Questo lavoro è sostenuto da fondi di avvio presso l&#39;Università di Louisville e CA135123 dal National Institutes of Health (per CH).

1. Cultura e transfezione cellulare <ol><li> COS-7 cellule vengono coltivate in terreno Eagle modificato di Dulbecco (DMEM) supplementato con 4,5 g / l di glucosio e 10% di siero bovino fetale (FBS). </li><li> Trasfezione plasmide è fatto con Lipofectamine secondo le istruzioni del produttore (Invitrogen). </li></ol> 2. Analisi al microscopio di fluorescenza Expression SNARE della superficie cellulare <ol><li> Il giorno prima della transfezione, 3 × 10 4 cellule COS-7 sono seminate su sterili 12-millimetri vetrini (Fisher Scientific) contenuti in piastre da 24 pozzetti. </li><li> Per v-celle in ciascun pozzetto, 0,25 microgrammi di plasmide che codifica tTA (pTet-Off, CLONTECH) è co-trasfettate con 0,25 mg di plasmidi che esprimono capovolto vampiri. </li><li> Per le cellule T in ogni pozzetto, 0,25 mg del plasmide codificante TRE-LacZ (PBI-G, CLONTECH) è co-trasfettate con 0,25 mg ciascuno dei plasmidi che esprimono capovolte SNAP-25 e sintaxine 1 o 4. </li><li> 24 ore dopo transfection, le cellule vengono fissate con 4% paraformaldeide in PBS + + (PBS supplementato con 0,1 g / l CaCl 2 e 0,1 g / l MgCl 2) per 10 min, e quindi bloccati nel 10% FBS in PBS + + per 30 min. </li><li> Le cellule sono incubate per 1,5 ore con gli anticorpi anti-Myc 9E10 anticorpi monoclonali (neat supernatante di coltura di ibridoma). </li><li> Dopo quattro lavaggi con PBS + +, le cellule vengono incubate per 1 ora con anticorpi secondari coniugati con FITC (Jackson ImmunoResearch Laboratories) alla diluizione di 1:500. </li><li> Dopo quattro lavaggi con PBS + +, le cellule marcate sono montati in oro antifade Prolungare reagente (Invitrogen). </li><li> Immagini confocali sono raccolti su un microscopio laser confocale Olympus scansione. Le immagini vengono elaborate con il software Adobe Photoshop. </li></ol> 3. Analisi FACS di espressione SNARE della superficie cellulare <ol><li> Il giorno prima della transfezione, 2 × 10 5 cellule COS-7 sono seminate in ciascun pozzetto di piastre da 6 pozzetti. </li><li> 24 ore dopo la tradinsfection con la capovolto SNARE, pTet-Off e pBI-G plasmidi, le cellule vengono fissate con 1% paraformaldeide in PBS + + per 15 min, e quindi bloccati nel 10% FBS in PBS + + per 15 min. </li><li> Le cellule sono incubate con gli anticorpi anti-Myc 9E10 anticorpi monoclonali per 60 min. </li><li> Dopo tre lavaggi con PBS + +, le cellule vengono marcate con anticorpi secondari coniugati con FITC (diluizione 1:200) per 45 min. </li><li> Dopo tre lavaggi con PBS + +, le cellule vengono raschiate le piastre con un raschietto cellulare. </li><li> 15.000 cellule vengono analizzate usando un citometro a flusso FACSCalibur (BD Biosciences). L&#39;intensità di fluorescenza media di ciascun campione è ottenuta utilizzando il software CellQuest Pro. </li></ol> 4. Enzimatica cellulare Assay Fusion <ol><li> Il giorno prima della transfezione, 1,2 x 10 6 cellule COS-7 sono seminate in ogni 100 mm piatto di coltura di tessuti, e 2 × 10 5 cellule COS-7 sono seminate in ciascun pozzetto di piastre da 6 pozzetti. </li><li> Per v-cellule, 0,5 - 5 mg ogni Flipped plasmide VAMP è cotransfected con 5 pg di pTet-Off nelle celle di ogni 100 mm piatto di coltura. Cellule di controllo sono co-trasfettate con il vettore vuoto pcDNA3.1 (+) e pTet-Off. Per impedire la N-glicosilazione di VAMPS 1, 4, 5, 7 e 8, tunicamicina (10 pg / ml) è incluso nel mezzo di coltura cellulare durante la trasfezione. </li><li> Per cellule T in ciascun pozzetto di piastre da 6 pozzetti, 1 ug di capovolte SNAP-25 e plasmide pBI-G vengono cotrasfettate con 0,5 pg di plasmide o capovolto syntaxin1 0,05 pg di plasmide syntaxin4 capovolte. </li><li> 24 ore dopo la trasfezione, le v-cellule sono staccate da piastre di coltura con l&#39;enzima senza dissociazione cellulare Buffer (Invitrogen). Cellule staccati sono contate con un emocitometro e risospese in tampone HEPES DMEM supplementato con 10% FBS, 6,7 ug / ml e 0,67 tunicamicina mM DTT. </li><li> 4,8 × 10 risospeso 5 V-cellule vengono aggiunti a ciascun pozzetto contenente già le cellule T. </li><li> Ratto dopo 6, 12 o 24 ore a 37 ° C in 5% CO 2 </sub&gt;, l&#39;espressione di β-galattosidasi è misurata utilizzando il β-galattosidasi Sistema saggio enzimatico con tampone di lisi Reporter secondo le istruzioni del produttore (Promega). Brevemente, le cellule vengono lavate due volte con PBS e lisate in tampone di lisi Reporter. I lisati cellulari sono mescolati con un volume uguale di tampone di saggio 2 ×. Come un controllo in bianco, il tampone di lisi Reporter viene miscelato con il tampone del saggio 2 ×. </li><li> Dopo 90 minuti, la reazione colorimetrica viene bloccata per aggiunta di carbonato di sodio 1 M. </li><li> Assorbanza a 420 nm viene misurata mediante spettrofotometro HITACHI 100-40. </li></ol>

