Ringraziamo sentitamente il Dott. Chen Wenjin per il suo aiuto con il programma MATLAB e il Cancer Institute del New Jersey istopatologia struttura e degli impianti microscopia. Ringraziamo anche i revisori per i loro commenti e suggerimenti. Questo studio è sostenuto dalla Raymond e Beverly Sackler Research Foundation.

1. Preparazione di 1% agarosio rivestita 24-pozzetti <ol><li> Aggiungere 1 g di agarosio (RPI, A20090-500) a 100 ml di acqua deionizzata in un flacone 250-500 ml e autoclave per sterilizzare l&#39;agarosio (121 ° C, 15 psi, 15 min in una macchina autoclave). Trasferire la bottiglia con sterilizzato agarosio in un bagno di acqua 70 ° C. L&#39;agarosio è pronta per essere versata quando è raffreddata a 70 ° C, che richiede circa un&#39;ora. Assicurarsi di mantenere la sterile agarosio in ogni momento. </li><li> Ottenere i 24 pozzetti a fondo piatto piastre (Falcon, 353.047), qualsiasi tipo di 24 pozzetti a fondo piatto piatti avrebbe funzionato se i piatti possono essere esposte sotto un microscopio a contrasto di fase. </li><li> Dispensare 200 ul di agarosio ad ogni pozzetto con una pipetta Eppendorf ripetitore in un armadio biosicurezza e agitare la agarosio intorno al pozzo per farlo coprire il bene in modo uniforme. 200 pl di agarosio è appropriato per formare una superficie concava in modo che sferoidi possono formare le forme sferiche coerenti. Meno di 200 pl agarosio non puòcoprire il pozzo interamente, ma più di 200 pl di agarosio non può formare la superficie concava e gli sferoidi coltivate su di esso non può formare forme sferiche. </li><li> Le agarosio rivestite piastre da 24 pozzetti sono pronti per essere utilizzati in circa 10 min. (Facoltativo) Aggiungere 100 ul di mezzo per equilibrare l&#39;agarosio con terreno di coltura prima della semina delle cellule. </li><li> In alternativa, dopo l&#39;agarosio è completamente solidificato, aggiungere 100 microlitri terreno di crescita a ciascun pozzetto e le piastre sigillare con il nastro sigillante sterile (Nunc, 236.366). Queste piastre possono essere conservati a 4 ° C per una settimana. </li></ol> 2. Preparazione di sospensioni di cellule singole <ol><li> Tutti gli esperimenti sono fatte usando le tecniche standard asettiche in un armadio biosicurezza e tutte le colture vengono coltivate a 37 ° C incubatore umidificato con 5% CO 2 in aria, se non specificato. </li><li> Pancreatico umano NET BON-1 cellule sono mantenute in DMEM/F12 (Invitrogen, 10.565) con 10% siero fetale bovino (FBS, Invitrogen,16000-044) in un mezzo mm 100 x 20 mm sterile piastra di coltura tissutale (Corning, 430.167). </li><li> Quando monostrato BON-1 le cellule raggiungere il 70-80% di confluenza, il mezzo viene rimosso. Le cellule vengono lavate due volte con PBS, e rimosse dalla piastra mediante l&#39;aggiunta di 1 ml Triplo (Invitrogen, 12604) con 5 minuti di incubazione a 37 ° C. Triplo è simile a tripsina, ma è stabile a 15 - 30 ° C nonché a 4 ° C. Controllare al microscopio per assicurarsi che tutte le cellule si staccano dal piatto. </li><li> Aggiungi 9 ml terreno di crescita per le cellule tripsinizzate e usare una pipetta di dispensare le cellule su e giù un paio di volte per assicurare una sospensione di cellule ancora singola. </li><li> Utilizzare 70-um cell filtro (Fisher, 22.363.548) per filtrare le cellule. </li><li> Raccogliere le cellule e di eseguire una conta di cellule utilizzando Guava PCA-96 Sistema di Base (Millipore). </li><li> Preparare una sospensione di 5000 cellule per ml in fenolo-free DMEM/F12 con 10% di crescita medio FBS. </li></ol> 3. Cultura sferoide <ol><li> Overlay 200 pl del singolosospensioni cellulari al agarosio rivestita 24-pozzetti e sigillare le piastre a 24 pozzetti con il nastro sigillante sterile per impedire l&#39;evaporazione. </li></ol> Nota: - Il numero di cellule da rivestire deve essere determinato empiricamente sulla base delle dimensioni degli sferoidi al giorno 6; 300-400 micron di diametro degli sferoidi sarebbe la dimensione ideale per iniziare il trattamento farmacologico; 1.000 BON-1 e H727 cellule vengono piastrate. - Si consiglia di non iniziare trattamenti farmacologici dopo giorno 6, perché la vitalità delle cellule 3D inizia a calare a circa 10 giorni (dati non mostrati, manoscritto in preparazione). <ol start="2"><li> Posizionare i suddetti agarosio rivestite piastre da 24 pozzetti con cellule BON-1 su un agitatore orbitale a una agitazione molto lenta inferiore a 40 rpm durante la notte a 37 ° C incubatore umidificato con 5% CO 2 in aria. Poi spostare questi piatti per una piattaforma stabile per mantenere le colture in crescita. </li><li> Aggiungere 200 pl mezzo di crescita a ciascun pozzetto della piastra sopras ogni 3 giorni. Non disturbare le sferoidi. Prova di aggiungere mezzo attraverso la parete di ciascun pozzetto toccando la punta della pipetta sul lato del pozzo e lasciando la portata media nel pozzo. </li><li> Monitorare la formazione sferoide nelle piastre da 24 pozzetti sotto un microscopio. </li></ol> 4. Drug Treatment <ol><li> Quando le sferoidi raggiungere circa 300-400 micron di diametro al giorno 6, le sferoidi 3D sono trattati con farmaci. Questo è indicato come 0 giorni per il trattamento farmacologico. </li><li> Al giorno 6, ciascun pozzetto della piastra contiene circa 400 pl di mezzo. Per assicurarsi che i trattamenti farmacologici sono a 1x concentrazione finale in ciascun pozzetto, 3x diluizioni seriali di ogni dose di trattamenti sono realizzati con lo stock di droga in 5 ml di terreno di coltura in una provetta 15 ml conica, che è sufficiente per 8 repliche. </li><li> Gli sferoidi ad ogni riga della piastra da 24 pozzetti sono classificati come veicolo, la dose 1, 2, 3, 4 e 5. Esistono 4 repliche per ogni dose di trattamenti su una piastra da 24 pozzetti (vedi <strong&gt; Tabella 1). Di solito trattare sferoidi 3D almeno 2 in piastre da 24 pozzetti, che rende almeno 8 repliche per ogni dose di trattamenti. </li><li> Centrifugare la piastra da 24 pozzetti a 800 rpm per 5 min a 4 ° C per assicurarsi che tutte le condensazioni sul nastro sigillante passare nel pozzo. Grazie alla caratteristica flottante delle sferoidi 3D, il mezzo in ciascun pozzetto non viene rimosso per evitare perturbazioni degli sferoidi. </li><li> Cautela aggiungere 200 pl di sopra fatte trattamenti di ciascuna dose nei