cycle dynamics of the above-mentioned cell populations from the adult SVZ with a LeX/EGFR/CD24 triple staining. Isolated cells are then plated as adherent cells to explore in details their cell cycle progression by time-lapse video microscopy. To this end, we use transgenic Fluorescence Ubiquitination Cell Cycle Indicator (FUCCI) mice in which cells are red-fluorescent during G1 phase due to a G1 specific red-Cdt1 reporter. This method has recently revealed that proliferating NSCs progressively lengthen their G1 phase during aging, leading to neurogenesis impairment. This method is easily transposable to other systems and could be of great interest for the study of the cell cycle dynamics of brain cells in the context of brain pathologies.

We report a Fluorescent Activated Cell Sorting (FACS)-based method to isolate neural stem cells (NSCs) and their progeny from the subventricular zone (SVZ) of the adult mouse brain. Applied to Fluorescence Ubiquitination Cell Cycle Indicator (FUCCI) transgenic mice, it allows the study of cell cycle progression by live imaging.

Ordinamento delle cellule staminali neurali e di cellule progenitrici del topo adulto subventricolare Zone e Live-imaging loro dinamiche del ciclo cellulare

Neural stem cells (NSCs) in the subventricular zone of the lateral ventricles (SVZ) sustain olfactory neurogenesis throughout life in the mammalian brain. ...

Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS) and Gene Expression Analysis of Fos-expressing Neurons from Fresh and Frozen Rat Brain Tissue

The study of neuroplasticity and molecular alterations in learned behaviors is switching from the study of whole brain regions to the study of specific sets of sparsely distributed activated neurons called neuronal ensembles that mediate learned associations. Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS) has recently been optimized for adult rat brain tissue and allowed isolation of activated neurons using antibodies against the neuronal marker NeuN and Fos protein, a marker of strongly activated neurons. Until now, Fos-expressing neurons and other cell types were isolated from fresh tissue, which entailed long processing days and allowed very limited numbers of brain samples to be assessed after lengthy and complex behavioral procedures. Here we found that yields of Fos-expressing neurons and Fos mRNA from dorsal striatum were similar between freshly dissected tissue and tissue frozen at -80 &#186;C for 3 - 21 days. In addition, we confirmed the phenotype of the NeuN-positive and NeuN-negative sorted cells by assessing gene expression of neuronal (NeuN), astrocytic (GFAP), oligodendrocytic (Oligo2) and microgial (Iba1) markers, which indicates that frozen tissue can also be used for FACS isolation of glial cell types. Overall, it is possible to collect, dissect and freeze brain tissue for multiple FACS sessions. This maximizes the amount of data obtained from valuable animal subjects that have often undergone long and complex behavioral procedures.

Fluorescence Activated Cell Sorting FACS and Gene Expression Analysis of Fos-expressing Neurons from Fresh and Frozen Rat Brain Tissue

Here we present a Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS) protocol to study molecular alterations in Fos-expressing neuronal ensembles from both fresh and frozen brain tissue. The use of frozen tissue allows FACS isolation of many brain areas over multiple sessions to maximize the use of valuable animal subjects.

Fluorescence Activated di separazione delle cellule (FACS) e Gene Expression Analisi di Fos-esprimono neuroni da freschi e congelati Rat tessuto cerebrale

The study of neuroplasticity and molecular alterations in learned behaviors is switching from the study of whole brain regions to the study of specific ...

Isolation and Cultivation of Neural Progenitors Followed by Chromatin-Immunoprecipitation of Histone 3 Lysine 79 Dimethylation Mark

Brain development is a complex process, which is controlled in a temporo-spatial manner by gradients of morphogens and different transcriptional programs. Additionally, epigenetic chromatin modifications, like histone methylation, have an important role for establishing and maintaining specific cell fates within this process. The vast majority of histone methylation occurs on the flexible histone tail, which is accessible to histone modifiers, erasers, and histone reader proteins. In contrast, H3K79 methylation is located in the globular domain of histone 3 and is implicated in different developmental functions. H3K79 methylation is evolutionarily conserved and can be found in a wide range of species from Homo sapiens to Saccharomyces cerevisiae. The modification occurs in different cell populations within organisms, including neural progenitors. The location of H3K79 methylation in the globular domain of histone 3 makes it difficult to assess. Here, we present methods to isolate and culture cortical progenitor cells (CPCs) from embryonic cortical brain tissue (E11.5-E14.5) or cerebellar granular neuron progenitors (CGNPs) from postnatal tissue (P5-P7), and to efficiently immunoprecipitate H3K79me2 for quantitative PCR (qPCR) and genome-wide sequencing.