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	<li>Rothman, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+intracellular+protein+transport.">Mechanisms of intracellular protein transport.</a> Nature. 372, 55-63 (1994).</li><li>Jahn, R., Lang, T., Sudhof, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+fusion.">Membrane fusion.</a> Cell. 112, 519-533 (2003).</li><li>Bonifacino, J. S., Glick, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mechanisms+of+vesicle+budding+and+fusion.">The mechanisms of vesicle budding and fusion.</a> Cell. 116, 153-166 (2004).</li><li>Jahn, R., Scheller, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SNAREs--engines+for+membrane+fusion.">SNAREs--engines for membrane fusion.</a> Nature. 7, 631-643 (2006).</li><li>Weber, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SNAREpins:+minimal+machinery+for+membrane+fusion.">SNAREpins: minimal machinery for membrane fusion.</a> Cell. 92, 759-772 (1998).</li><li>Hu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fusion+of+cells+by+flipped+SNAREs.">Fusion of cells by flipped SNAREs.</a> Science (New York, N.Y). 300, 1745-1749 (2003).</li><li>Hu, C., Hardee, D., Minnear, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+fusion+by+VAMP3+and+plasma+membrane+t-SNAREs.">Membrane fusion by VAMP3 and plasma membrane t-SNAREs.</a> Experimental cell research. 313, 3198-3209 (2007).</li><li>Hasan, N., Corbin, D., Hu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fusogenic+Pairings+of+Vesicle-Associated+Membrane+Proteins+(VAMPs)+and+Plasma+Membrane+t-SNAREs+-+VAMP5+as+the+Exception.">Fusogenic Pairings of Vesicle-Associated Membrane Proteins (VAMPs) and Plasma Membrane t-SNAREs - VAMP5 as the Exception.</a> PloS one. 5, e14238 (2010).</li><li>Gossen, M., Bujard, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tight+control+of+gene+expression+in+mammalian+cells+by+tetracycline-responsive+promoters.">Tight control of gene expression in mammalian cells by tetracycline-responsive promoters.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 89, 5547-5551 (1992).</li><li>Hanson, P. I., Heuser, J. E., Jahn, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurotransmitter+release+-+four+years+of+SNARE+complexes.">Neurotransmitter release - four years of SNARE complexes.</a> Current opinion in neurobiology. 7, 310-315 (1997).</li><li>McMahon, H. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellubrevin+is+a+ubiquitous+tetanus-toxin+substrate+homologous+to+a+putative+synaptic+vesicle+fusion+protein.+[see+comments.">Cellubrevin is a ubiquitous tetanus-toxin substrate homologous to a putative synaptic vesicle fusion protein. [see comments.</a> Nature. 364, 346-349 (1993).</li><li>Steegmaier, M., Klumperman, J., Foletti, D. L., Yoo, J. S., Scheller, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vesicle-associated+membrane+protein+4+is+implicated+in+trans-Golgi+network+vesicle+trafficking.">Vesicle-associated membrane protein 4 is implicated in trans-Golgi network vesicle trafficking.