Ringraziamo il Dott. Nael Alami e il Dr. Nam Chul Kim per i loro utili commenti su questo manoscritto.

1. Preparazione per Immunofluorescenza: <ol><li> Per creare una superficie dissezione, versare Sylgard 184 Base elastomeri di silicone in un piatto piccolo coltura di tessuti. Fare attenzione a non riempire completamente la piastra in modo che l&#39;area dissezione è più basso del cerchio. </li><li> Trim pin dissezione, per una lunghezza di circa 3,5 mm per una maggiore facilità di manipolazione, e assicuratevi di avere almeno 6 pin per ogni larva. </li><li> Avrete bisogno di forcipe smussato che permetterà di cogliere che i perni per la dissezione. </li></ol> 2. Dissezione delle larve: <ol><li> Seleziona vagare terzo larve instar che sono strisciare intorno ai lati del flacone e non hanno cominciato a pupate. </li><li> Inserire una larva sulla superficie dissezione sotto uno stereomicroscopio. Stoppino via umida in eccesso con un Kimwipe. </li><li> Disporre ogni larva modo che il lato dorsale è rivolto verso l&#39;alto. Sarete in grado di vedere due trachea, linee bianche lungo il lato dorsale delle larve. Prova a centro di questi nel mezzo il più possibile perché questo segna la linea mediana dorsale. </li><li> Porre il Pin # 1 appena sopra i ganci bocca (Figura 1). </li><li> Porre il Pin # 2 nella coda appena sopra la spiracoli tra le trachee. </li><li> Aggiungere una piccola quantità di PBS alle larve contro l&#39;essiccamento della cuticola. </li><li> Ripetere i passaggi precedenti con tutte le larve, assicurandosi che i genotipi sono separati spazialmente mettendo un perno tra ciascun genotipo. </li><li> Svoltare a destra piccolo taglio trasversale sopra pin n ° 2 in entrambi i tracheas (Figura 1). </li><li> Inserisci il tuo forbici nel primo taglio e tagliare lungo la linea mediana dorsale tra il tracheas tutta la strada fino pin passato # 1. </li><li> Avrete bisogno di fare altri piccoli tagli al fondo superiore e di ogni lato della cuticola, in modo che i lati sinistro e destro si aprirà permettendovi di pin giù senza tirare su la cuticola. </li><li> Porre il Pin # &#39;s 3, 4, 5 e 6 ad ogni angolo. </li><li> Fissare il campione con 4% PFA per 20-25 minuti a temperatura ambiente </li><li> Decantare il PFA e risciacquare con tempi di PBS 3-4, decantazione di volta in volta. </li></ol> 3. Rimozione del tessuto: <ol><li> Inizia prelevare tessuti alla fine posteriore perché di solito si desidera proteggere la zona dove si trova il cervello. </li><li> Mentre si utilizza una steromicroscope e con le larve in una goccia di PBS, prima afferrare l&#39;estremità posteriore di uno dei trachea e tirarlo fuori che può rimuovere alcune delle grasso corporeo con esso. Ripetere l&#39;operazione per la trachea secondo. </li><li> Prendete alcuni del corpo posteriore grasso o intestino e tirare fuori dal preparazione. Una volta che la maggior parte del tessuto posteriore è stato rimosso, concentrarsi sulla rimozione dei tessuti piccolo intorno al cervello. Se siete interessati solo i muscoli, o morfologia del NMJ è possibile rimuovere il cervello pure. </li><li> La rimozione del cervello consente una migliore visualizzazione di Muscle 31, che è un marker utile per l&#39;orientamento del segmento addominale. </li></ol> 4. Immunofluorescenza per le zone attive: <ol><li> Aggiungi agente bloccante (5% di siero normale di capra in PBS) per la prepara sezionato nel piatto dissezione. Blocco per 1 ora a temperatura ambiente. Se volete fare una sola soluzione per bloccare e diluizioni di anticorpi, comprendono 0,1% TritonX-100 al vostro agente di blocco per permeabilizzazione del tessuto. </li><li> Applicare l&#39;anticorpo primario diluito in blocco reagente con 0,1% TritonX-100. L&#39;anticorpo zona attiva è raggiungibile attraverso il Developmental Studies Ibridoma Bank (DSHB, http://dshb.biology.uiowa.edu/). Utilizzare un anticorpo di riferimento (es. perossidasi-coniugato Cy3) per etichettare la membrana NMJ e assoni. </li><li> Incubare gli anticorpi primari a 4 ° C durante la notte. In modo che la secchezza del frigorifero non far evaporare la soluzione di anticorpi, creare una camera umida mettendo un pò d&#39;acqua sul fondo di una scatola pipetta utilizzata punta. Coprire il coperchio trasparente con un foglio di alluminio per ridurre fluorescenti sbiancamento. Posizionare la diapositiva dissezione nella camera umida e mettere l&#39;intera scatola nella 