Questo articolo è stato finanziato dal NIH a JER. Vorrei ringraziare il Dott. Alex Gottschalk per fornire i vermi transgenici che esprimono canale rodopsina nei neuroni colinergici motore utilizzato in una delle dimostrazioni di registrazione.

A. Preparazione di strumenti utilizzati per la dissezione. <ol><li> La dissezione / camera di registrazione: Noi di solito costruire la nostra camera di registrazione da un 1 / 16 ° foglio pollici magnetico, con un foro circolare forato al centro che è grande abbastanza per ospitare un diametro di 22 mm circolare vetro di copertura. Le dimensioni esterne della camera dipende dal palco microscopio utilizzato per fare le registrazioni. Sul lato opposto del foglio magnetico, si allega un x 48 60 vetrino mm, che aderiamo alla camera mettendo una pallina di cera bassa tessuto fondere Paraplax embedding in ogni angolo della copertina scivolare inserita tra il vetro e la camera . La cera viene sciolta in un piatto caldo, piastra di vetro rivolto verso l&#39;alto, fino a formare una strato di incollaggio continuo scivolare il coperchio alla camera. Non lasciare incustoditi questo passo come la cera si scioglie in fretta. La camera deve essere rimosso e raffreddato, non appena la cera si è sciolta. Cera in eccesso che si è infiltrata lungo il bordo interno della cavità circolare 22 millimetri può essere rimosso utilizzando una lama di rasoio. </li><li> Sylgard rivestita scivola copertina: La dissezione viene eseguita su un 22 mm, rivestite Sylgard vetrino che viene inserito all&#39;interno della cavità circolare della camera di registrazione. Il mantello Sylgard aiuta la colla cianoacrilica aderire alla copertura scivolare durante l&#39;incollaggio i vermi verso il basso e agisce anche come un cuscino su cui rompere di nuovo la colla pipetta punta quando diventa collegato. Sylgard è costituito fresco secondo le istruzioni di produttori (10 silicone parti di base per 1 parte di catalizzatore in peso). Una piccola goccia di Sylgard è quindi posto su ogni vetrino e spalmato in tutto con un filo della lama di rasoio per fare una superficie piana. Le polizze di copertura rivestita sono poste in grandi contenitori piatto coperto e lasciato in forno a 65 ° gradi durante la notte per curare. </li><li> Pipette: in genere, usiamo lo stesso 1 millimetro di diametro esterno filamenti di vetro borosilicato per generare le pipette per i vermi incollatura verso il basso, rendendo incisioni cuticola e la registrazione da muscoli, utilizzando un elettrodo estrattore. Si consiglia di tirare un vaso di pipette prima di tentare una dissezione di questa fase può richiedere parecchi scambi rapidi di pipette. </li><li> Applicatore Colla: Colla viene caricato e applicato dalla punta di una pipetta di colla, per bocca di pressione. La pipetta incollaggio viene inserito in una estremità di un pezzo 2 metri di tubo in polietilene con diametro interno che corrisponde al diametro esterno della pipetta di vetro (di solito 1 mm). L&#39;altra estremità del tubo detiene una punta della pipetta eppendorf che agisce come un pezzo bocca. </li><li> Estrazione pipetta: I visceri verme deve essere rimosso dalla cavità verme una volta che l&#39;incisione cuticola è stato fatto. Questo risultato è ottenuto con un pezzo di tubo collegato ad un punta della pipetta eppendorf simile al applicatore colla ma in questo caso l&#39;estrazione punta della pipetta di vetro è rotto di nuovo a sufficienza per permettere le uova e visceri per essere facilmente aspirato dalla cavità worm. </li></ol> B. La dissezione <ol><li> Nella camera di registrazione di una circolare linea tracciata a penna cera è avvicinato al perimetro della camera a cui si preme un Sylgard rivestimento antiscivolo coperchio saldamente in posizione (Sylgard-coat verso l&#39;alto). Questa linea di cera immobilizza la polizza di copertura e impedisce la soluzione di registrazione di colare sotto e staccare il vetrino durante la dissezione e la registrazione. La camera viene poi riempito con una soluzione di registrazione extracellulare e vermi diversi sono posti al centro con un pick verme. Worms nuoterà in soluzione, tuttavia con la pratica, questi worm possono essere incollate, senza ulteriori procedure come il raffreddamento per evitare movimenti. Durante la fase di formazione, può aiutare a praticare worm incollaggio mutante in cui è compromessa nuoto (come mutanti unc-31). </li><li> Un contenitore di colla ricavata da un tappo di PCR tenuto in cera o creta, è usato per tenere una scorta di lavoro della colla cianoacrilica. Pipette colla punta di dimensioni simili alle pipette di registrazione (di solito ~ 4 megaohm resistenza) sono utilizzati per applicare la colla. Utilizzando l&#39;applicatore di colla, una piccola quantità di colla viene aspirata nella pipetta colla, utilizzando la portata dissezione di visualizzare la punta della pipetta da collante viene aspirata. </li><li> La colla cianoacrilica (HistoacrylBlue, Aesulap) polimerizza a contatto con soluzione di registrazione extracellulare, quindi è importante