Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave sul significato della dinamica dell'espressione genica nella proliferazione e differenziazione cellulare, in particolare la dinamica delle molecole di segnalazione notch nelle cellule staminali neurali. Il vantaggio principale di questa tecnica è che possiamo monitorare l'espressione genica sia in vitro che in vivo con un'altissima precisione attraverso l'imaging dal vivo. A dimostrare la procedura sarà Hiromi Shimojo, l'assistente professore del mio laboratorio che ha sviluppato questa nuova tecnologia.
Per dll1 F luciferasi reporter introduzione in NPC, confermare una mancanza di risposta al riflesso del pedale in un giorno embrionale da 12.5 a 14.5 topo incinta prima di fare un'incisione da due a tre centimetri attraverso l'addome, lungo la linea mediana. Posizionare una garza imbevuta di PBS intorno all'incisione e utilizzare le forcep a forma di anello per estrarre con cura il corno uterino destro. Dopo aver contato gli embrioni, utilizzare un micro capillare per iniettare uno o due microlitri di DNA del reporter misto Dll1 F luciferasi nel ventricolo del telencefalo di ogni embrione.
Un'iniezione riuscita comporterà l'osservanza della tintura blu sulla superficie dell'utero. Per l'elettroporazione, bagnare l'utero e l'elettrodo con PBS e afferrare delicatamente la testa del primo embrione. Impostare l'elettrodo caricato positivamente sul lato dell'emisfero in cui è stato iniettato il DNA e fornire cinque impulsi da 30 a 50 volt e 50 millisecondi, con una pausa di un secondo tra gli impulsi, controllando che le bolle siano generate dall'elettrodo caricato negativamente.
Quando tutti gli embrioni sono stati iniettati, riportare il corno uterino sinistro all'addome e utilizzare un ago di 17 millimetri per chiudere l'incisione con una sutura di seta 4-0, posizionando PBS caldo nella cavità addominale prima di completare la chiusura. Per impostare una cultura NPC dissociata, mettere innanzitutto l'utero da un giorno embrionale da 12,5 a 14,5 dll1 incinta ubiquitinato di luciferasi transgenico in una piastra di Petri di 10 centimetri contenente 25 millilitri di PBS ghiacciato e utilizzare micro forbici e forcette fini per rimuovere gli embrioni dall'utero. Dopo aver decapitato gli embrioni, posizionare le teste in una nuova piastra di Petri di 10 centimetri contenente DMEM / F12 ghiacciato e rimuovere l'epidermide e la cartilagine che circondano ogni cervello.
Trasferire il cervello in un piatto da 35 millimetri sotto un microscopio sezionante contenente tre millilitri di mezzo N2B27 ghiacciato. Rimuovere il telencefalo destro e sinistro dal diencefalo. Utilizzare forcep fini per rimuovere le meningi che coprono la superficie del telencefalo e per sezionare la parte dorsolaterale della corteccia dal telencefalo.
Quando tutti i tessuti neurali di interesse sono stati isolati, utilizzare una pipetta P1000 per trasferire i campioni in singoli tubi da 1,5 millilitri e utilizzare una pipetta P200 per aspirare qualsiasi mezzo extra da ogni tubo. Aggiungere 100 microlitri di soluzione di papaina per coppia di corteccia e posizionare i campioni a 24 gradi Celsius per 15 minuti. Alla fine dell'incubazione, pipettare delicatamente i campioni 10 volte con una nuova pipetta P1000 e riportare i tubi a 24 gradi Celsius per altri 15 minuti.
Al termine dell'incubazione, pipettare delicatamente nuovamente i campioni prima di raccogliere i tessuti digeriti per centrifugazione. Aspirare i supernaganti e rimorsi delicatamente ogni pellet con un millilitro di mezzo DMEM/F12. Centrifugare i campioni altre tre volte come appena dimostrato, rimontegando delicatamente ogni pellet con un millilitro fresco di mezzo dopo ogni centrifugazione.
Dopo l'ultima centrifugazione, risosorne i pellet in 500 microlitri di mezzo N2B27 integrati con luciferina millimolare e seminare una volta 10 alle sei cellule di ciascun campione su singoli piatti di fondo in vetro rivestito in poli-L-lisina. Quindi, posizionare le piastre nell'incubatore di coltura cellulare per un'ora. Una volta che le cellule hanno aderito al piatto, aggiungere due millilitri di mezzo N2B27 fresco più luciferina millimolare ad ogni piatto.