4 ° C durante la notte incubatore. </li><li> La mattina dopo, lavare con PBST (PBS con 0,2% Triton X-100) 5-10 volte per 5-10 minuti ciascuno. </li><li> Incubare con l&#39;anticorpo secondario (ad esempio Invitrogen Alexa capra anti-topo-488) diluito in blocco reagente con 0,1% TritonX-100 a temperatura ambiente per 2-4 ore nella camera umida coperta. Includono una macchia nucleare (per es DAPI) nel secondario, se si vuole identificare la posizione del nucleo nei muscoli o nel cervello. </li><li> Lavare con PBST (PBS con 0,02% Triton-X-100) 5-10 volte per 5-10 minuti ciascuno. </li></ol> 5. Montaggio dei campioni larvali nelle diapositive: <ol><li> Decantare e stoppino spento l&#39;ultimo lavaggio PBST. </li><li> Pipettare 1 ml di glicerolo circa l&#39;80% per coprire le pelli immobilizzato larvale. </li><li> Rimuovere 5 dei 6 pin in tutte le larve. </li><li> Quando si è pronti a mettere il genotipo prima su un vetrino da togliere il perno ultima per tutte le larve di quel genotype. </li><li> Preparare una slide &quot;lavaggio&quot; mettendo due gocce del vostro mezzo di montaggio su un vetrino pulito. Questo passo è importante lavare la soluzione di acqua al largo delle larve per il montaggio e più chiaro di imaging. </li><li> Afferrare una larva per la coda con il forcipe smussato, trascinare la larva in giro per il glicerolo e poi lungo i bordi secchi della parabola dissezione, per rimuovere la maggior parte del glicerolo. Mettere le larve alla prima prova mezzo di montaggio. </li><li> Ripetere il passaggio 6 per tutte le larve del genotipo stesso. </li><li> Una volta che tutte le larve sono in prima goccia mezzo di montaggio, afferrare la larva prima per la coda e tirarlo attraverso la goccia e poi lungo i bordi del piatto asciutto per rimuovere la maggioranza dei media. Poi posto le larve nella seconda goccia mezzo di montaggio. </li><li> Ripetere il punto 8 per tutte le larve con lo stesso genotipo. </li><li> Preparare la diapositiva finale, mediante l&#39;etichettatura e mettendo una piccola forma di &quot;T&quot; di mezzo di montaggio sul vetrino. </li><li> Come al punto 5.8, afferrare la larva per la coda, tirare la pelle attraverso la seconda goccia mezzo di montaggio e poi lungo i lati secco delle slide &quot;Wash&quot;. Dopo che la maggior parte del mezzo è venuto fuori, la pelle larvale posto sulla diapositiva finale nel mezzo di montaggio. </li><li> Ripetere l&#39;operazione per tutte le pelli larvale. </li><li> Assicurarsi che tutte le pelli larvali sono organizzati come desiderato fare in modo che il lato cuticola è basso e il muscolo è esposta verso l&#39;alto. </li><li> Posizionare un vetrino sul vetrino per coprire le larve sezionato, con il bordo a partire dalla linea superiore del &quot;T.&quot; </li><li> Mettete un piccolo peso (per esempio batteria da 9 volt) sul vetrino, assicurandosi che il supporto di montaggio si diffonde completamente sotto il vetrino. </li><li> Per ridurre i possibili tempra fluorescente, posto il vetrino in un cassetto o spazio buio fino a quando il mezzo di montaggio è curato. </li><li> Pulizia del supporto di montaggio che straripato il taglio della ricevuta di copertura. Pulire l&#39;eccesso di media a secco di montaggio sul vetrino o scivolare con il 70% di etanolo. </li><li> Per creare un sigillo finale, sigillare con smalto per unghie. </li></ol> 6. Rappresentante dei risultati: Uno scivolo esempio di larve sezionato e immunostained è illustrato nella figura 2. Quando il dissezioni larve, macchie e di montaggio sono fatto correttamente, l&#39;utente può identificare il muscolo larve di interesse (Figura 3) in segmenti A2-A6. Hoang et al. Fornisce una descrizione dettagliata della posizione muscolare così come la caratterizzazione di specifiche boutons sinaptica (Hoang e Chiba, 2001). Utilizzando un obiettivo ad alta potenza che l&#39;utente può concentrarsi su una singola sinapsi e prendere z-serie di immagini. Un massimo un&#39;immagine rappresentativa proiezione di una parte della sinapsi 6 / 7 è mostrato (Figura 4). Quindi, utilizzando software di imaging, le zone attivo può essere quantitativamente valutati per le caratteristiche che sono specifiche al fenotipo mutante. Esempi di caratteristiche che possono essere modificati in un particolare fenotipo mutante comprendono il numero totale, intensità fluorescenza e la spaziatura tra le zone attive. Potenziali insidie: Valutazione immunofluorescenza