mantenere la pressione positiva sulla pipetta colla, che entra nella camera di soluzione per evitare che la colla di indurimento e collegare la pipetta. Non appena la colla è pipetta nella soluzione di camera, un piccolo ruscello ma costante di colla deve essere applicata sulla superficie Sylgard in bocca-il controllo della pressione per evitare intasamenti. Se la pipetta viene collegato a volte può essere sbloccato picchiettando delicatamente la punta sulla sylgard rivestita di vetro. Si consiglia di fare pratica prima di provare a incollare worm colla. Se si riesce a scrivere regolarmente il proprio nome in colla sulla Sylgard, con lettere fatte di linee sottili rispetto alla larghezza worm si è pronti per proceed per incollaggio la cuticola worm. </li><li> Per incollare un worm, utilizzare a pressione positiva di allegare una piccola quantità di colla sia il capo o la coda del worm e rapidamente disegnare il verme verso il basso sulla superficie Sylgard. Provate a collegare il verme vicino al centro della camera come vermi incollati troppo vicino al bordo sarà difficile da raggiungere con pipette di registrazione. Quindi applicare un flusso costante di colla lungo il bordo dorsale della cuticola del worm al distacco di partenza, costringendo il worm in un C-posizione con la vulva rivolti verso l&#39;interno (per le registrazioni dei muscoli ventrali). Eventuali lacune in questa linea di colla deve essere compilato in modo che il worm è fortemente collegata, per evitare che il worm si stacchi durante la fase di incisione cuticola. </li><li> Per rendere l&#39;incisione cuticola, passare a una mano pipetta dissezione. Questo pipetta deve essere più tagliente di colla / pipette di registrazione e hanno un breve, albero robusto. Usando il più alto ingrandimento sulla portata dissezione, allineare la pipetta parallelo all&#39;asse longitudinale del worm e inserire la punta di metà lungo il worm (vicino alla vulva), rendendo l&#39;incisione presso la cuticola / colla interfaccia. Questa incisione rilascia la pressione idrostatica vermi costringendo uova e nell&#39;intestino attraverso il punto di incisione. Continuare a tagliare le cuticole verso la testa del worm con un movimento simile ad affettare l&#39;apertura di una lettera, fino a raggiungere la faringe. Passare alla pipetta di estrazione a vuoto fuori gli organi interni del worm. Dopo aver eliminato l&#39;incisione, la cuticola aperto manterrà la sua forma cilindrica. Utilizzare una pipetta fresca incollaggio a punto di saldatura del bordo tagliato della cuticola verso il basso sulla superficie Sylgard. E &#39;importante usare i punti colla minima in questa fase per evitare di danneggiare o oscurando la NMJs. I muscoli della parete ventrale del nervo cavo e il corpo sono ora esposti. </li><li> Per rimuovere la membrana basale che copre il NMJs, succhiano la soluzione extracellulare registrazione dalla camera e applicare collagenasi (0.4mg/ml nella soluzione di registrazione extracellulare) per circa 10-20 secondi, togliere e lavare più volte con nuove soluzione di registrazione extracellulare. Procedere alla fase di registrazione. </li></ol> C. patch-clamp registrazione <ol><li> Posizionare la camera di registrazione su un up-destra stadio microscopio usando un obiettivo 10X per centrare il worm. Passare ad una 40X acqua emersione obiettivo con DIC e verificare che i muscoli del corpo a parete e cavo di nervi sono intatti. Posizionare il verme in modo che l&#39;asse longitudinale del worm è parallelo con il bordo anteriore del campo di applicazione, permettendo elettrodi è stato introdotto da entrambi i lati sinistro e destro. </li><li> Patch del muscolo utilizzando le normali tecniche di patch-bloccaggio. Elettrodi di registrazione di circa 4 megaohm resistenza funzionano bene. Una volta che l&#39;elettrodo tocca la membrana muscolare, aumentare la pressione negativa fino a quando un sigillo gigohm si ottiene. Per l&#39;intero-cellula voltage-clamp modalità di registrazione, applicare più di aspirazione e di zapping la membrana fino a quando il sigillo gigohm è rotta. In una buona registrazione, i muscoli del corpo muro di wild-type vermi adulti in genere hanno una membrana cellulare capacità di circa 70 pF e può essere stabilmente registrato per almeno 10 minuti a una potenziale detenzione di -60 mV con un minimo correnti holding (~ 50 pA). </li><li> La soluzione di registrazione extracellulare è costituito da (in mM): NaCl 150, KCl 5, CaCl 2 5, MgCl 2 4, glucosio 10, saccarosio 5, HEPES 15 (pH 7,3, 330mOsm ~). La pipetta cerotto contiene (in mm): KCl 120, KOH 20, MgCl 2 4, (N-tris [idrossimetil] mthyl-2-amminoetanetiolo-solfonico) TES 5, diidrato CaCl 2 0,25, Na 2 ATP 4, saccarosio 36 , EGTA 5 (pH 7,2, ~ 312 mOsm). Nota: Queste soluzioni artificialmente carico cellule muscolari con il cloruro, in modo che il recettore GABA-mediata correnti verso l&#39;interno a causa di efflusso cloruro ad un potenziale detenzione di -60 mV. Variazioni su queste soluzioni sono state utilizzate (vedi le pubblicazioni per