pozzetti appropriati lungo la parete di ciascun pozzetto. </li><li> Sigillare le piastre da 24 pozzetti con il nastro adesivo e incubare le culture nel 37 ° C incubatore umidificato con 5% di CO 2 in aria. </li><li> Se necessario, gli sferoidi ritirarsi in ciascun pozzetto con la dose rispettiva trattamenti dopo 72-96 ore. </li></ol> 5. Monitor 3D sferoidali Culture <ol><li> Ad ogni punto di tempo scelto dopo trattamenti farmacologici (0, 24, 48, 72 ore), le sferoidi in ciascun pozzetto della tegli 24-pozzetti sono ripreso con un Zeiss Axiovert 200/M-based microscopio a contrasto di fase usando un obiettivo 5x. </li></ol> Nota: le immagini possono essere prese su qualsiasi microscopio ottico con una scala calibrata tra pm e pixel. Un obiettivo 5x è l&#39;ideale perché gli sferoidi rapidamente troppo grande per il campo di imaging con un obiettivo 10x. <ol start="2"><li> Analisi sferoide può essere eseguita manualmente utilizzando Zeiss AxioVision 4.8.2 del software con le immagini in formato raw. </li><li> In alternativa, un programma personalizzato sviluppato MATLAB viene utilizzato per stimare la dimensione degli sferoidi automaticamente / semi-automaticamente. Il programma automatico implementa l&#39;algoritmo attivo contorno 4 per localizzare con precisione contorno dello sferoide in una data immagine e misurare il suo principale (L) e minori (W) assi automaticamente. Una versione semi-automatica dello stesso algoritmo consente agli utenti di aiutare avviare il programma quando manufatto forte è presente. Tutte le immagini devono essere esportati come formati di file TIFF o JPEG dale prime immagini da leggere dal programma. Il volume dello sferoide è stimato come 0,5 x L x W 2. </li></ol> 6. HistoGel-embedding delle sferoidi NET 3D <ol><li> 10-24 sferoidi sono raccolti dalle piastre da 24 pozzetti, lavate due volte in PBS, fissate in formalina al 10% per 2 ore, lavato in 50% e 70% di etanolo per 15 min due volte, rispettivamente, e sono pronti per l&#39;incorporamento HistoGel. In alternativa, essi possono essere tenuti in etanolo 70% a 4 ° C per diversi mesi. </li><li> Un tubo di freddo HistoGel (Thermo Scientific, HG-4000-012) viene messo in un bicchiere pieno d&#39;acqua. Il beaker viene riscaldata in un forno a microonde per 1 minuto o fino a che il gel è completamente liquefatto, quindi tenuta stesso pieno d&#39;acqua becher in ogni momento. </li><li> Gli sferoidi nel 70% di etanolo dall&#39;alto vengono trasferiti in un cryomold biopsia (Tissue-Tek, Sakura Finetek, 4565) con uno stuzzicadenti. Assicurarsi che tutti i sferoidi vengono trasferiti. Sia gli sferoidi riposare per un minuto per affondare fino al fondo del biopsy cryomold. Prova a liberarsi dei liquidi in cryomold biopsia con Kimwipes e nel frattempo, molto delicatamente spingere i sferoidi al centro nella parte inferiore della biopsia cryomold utilizzando la pipetta Pasteur monouso in plastica. Questo passaggio potrebbe essere più facile da fare sotto un microscopio da dissezione. </li><li> Un sottile strato di HistoGel riscaldata viene aggiunto al cryomold biopsia per stabilizzare gli sferoidi sul fondo del cryomold biopsia, intanto, il stuzzicadenti viene utilizzato per mantenere gli sferoidi al centro nella parte inferiore del cryomold biopsia delicatamente. Non aggiungere HistoGel troppo ma appena sufficiente per stabilizzare gli sferoidi sul fondo del cryomold biopsia. </li><li> Lasciate che i sferoidi / HistoGel riposare per 1-2 minuti a temperatura ambiente o fino al HistoGel è solidificato. Poi riempire il resto del cryomold biopsia con il HistoGel riscaldata. </li><li> Lasciare solidificare a temperatura ambiente per circa 10 min. </li><li> Appena prima di saltar fuori gli sferoidi / blocco HistoGel dal cryomold biopsia, leave lo a 4 ° C per 1 min, che aiuta a saltar fuori gli sferoidi intatte / blocco HistoGel. Gli sferoidi / block HistoGel viene poi avvolto in un pezzo di Bio-impacchi (Surgipath, 01.090) e messo in un fazzoletto e cassette biopsia (Fisher Scientific, 15-182-701D). Il tessuto e la cassetta biopsia è memorizzato in un contenitore con etanolo 70%. Poi le procedure di routine di trasformazione dei tessuti in paraffina sono state seguite. 5 </li><li> Il blocco paraffina può essere sezionato in 3-um vetrini strato di spessore. I vetrini possono essere colorate con ematossilina ed eosina di determinare alterazioni istologiche e può anche essere utilizzato per la colorazione immunoistochimica. </li></ol> 7. Risultati rappresentativi Neuroendocrini pancreatici umani linee cellulari tumorali BON-1 (fornito Verto Istituto da Kjell Oberg, Uppsala University, Svezia), QGP-1 (giapponese Health Sciences Foundation, Osaka, Giappone), e umano delle cellule tumorali del polmone neuroendocrine linea H727 (ATCC) sono stati coltivate su un agarose rivestita con 24-pozzetti. Come si vede nella figura 1, le tre linee cellulari mostrano morfologia differente. Cellule BON-1 e H727 formato sferoidi 3D. Sotto il microscopio, H727 cellule mostravano sferoidi strette e più compatto rispetto BON-1 le cellule. Noi ipotizziamo che H727 cellule hanno una maggiore capacità di adesione cellula-cellula e formare giunzioni strette come risultato. QGP-1 le cellule mostrano grandi masse porose uva-simili, che non sono considerati sferoidi. A causa della crescente interesse della ricerca tumore pancreatico neuroendocrino negli ultimi anni, BON-1 cellule vengono usate per il resto delle figure. Dopo la semina BON-1 le cellule sulla agarosio rivestite con piastra da 24 pozzetti, la formazione di sferoidi multicellulari si verifica in genere entro il giorno 3 ° e 4 ° e gli sferoidi rounder diventano di giorno in giorno 6 °. A causa della limitazione da nutrienti e ossigeno, cellule del nucleo denso degli sferoidi iniziano a morire circa 10 giorni e per giorno 17, gli sferoidi cominciano a disintegrarsi a causa delle dimensioni grandi o nellame casi l&#39;espulsione del nucleo necrotico. Gli sferoidi tipicamente può crescere fino a 1000 micron di diametro. Figura 2 mostra le sezioni della crescita formazione, e la disintegrazione di BON-1 sferoidi 3D. Trattamenti farmacologici sono stati avviati quando sferoidi sono stati di circa 300-400 micron e le cellule mantenuto alta vitalità (manoscritto in preparazione). Giorno 6 sferoidi 3D sono stati scelti come punto di partenza per trattamenti farmacologici. E &#39;stato riportato che gli inibitori delle istone deacetilasi ha dimostrato effetti antiproliferativi e pro-apoptotica sulle cellule NET. 6 Abbiamo scelto la istone-deacetilasi-inibitore tricostatina A (TSA) come un esempio per illustrare l&#39;effetto di trattamenti farmacologici in 3D sferoidi NET. Figura 3A mostra la morfologia degli sferoidi 3D sul trattamento di TSA. Figura 3B mostra il volume degli sferoidi 3D su TSA (Sigma, T8552) trattamento. La dimensione di ogni singolo sferoide stato stimato automaticamente da un CUStom-ha sviluppato programma MATLAB. 