della giunzione neuromuscolare larvale è un sistema valido che può fornire informazioni preziose in biologia sinaptica, anche se ci sono potenziali insidie ​​che possono limitare l&#39;utilità di questo sistema. Per esempio, spesso è auspicabile l&#39;immagine del pattern di colorazione di due o più anticorpi primari nello stesso campione. La scelta di appropriati anticorpi primari, fluorofori del caso, e adeguati controlli negativi è essenziale per il successo. Se l&#39;imaging due antigeni nel vostro esperimento, essere certi che gli anticorpi primari sono di specie diverse in modo che ogni proteina di interesse può essere identificato in modo univoco con un anticorpo fluorescente secondario. Un metodo consigliato per ridurre il fondo è quello di utilizzare un agente di blocco contenente il siero normale della specie da cui derivano gli anticorpi secondari (ad esempio l&#39;uso del siero normale di capra come agente di blocco quando si usa capra anti-coniglio o anti-topo anticorpi secondari). Dopo aver pianificato gli anticorpi primari e secondari che si intende utilizzare nel vostro esperimento, è necessario considerare anche compresi i controlli nella colorazione set per garantire che il segnale fluorescente che state vedendo è reale e non solo di sfondo. Se possibile, includere campioni di controllo negativo che non contengono la proteina di interesse. Questo è fatto facilmente negli studi di sovraespressione transgene esogeni includendo un animale selvatico tipo, ma in alcuni casi può essere realizzato utilizzando un mutante omozigote della proteina di interesse. Un altro controllo negativo essenziale, utile per misurare i livelli di fondo del segnale fluorescente, è quello di utilizzare l&#39;anticorpo secondario senza includere il primario. Quando si prepara la tua immagine risultante, è importante capire che tutti i segnali fluorescenti che si sta vedendo potrebbe non essere reale, e potrebbe essere di sfondo da anniur anticorpi secondari o di sfondo del tessuto endogeno. Potrebbe essere necessario normalizzare le immagini da considerare fluorescenza di fondo quando per saggiare le modifiche tra intensità di fluorescenza. Scelta del fluoroforo deve essere effettuata anche con cura. Dall&#39;esame della eccitazione e spettri di emissione per ciascun fluoroforo e la capacità di individuare in modo univoco ogni segnale è essenziale per evitare sanguinare canale attraverso. Se c&#39;è qualche incertezza, un modo semplice per determinare se la portata di sfiato attraverso è immunostain con un unico fluorocromo-anticorpo marcato per volta e controllare l&#39;immagine ad ogni canale che si prevede di utilizzare nel vostro esperimento finale. Questo dovrebbe rivelare se sanguinare attraverso sta avvenendo con il set microscopio filtro. <img src="/files/ftp_upload/2676/2676fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. Diagramma di flusso del taglio cuticola e il posizionamento di pin 1-6. <a href="http://jove.com/files/ftp_upload/2676/2676fig1_large.jpg">Clicca qui per visualizzare l&#39;immagine ingrandita</a> <img src="/files/ftp_upload/2676/2676fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2. Posizionamento delle larve sulla diapositiva finale. Assicurarsi che la prepara le larve sono esposti lato muscolare alto e lato basso cuticola. Lasciare almeno una larghezza larvale corpo in-tra ogni campione. <img src="/files/ftp_upload/2676/2676fig3.jpg" alt="Figura 3" /> Figura 3. Quando l&#39;imaging, individuare i muscoli e segmenti di interesse. Comune giunzioni neuromuscolari caratterizzate innervano i muscoli 6 / 7, 13 muscoli, muscoli 12, o del muscolo 4. Sul lato opposto della linea mediana ventrale, vi è una immagine speculare struttura muscolare del mostrata emi-segmento. Usa muscolare 31 come un marker per identificare quale segmento si sta imaging. L&#39;immagine della sinapsi stessa e segmenti per il resto dei vostri campioni, raccogliendo molte immagini sinaptica per genotipo che possono essere utilizzati per la quantificazione. <img src="/files/ftp_upload/2676/2676fig4.jpg" alt="Figura 4" /> Figura 4. Un rappresentante dell&#39;immagine proiettata al massimo di una porzione del muscolo NMJ innervano 6 / 7 è mostrato. NC82 (Bruchpilot) colorazione è evidenziato in verde. HRP pre-sinaptici macchia è mostrato in rosso. Si noti la punctae attivo zona che può essere ulteriormente quantificato software di imaging.