i dettagli). </li><li> Evocati rilascio. Di solito abbiamo posto un secondo elettrodo contenente soluzione extracellulare sulla anteriore ventrale cordone nervoso al muscolo patch. Questa configurazione di patch perdere richiede grandi stimoli depolarizzanti (dell&#39;ordine di 10s di volt) di breve durata (1-2ms) per ottenere la massima risposte evocate (tipicamente 2,0-2,5 nA) nel wild-type vermi. Le limitazioni di questo approccio sono: 1) Solo alcune risposte evocate possono essere consegnati prima che il cordone nervoso è danneggiato in modo irreversibile e 2) Per ragioni sconosciute, solo le risposte possono essere evocate colinergici suscitato utilizzando questa configurazione stimolazione. </li><li> Luce attivati ​​canali rodopsina stimolazione. Recentemente, il laboratorio di Gottschalk ha generato vermi transgenici che esprimono alghe derivati ​​rhodopsins canale che depolarizza la membrana sulla luce-stimolazione dei neuroni in sottoinsiemi, a seconda del promotore usato per guidare l&#39;espressione 4. Nel caso della C. elegans NMJ, linee integrate esprimendo canale rodopsina in entrambi i motoneuroni o neuroni colinergici motore GABAergici sono ora dispone. Dal canale rodopsina risponde solo alla luce quando tutto-trans retinico è associato con la frazione opsina, worm utilizzato per questa applicazione deve essere coltivate su batteri cucita con retina. Un impulso di luce verde può quindi essere utilizzata per attivare ripetutamente la rodopsina canale causando rilascio evocato di uno ACh o GABA, a seconda di quale vermi transgenici vengono utilizzati. Questi vermi transgenici può essere attraversato in ceppi mutanti. Il vantaggio di questa tecnica rispetto alla stimolazione elettrica precedenti includono: 1) Light-attivazione non causa danno neuronale, permettendo ripetere molti stimoli da svolgere e 2) Evocati rilascio da entrambi i motoneuroni GABAergici o colinergica può essere studiato in modo indipendente. </li><li> Iperosmotico indotta rilascio. Per misurare la dimensione del pool di vescicole facilmente sganciabile (che riflette la piscina riassunto delle vescicole innescato da tutte le NMJ è sul muscolo registrato), una pressione pipetta contenente iperosmotico soluzione extracellulare (regolato ~ 850 mOsm con l&#39;aggiunta di saccarosio supplementari) viene utilizzato. Pressione impulsi applicazioni di 1-3 secondi produrre un fuoco di fila di asincrono post-sinaptica eventi utilizzando le soluzioni standard descritto in precedenza. </li></ol><img src="/files/ftp_upload/old/1165_2009_1_22_3/figure1.png" alt="" width="600" height="449" /> Figura 1: Schema della C. elegans dissezione e la configurazione di registrazione neuromuscolari Un coprioggetto sylgard rivestito fatta da spalmare una goccia di Sylgard attraverso il vetro e curando tutta la notte si trova nella cavità circolare della camera di registrazione prefabbricate e coperto con soluzione di registrazione. Un worm posto al centro è incollato alla superficie Sylgard a partire dal capo né coda, applicare la colla sul lato dorsale del worm, con una pipetta colla,. Una volta che l&#39;incollaggio è completo, un&#39;incisione adiacente alla vulva, a livello di interfaccia tra la cuticola e la colla è fatta con un ago di vetro ed estesa verso la testa (vedi linea rossa perforato). Dopo l&#39;estrazione dei visceri e uova dalle cavità del corpo, il bordo tagliato dell&#39;incisione è saldato con la colla al Sylgard esponendo il nervo ventrale (verde) e muscoli della parete del corpo (rosso). Il ventrale-mediale del muscolo anteriore della vulva è patch-bloccato e l&#39;elettrodo stimolante è posto a monte del cordone nervoso. Rappresentante risultati <img src="/files/ftp_upload/1165/Reprensentative.png" alt="Figura Represenative" width="600" height="404" /> Whole-cell, tensione bloccato corpo registrazioni muscolare della parete sono indicati per ciascuna delle tre protocolli di stimolazione sopra descritti (elettricamente evocato, luce evocata e risposte iperosmotico). In tutti i casi il ventrale-mediale del muscolo parete del corpo è bloccato a -60 mV. A. wild-type cellule muscolari tipicamente presentano un alto tasso di endogene verso l&#39;interno delle correnti in miniatura sinaptiche nelle nostre soluzioni di registrazione standard. B. Un 2ms depolarizzazione del cordone nervoso ventrale anteriore provoca il rilascio sincrono da sinapsi diverse con conseguente risposta evocata grande di circa 2-2,5 nA wild-type vermi. Tracce di rappresentanza a destra del wild-type tracce in A e B mostrano rilascio sinaptico in un grave scoordinata mutante (unc-18). Panel C presenta una risposta di luce evocata dalla giunzione neuromuscolare di una wild-type verme che esprimono canale rodopsina nei neuroni colinergici. Un 2ms impulso luminoso produce tipicamente una risposta di 1,5-1,8 nA. D. pressione espulsione di 850 mOsm salina iperosmotico sul muscolo per 1s, produce uno sbarramento asincrona di correnti sinaptiche in miniatura che rappresenta la piscina facilmente sganciabile di vescicole.