4 A passo disegno manuale è stato aggiunto per aiutare ad acquisire le sferoidi, che erano vicino al bordo in una data immagine. Almeno 8 sferoidi sono stati misurati per dose di trattamenti TSA in ogni punto. Il volume di ciascuna sferoide 3D ​​è stato calcolato come 0,5 x lunghezza x larghezza 2. Come visto in figura 3A e 3B, rispetto al veicolo, tutte le dosi di TSA mostrate nelle figure dimostrato un certo grado di inibizione della crescita di BON-1 sferoidi 3D. Tra questi, le concentrazioni di 125 nM e 250 nM di TSA fortemente soppressa la crescita di sferoidi 3D e portato alla morte cellulare a 96-ore punto temporale. Per comprendere l&#39;istologia degli sferoidi NET 3D, uno H e E e immunoistochimica (IHC) sono stati eseguiti su sferoidi 3D che erano state coltivate per 17 giorni. Figura 4A illustra un metodo per elaborare sferoidi 3D per l&#39;incorporamento HistoGel, che è la chiave passo per la paraffina del 3D spher<html> OID. Figura 4B mostra la colorazione H &amp; E, la colorazione immunoistochimica del clivata caspasi-3 (un marcatore per le cellule apoptotiche) e Ki-67 (un marcatore per le cellule proliferanti) anticorpi su sferoidi 3D, che erano state coltivate per 17 giorni . Le cellule all&#39;interno del nucleo degli sferoidi 3D sono principalmente necrotica / apoptotico e le cellule dello strato esterno sono attivamente proliferanti. <img src="/files/ftp_upload/4218/4218fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. La morfologia di NET sferoidi 3D. Gli sferoidi 3D da tre linee cellulari tumorali umane neuroendocrini sono formate sulla agarosio rivestite piastre da 24 pozzetti. 1.000 cellule BON-1, H727 e QGP-1 sono state seminate su agarosio rivestite con piastre da 24 pozzetti e cresciuto in una condizione fisiologica come specificato nel protocollo. Queste sono le immagini di sferoidi 3D per BON-1 e H727 o aggregati di cellule QGP-1, che sono state coltivate per 10 giorni. 18/4218fig2.jpg &quot;alt =&quot; Figura 2 &quot;/&gt; Figura 2. Il monitoraggio della crescita dei BON-1 sferoidi 3D Il monitoraggio della crescita di Bon-1 sferoidi 3D:. Formazione, la crescita e la disgregazione di sferoidi 3D. Come specificato nel protocollo, 1.000 BON-1 cellule vengono piastrate su un agarosio rivestite con piastra da 24 pozzetti. Le cellule vengono coltivate in mezzo DMEM/F12 uno standard con 10% FBS in un agitatore orbitale in una condizione fisiologica notte, poi trasferito su una piattaforma stabile e coltivati ​​nelle stesse condizioni. La crescita delle cellule inseguimento in 3D sono state seguite da cellule di imaging ogni ora per le prime 5 ore dopo la placcatura, e quindi ogni 1-3 giorni con una Zeiss Axiovert 200/M-based microscopio a contrasto di fase usando un obiettivo 5x. Le cellule si aggregano in prime messe, poi formare aggregati multicellulari, sferoidi piccoli, grandi sferoidi, e alla fine gli sferoidi si disintegrano. <img src="/files/ftp_upload/4218/4218fig3.jpg" alt="Figura 3" /> Figura 3. Trattamento TSA il BON-1Sferoidi 3D. (A) Immagini di sferoidi 3D in seguito al trattamento TSA. Gruppo di trattamento: V - Vehicle (0,0025% DMSO); D1-dose 1 (15,625 nM TSA); D2-dose 2 (31,25 nM TSA); D3: dose 3 (62,5 nM TSA); D4: dose 4 (125 nM TSA ); D5: alla dose di 5 (250 nM TSA). Tempo di trattamento: 0 H - punto di tempo che i trattamenti iniziati il ​​giorno 6 sferoidi 3D, 24 H, 48 H, 72 H e 96 H sono i punti temporali dopo i trattamenti iniziato. Sferoidi 3D sono stati ripresi in ogni punto temporale come prima. (B) La crescita degli sferoidi 3D in seguito al trattamento TSA. I principali (L) e minore (W) assi dei sferoidi 3D in (A) sono stati stimati automaticamente dal programma Matlab ad ogni tempo di trattamento (0, 24, 48, 72 e 96 ore). Il volume degli sferoidi 3D è stato stimato in 0,5 L x W x 2. Il volume dello sferoide nel grafico è la media di 8 repliche e la barra di errore è stato calcolato sulla base di 8 repliche. <img alt="Tabella 1" src="/files/ftp_upload/4218/4218table1.jpg" /> Tabella 1.Disposizione dei trattamenti farmacologici su una piastra da 24 pozzetti <img src="/files/ftp_upload/4218/4218fig4A.jpg" alt="Figura 4A" /> Figura 4A. Illustrazione di un metodo per elaborare sferoidi 3D per Embedding HistoGel. Un metodo per elaborare sferoidi 3D per l&#39;incorporamento HistoGel e la colorazione immunoistochimica degli sferoidi 3D (A) Una panoramica di un metodo per elaborare sferoidi 3D per l&#39;incorporamento dei HistoGel. Sferoidi 3D sono stati incapsulati in un HistoGel essere allo stesso livello della cryomold biopsia, quindi il HistoGel / blocco sferoidi è stato avvolto in un blu Bio-avvolgimenti e trasferito in una cassetta per biopsia giallo paraffina. <img src="/files/ftp_upload/4218/4218fig4B.jpg" alt="Figura 4B" /> Figura 4B. H &amp; E colorazione e colorazione immunoistochimica del giorno-17 sferoidi 3D. (B) colorazione H &amp; E, colorazione immunoistochimica di Ki-67 e spaccati caspasi-3 degli sferoidi 3D di 17 giorni. Il paraffin incorporate diapositive sono stati sezionati deparaffinate e recupero dell&#39;antigene è stata effettuata utilizzando CCI (Conditioning Solution Cell, Verana Medical System, # 711-065-152). Coniglio policlonale Ki-67 anticorpo (Abcam. # Ab833) e spaccati caspasi 3 anticorpo (Tecnologia di segnalazione cellulare, # 9661) sono stati applicati ad una concentrazione di 1:75 e 1:200, rispettivamente, per 1 ora a temperatura ambiente. L&#39;anti-coniglio anticorpo secondario (Jackson Immunolab, # 711-065-152) è stato applicato a 1:500 per 1 ora a temperatura ambiente, seguito da rivelazione cromogenico kit DABMap (Ventana Medical Systems, # 760-124). I vetrini sono stati di contrasto con ematossilina e disidratato ed eliminato prima coprioggetto da xilene.