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	<li>Budnik, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synapse+maturation+and+structural+plasticity+at+Drosophila+neuromuscular+junctions.">Synapse maturation and structural plasticity at Drosophila neuromuscular junctions.</a> Curr Opin Neurobiol. 6, 858-867 (1996).</li><li>Fouquet, W., Owald, D., Wichmann, C., Mertel, S., Depner, H., Dyba, M., Hallermann, S., Kittel, R. J., Eimer, S., Sigrist, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maturation+of+active+zone+assembly+by+Drosophila+Bruchpilot.">Maturation of active zone assembly by Drosophila Bruchpilot.</a> J Cell Biol. 186, 129-145 (2009).</li><li>Hoang, B., Chiba, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-Cell+Analysis+of+Drosophila+Larval+Neuromuscular+Synapses.">Single-Cell Analysis of Drosophila Larval Neuromuscular Synapses.</a> Developmental Biology. 229, 55-70 (2001).</li><li>Keshishian, H., Kim, Y. -. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Orchestrating+development+and+function:+retrograde+BMP+signaling+in+the+Drosophila+nervous+system.">Orchestrating development and function: retrograde BMP signaling in the Drosophila nervous system.</a> Trends in Neurosciences. 27, 143-147 (2004).</li><li>Kittel, R. J., Wichmann, C., Rasse, T. M., Fouquet, W., Schmidt, M., Schmid, A., Wagh, D. A., Pawlu, C., Kellner, R. R., Willig, K. I., Hell, S. W., Buchner, E., Heckmann, M., Sigrist, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bruchpilot+Promotes+Active+Zone+Assembly,+Ca2++Channel+Clustering,+and+Vesicle+Release.">Bruchpilot Promotes Active Zone Assembly, Ca2+ Channel Clustering, and Vesicle Release.</a> Science. 312, 1051-1054 (2006).</li><li>Koh, Y. H., Gramates, L. S., Budnik, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+larval+neuromuscular+junction:+Molecular+components+and+mechanisms+underlying+synaptic+plasticity.">Drosophila larval neuromuscular junction: Molecular components and mechanisms underlying synaptic plasticity.</a> Microscopy Research and Technique. 49, 14-25 (2000).</li><li>Lloyd, T. E., Taylor, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flightless+flies:+Drosophila+models+of+neuromuscular+disease.">Flightless flies: Drosophila models of neuromuscular disease.</a> Ann N Y Acad Sci. 1184, e1-e20 (2010).</li><li>Ratnaparkhi, A., Lawless, G. M., Schweizer, F. E., Golshani, P., Jackson, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Drosophila+model+of+ALS:+human+ALS-associated+mutation+in+VAP33A+suggests+a+dominant+negative+mechanism.">A Drosophila model of ALS: human ALS-associated mutation in VAP33A suggests a dominant negative mechanism.</a> PLoS One. 3, e2334-e2334 (2008).</li><li>Wagh, D. A., Rasse, T. M., Asan, E., Hofbauer, A., Schwenkert, I., D&#252;rrbeck, H., Buchner, S., Dabauvalle, M. -. C., Schmidt, M., Qin, G., Wichmann, C., Kittel, R., Sigrist, S. J., Buchner, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bruchpilot,+a+Protein+with+Homology+to+ELKS/CAST,+Is+Required+for+Structural+Integrity+and+Function+of+Synaptic+Active+Zones+in+Drosophila.">Bruchpilot, a Protein with Homology to ELKS/CAST, Is Required for Structural Integrity and Function of Synaptic Active Zones in Drosophila.</a> Neuron. 49, 833-844 (2006).</li><li>Zweier, C., Jong, E. K. d. e., Zweier, M., Orrico, A., Ousager, L. B., Collins, A. L., Bijlsma, E. K., Oortveld, M. A., Ekici, A. B., Reis, A., Schenck, A., Rauch, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CNTNAP2+and+NRXN1+are+mutated+in+autosomal-recessive+Pitt-Hopkins-like+mental+retardation+and+determine+the+level+of+a+common+synaptic+protein+in+Drosophila.">CNTNAP2 and NRXN1 are mutated in autosomal-recessive Pitt-Hopkins-like mental retardation and determine the level of a common synaptic protein in Drosophila.</a> Am J Hum Genet. 85, 655-666 (2009).</li></ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Per i neuroni, la zona terminale sinaptico è di fondamentale importanza, ed è il ponte per una corretta comunicazione tra il post-e pre-sinaptici delle cellule. Un modo efficace per studiare la salute del neurone in modelli di malattia è quello di analizzare le proteine ​​del terminale sinaptico mediante immunofluorescenza. Il metodo di immunofluorescenza qui presentata consente al ricercatore di esaminare le larve di molti contemporaneamente, limitando le differenze ambientali tra i gruppi. Il sistema nervoso ce...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome del reagente </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td><td> Commenti </td></tr><tr><td> Sylgard 184 Base in silicone elastomero </td><td> Dow Corning </td><td> 68037-59-2 </td><td> Dopo la miscelazione permettono di bolle a salire lentamente mettendo su dei rotatori lenti o che consentono di sedersi per 30 minuti o più. </td></tr><tr><td> Acciaio Minutien Pins </td><td> Strumenti Scienza multa </td><td> 26002-10 </td><td> Tagliare a ca. 3-4mm di lunghezza con le forbici normali </td></tr><tr><td> Pinze laminectomia (Blunt-Usato per afferrare pin) </td><td> Strumenti di Scienze multa </td><td> 11223-20 </td><td> Usa come pinze per afferrare smussato perni </td></tr><tr><td> Pinza dissezione </td><td> Mondo Strumenti di precisione </td><td> 501985 </td><td></td></tr><tr><td> Vännäs SuperFine Forbici, 8cm lunghi </td><td> Mondo Strumenti di precisione </td><td> 501778 </td><td></td></tr><tr><td> Topo anti-Brp anticorpi </td><td> DSHB </td><td> NC82 </td><td> Usa diluizione 1:50 </td></tr><tr><td> Cy3 Affinipure capra anti-perossidasi di rafano </td><td> Jackson ImmunoResearch </td><td> 123-165-021 </td><td> Uso a 1:200 diluizione </td></tr><tr><td> Alexa Fluor 488 capra anti-topo IgG </td><td> Invitrogen </td><td> A11001 </td><td> Usa ca. Diluizione 1:200 </td></tr></tbody></table>