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Il modello genetico dell&#39;organismo C, elegans è ideale per lo studio della trasmissione sinaptica, attraverso l&#39;analisi funzionale delle mutazioni in geni che codificano proteine ​​sinaptiche. Qui abbiamo descritto una tecnica di dissezione che rende il C. elegans NMJs accessibili per l&#39;analisi elettrofisiologiche. Il video che accompagna la mostra passaggi critici nella C. elegans dissezione e la configurazione tipica di registrazione utilizzato per misurare l&#39;attività s...

dissecting and recording from the c. elegans neuromuscular junction

Neurotrasmissione è il processo attraverso il quale i neuroni trasferire informazioni attraverso segnali chimici per la loro post-sinaptico obiettivi, su una scala temporale rapido. Questo processo complesso richiede l&#39;attività coordinata di molte proteine ​​pre-e post-sinaptica per assicurare corretto funzionamento della connessione sinaptica, la conduzione dei segnali elettrici, targeting e di adescamento di vescicole secretorie, il rilevamento di calcio, la fusione delle vescicole, la localizzazione e la funzione dei recettori postsinaptici e, infine, il riciclaggio meccanismi. Come neuroscienziati è il nostro obiettivo di chiarire quali proteine ​​funzione in ciascuno di questi passi e capire i loro meccanismi di azione. Le registrazioni elettrofisiologiche da sinapsi fornire una quantificabile leggere degli eventi di riferimento elettriche che si verificano durante la trasmissione sinaptica. Combinando questa tecnica con il potente gamma di strumenti molecolari e genetici disponibili per manipolare proteine ​​sinaptiche in C. elegans, possiamo analizzare le conseguenti modifiche funzionali nella trasmissione sinaptica. Il C. elegans NMJs formano tra i neuroni motori e la parete muscolare del corpo locomozione di controllo, quindi, mutanti con fenotipi motoria scoordinata (noto come unc s) spesso perturbano la trasmissione sinaptica a queste sinapsi 1. Dal momento che i mutanti unc sono mantenuti su una ricca offerta di una fonte di cibo batterica, rimangono valide fino a quando mantengono una certa capacità di pompaggio della faringe di ingerire cibo. Questo, unitamente al fatto che C. elegans esistono come ermafroditi, permette loro di passare per la prole mutante senza la necessità di comportamenti di accoppiamento elaborati. Queste caratteristiche, insieme alla nostra capacità di recente per registrare dal worm NMJs 2,3,7 fanno di questo organismo un ottimo modello in cui per affrontare con precisione come unc neurotrasmissione impatto mutanti. Il metodo di dissezione coinvolge vermi adulti immobilizzare con una colla cianoacrilica per fare un&#39;incisione nella cuticola verme esponendo il NMJs. Dal C. adulti elegans sono solo 1 mm di lunghezza viene eseguita la dissezione con l&#39;utilizzo di un microscopio da dissezione e richiede un&#39;ottima coordinazione occhio-mano. NMJ registrazioni sono fatte da cellula intera tensione di serraggio singolo corpo le cellule muscolari della parete e il rilascio dei neurotrasmettitori possono essere evocati utilizzando una varietà di protocolli di stimolazione tra cui la stimolazione elettrica, la luce-attivati ​​canali rodopsina-mediata depolarizzazione 4 e salina iperosmotico, ognuno dei quali sarà brevemente descritto.

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Dissecting and Recording from The C. Elegans Neuromuscular Junction

Applicazione di elettrofisiologia di sinapsi accessibile fornisce una misura quantificabile di attività sinaptica, utile per analizzare mutanti sinaptica. Questo articolo descrive un metodo di dissezione utilizzati per esporre le giunzioni neuromuscolari (NMJ) di<em&gt; Caenorhabditis elegans (C. elegans)</em&gt; E discute brevemente alcuni degli usi a cui questa preparazione può essere applicata.