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Non ci sono conflitti di interesse dichiarati.

Abbiamo dimostrato un metodo semplice, affidabile e riproducibile per la formazione di immagini 3D sferoide multicellulare da cellule tumorali umane neuroendocrine agarosio utilizzando rivestite piastre da 24 pozzetti. Il successo di questa tecnica è la possibilità di ottenere uno sferoide unico con dimensioni omogeneo e uniforme forma di giorno 6 a partire da un numero fisso di cellule. Il punto chiave è l&#39;agitazione lenta della piastra con le cellule NET per il primo 16-24 ore dopo la placcatura. Questo metodo può valere anche per umana comune linea di cellule del cancro al seno MCF-7, umano adenocarcinoma del colon linea cellulare HT-29, umano polmone non a piccole cellule linea di carcinoma a cellule umane embrionali e H1299 linea cellulare di rene HEK-293. Essi possono formare sferoidi 3D uniformi e compatti per schermo di un farmaco terapeutico (dati non riportati). Sebbene molti metodi sono riportati sulla generazione sferoidi 3D, 7-10 il metodo riportato qui non richiede piastre specializzati o reagenti ed è quindi semplice e conveniente. Il nostro dimo dati non pubblicatiNET e che sferoidi 3D coltivati ​​agarosio imitare il tumore in vivo xenotrapianto NET geometricamente e molecolarmente, rispetto alle cellule monostrato 2D. Questo è simile a quanto riportato per gli sferoidi 3D realizzati su linee di cellule umane di cancro altri. 11,12 La limitazione del modello 3D coltura cellulare è che esso non può sostituire completamente testare l&#39;efficacia in vivo di altri farmaci o trattamenti terapeutici poiché gli sferoidi 3D sono come tumori avascolare, che è diverso dal tumore in vivo in questo aspetto. Tuttavia, questo metodo contribuirà a colmare il divario e le valutazioni di NET farmaci terapeutici in vitro al vivo in alcuni aspetti. Immunofluorescenza su sferoidi multicellulari è molto difficile da eseguire a causa delle grandi dimensioni e la geometria degli sferoidi galleggianti 3D e la limitazione del microscopio confocale. Qui si illustra un metodo per elaborare inclusione HistoGel per paraffinaincorporamento, permettendo colorazione immunoistochimica delle diapositive seriali sezione del sferoidi 3D. Inoltre, il programma personalizzato sviluppato MATLAB aiuta accurato e riproducibile stimare le dimensioni degli sferoidi, monitorare l&#39;efficacia del farmaco in modo efficiente, e potrebbero essere incorporati in uno schermo ad alta capacità per lo sviluppo di farmaci per i pazienti NET.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td><td> Comments </td></tr><tr><td> DMEM/F12 media </td><td> Gibco </td><td> 10565-018 </td><td></td></tr><tr><td> Triplo </td><td> Gibco </td><td> 12604 </td><td></td></tr><tr><td> 24-pozzetti </td><td> Falco </td><td> 353047 </td><td></td></tr><tr><td> 70 mM filtro cella </td><td> Fisher Scientific </td><td> 22363548 </td><td></td></tr><tr><td> Nastro sigillante sterile </td><td> Nunc </td><td> 236366 </td><td></td></tr><tr><td> A tricostatina </td><td> Sigma </td><td> T8552 </td><td></td></tr><tr><td> Orbital Shaker </td><td> Fisher Scientific </td><td> 11-402-12 </td><td></td></tr></tbody></table>

human neuroendocrine tumor cell lines as a three-dimensional model for the study of human neuroendocrine tumor therapy