</a> Molecular biology of the cell. 10, 1957-1972 (1999).</li><li>Zeng, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+synaptobrevin/VAMP+homologous+protein+(VAMP5)+is+increased+during+in+vitro+myogenesis+and+present+in+the+plasma+membrane.">A novel synaptobrevin/VAMP homologous protein (VAMP5) is increased during in vitro myogenesis and present in the plasma membrane.</a> Molecular biology of the cell. 9, 2423-2437 (1998).</li><li>Galli, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+tetanus+neurotoxin-insensitive+vesicle-associated+membrane+protein+in+SNARE+complexes+of+the+apical+plasma+membrane+of+epithelial+cells.">A novel tetanus neurotoxin-insensitive vesicle-associated membrane protein in SNARE complexes of the apical plasma membrane of epithelial cells.</a> Molecular biology of the cell. 9, 1437-1448 (1998).</li><li>Wong, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endobrevin,+a+novel+synaptobrevin/VAMP-like+protein+preferentially+associated+with+the+early+endosome.">Endobrevin, a novel synaptobrevin/VAMP-like protein preferentially associated with the early endosome.</a> Molecular biology of the cell. 9, 1549-1563 (1998).</li></ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Il saggio originale fusione cellulare 6 determina SNARE mediati eventi di fusione cellulare mediante microscopia a fluorescenza. Qui si descrive un saggio innovativo che quantifica SNARE-mediati eventi di fusione di cellule di espressione attiva di β-galattosidasi e la misurazione spettrometrica. Questo test, si analizzano routinariamente 15-20-v e t-SNARE combinazioni in un singolo esperimento. Citometria a flusso per misurare SNARE espressione sulla superficie cellulare, abbiamo titolare i livelli di espre...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome del reagente e </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Invitrogen </td><td> 12800-017 </td></tr><tr><td> Cellule COS-7 </td><td> ATCC </td><td> CRL-1651 </td></tr><tr><td> tunicamicina </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> T7765-5MG </td></tr><tr><td> pTet-Off </td><td> Clontech </td><td> K1620-A </td></tr><tr><td> PBI-G </td><td> Clontech </td><td> 6150-1 </td></tr><tr><td> lipofectamina </td><td> Invitrogen </td><td> 18324-012 </td></tr><tr><td> Enzima soluzione senza dissociazione cellulare </td><td> Invitrogen </td><td> 13151-014 </td></tr><tr><td> Coniglio anti-TET repressore anticorpo policlonale </td><td> Millipore </td><td> AB3541 </td></tr><tr><td> FITC-coniugato asino anti-IgG di topo (H + L) </td><td> Jackson ImmunoResearch </td><td> 715-095-150 </td></tr><tr><td> Microscopio a scansione laser confocale </td><td> Olimpo </td><td> FV1000 </td></tr><tr><td> FACSCalibur citofluorimetro </td><td> BD Biosciences </td><td></td></tr><tr><td> β-galattosidasi Assay sistema enzimatico con il tampone di lisi Reporter </td><td> Promega </td><td> E2000 </td></tr><tr><td> Modello 100-40 UV-VIS </td><td> Hitachi </td><td> C740843 </td></tr></tbody></table>