Dissezione e registrazione dal bivio C. Elegans neuromuscolare

Neurotransmission is the process by which neurons transfer information via chemical signals to their post-synaptic targets, on a rapid time scale.   This ...

dissecting-and-recording-from-the-c-elegans-neuromuscular-junction

Research

JoVE Journal

Biology

15.5K Views.  University of Illinois, Chicago. Applicazione di elettrofisiologia di sinapsi accessibile fornisce una misura quantificabile di attività sinaptica, utile per analizzare mutanti sinaptica. Questo articolo descrive un metodo di dissezione utilizzati per esporre le giunzioni neuromuscolari (NMJ) di Caenorhabditis elegans (C. elegans) E discute brevemente alcuni degli usi a cui questa preparazione può essere applicata.

Video: Dissecting and Recording from The C. Elegans Neuromuscular Junction

Generation of Stable Transgenic C. elegans Using Microinjection

Transgenic Caenorhabditis elegans can be readily created via microinjection of a DNA plasmid solution into the gonad 1. The plasmid DNA rearranges to form extrachromosomal concatamers that are stably inherited, though not with the same efficiency as actual chromosomes 2. A gene of interest is co-injected with an obvious phenotypic marker, such as rol-6 or GFP, to allow selection of transgenic animals under a dissecting microscope. The exogenous gene may be expressed from its native promoter for cellular localization studies. Alternatively, the transgene can be driven by a different tissue-specific promoter to assess the role of the gene product in that particular cell or tissue. This technique efficiently drives gene expression in all tissues of C. elegans except for the germline or early embryo 3. Creation of transgenic animals is widely utilized for a range of experimental paradigms. This video demonstrates the microinjection procedure to generate transgenic worms. Furthermore, selection and maintenance of stable transgenic C. elegans lines is described.

This video demonstrates the technique of microinjection into the gonad of C. elegans to create transgenic animals.

Generazione di Stabile transgenici C. elegans Utilizzando Microiniezione

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Ricerca

Biologia

Visualizing the Live Drosophila Glial-neuromuscular Junction with Fluorescent Dyes

Our project identified GFP labeled glial structures at the developing larval fly neuromuscular synapse. To look at development of live glial-nerve-muscle synapses, we developed a larval tissue preparation that had features of live intact larvae, but also had good optical properties.  This new preparation also allowed for access of perfusates to the synapse.  We used fly larvae, immersed them in artificial hemolymph, and relaxed their normal rhythmic body contractions by chilling them. Next we dissected off the posterior segments of each animal and with a blunt insect pin pushed the mouth parts backward through the body cavity.  This everted the larval body wall, like turning a sock inside-out.  We completed the dissection with ultra-fine dissection scissors and thus exposed the visceral side of the body wall muscles. The glial structures at the NMJ expressed membrane targeted GFP under the control of glial specific promoters. The post-synaptic membrane, the SSR (Subsynaptic Reticula) in muscle expressed synaptically targeted dsRed. We needed to acutely label the motor neuron terminals, the third part of the synapse. To do this we applied primary antibodies to HRP, conjugated to a far-red emitting flurophore.  To test for dye diffusion properties into the perisynaptic space between the motor neuron terminals and the SSR, we applied a solution of large Dextran molecules conjugated to far-red emitting flurophore and collected images.

Visualizing the Live Drosophila Glial-neuromuscular Junction with Fluorescent Dyes

We described structural features of the Glia-neuromuscular synapses in a novel Inside-out tissue preparation of live fly larvae using fluorescent dyes with confocal microscopy. We labeled live neuron terminals with fluorescent primary antibodies to HRP, and also visualized the perisynaptic space with fluorescent Dextrans.

Visualizzazione di Live Drosophila Gliali-giunzione neuromuscolare con tinture fluorescenti

Our project identified GFP labeled glial structures at the developing larval fly neuromuscular synapse. To look at development of live glial-nerve-muscle ...

The Production of C. elegans Transgenes via Recombineering with the galK Selectable Marker

The creation of transgenic animals is widely utilized in C. elegans research including the use of GFP fusion proteins to study the regulation and expression pattern of genes of interest or generation of tandem affinity purification (TAP) tagged versions of specific genes to facilitate their purification. Typically transgenes are generated by placing a promoter upstream of a GFP reporter gene or cDNA of interest, and this often produces a representative expression pattern. However, critical elements of gene regulation, such as control elements in the 3' untranslated region or alternative promoters, could be missed by this approach. Further only a single splice variant can be usually studied by this means. In contrast, the use of worm genomic DNA carried by fosmid DNA clones likely includes most if not all elements involved in gene regulation in vivo which permits the greater ability to capture the genuine expression pattern and timing. To facilitate the generation of transgenes using fosmid DNA, we describe an E. coli based recombineering procedure to insert GFP, a TAP-tag, or other sequences of interest into any location in the gene. The procedure uses the galK gene as the selection marker for both the positive and negative selection steps in recombineering which results in obtaining the desired modification with high efficiency. Further, plasmids containing the galK gene flanked by homology arms to commonly used GFP and TAP fusion genes are available which reduce the cost of oligos by 50% when generating a GFP or TAP fusion protein. These plasmids use the R6K replication origin which precludes the need for extensive PCR product purification. Finally, we also demonstrate a technique to integrate the unc-119 marker on to the fosmid backbone which allows the fosmid to be directly injected or bombarded into worms to generate transgenic animals. This video demonstrates the procedures involved in generating a transgene via recombineering using this method.