I tumori neuroendocrini (NET) sono tumori rari, con un&#39;incidenza di due per 100, 000 persone l&#39;anno, e rappresentano lo 0,5% di tutte le neoplasie umane. 1 Oltre a un intervento chirurgico per la minoranza di pazienti che presentano malattia localizzata, non vi è sopravvivenza poco o nessun beneficio della terapia sistemica. Pertanto, vi è una grande necessità di capire meglio la biologia delle reti, e in particolare definire nuovi bersagli terapeutici per i pazienti con tumori neuroendocrini non resecabile o metastatico. Coltura cellulare 3D sta diventando un metodo popolare per lo screening di stupefacenti a causa della sua importanza nel modellare l&#39;organizzazione in vivo del tessuto tumorale e microambiente. 2,3 Gli sferoidi multicellulari in 3D in grado di fornire preziose informazioni in modo più tempestivo e meno costoso di procedere direttamente dal 2D esperimenti di coltura cellulare per gli animali (topo) i modelli. Per facilitare la scoperta di nuove terapie per la NET patients, abbiamo sviluppato un modello in vitro sferoidi multicellulari 3D utilizzando le linee di cellule umane di NET. Le cellule vengono piastrate NET in un non-adesivo agarosio rivestita con piastra da 24 pozzetti e incubate in condizioni fisiologiche (5% CO 2, 37 ° C) con una agitazione molto lenta per 16-24 ore dopo la placcatura. Le cellule formano sferoidi multicellulari a partire dal giorno 3 ° e 4 °. Gli sferoidi diventano più sferica entro il giorno 6 °, a quel punto sono iniziati i trattamenti farmacologici. L&#39;efficacia dei trattamenti farmacologici sugli sferoidi NET viene monitorata in base alla forma morfologia, e la dimensione delle sferoidi con un microscopio a contrasto di fase della luce. La dimensione degli sferoidi è stimato automaticamente utilizzando un programma personalizzato sviluppato MATLAB basato su un algoritmo profilo attivo. Inoltre, abbiamo dimostrato un metodo semplice per elaborare l&#39;incorporamento HistoGel su questi sferoidi 3D, permettendo l&#39;uso di normali tecniche istologiche e immunoistochimica. <pclass = &quot;jove_content&quot;&gt; Questo è il primo rapporto sulla generazione di sferoidi 3D utilizzando linee cellulari NET per esaminare l&#39;effetto dei farmaci terapeutici. Abbiamo anche eseguito istologia questi sferoidi 3D, e mostrato un esempio di un singolo farmaco effetto sulla crescita e la proliferazione delle sferoidi NET. I nostri risultati confermano che gli sferoidi NET sono preziosi per ulteriori studi di biologia NET e lo sviluppo di farmaci.

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Human Neuroendocrine Tumor Cell Lines as a Three-Dimensional Model for the Study of Human Neuroendocrine Tumor Therapy

Vi presentiamo una semplice piattaforma di agarosio overlay a crescere 3D sferoidi multicellulari neuroendocrini utilizzando linee cellulari tumorali. Questo metodo fornisce un modo molto comodo per esaminare l&#39;effetto di farmaci terapeutici sulle cellule tumorali neuroendocrine. Si potrebbe anche aiutarci a definire umani sferoidi tumorali neuroendocrine per la terapia del cancro.

Neuroendocrini umani cella linee tumorali come un modello tridimensionale per lo studio dei diritti dell&#39;uomo e terapia dei tumori neuroendocrini

Neuroendocrine tumors (NETs) are rare tumors, with an incidence of two per 100,&#x200A;000 individuals per year, and they account for 0.5% of all human ...

human-neuroendocrine-tumor-cell-lines-as-three-dimensional-model-for

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28.5K Views.  Raymond and Beverly Sackler Foundation. Vi presentiamo una semplice piattaforma di agarosio overlay a crescere 3D sferoidi multicellulari neuroendocrini utilizzando linee cellulari tumorali. Questo metodo fornisce un modo molto comodo per esaminare l'effetto di farmaci terapeutici sulle cellule tumorali neuroendocrine. Si potrebbe anche aiutarci a definire umani sferoidi tumorali neuroendocrine per la terapia del cancro.

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A Novel High-resolution In vivo Imaging Technique to Study the Dynamic Response of Intracranial Structures to Tumor Growth and Therapeutics

We have successfully integrated previously established Intracranial window (ICW) technology 1-4 with intravital 2-photon confocal microscopy to develop a novel platform that allows for direct long-term visualization of tissue structure changes intracranially. Imaging at a single cell resolution in a real-time fashion provides supplementary dynamic information beyond that provided by standard end-point histological analysis, which looks solely at 'snap-shot' cross sections of tissue.
Establishing this intravital imaging technique in fluorescent chimeric mice, we are able to image four fluorescent channels simultaneously. By incorporating fluorescently labeled cells, such as GFP+ bone marrow, it is possible to track the fate of these cells studying their long-term migration, integration and differentiation within tissue. Further integration of a secondary reporter cell, such as an mCherry glioma tumor line, allows for characterization of cell:cell interactions. Structural changes in the tissue microenvironment can be highlighted through the addition of intra-vital dyes and antibodies, for example CD31 tagged antibodies and Dextran molecules.
Moreover, we describe the combination of our ICW imaging model with a small animal micro-irradiator that provides stereotactic irradiation, creating a platform through which the dynamic tissue changes that occur following the administration of ionizing irradiation can be assessed.
Current limitations of our model include penetrance of the microscope, which is limited to a depth of up to 900 &mu;m from the sub cortical surface, limiting imaging to the dorsal axis of the brain. The presence of the skull bone makes the ICW a more challenging technical procedure, compared to the more established and utilized chamber models currently used to study mammary tissue and fat pads 5-7. In addition, the ICW provides many challenges when optimizing the imaging.