dissection and imaging of active zones in the drosophila neuromuscular junction

Le larve di Drosophila giunzione neuromuscolare (NMJ) è un modello eccellente per lo studio della struttura e della funzione sinaptica. Drosophila è ben noto per la facilità di potenti manipolazioni genetiche e il sistema nervoso larvale è dimostrata particolarmente utile per studiare non solo la normale funzione ma anche perturbazioni che accompagnano una malattia neurologica (Lloyd e Taylor, 2010). Molte molecole chiave sinaptica si trovano in Drosophila sono presenti anche nei mammiferi e come la maggior parte delle sinapsi eccitatorie sistema nervoso centrale nei mammiferi, la NMJ Drosophila è glutammatergica e dimostra attività-dipendente rimodellamento (Koh et al., 2000). Inoltre, i neuroni Drosophila possano essere identificati individualmente, perché i loro modelli di innervazione sono stereotipati e ripetitivi che consente di studio ha identificato i terminali sinaptici, come quelle tra i neuroni motori e il corpo-muro fibre muscolari che innervano (Keshishian e Kim, 2004). L&#39;esistenza di componenti sinapsi evolutivamente conservata insieme alla facilità di manipolazione genetica e fisica del modello Drosophila ideale per lo studio dei meccanismi alla base della funzione sinaptica (Budnik, 1996). Le zone attive ai terminali sinaptici sono di particolare interesse perché questi sono i luoghi di rilascio dei neurotrasmettitori. NC82 è un anticorpo monoclonale che riconosce la proteina Bruchpilot Drosophila (BRP), un membro della famiglia CAST1/ERC che è una componente importante della zona attiva (Wagh et al., 2006). BRP ha dimostrato di forma direttamente la zona attiva T-bar ed è responsabile in modo efficace il clustering Ca 2 + canali sotto la T-bar densità (Fouquet et al., 2009). Mutanti di BRP hanno ridotto Ca 2 + densità di canali, depresso rilascio delle vescicole evocato, e modificato a breve termine plasticità (Kittel et al., 2006). Alterazioni zone attive sono state osservate in modelli di malattia Drosophila. Per esempio, immunofluorescenza utilizzando l&#39;anticorpo NC82 ha mostrato che la densità zona attiva è stata ridotta in modelli di sclerosi laterale amiotrofica e la sindrome di Pitt-Hopkins (Ratnaparkhi et al, 2008;. Zweier et al, 2009.). Quindi, la valutazione delle zone attive, o altre proteine ​​sinaptiche, in modelli larve di Drosophila malattia può fornire un indizio prezioso iniziale per la presenza di un difetto sinaptica. Preparare tutto il montaggio larve sezionato Drosophila per l&#39;analisi di immunofluorescenza del NMJ richiede una certa abilità, ma può essere realizzato dalla maggior parte degli scienziati con un po &#39;di pratica. Presentato è un metodo che prevede le larve più per essere sezionati e immunostained nel piatto dissezione stessa, limitando le differenze ambientali tra ciascun genotipo e fornendo animali sufficiente per la fiducia nella riproducibilità e analisi statistiche.

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Dissection and Imaging of Active Zones in the Drosophila Neuromuscular Junction

La giunzione neuromuscolare (NMJ) di<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt; È un sistema importante modello per lo studio normale funzione sinaptica e perturbazioni a funzione sinaptica si trovano in alcune malattie neurologiche. Vi presentiamo un protocollo per la dissezione del<em&gt; Drosophila</em&gt; Larvale motore del sistema e immunocolorazione per le proteine ​​all&#39;interno della zona attiva NMJ.

Dissezione e immagini di zone attive nel Drosophila Giunzione neuromuscolare

The Drosophila  larvae neuromuscular junction (NMJ) is an excellent model for the study of synaptic structure and function. Drosophila  is well known for ...

dissection-imaging-active-zones-drosophila-neuromuscular

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Dissection and Imaging of Active Zones in the Drosophila Neuromuscular Junction

15.3K Views.  St. Jude Children’s Research Hospital. La giunzione neuromuscolare (NMJ) di Drosophila melanogaster È un sistema importante modello per lo studio normale funzione sinaptica e perturbazioni a funzione sinaptica si trovano in alcune malattie neurologiche. Vi presentiamo un protocollo per la dissezione del Drosophila Larvale motore del sistema e immunocolorazione per le proteine ​​all'interno della zona attiva NMJ.

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Single Drosophila Ommatidium Dissection and Imaging

The fruit fly Drosophila melanogaster has made invaluable contributions to neuroscience research and has been used widely as a model for neurodegenerative diseases because of its powerful genetics1. The fly eye in particular has been the organ of choice for neurodegeneration research, being the most accessible and life-dispensable part of the Drosophila nervous system. However the major caveat of intact eyes is the difficulty, because of the intense autofluorescence of the pigment, in imaging intracellular events, such as autophagy dynamics2, which are paramount to understanding of neurodegeneration.
We have recently used the dissection and culture of single ommatidia3 that has been essential for our understanding of autophagic dysfunctions in a fly model of Dentatorubro-Pallidoluysian Atrophy (DRPLA)3, 4.
We now report a comprehensive description of this technique (Fig. 1), adapted from electrophysiological studies5, which is likely to expand dramatically the possibility of fly models for neurodegeneration. This method can be adapted to image live subcellular events and to monitor effective drug administration onto photoreceptor cells (Fig. 2). If used in combination with mosaic techniques6-8, the responses of genetically different cells can be assayed in parallel (Fig. 2).

Single Drosophila Ommatidium Dissection and Imaging

The limiting factor in the use of the adult Drosophila eye to study neurodegeneration and cell biology is the difficult imaging of intracellular processes. We describe the dissection of single ommatidia to generate a bona-fide primary neuronal cell culture, which can be subject to drug treatment and advanced imaging.

Singolo Drosophila Ommatidium Dissection e Imaging

The fruit fly Drosophila melanogaster has made invaluable contributions to neuroscience research and has been used widely as a model for neurodegenerative ...