The Production of C. elegans Transgenes via Recombineering with the galK Selectable Marker

The ability to produce transgenes for Caenorhabditis elegans using genomic DNA carried by fosmids is particularly attractive as all of the native regulatory elements are retained. Described is a simple and robust procedure for the production of transgenes via recombineering with the galK selectable marker.

La produzione di C. elegans Transgeni attraverso recombineering con il GalK Marcatori selezionabili

The creation of transgenic animals is widely utilized in C. elegans research including the use of GFP fusion proteins to study the regulation and ...

RNAi Screening to Identify Postembryonic Phenotypes in C. elegans

C. elegans has proven to be a valuable model system for the discovery and functional characterization of many genes and gene pathways1. More sophisticated tools and resources for studies in this system are facilitating continued discovery of genes with more subtle phenotypes or roles. 
Here we present a generalized protocol we adapted for identifying C. elegans genes with postembryonic phenotypes of interest using RNAi2. This procedure is easily modified to assay the phenotype of choice, whether by light or fluorescence optics on a dissecting or compound microscope. This screening protocol capitalizes on the physical assets of the organism and molecular tools the C. elegans research community has produced. As an example, we demonstrate the use of an integrated transgene that expresses a fluorescent product in an RNAi screen to identify genes required for the normal localization of this product in late stage larvae and adults. First, we used a commercially available genomic RNAi library with full-length cDNA inserts. This library facilitates the rapid identification of multiple candidates by RNAi reduction of the candidate gene product. Second, we generated an integrated transgene that expresses our fluorecently tagged protein of interest in an RNAi-sensitive background. Third, by exposing hatched animals to RNAi, this screen permits identification of gene products that have a vital embryonic role that would otherwise mask a post-embryonic role in regulating the protein of interest. Lastly, this screen uses a compound microscope equipped for single cell resolution.

RNAi Screening to Identify Postembryonic Phenotypes in C. elegans

We describe a sensitized method to identify postembryonic regulators of protein expression and localization in C. elegans using an RNAi-based genomic screen and an integrated transgene that expresses a functional, fluorescently tagged protein.

RNAi di screening per identificare fenotipi postembrionale in C. elegans</em

C. elegans has proven to be a valuable model system for the discovery and functional characterization of many genes and gene pathways1. More sophisticated ...

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

Research into the molecular and developmental biology of the nematode Caenorhabditis elegans was begun in the early seventies by Sydney Brenner and it has since been used extensively as a model organism 1. C. elegans possesses key attributes such as simplicity, transparency and short life cycle that have made it a suitable experimental system for fundamental biological studies for many years 2. Discoveries in this nematode have broad implications because many cellular and molecular processes that control animal development are evolutionary conserved 3.
C. elegans life cycle goes through an embryonic stage and four larval stages before animals reach adulthood. Development can take 2 to 4 days depending on the temperature. In each of the stages several characteristic traits can be observed. The knowledge of its complete cell lineage 4,5 together with the deep annotation of its genome turn this nematode into a great model in fields as diverse as the neurobiology 6, aging 7,8, stem cell biology 9 and germ line biology 10. 
An additional feature that makes C. elegans an attractive model to work with is the possibility of obtaining populations of worms synchronized at a specific stage through a relatively easy protocol. The ease of maintaining and propagating this nematode added to the possibility of synchronization provide a powerful tool to obtain large amounts of worms, which can be used for a wide variety of small or high-throughput experiments such as RNAi screens, microarrays, massive sequencing, immunoblot or in situ hybridization, among others. 
Because of its transparency, C. elegans structures can be distinguished under the microscope using Differential Interference Contrast microscopy, also known as Nomarski microscopy. The use of a fluorescent DNA binder, DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole), for instance, can lead to the specific identification and localization of individual cells, as well as subcellular structures/defects associated to them.

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

The easiness of maintaining and propagating the nematode C. elegans make it a nice model organism to work with. The possibility of synchronizing worms allows the work with a significant amount of subjects at the same developmental stage, what facilitates the study of one particular process in many animals.

Di base<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; Metodi: sincronizzazione e di osservazione

Research into the molecular and developmental biology of the nematode Caenorhabditis elegans was begun in the early seventies by Sydney Brenner and it has ...