Per visualizzare l'espressione del reporter luciferasi nelle colture di dissociazione NPC, selezionare l'obiettivo di immersione dell'olio e posizionare il piatto campione sullo stadio del microscopio. Visualizzare manualmente il campo per determinare la posizione migliore per la visualizzazione delle celle e concentrarsi sulle celle di interesse. Fare clic su Live per acquisire l'immagine di test e utilizzare il programma di acquisizione multidimensionale per eseguire l'acquisizione time-lapse mediante luminescenza bidimensionale e acquisizioni di campi luminosi per 24 ore.
Per preparare lo sviluppo di colture di fette di corteccia, un giorno dopo l'iniezione del reporter, raccogliere il giorno embrionale da 13,5 a 14,5 cervelli embrionali come dimostrato e posizionare il piatto contenente il cervello sullo stadio di un microscopio stereoscopico a fluorescenza. Verificare che ogni corteccia esprima il reporter fluorescente iniettato sotto l'appropriata luce di eccitazione e trasferisca il cervello a un tagliere in gomma siliconica riempito con 30 millilitri di mezzo DMEM/F12, bollito con gas ossigeno al 100%. Utilizzare un coltello microchir chirurgico e forcep fini per tagliare il bordo tra la porzione mediale e laterale del telencefalo dorsale e separare il tessuto in due emisferi.
Quindi, utilizzare il coltello per tagliare la corteccia come strisce per ottenere fette corticali, trasferendo le fette in mezzo dal tagliere in una nuova piastra di Petri da 35 millimetri man mano che vengono acquisite. Una volta raccolte tutte le fette, posizionare la superficie tagliata di ogni fetta su un inserto di coltura incastonato in un piatto inferiore di vetro contenente mezzo arricchito, regolando l'orientamento di ogni fetta con forcep fini se necessario. Quindi, rimuovere qualsiasi mezzo in eccesso con una pipetta e posizionare il piatto in un incubatore multi-gas impostato su 40% ossigeno, 5% anidride carbonica e 37 gradi Celsius per 30 minuti.
Al termine dell'incubazione, aggiungere 300 microlitri di mezzo arricchito integrati con luciferina millimolare al piatto di coltura. Per visualizzare l'espressione del reporter luciferasi all'interno delle impostazioni cultura della fetta, selezionare l'obiettivo 40x e posizionare il piatto campione sullo stadio del microscopio. Acquisire un'immagine di prova della fluorescenza e impostare la posizione e il piano di messa a fuoco sulla regione di interesse sotto l'illuminazione della luce di eccitazione appropriata.
Quindi, esegui l'acquisizione time-lapse con luminescenza tridimensionale, fluorescenza e acquisizioni di campi luminosi per 24 ore. Per monitorare l'attività promotrice del gene oscillante Dll1, è possibile utilizzare la luciferasi ubiquitinata, un reporter luciferasi destabilizzato con un'emività di circa 10 minuti. Come un reporter fluorescente, il reporter luciferasi può essere usato per monitorare la dinamica di espressione di una proteina essendo fuso alla sequenza di codifica genica di interesse.
Per visualizzare l'espressione del reporter a livello di singola cellula nelle colture tissutali, il gene reporter può essere transiently trasfetto nei PNG attraverso l'elettroporazione utero come dimostrato. Inoltre, l'imaging basato su microscopio consente l'acquisizione di immagini a campo luminoso, fluorescenza e chemiluminescenza. Il reporter dell'attività promotore dll1 mostra un'espressione oscillatoria nei PNG derivata dal telencefalo di Dll1 ubiquitinato F luciferasi reporter topi, con il reporter luciferasi destabilizzato che indica una regolazione netta su e giù dell'espressione dell'attività promotore.
Nelle cellule positive alle proteine fluorescenti verdi adiacenti che trasportano cellule hes1 reporter e mCherry-positive che esprimono il reporter della proteina Dll1 che ha preso contatto tra loro durante l'osservazione, l'espressione del reporter Hes1 sembra iniziare circa 60 minuti dopo il contatto, suggerendo che il ritardo per la trasmissione della segnalazione notch tra le cellule adiacenti è di circa un'ora. Inoltre, durante la trasmissione del segnale, l'espressione proteica Dll1 mostra una traslocazione dinamica. Quando si acquisisce l'imaging a bioluminescenza, mantenere la stanza del microscopio completamente buia, poiché la luce estranea può impedire un'acquisizione ottimale.
I recenti sviluppi dell'optogenetica ci permettono di controllare l'espressione genica con la luce. Con questa tecnica, possiamo introdurre contemporaneamente vari modelli di espressione genica e monitorare le risposte dei reporter luciferasi.