A Novel High-resolution In vivo Imaging Technique to Study the Dynamic Response of Intracranial Structures to Tumor Growth and Therapeutics

We describe a novel in vivo imaging technique that couples fluorescent chimeric mice with intracranial windows and high-resolution 2-photon microscopy. This imaging platform aids studies of dynamic changes in brain tissue and microvasculature, at a single-cell level, following pathological insults and is adaptable to assess intracranial drug delivery and distribution.

Un romanzo ad alta risoluzione<em&gt; In vivo</em&gt; Tecnica di imaging per studiare la risposta dinamica di strutture intracraniche alla crescita del tumore e Terapeutica

We have successfully integrated previously established Intracranial window (ICW) technology 1-4 with intravital 2-photon confocal microscopy to develop a ...

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Medicina

A Three-dimensional Tissue Culture Model to Study Primary Human Bone Marrow and its Malignancies

Tissue culture has been an invaluable tool to study many aspects of cell function, from normal development to disease. Conventional cell culture methods rely on the ability of cells either to attach to a solid substratum of a tissue culture dish or to grow in suspension in liquid medium. Multiple immortal cell lines have been created and grown using such approaches, however, these methods frequently fail when primary cells need to be grown ex vivo. Such failure has been attributed to the absence of the appropriate extracellular matrix components of the tissue microenvironment from the standard systems where tissue culture plastic is used as a surface for cell growth. Extracellular matrix is an integral component of the tissue microenvironment and its presence is crucial for the maintenance of physiological functions such as cell polarization, survival, and proliferation. Here we present a 3-dimensional tissue culture method where primary bone marrow cells are grown in extracellular matrix formulated to recapitulate the microenvironment of the human bone (rBM system). Embedded in the extracellular matrix, cells are supplied with nutrients through the medium supplemented with human plasma, thus providing a comprehensive system where cell survival and proliferation can be sustained for up to 30 days while maintaining the cellular composition of the primary tissue. Using the rBM system we have successfully grown primary bone marrow cells from normal donors and patients with amyloidosis, and various hematological malignancies. The rBM system allows for direct, in-matrix real time visualization of the cell behavior and evaluation of preclinical efficacy of novel therapeutics. Moreover, cells can be isolated from the rBM and subsequently used for in vivo transplantation, cell sorting, flow cytometry, and nucleic acid and protein analysis. Taken together, the rBM method provides a reliable system for the growth of primary bone marrow cells under physiological conditions.

In standard culture methods cells are taken out of their physiological environment and grown on the plastic surface of a dish. To study the behavior of primary human bone marrow cells we created a 3-D culture system where cells are grown under conditions recapitulating the native microenvironment of the tissue.

A Three-dimensional Tissue Culture modello per studiare Primario Osso Osseo e le sue Malignità

Tissue culture has been an invaluable tool to study many aspects of cell function, from normal development to disease. Conventional cell culture methods ...

Excitotoxic Stimulation of Brain Microslices as an In vitro Model of Stroke

Examining molecular mechanisms involved in neuropathological conditions, such as ischemic stroke, can be difficult when using whole animal systems. As such, primary or &#39;neuronal-like&#39; cell culture systems are commonly utilized. While&#160;these systems are relatively easy to work with, and are useful model systems in which various functional outcomes (such as cell death) can be readily quantified, the examined outcomes and pathways in cultured immature neurons (such as excitotoxicity-mediated cell death pathways) are not necessarily the same as those observed in mature brain, or in intact tissue. Therefore, there is the need to develop models in which cellular mechanisms in mature neural tissue can be examined. We have developed an in vitro technique that can be used to investigate a variety of molecular pathways in intact nervous tissue. The technique described herein utilizes rat cortical tissue, but this technique can be adapted to use tissue from a variety of species (such as mouse, rabbit, guinea pig, and chicken) or brain regions (for example, hippocampus, striatum, etc.). Additionally, a variety of stimulations/treatments can be used (for example, excitotoxic, administration of inhibitors, etc.). In conclusion, the brain slice model described herein can be used to examine a variety of molecular mechanisms involved in excitotoxicity-mediated brain injury.

Excitotoxic Stimulation of Brain Microslices as an In vitro Model of Stroke

We have developed a brain slice model which can be used to examine molecular mechanisms involved in excitotoxicity-mediated brain injury.&#160;This technique generates viable mature brain tissue and reduces animal numbers required for experimentation, whilst keeping the neuronal circuitry, cellular interactions, and postsynaptic compartments partly intact.

Eccitotossica stimolazione del cervello Microslices come<em&gt; In vitro</em&gt; Modello di Corsa

Examining molecular mechanisms involved in neuropathological conditions, such as ischemic stroke, can be difficult when using whole animal systems. As ...

Quantification of Breast Cancer Cell Invasiveness Using a Three-dimensional (3D) Model

It is now well known that the cellular and tissue microenvironment are critical regulators influencing tumor initiation and progression. Moreover, the extracellular matrix (ECM) has been demonstrated to be a critical regulator of cell behavior in culture and homeostasis in vivo. The current approach of culturing cells on two-dimensional (2D), plastic surfaces results in the disturbance and loss of complex interactions between cells and their microenvironment. Through the use of three-dimensional (3D) culture assays, the conditions for cell-microenvironment interaction are established resembling the in vivo microenvironment. This article provides a detailed methodology to grow breast cancer cells in a 3D basement membrane protein matrix, exemplifying the potential of 3D culture in the assessment of cell invasion into the surrounding environment. In addition, we discuss how these 3D assays have the potential to examine the loss of signaling molecules that regulate epithelial morphology by immunostaining procedures. These studies aid to identify important mechanistic details into the processes regulating invasion, required for the spread of breast cancer.