analysis of snare-mediated membrane fusion using an enzymatic cell fusion assay

Le interazioni di SNARE (s oluble N-ethylmaleimide sensibile al fattore di una proteina recettore ttachment ri) proteine ​​sulla vescicole (v-SNARE) e membrane bersaglio (t-SNARE) catalizzano la fusione della vescicola intracellulare 1-4. Saggi di ricostituzione, sono essenziali per la dissezione del meccanismo e la regolazione di SNARE-mediata fusione della membrana 5. In un saggio di fusione cellulare 6,7, proteine ​​SNARE sono espresse ectopicamente alla superficie cellulare. Questi &quot;girato&quot; SNARE unità proteine ​​fusione cellula-cellula, dimostrando che SNARE sono sufficienti per fondere le membrane cellulari. Poiché il saggio fusione cellulare si basa su analisi microscopica, è meno efficace quando viene utilizzato per analizzare multiple e v-t-SNARE interazioni quantitativamente. Qui si descrive un nuovo saggio 8 che quantifica SNARE-mediati eventi di fusione di cellule dall&#39;espressione attiva di β-galattosidasi. Duecomponenti del sistema Tet-Off genica 9 sono utilizzati come visualizzatore sistema: la tetraciclina controllato transattivatore (tTA) ed un plasmide reporter che codifica il gene lacZ sotto il controllo della tetraciclina-risposta elemento (TRE-LacZ). Abbiamo transfect tTA in cellule COS-7 che esprimono capovolte v-SNARE proteine ​​sulla superficie cellulare (V-cellule) e trasfezione TRE-LacZ in cellule COS-7 che esprimono capovolte t-SNARE proteine ​​sulla superficie cellulare (cellule T) . SNARE-dipendente fusione delle V-e cellule T determina il legame di tTA al TRE, l&#39;attivazione trascrizionale di LacZ e espressione di β-galattosidasi. L&#39;attività di β-galattosidasi è quantificato mediante un metodo colorimetrico mediante assorbimento a 420 nm. Le vescicole associate proteine ​​di membrana (vampiri) sono v-SNARE che risiedono in vari post-Golgi compartimenti vescicolari 10-15. Esprimendo VAMPS 1, 3, 4, 5, 7 e 8 allo stesso livello, si confronta la fusione della membranaattività che utilizzano il enzimatica fusione cellulare. Basata sulla misura spettrometrica, questo saggio offre un approccio per l&#39;analisi quantitativa SNARE-mediata fusione della membrana e di alta produttività studi.

Per sviluppare un saggio quantitativo fusione cellulare, approfittiamo del forte attivazione trascrizionale dal legame di tTA a TRE. In assenza di tTA, trascrizione del gene LacZ in TRE-LacZ è silenzioso. Quando tTA è presente, si lega al TRE e attiva la trascrizione di LacZ. Figura 1 mostra un diagramma di flusso del saggio enzimatico fusione cellulare. tTA viene transfettato in v cellule che esprimono v-SNARE proteine ​​sulla superficie cellulare, e TRE-LacZ v...

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Analysis of SNARE-mediated Membrane Fusion Using an Enzymatic Cell Fusion Assay

Abbiamo sviluppato un saggio fusione cellulare che quantifica SNARE mediati eventi di fusione della membrana mediante espressione di β-attivato galattosidasi.

Analisi delle SNARE-mediata fusione della membrana L&#39;utilizzo di un test enzimatico fusione cellulare

The interactions of SNARE (soluble N-ethylmaleimide-sensitive factor attachment protein receptor)  proteins on vesicles (v-SNAREs) and on target membranes ...

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