Ricerca

Neuroscienze

Sequential Photo-bleaching to Delineate Single Schwann Cells at the Neuromuscular Junction

Sequential photo-bleaching provides a non-invasive way to label individual SCs at the NMJ. The NMJ is the largest synapse of the mammalian nervous system and has served as guiding model to study synaptic structure and function. In mouse NMJs motor axon terminals form pretzel-like contact sites with muscle fibers. The motor axon and its terminal are sheathed by SCs. Over the past decades, several transgenic mice have been generated to visualize motor neurons and SCs, for example Thy1-XFP1 and Plp-GFP mice2, respectively.
Along motor axons, myelinating axonal SCs are arranged in non-overlapping internodes, separated by nodes of Ranvier, to enable saltatory action potential propagation. In contrast, terminal SCs at the synapse are specialized glial cells, which monitor and promote neurotransmission, digest debris and guide regenerating axons. NMJs are tightly covered by up to half a dozen non-myelinating terminal SCs - these, however, cannot be individually resolved by light microscopy, as they are in direct membrane contact3.
Several approaches exist to individually visualize terminal SCs. None of these are flawless, though. For instance, dye filling, where single cells are impaled with a dye-filled microelectrode, requires destroying a labelled cell before filling a second one. This is not compatible with subsequent time-lapse recordings3. Multi-spectral "Brainbow" labeling of SCs has been achieved by using combinatorial expression of fluorescent proteins4. However, this technique requires combining several transgenes and is limited by the expression pattern of the promoters used. In the future, expression of "photo-switchable" proteins in SCs might be yet another alternative5. Here we present sequential photo-bleaching, where single cells are bleached, and their image obtained by subtraction. We believe that this approach - due to its ease and versatility - represents a lasting addition to the neuroscientist's technology palette, especially as it can be used in vivo and transferred to others cell types, anatomical sites or species6.
In the following protocol, we detail the application of sequential bleaching and subsequent confocal time-lapse microscopy to terminal SCs in triangularis sterni muscle explants. This thin, superficial and easily dissected nerve-muscle preparation7,8 has proven useful for studies of NMJ development, physiology and pathology9. Finally, we explain how the triangularis sterni muscle is prepared after fixation to perform correlated high-resolution confocal imaging, immunohistochemistry or ultrastructural examinations.

Visualizing individual cells in densely packed tissues, such as terminal Schwann cells (SCs) at neuromuscular junctions (NMJs), is challenging. "Sequential photo-bleaching" allows delineating single terminal SCs, for instance in the triangularis sterni muscle explant, a convenient nerve-muscle preparation, where sequential bleaching can be combined with time-lapse imaging and post-hoc immunostainings.

Sequential Photo-sbiancante per Delineare cellule di Schwann singoli sulla giunzione neuromuscolare

Sequential photo-bleaching provides a non-invasive way to label individual SCs at the NMJ. The NMJ is the largest synapse of the mammalian nervous system ...

Dissection of the Transversus Abdominis Muscle for Whole-mount Neuromuscular Junction Analysis

Analysis of neuromuscular junction morphology can give important insight into the physiological status of a given motor neuron. Analysis of thin flat muscles can offer significant advantage over traditionally used thicker muscles, such as those from the hind limb (e.g. gastrocnemius). Thin muscles allow for comprehensive overview of the entire innervation pattern for a given muscle, which in turn permits identification of selectively vulnerable pools of motor neurons. These muscles also allow analysis of parameters such as motor unit size, axonal branching, and terminal/nodal sprouting. A common obstacle in using such muscles is gaining the technical expertise to dissect them. In this video, we detail the protocol for dissecting the transversus abdominis (TVA) muscle from young mice and performing immunofluorescence to visualize axons and neuromuscular junctions (NMJs). We demonstrate that this technique gives a complete overview of the innervation pattern of the TVA muscle&#160;and can be used to investigate NMJ pathology in a mouse model of the childhood motor neuron disease, spinal muscular atrophy.

Dissection of the Transversus Abdominis Muscle for Whole-mount Neuromuscular Junction Analysis

In this video we demonstrate a protocol for dissection of the transversus abdominis muscle of the mouse and use immunofluorescence and microscopy to visualize neuromuscular junctions.

Dissezione del muscolo Transversus Abdominis per l'analisi della giunzione neuromuscolare a montaggio intero

Analysis of neuromuscular junction morphology can give important insight into the physiological status of a given motor neuron. Analysis of thin flat ...

Detection of In Situ Protein-protein Complexes at the Drosophila Larval Neuromuscular Junction Using Proximity Ligation Assay

Discs large (Dlg) is a conserved member of the membrane-associated guanylate kinase family, and serves as a major scaffolding protein at the larval neuromuscular junction (NMJ) in Drosophila. Previous studies have shown that the postsynaptic distribution of Dlg at the larval NMJ overlaps with that of Hu-li tai shao (Hts), a homologue to the mammalian adducins. In addition, Dlg and Hts are observed to form a complex with each other based on co-immunoprecipitation experiments involving whole adult fly lysates. Due to the nature of these experiments, however, it was unknown whether this complex exists specifically at the NMJ during larval development.
Proximity Ligation Assay (PLA) is a recently developed technique used mostly in cell and tissue culture that can detect protein-protein interactions in situ. In this assay, samples are incubated with primary antibodies against the two proteins of interest using standard immunohistochemical procedures. The primary antibodies are then detected with a specially designed pair of oligonucleotide-conjugated secondary antibodies, termed PLA probes, which can be used to generate a signal only when the two probes have bound in close proximity to each other. Thus, proteins that are in a complex can be visualized. Here, it is demonstrated how PLA can be used to detect in situ protein-protein interactions at the Drosophila larval NMJ. The technique is performed on larval body wall muscle preparations to show that a complex between Dlg and Hts does indeed exist at the postsynaptic region of NMJs.

Detection of In Situ Protein-protein Complexes at the Drosophila Larval Neuromuscular Junction Using Proximity Ligation Assay

This protocol demonstrates how Proximity Ligation Assay can be used to detect in situ protein-protein interactions at the Drosophila larval neuromuscular junction. With this technique, Discs large and Hu-li tai shao are shown to form a complex at the postsynaptic region, an association previously identified through co-immunoprecipitation.