Quantification of Breast Cancer Cell Invasiveness Using a Three-dimensional 3D Model

This article provides detailed methodologies for the use of three-dimensional (3D) assays to quantify breast cancer cell invasion. Specifically, we discuss the procedures required to set up such assays, quantification, and data analysis, as well as methods to examine the loss of membrane integrity that occurs when cells invade.

Quantificazione del cancro al seno Cellula Invasività Utilizzando una tridimensionale (3D) Modello

It is now well known that the cellular and tissue microenvironment are critical regulators influencing tumor initiation and progression. Moreover, the ...

Three-dimensional Co-culture Model for Tumor-stromal Interaction

Cancer progression (initiation, growth, invasion and metastasis) occurs through interactions between malignant cells and the surrounding tumor stromal cells. The tumor microenvironment is comprised of a variety of cell types, such as fibroblasts, immune cells, vascular endothelial cells, pericytes and bone-marrow-derived cells, embedded in the extracellular matrix (ECM). Cancer-associated fibroblasts (CAFs) have a pro-tumorigenic role through the secretion of soluble factors, angiogenesis and ECM remodeling. The experimental models for cancer cell survival, proliferation, migration, and invasion have mostly relied on two-dimensional monocellular and monolayer tissue cultures or Boyden chamber assays. However, these experiments do not precisely reflect the physiological or pathological conditions in a diseased organ. To gain a better understanding of tumor stromal or tumor matrix interactions, multicellular and three-dimensional cultures provide more powerful tools for investigating intercellular communication and ECM-dependent modulation of cancer cell behavior. As a platform for this type of study, we present an experimental model in which cancer cells are cultured on collagen gels embedded with primary cultures of CAFs.

Here we present a protocol to co-culture in three-dimensions, which is useful for investigating multicellular interactions and extracellular matrix-dependent modulation of cancer cell behavior. In this experimental model, cancer cells are cultured on collagen gels embedded with human cancer-associated fibroblasts.

Tridimensionale Co-cultura Modello di tumore stromale-Interaction

Cancer progression (initiation, growth, invasion and metastasis) occurs through interactions between malignant cells and the surrounding tumor stromal ...

Evaluation of Tumor-infiltrating Leukocyte Subsets in a Subcutaneous Tumor Model

Specialized immune cells that infiltrate the tumor microenvironment regulate the growth and survival of neoplasia.&#160; Malignant cells must elude or subvert anti-tumor immune responses in order to survive and flourish. Tumors take advantage of a number of different mechanisms of immune &#8220;escape,&#8221; including the recruitment of tolerogenic DC, immunosuppressive regulatory T cells (Tregs), and myeloid-derived suppressor cells (MDSC) that inhibit cytotoxic anti-tumor responses. Conversely, anti-tumor effector immune cells can slow the growth and expansion of malignancies: immunostimulatory dendritic cells, natural killer cells which harbor innate anti-tumor immunity, and cytotoxic T cells all can participate in tumor suppression. The balance between pro- and anti-tumor leukocytes ultimately determines the behavior and fate of transformed cells; a multitude of human clinical studies have borne this out. Thus, detailed analysis of leukocyte subsets within the tumor microenvironment has become increasingly important. Here, we describe a method for analyzing infiltrating leukocyte subsets present in the tumor microenvironment in a mouse tumor model. Mouse B16 melanoma tumor cells were inoculated subcutaneously in C57BL/6 mice. At a specified time, tumors and surrounding skin were resected en bloc and processed into single cell suspensions, which were then stained for multi-color flow cytometry. Using a variety of leukocyte subset markers, we were able to compare the relative percentages of infiltrating leukocyte subsets between control and chemerin-expressing tumors. Investigators may use such a tool to study the immune presence in the tumor microenvironment and when combined with traditional caliper size measurements of tumor growth, will potentially allow them to elucidate the impact of changes in immune composition on tumor growth. Such a technique can be applied to any tumor model in which the tumor and its microenvironment can be resected and processed.

This protocol describes a method for the detailed evaluation of leukocyte subsets within the tumor microenvironment in a mouse tumor model. Chemerin-expressing B16 melanoma cells were implanted subcutaneously into syngeneic mice. Cells from the tumor microenvironment were then stained and analyzed by flow cytometry, allowing for detailed leukocyte subset analyses.

Valutazione del tumore infiltrante leucociti sottoinsiemi in un tumore sottocutaneo modello

Specialized immune cells that infiltrate the tumor microenvironment regulate the growth and survival of neoplasia.&#160; Malignant cells must elude or ...

Establishment of a Human Multiple Myeloma Xenograft Model in the Chicken to Study Tumor Growth, Invasion and Angiogenesis

Multiple myeloma (MM), a malignant plasma cell disease, remains incurable and novel drugs are required to improve the prognosis of patients. Due to the lack of the bone microenvironment and auto/paracrine growth factors human MM cells are difficult to cultivate. Therefore, there is an urgent need to establish proper in vitro and in vivo culture systems to study the action of novel therapeutics on human MM cells. Here we present a model to grow human multiple myeloma cells in a complex 3D environment in vitro and in vivo. MM cell lines OPM-2 and RPMI-8226 were transfected to express the transgene GFP and were cultivated in the presence of human mesenchymal cells and collagen type-I matrix as three-dimensional spheroids. In addition, spheroids were grafted on the chorioallantoic membrane (CAM) of chicken embryos and tumor growth was monitored by stereo fluorescence microscopy. Both models allow the study of novel therapeutic drugs in a complex 3D environment and the quantification of the tumor cell mass after homogenization of grafts in a transgene-specific GFP-ELISA. Moreover, angiogenic responses of the host and invasion of tumor cells into the subjacent host tissue can be monitored daily by a stereo microscope and analyzed by immunohistochemical staining against human tumor cells (Ki-67, CD138, Vimentin) or host mural cells covering blood vessels (desmin/ASMA).
In conclusion, the onplant system allows studying MM cell growth and angiogenesis in a complex 3D environment and enables screening for novel therapeutic compounds targeting survival and proliferation of MM cells.

Human multiple myeloma (MM) cells require the supportive microenvironment of mesenchymal cells and extracellular matrix components for survival and proliferation. We established an in vivo chicken embryo model with engrafted human myeloma and mesenchymal cells to study effects of cancer drugs on tumor growth, invasion and angiogenesis.

