La fusione delle membrane media molte funzioni biologiche. Questo protocollo descrive un metodo per rilevare l'apertura dei pori di fusione e la dinamica di rilascio del trasmettitore e distinguere tre modalità di fusione: fusione ravvicinata, fusione permanente e fusione termoretraibile. La combinazione del microscopio confocale e della registrazione patch-clamp facilita la visualizzazione dell'apertura e della chiusura dei pori di fusione e la determinazione della loro cinetica.
Sebbene descritto per le cellule cromaffini, il principio del metodo qui descritto può essere applicato ampiamente a molte cellule secretorie ben oltre le cellule cromaffini. Il successo dell'implementazione di questo metodo dipende da diverse fasi generali, come la generazione di una sana coltura di cellule cromaffini primarie, una sufficiente efficienza di trasfezione del plasmide e un alto tasso di successo della registrazione elettrofisiologica. Scegli tre ghiandole intatte senza tagli o sanguinamenti sulla superficie e rimuovi il tessuto adiposo con le forbici.
Lavare le ghiandole per perfusione con la soluzione di Locke fino a quando non esce sangue. Per la digestione, iniettare la soluzione enzimatica attraverso la vena surrenale utilizzando una siringa da 30 millimetri attaccata con un filtro da 0,22 micrometri fino a quando la ghiandola inizia a gonfiarsi. Quindi lasciare le ghiandole a 37 gradi Celsius per 10 minuti.
Iniettare di nuovo e lasciare le ghiandole a 37 gradi Celsius per altri 10 minuti. Dopo la digestione, tagliare la ghiandola longitudinalmente dalla vena surrenale all'altra estremità con le forbici per aprire la ghiandola. Isolare il midollo bianco estraendolo a pezzi in una capsula di Petri di 10 centimetri contenente la soluzione di Locke.
Tagliare e tritare il midollo con le forbici. Filtrare la sospensione del midollo con una rete di nylon da 80 a 100 micrometri in un becher. Trasferire il filtrato in un tubo conico da 50 millilitri e centrifugare a temperatura ambiente 48 x g per tre minuti con una decelerazione di tre.
Dopo la centrifugazione, rimuovere il surnatante e risospescere il pellet cellulare con la soluzione di Locke mediante pipettaggio. Filtrare la sospensione cellulare con un filtro da 80 a 100 micrometri e centrifugare a temperatura ambiente di 48 x g per tre minuti con decelerazione tre. Rimuovere il surnatante e risospesciare il pellet cellulare con 30 millilitri di terreno di coltura.
Determinare il numero di cellule utilizzando una camera di conteggio dell'emocitometro. Trasferire 2, 800, 000 celle in un tubo da 15 millilitri. Pellet le celle per centrifugazione a 48 x g per due minuti con la decelerazione di tre.
Aggiungere 100 microlitri di tampone di transezione forniti dal produttore al pellet di cella. E poi aggiungere due microgrammi di plasmide PH-mNG. Mescolare delicatamente la sospensione convogliando la soluzione su e giù e trasferire la miscela in una cuvetta elettroporatoria senza indugio.
Trasferire immediatamente la cuvetta sull'elettroporatore, selezionare il programma 005 nell'elenco delle schermate e premere Invio per eseguire l'elettroporazione. Dopo l'elettroporazione, aggiungere immediatamente 1,8 millilitri di mezzo alla cuvetta e mescolare delicatamente con una micropipetta dotata di una punta sterile. Aggiungere 300 microlitri della sospensione delle celle elettroporate sul coperchio scivolare in ogni piatto placcando da cinque a sei piatti in totale per una reazione di elettroporazione.
Trasferire con cura i piatti in un incubatore umidificato a 37 gradi Celsius con il 9% di anidride carbonica per 30 minuti e aggiungere delicatamente due millilitri di terreno preriscaldato a ciascun piatto dopo 30 minuti. Preparare le pipette patch dai capillari di vetro borosilicato tirandole con un estrattore di pipette, rivestendo le loro punte con cera liquida e lucidandole con una microforgia. Accendere l'amplificatore di registrazione patch clamp e avviare il software.
Impostare i parametri di registrazione della corrente di calcio e della capacità appropriati del software. Impostare un protocollo di registrazione della durata totale di 60 secondi in cui la stimolazione inizia a 10 secondi. Impostare il potenziale di tenuta per la registrazione del morsetto di tensione su 80 millivolt.
Imposta una depolarizzazione di un secondo da meno 80 millivolt a 10 millivolt come stimolo per indurre l'afflusso di calcio e il salto di capacità. Accendere il sistema di microscopio confocale e impostare i parametri appropriati nel software. Accendere i laser, inclusi 458 nanometri, 514 nanometri e 633 nanometri e impostare l'intervallo di raccolta delle emissioni per ciascun laser in base a ciascuna sonda di fluorescenza.
Scegli un piatto con un buon stato cellulare e una corretta espressione e aggiungi due microlitri di falso neurotrasmettitore a fluorescenza FFN511 nel mezzo nel piatto. Rimettere il piatto nell'incubatrice per 20 minuti. Dopo aver caricato FFN511, preparare la camera di registrazione e aggiungere due microlitri di colorante a fluorescenza A655 in 50 microlitri di soluzione da bagno.