Rilevamento di<em&gt; In Situ</em&gt; Complessi proteina-proteina del<em&gt; Drosophila</em&gt; Larvale neuromuscolare Junction Utilizzando prossimità legatura Assay

Discs large (Dlg) is a conserved member of the membrane-associated guanylate kinase family, and serves as a major scaffolding protein at the larval ...

Why Quantification Matters: Characterization of Phenotypes at the Drosophila Larval Neuromuscular Junction

Most studies on morphogenesis rely on qualitative descriptions of how anatomical traits are affected by the disruption of specific genes and genetic pathways. Quantitative descriptions are rarely performed, although genetic manipulations produce a range of phenotypic effects and variations are observed even among individuals within control groups.&#160;Emerging evidence shows that morphology, size and location of organelles play a previously underappreciated, yet fundamental role in cell function and survival. Here we provide step-by-step instructions for performing quantitative analyses of phenotypes at the Drosophila larval neuromuscular junction (NMJ). We use several reliable immuno-histochemical markers combined with bio-imaging techniques and morphometric analyses to examine the effects of genetic mutations on specific cellular processes. In particular, we focus on the quantitative analysis of phenotypes affecting morphology, size and position of nuclei within the striated muscles of Drosophila larvae. The Drosophila larval NMJ is a valuable experimental model to investigate the molecular mechanisms underlying the structure and the function of the neuromuscular system, both in health and disease. However, the methodologies we describe here can be extended to other systems as well.

Why Quantification Matters: Characterization of Phenotypes at the Drosophila Larval Neuromuscular Junction

Morphology, size and location of intracellular organelles are evolutionarily conserved and appear to directly affect their function. Understanding the molecular mechanisms underlying these processes has become an important goal of modern biology. Here we show how these studies can be facilitated by the application of quantitative techniques.

Perché Quantificazione Matters: Caratterizzazione dei fenotipi al<em&gt; Drosophila</em&gt; Larvale Giunzione neuromuscolare

Most studies on morphogenesis rely on qualitative descriptions of how anatomical traits are affected by the disruption of specific genes and genetic ...

A Simple One-step Dissection Protocol for Whole-mount Preparation of Adult Drosophila Brains

There is an increasing interest in using Drosophila to model human brain degenerative diseases, map neuronal circuitries in adult brains, and study the molecular and cellular basis of higher brain functions. A whole-mount preparation of adult brains with well-preserved morphology is critical for such whole brain-based studies, but can be technically challenging and time-consuming. This protocol describes an easy-to-learn, one-step dissection approach of an adult fly head in less than 10 s, while keeping the intact brain attached to the rest of the body to facilitate subsequent processing steps. The procedure helps remove most of the eye and tracheal tissues normally associated with the brain that can interfere with the later imaging step, and also places less demand on the quality of the dissecting forceps. Additionally, we describe a simple method that allows convenient flipping of the mounted brain samples on a coverslip, which is important for imaging both sides of the brains with similar signal intensity and quality. As an example of the protocol, we present an analysis of dopaminergic (DA) neurons in adult brains of WT (w1118) flies. The high efficacy of the dissection method makes it particularly useful for large-scale adult brain-based studies in Drosophila.

A Simple One-step Dissection Protocol for Whole-mount Preparation of Adult Drosophila Brains

The adult Drosophila brain is a valuable system for studying neuronal circuitry, higher brain functions, and complex disorders. An efficient method to dissect whole brain tissue from the small fly head will facilitate brain-based studies. Here we describe a simple, one-step dissection protocol of adult brains with well-preserved morphology.

Un semplice passo-dissezione Protocollo per tutto il montaggio Preparazione per adulti<em&gt; Drosophila</em&gt; Brains

There is an increasing interest in using Drosophila to model human brain degenerative diseases, map neuronal circuitries in adult brains, and study the ...

Measuring Neuromuscular Junction Functionality

Neuromuscular junction (NMJ) functionality plays a pivotal role when studying diseases in which the communication between motor neuron and muscle is impaired, such as aging and amyotrophic lateral sclerosis (ALS). Here we describe an experimental protocol that can be used to measure NMJ functionality by combining two types of electrical stimulation: direct muscle membrane stimulation and the stimulation through the nerve. The comparison of the muscle response to these two different stimulations can help to define, at the functional level, potential alterations in the NMJ that lead to functional decline in muscle.
Ex vivo preparations are suited to well-controlled studies. Here we describe an intensive protocol to measure several parameters of muscle and NMJ functionality for the soleus-sciatic nerve preparation and for the diaphragm-phrenic nerve preparation. The protocol lasts approximately 60 min and is conducted uninterruptedly by means of a custom-made software that measures the twitch kinetics properties, the force-frequency relationship for both muscle and nerve stimulations, and two parameters specific to NMJ functionality, i.e. neurotransmission failure and intratetanic fatigue. This methodology was used to detect damages in soleus and diaphragm muscle-nerve preparations by using SOD1G93A transgenic mouse, an experimental model of ALS that ubiquitously overexpresses the mutant antioxidant enzyme superoxide dismutase 1 (SOD1).

A functional assessment of the neuromuscular junction (NMJ) can provide essential information on the communication between muscle and nerve. Here we describe a protocol to comprehensively evaluate both the NMJ and muscle functionality using two different muscle-nerve preparations, i.e. soleus-sciatic and diaphragm-phrenic.