Creating Defined Gaseous Environments to Study the Effects of Hypoxia on C. elegans

Oxygen is essential for all metazoans to survive, with one known exception1. Decreased O2 availability (hypoxia) can arise during states of disease, normal development or changes in environmental conditions2-5. Understanding the cellular signaling pathways that are involved in the response to hypoxia could provide new insight into treatment strategies for diverse human pathologies, from stroke to cancer. This goal has been impeded, at least in part, by technical difficulties associated with controlled hypoxic exposure in genetically amenable model organisms.
The nematode Caenorhabditis elegans is ideally suited as a model organism for the study of hypoxic response, as it is easy to culture and genetically manipulate. Moreover, it is possible to study cellular responses to specific hypoxic O2 concentrations without confounding effects since C. elegans obtain O2 (and other gasses) by diffusion, as opposed to a facilitated respiratory system6. Factors known to be involved in the response to hypoxia are conserved in C. elegans. The actual response to hypoxia depends on the specific concentration of O2 that is available. In C. elegans, exposure to moderate hypoxia elicits a transcriptional response mediated largely by hif-1, the highly-conserved hypoxia-inducible transcription factor6-9. C .elegans embryos require hif-1 to survive in 5,000-20,000 ppm O27,10. Hypoxia is a general term for "less than normal O2". Normoxia (normal O2) can also be difficult to define. We generally consider room air, which is 210,000 ppm O2 to be normoxia. However, it has been shown that C. elegans has a behavioral preference for O2 concentrations from 5-12% (50,000-120,000 ppm O2)11. In larvae and adults, hif-1 acts to prevent hypoxia-induced diapause in 5,000 ppm O212. However, hif-1 does not play a role in the response to lower concentrations of O2 (anoxia, operational definition &lt;10 ppm O2)13. In anoxia, C. elegans enters into a reversible state of suspended animation in which all microscopically observable activity ceases10. The fact that different physiological responses occur in different conditions highlights the importance of having experimental control over the hypoxic concentration of O2.
Here, we present a method for the construction and implementation of environmental chambers that produce reliable and reproducible hypoxic conditions with defined concentrations of O2. The continual flow method ensures rapid equilibration of the chamber and increases the stability of the system. Additionally, the transparency and accessibility of the chambers allow for direct visualization of animals being exposed to hypoxia. We further demonstrate an effective method of harvesting C. elegans samples rapidly after exposure to hypoxia, which is necessary to observe many of the rapidly-reversed changes that occur in hypoxia10,14. This method provides a basic foundation that can be easily modified for individual laboratory needs, including different model systems and a variety of gasses.

Creating Defined Gaseous Environments to Study the Effects of Hypoxia on C. elegans

This paper details how to use continuous-flow hypoxia chambers to generate atmospheres with defined concentrations of O2 to understand biological responses to decreased O2. This system is easy to setup and maintain, and flexible enough to suit a wide range of O2 concentrations and model systems

La creazione di ambienti definiti gassosi Per studiare gli effetti dell&#39;ipossia sulla<em&gt; C. elegans</em

Oxygen is essential for all metazoans to survive, with one known exception1. Decreased O2 availability (hypoxia) can arise during states of disease, ...

C. elegans Chemotaxis Assay

Many organisms use chemotaxis to seek out food sources, avoid noxious substances, and find mates. Caenorhabditis elegans has impressive chemotaxis behavior.
 The premise behind testing the response of the worms to an odorant is to place them in an area and observe the movement evoked in response to an odorant. Even with the many available assays, optimizing worm starting location relative to both the control and test areas, while minimizing the interaction of worms with each other, while maintaining a significant sample size remains a work in progress 1-10. The method described here aims to address these issues by modifying the assay developed by Bargmann et al.1. A Petri dish is divided into four quadrants, two opposite quadrants marked "Test" and two are designated "Control". Anesthetic is placed in all test and control sites. The worms are placed in the center of the plate with a circle marked around the origin to ensure that non-motile worms will be ignored. Utilizing a four-quadrant system rather than one 2 or two 1 eliminates bias in the movement of the worms, as they are equidistant from test and control samples, regardless of which side of the origin they began. This circumvents the problem of worms being forced to travel through a cluster of other worms to respond to an odorant, which can delay worms or force them to take a more circuitous route, yielding an incorrect interpretation of their intended path. This method also shows practical advantages by having a larger sample size and allowing the researcher to run the assay unattended and score the worms once the allotted time has expired.

C. elegans Chemotaxis Assay

A method of quantitatively evaluating the chemotactic response of Caenorhabditis elegans is described. A chemotactic index (CI) was employed as a way to precisely evaluate the response of worms to certain targets, and serve as a platform of comparison between strains and compounds of interest.

C. elegans Chemiotassi Assay

Many organisms use chemotaxis to seek out food sources, avoid noxious substances, and find mates.  Caenorhabditis elegans has impressive chemotaxis ...