We present an effective and reproducible method to isolate and culture neural progenitor cells from embryonic and postnatal brain tissue for chromatin immunoprecipitation (ChIP) of histone 3 lysine 79 dimethylation (H3K79me2) - a histone mark located within the globular domain of histone 3.

Isolamento e coltura dei progenitori neurali seguito da immunoprecipitazione della cromatina di istone 3 lisina 79 Dimethylation Mark

Brain development is a complex process, which is controlled in a temporo-spatial manner by gradients of morphogens and different transcriptional programs. ...

Primary Cell Culture of Purified GABAergic or Glutamatergic Neurons Established through Fluorescence-activated Cell Sorting

The overall goal of this protocol is to generate purified neuronal cultures derived from either GABAergic or glutamatergic neurons. Purified neurons can be cultured in defined media for 16 days in vitro and are amenable to any analyses typically performed on dissociated cultures, including electrophysiological, morphological and survival analyses. The major advantage of these cultures is that specific cell types can be selectively studied in the absence of complex external influences, such as those arising from glial cells or other neuron types. When planning experiments with purified cells, however, it is important to note that neurons strongly depend on glia-conditioned media for their growth and survival. In addition, glutamatergic neurons further depend on glia-secreted factors for the establishment of synaptic transmission. We therefore also describe a method for co-culturing neurons and glial cells in a non-contact arrangement. Using these methods, we have identified major differences between the development of GABAergic and glutamatergic neuronal networks. Thus, studying cultures of purified neurons has great potential for furthering our understanding of how the nervous system develops and functions. Moreover, purified cultures may be useful for investigating the direct action of pharmacological agents, growth factors or for exploring the consequences of genetic manipulations on specific cell types. As more and more transgenic animals become available, labeling additional specific cell types of interest, we expect that the protocols described here will grow in their applicability and potential.

This protocol describes a cell sorting based method for the purification and culture of fluorescent GABAergic or glutamatergic neurons from the neocortex and hippocampus of postnatal mice or rats.

Coltura cellulare primaria di neuroni GABAergici o glutamatergici purificati stabiliti attraverso la selezione di cellule attivate a fluorescenza

The overall goal of this protocol is to generate purified neuronal cultures derived from either GABAergic or glutamatergic neurons. Purified neurons can ...

Dissection of Pelvic Autonomic Ganglia and Associated Nerves in Male and Female Rats

The bilateral major pelvic ganglia (MPG; synonym, pelvic ganglia) are the primary source of postganglionic sympathetic and parasympathetic neurons innervating pelvic organs of rodents; the functionally equivalent structure in humans is the inferior hypogastric plexus. The major pelvic ganglia also provide the route by which lumbar and sacral sensory axons reach the pelvic organs. These complex, mixed ganglia can prove challenging to identify and dissect for further experimental study of normal autonomic mechanisms or to establish preclinical models of disease, injury or visceral pain. Here we describe a protocol to access and visualize these ganglia and their associated nerve tracts. We provide this protocol with schematics for both male and female rats, as the ganglion size and landmarks for identification differ between sexes. The protocol describes removal of the ganglion for in vitro studies, but this method can be integrated into a surgical recovery protocol for experimental interventions (e.g., nerve crush, nerve resection) or for mapping neuronal circuits (e.g., by microinjection of neural tracers). We also demonstrate the primary structures of the ganglion and its associated nerves immediately following dissection and following immunohistochemical staining.

The major pelvic ganglia contain parasympathetic and sympathetic neurons that innervate pelvic organs. Here we describe a dissection method and provide schematics for identification of these ganglia and their associated nerves. These methods can be applied to experimental manipulation of these ganglia in vivo or removal post-mortem for further study.