Funzionalità di misurazione della giunzione neuromuscolare

Neuromuscular junction (NMJ) functionality plays a pivotal role when studying diseases in which the communication between motor neuron and muscle is ...

Two Algorithms for High-throughput and Multi-parametric Quantification of Drosophila Neuromuscular Junction Morphology

Synaptic morphology is tightly related to synaptic efficacy, and in many cases morphological synapse defects ultimately lead to synaptic malfunction. The Drosophila larval neuromuscular junction (NMJ), a well-established model for glutamatergic synapses, has been extensively studied for decades. Identification of mutations causing NMJ morphological defects revealed a repertoire of genes that regulate synapse development and function. Many of these were identified in large-scale studies that focused on qualitative approaches to detect morphological abnormalities of the Drosophila NMJ. A drawback of qualitative analyses is that many subtle players contributing to NMJ morphology likely remain unnoticed. Whereas quantitative analyses are required to detect the subtler morphological differences, such analyses are not yet commonly performed because they are laborious. This protocol describes in detail two image analysis algorithms "Drosophila NMJ Morphometrics" and "Drosophila NMJ Bouton Morphometrics", available as Fiji-compatible macros, for quantitative, accurate and objective morphometric analysis of the Drosophila NMJ. This methodology is developed to analyze NMJ terminals immunolabeled with the commonly used markers Dlg-1 and Brp. Additionally, its wider application to other markers such as Hrp, Csp and Syt is presented in this protocol. The macros are able to assess nine morphological NMJ features: NMJ area, NMJ perimeter, number of boutons, NMJ length, NMJ longest branch length, number of islands, number of branches, number of branching points and number of active zones in the NMJ terminal.

Two Algorithms for High-throughput and Multi-parametric Quantification of Drosophila Neuromuscular Junction Morphology

Two image analysis algorithms, "Drosophila NMJ Morphometrics" and "Drosophila NMJ Bouton Morphometrics" were created, to automatically quantify nine morphological features of the Drosophila neuromuscular junction (NMJ).

Due Algoritmi per high-throughput e multi-parametrica Quantificazione degli<em&gt; Drosophila</em&gt; Giunzione neuromuscolare Morfologia

Synaptic morphology is tightly related to synaptic efficacy, and in many cases morphological synapse defects ultimately lead to synaptic malfunction. The ...

Focal Macropatch Recordings of Synaptic Currents from the Drosophila Larval Neuromuscular Junction

Drosophila neuromuscular junction (NMJ) is an excellent model system to study glutamatergic synaptic transmission. We describe the technique of focal macropatch recordings of synaptic currents from visualized boutons at the Drosophila larval NMJ. This technique requires customized fabrication of recording micropipettes, as well as a compound microscope equipped with a high magnification, long-distance water immersion objective, differential interference contrast (DIC) optics, and a fluorescent attachment. The recording electrode is positioned on the top of a selected synaptic bouton visualized with DIC optics, epi-fluorescence, or both. The advantage of this technique is that it allows monitoring the synaptic activity of a limited number of sites of release. The recording electrode has&#160;a diameter of several microns, and the release sites positioned outside of the electrode rim do&#160;not significantly affect the recorded currents. The recorded synaptic currents have fast kinetics and can be readily resolved. These advantages are especially important for the studies of mutant fly lines with enhanced spontaneous or asynchronous synaptic activity.

Focal Macropatch Recordings of Synaptic Currents from the Drosophila Larval Neuromuscular Junction

Synaptic currents can be recorded focally from visualized synaptic boutons at the Drosophila third instar larvae neuromuscular junction. This technique enables monitoring the activity of a single synaptic bouton.

Macropatch focale registrazioni delle correnti sinaptiche da giunzione neuromuscolare larvale della drosofila

Drosophila neuromuscular junction (NMJ) is an excellent model system to study glutamatergic synaptic transmission. We describe the technique of focal ...

Dissection and Immunohistochemistry of the Drosophila Adult Leg to Detect Changes at the Neuromuscular Junction for an Identified Motor Neuron

Drosophila melanogaster represents a genetically tractable model to study neuronal structure and function, and subsequent changes in disease states. The well characterized larval neuromuscular junction is often used for such studies. However, rapid larval development followed by muscle histolysis and nervous system remodeling during metamorphosis makes this model problematic for the study of slow age-dependent degenerative changes like those occurring in amyotrophic lateral sclerosis. Alternatively, adult flies live for 90 days and the adult leg can be used to study motor neuron changes over the course of adult lifespan using in vivo fluorescent imaging through the cuticle. Here, we describe a leg dissection technique coupled with immunocytochemistry, which allows for the study of molecular changes at the neuromuscular junction of identified adult leg motor neurons. These techniques can be coupled with a myriad of antibodies labeling both pre- and post-synaptic structures. Together these procedures allow a more complete characterization of slow age-dependent changes in adult flies and can be applied across multiple motor neuron disease models.

Dissection and Immunohistochemistry of the Drosophila Adult Leg to Detect Changes at the Neuromuscular Junction for an Identified Motor Neuron

We describe a dissection technique that preserves the architecture of the neuromuscular junction and enables a detailed immunocytochemical study of motor neurons in the adult Drosophila leg.

Dissezione e immunoistochimica della gamba adulta di Drosophila per rilevare i cambiamenti alla giunzione neuromuscolare per un motoneurone identificato

Drosophila melanogaster represents a genetically tractable model to study neuronal structure and function, and subsequent changes in disease states. The ...