Istituzione di un mieloma multiplo umano Xenograft modello nel pollo per studiare la crescita del tumore, invasione e l&#39;angiogenesi

Multiple myeloma (MM), a malignant plasma cell disease, remains incurable and novel drugs are required to improve the prognosis of patients. Due to the ...

Three-Dimensional (3D) Tumor Spheroid Invasion Assay

Invasion of surrounding normal tissues is generally considered to be a key hallmark of malignant (as opposed to benign) tumors. For some cancers in particular (e.g., brain tumors such as glioblastoma multiforme and squamous cell carcinoma of the head and neck &#8211; SCCHN) it is a cause of severe morbidity and can be life-threatening even in the absence of distant metastases. In addition, cancers which have relapsed following treatment unfortunately often present with a more aggressive phenotype. Therefore, there is an opportunity to target the process of invasion to provide novel therapies that could be complementary to standard anti-proliferative agents. Until now, this strategy has been hampered by the lack of robust, reproducible assays suitable for a detailed analysis of invasion and for drug screening. Here we provide a simple micro-plate method (based on uniform, self-assembling 3D tumor spheroids) which has great potential for such studies. We exemplify the assay platform using a human glioblastoma cell line and also an SCCHN model where the development of resistance against targeted epidermal growth factor receptor (EGFR) inhibitors is associated with enhanced matrix-invasive potential. We also provide two alternative methods of semi-automated quantification: one using an imaging cytometer and a second which simply requires standard microscopy and image capture with digital image analysis.

Three-Dimensional 3D Tumor Spheroid Invasion Assay

Invasion of surrounding normal tissues is a defining characteristic of malignant tumors. We provide here a simple, semi-automated micro-plate assay of invasion into a natural 3D biomatrix that has been exemplified with a number of models of advanced human cancers.

Tridimensionale (3D) Tumore Spheroid Invasion Assay

Invasion of surrounding normal tissues is generally considered to be a key hallmark of malignant (as opposed to benign) tumors. For some cancers in ...

Dynamic Lung Tumor Tracking for Stereotactic Ablative Body Radiation Therapy

Physicians considering stereotactic ablative body radiation therapy (SBRT) for the treatment of extracranial cancer targets must be aware of the sizeable risks for normal tissue injury and the hazards of physical tumor miss. A first-of-its-kind SBRT platform achieves high-precision ablative radiation treatment through a combination of versatile real-time imaging solutions and sophisticated tumor tracking capabilities. It uses dual-diagnostic kV x-ray units for stereoscopic open-loop feedback of cancer target intrafraction movement occurring as a consequence of respiratory motions and heartbeat. Image-guided feedback drives a gimbaled radiation accelerator (maximum 15 x 15 cm field size) capable of real-time &#177;4 cm pan-and-tilt action. Robot-driven &#177;60&#176; pivots of an integrated &#177;185&#176; rotational gantry allow for coplanar and non-coplanar accelerator beam set-up angles, ultimately permitting unique treatment degrees of freedom. State-of-the-art software aids real-time six dimensional positioning, ensuring irradiation of cancer targets with sub-millimeter accuracy (0.4 mm at isocenter). Use of these features enables treating physicians to steer radiation dose to cancer tumor targets while simultaneously reducing radiation dose to normal tissues. By adding respiration correlated computed tomography (CT) and 2-[18F] fluoro-2-deoxy-&#7429;-glucose (18F-FDG) positron emission tomography (PET) images into the planning system for enhanced tumor target contouring, the likelihood of physical tumor miss becomes substantially less1. In this article, we describe new radiation plans for the treatment of moving lung tumors.

Stereotactic ablative body radiation therapy (SBRT) involves the precise delivery of high-dose radiation to cancer tumor targets. A novel SBRT platform offers a first-of-its-kind gimbaled radiation accelerator mounted within a pivoting O-ring gantry capable of dynamic image-guided tumor tracking. Here, we describe dynamic tumor tracking for lung targets.

Polmone dinamico Tumore inseguimento per stereotassica ablativo corpo Radioterapia

Physicians considering stereotactic ablative body radiation therapy (SBRT) for the treatment of extracranial cancer targets must be aware of the sizeable ...

A Human Glioblastoma Organotypic Slice Culture Model for Study of Tumor Cell Migration and Patient-specific Effects of Anti-Invasive Drugs

Glioblastoma (GBM) continues to carry an extremely poor clinical prognosis despite surgical, chemotherapeutic, and radiation therapy. Progressive tumor invasion into surrounding brain parenchyma represents an enduring therapeutic challenge. To develop anti-migration therapies for GBM, model systems that provide a physiologically relevant background for controlled experimentation are essential. Here, we present a protocol for generating slice cultures from human GBM tissue obtained during surgical resection. These cultures allow for ex vivo experimentation without passaging through animal xenografts or single cell cultures. Further, we describe the use of time-lapse laser scanning confocal microscopy in conjunction with cell tracking to quantitatively study the migratory behavior of tumor cells and associated response to therapeutics. Slices are reproducibly generated within 90 min of surgical tissue acquisition. Retrovirally-mediated fluorescent cell labeling, confocal imaging, and tumor cell migration analyses are subsequently completed within two weeks of culture. We have successfully used these slice cultures to uncover genetic factors associated with increased migratory behavior in human GBM. Further, we have validated the model&#39;s ability to detect patient-specific variation in response to anti-migration therapies. Moving forward, human GBM slice cultures are an attractive platform for rapid ex vivo assessment of tumor sensitivity to therapeutic agents, in order to advance personalized neuro-oncologic therapy.

Current ex vivo models of glioblastoma (GBM) are not optimized for physiologically relevant study of human tumor invasion. Here, we present a protocol for generation and maintenance of organotypic slice cultures from fresh human GBM tissue. A description of time-lapse microscopy and quantitative cell migration analysis techniques is provided.

Un modello di cultura organica fetta di Glioblastoma umano per lo studio della migrazione delle cellule tumorali e degli effetti specifici del paziente di farmaci antiinvasivi

Glioblastoma (GBM) continues to carry an extremely poor clinical prognosis despite surgical, chemotherapeutic, and radiation therapy. Progressive tumor ...