Trasferire il coperchio dal piatto nella camera di registrazione con una pinzetta e aggiungere immediatamente la soluzione da bagno contenente A655. Posizionare una goccia d'olio sull'obiettivo di immersione in olio 100X. Montare la camera al microscopio e utilizzare la manopola di regolazione per far sì che l'olio entri in contatto con il fondo del coperchio.
Metti a fuoco le cellule e usa il campo luminoso e l'imaging confocale per trovare una cellula adatta con espressione mNG. Ingrandisci la cella selezionata e centrala nel campo visivo, riducendo al minimo le regioni vuote. Impostare i parametri per l'imaging confocale del piano XY su un piano Z fisso di FFN511, PH-mNG e A665 con un intervallo di tempo ridotto al minimo.
Regolare la messa a fuoco nella parte inferiore della cella con una manopola di regolazione fine. Regolare la potenza del laser di eccitazione nel software per trovare un'impostazione per ottenere il miglior rapporto segnale-rumore ed evitare significativi sbiancamenti a fluorescenza. Aggiungere nove microlitri di soluzione interna in una pipetta patch e collegare la pipetta al supporto dello stadio amplificatore patch clamp.
Applicare una piccola quantità di pressione positiva con una siringa e spostare la punta della pipetta per toccare la soluzione da bagno con un micromanipolatore. Assicurarsi che l'amplificatore mostri che la resistenza della pipetta è approssimativamente compresa tra due e quattro megaohm con un test di impulso di tensione. Premere LJ/Auto per annullare la giunzione del liquido.
Spostare la pipetta verso la cella selezionata con un micromanipolatore. Per formare una modalità di collegamento della cella, spostare la punta della pipetta per toccare la cella. Modificare il potenziale di tenuta da zero a meno 80 millivolt mentre si applica una leggera pressione negativa con una siringa.
Una volta che la resistenza supera un gigaohm, attendere circa 30 secondi affinché la configurazione si stabilizzi. Premere C-fast/Auto per compensare la capacità veloce. Per formare una modalità all'ingrosso, applicare impulsi brevi ma potenti di pressione negativa con la siringa fino a quando la membrana non si rompe.
Premere C-slow/Auto per compensare la capacità lenta. Regolare leggermente la messa a fuoco dell'immagine per mettere a fuoco il fondo della cella. Avviare contemporaneamente l'imaging time lapse confocale e la registrazione del patch clamp facendo clic sui pulsanti Start con due diverse applicazioni software.
Dopo la registrazione, assicurarsi che i dati vengano salvati. Modificare il potenziale di mantenimento a zero millivolt. Spostare la pipetta fuori dalla soluzione del bagno e scartarla.
Aprire i file di imaging non elaborati con qualsiasi produttore o software fornito. Vai a Processo, fai clic su ProcessTools e utilizza gli strumenti per generare file di media mobile per ogni immagine time lapse. Salvare questi file.
Sotto quantificare, vai su Strumenti e fai clic sui pulsanti Profilo stack per controllare i punti temporali prima e dopo la stimolazione e identificare i cambiamenti di fluorescenza in ciascun canale. Fare clic sul pulsante Disegna ellisse per cerchiare le regioni di interesse per gli eventi di fusione. Fare clic con il pulsante destro del mouse sull'immagine e fare clic su Salva ROI per salvare.
Fare clic su Apri progetti per individuare il file raw. Fare clic con il pulsante destro del mouse sull'immagine e fare clic su Carica ROI per caricare il file ROI nel file di imaging raw per misurare le intensità di fluorescenza. Vai su Strumenti e fai clic su Ordina ROI nel software e traccia le tracce per tutti e tre i canali di ciascun ROI.
Fare clic su Report per salvare i dati roi, inclusi i dati digitali e le tracce di imaging per ogni ROI in una cartella di file. L'intera registrazione patch-clamp cellulare e l'applicazione di una depolarizzazione di un secondo da 80 a 10 millivolt è stata eseguita per evocare eso ed endocitosi. La depolarizzazione applicata ha indotto una corrente di calcio verso l'interno, un salto di capacità, che indica l'esocitosi, e un decadimento della capacità dopo il salto, indicando l'endocitosi.
Con l'imaging time lapse sul fondo cellulare, gli eventi di fusione indotti dal protocollo di depolarizzazione di un secondo sono stati indicati come diminuzione FFN che riflette il rilascio di FFN511, accompagnato da un aumento della fluorescenza spot FPH e A655, riflettendo la diffusione di PH-mNG e A655 dalla membrana plasmatica e dalla soluzione del bagno nella vescicola di fusione. La figura presenta una fusione ravvicinata identificata come F655 dimming, mentre FPH sostenuta o decaduta con un ritardo. La figura rappresenta la fusione di permanenza rilevata dalla presenza di punti PH-mNG e A655.
La figura rappresenta la fusione di restringimento rilevata come decadimento parallelo FPH e F655 accompagnato da una riduzione delle dimensioni parallele dello spot PH-mNG e dello spot A655 La registrazione di successo richiede la generazione dell'intera configurazione cellulare con patch-clamp e imaging sul fondo della cella con la giusta intensità fluorescente per ciascun canale. La combinazione di elettrofisiologia e microscopia a super risoluzione qui descritta è uno strumento prezioso per misurare la dinamica dei pori di fusione e i neurocircuiti.