A Method for Culturing Embryonic C. elegans Cells

C. elegans is a powerful model system, in which genetic and molecular techniques are easily applicable. Until recently though, techniques that require direct access to cells and isolation of specific cell types, could not be applied in C. elegans. This limitation was due to the fact that tissues are confined within a pressurized cuticle which is not easily digested by treatment with enzymes and/or detergents. Based on early pioneer work by Laird Bloom, Christensen and colleagues 1 developed a robust method for culturing C. elegans embryonic cells in large scale. Eggs are isolated from gravid adults by treatment with bleach/NaOH and subsequently treated with chitinase to remove the eggshells. Embryonic cells are then dissociated by manual pipetting and plated onto substrate-covered glass in serum-enriched media. Within 24 hr of isolation cells begin to differentiate by changing morphology and by expressing cell specific markers. C. elegans cells cultured using this method survive for up 2 weeks in vitro and have been used for electrophysiological, immunochemical, and imaging analyses as well as they have been sorted and used for microarray profiling.

A Method for Culturing Embryonic C. elegans Cells

We describe here a revised protocol for large-scale culture of embryonic C. elegans cells. Embryonic C. elegans cells cultured in vitro using this method, appear to differentiate and recapitulate the expression of genes in a cell specific manner. Techniques that require direct access to the cells or isolation of specific cell types from the other tissues can be applied on C. elegans cultured cells.

Un metodo per la coltura embrionale<em&gt; C. elegans</em&gt; Celle

C. elegans is a powerful model system, in which genetic and molecular techniques are easily applicable. Until recently though, techniques that require ...

Methods for Skin Wounding and Assays for Wound Responses in C. elegans

The C. elegans epidermis and cuticle form a simple yet sophisticated skin layer that can repair localized damage resulting from wounding. Studies of wound responses and repair in this model have illuminated our understanding of the cytoskeletal and genomic responses to tissue damage. The two most commonly used methods to wound the C. elegans adult skin are pricks with microinjection needles, and local laser irradiation. Needle wounding locally disrupts the cuticle, epidermis, and associated extracellular matrix, and may also damage internal tissues. Laser irradiation results in more localized damage. Wounding triggers a succession of readily assayed responses including elevated epidermal Ca2+ (seconds-minutes), formation and closure of an actin-containing ring at the wound site (1-2 hr), elevated transcription of antimicrobial peptide genes (2-24 hr), and scar formation. Essentially all wild type adult animals survive wounding, whereas mutants defective in wound repair or other responses show decreased survival. Detailed protocols for needle and laser wounding, and assays for quantitation and visualization of wound responses and repair processes (Ca dynamics, actin dynamics, antimicrobial peptide induction, and survival) are presented.

Methods for Skin Wounding and Assays for Wound Responses in C. elegans

The adult C. elegans skin is a tractable model for studies of epithelial wound responses, including wound closure, scar formation, and innate immunity.

Metodi per la pelle Ferimento e saggi per risposte ferita<em&gt; C. elegans</em

The C. elegans epidermis and cuticle form a simple yet sophisticated skin layer that can repair localized damage resulting from wounding. Studies of wound ...

Investigating the Spreading and Toxicity of Prion-like Proteins Using the Metazoan Model Organism C. elegans

Prions are unconventional self-propagating proteinaceous particles, devoid of any coding nucleic acid. These proteinaceous seeds serve as templates for the conversion and replication of their benign cellular isoform. Accumulating evidence suggests that many protein aggregates can act as self-propagating templates and corrupt the folding of cognate proteins. Although aggregates can be functional under certain circumstances, this process often leads to the disruption of the cellular protein homeostasis (proteostasis), eventually leading to devastating diseases such as Alzheimer&#8217;s disease (AD), Parkinson&#8217;s disease (PD), Amyotrophic lateral sclerosis (ALS), or transmissible spongiform encephalopathies (TSEs). The exact mechanisms of prion propagation and cell-to-cell spreading of protein aggregates are still subjects of intense investigation. To further this knowledge, recently a new metazoan model in Caenorhabditis elegans, for expression of the prion domain of the cytosolic yeast prion protein Sup35 has been established. This prion model offers several advantages, as it allows direct monitoring of the fluorescently tagged prion domain in living animals and ease of genetic approaches. Described here are methods to study prion-like behavior of protein aggregates and to identify modifiers of prion-induced toxicity using C. elegans.

Investigating the Spreading and Toxicity of Prion-like Proteins Using the Metazoan Model Organism C. elegans

Prion-like propagation of protein aggregates has recently emerged as being implicated in many neurodegenerative diseases. The goal of this protocol is to describe, how to use the nematode C. elegans as a model system to monitor protein spreading and to investigate prion-like phenomena.

Indagare le proteine ​​prioniche-come diffusione e tossicità di utilizzare i metazoi Organismo modello<em&gt; C. elegans</em

Prions are unconventional self-propagating proteinaceous particles, devoid of any coding nucleic acid. These proteinaceous seeds serve as templates for ...