Questo lavoro è stato finanziato dal National Institutes of Health 1R21HL092370-01 (GG), 1R01 HL095764-01 (GG); R01HL082694 (JW), American Heart Association, affiliato Founders (0855943D, GG), Stony Wold - Herbert Fund, New York (SHP).

1. Preparazione <ol><li> Preparare le seguenti soluzioni e tubi (Tabella 1) come segue: <ol><li> Hanks soluzione, no, magnesio calcio o indicatore con penicillina (100 U / ml) / streptomicina (100 mg / ml). </li><li> Tampone fosfato salino (PBS), 1x, no calcio, magnesio no. </li><li> Etanolo, 70%, 500 ml fare. </li><li> Tamponata di formaldeide, il 7-10% con PBS, fare 500 ml. </li><li> Anestesia soluzioni: <ol><li> Avertin. Cautela aggiungere 5 ml di 2-metil-2-butanolo a 5 g di 2,2,2-Tribromoethanol. Una volta sciolto, tenere soluzione madre a temperatura ambiente al buio. Prendete 0,25 ml di soluzione madre e diluire con 10 ml di 1xPBS in bottiglia di vetro inferiore. Avvolgere la bottiglia con foglio di alluminio, posto a 37 ° C fino a completa dissoluzione e poi aliquotare in tubi di polipropilene da 5 ml e conservare in frigorifero. Scaldare uno aliquota la mattina dell&#39;esperimento. </li><li> Barbiturici. Diluire soluzione madre con PBS per ottenere 2,6% barbiturici solution. Posizionare aliquote 3-4 ml in tubi di polipropilene. </li></ol></li></ol></li><li> Organizzare il lavoro tre-aree (Figura 1). </li><li><ol><li> Area A: Disporre i seguenti elementi: la forma di studio per registrare il numero di identificazione di studio, la data, il peso corporeo, i pesi del cuore destro, cuore sinistro e del setto, bilancia di precisione (0-50 g a 0,01 g di precisione) per determinare il peso corporeo; scala micro per determinare i pesi del cuore a 0,001 g di precisione, pesa imbarcazioni; soluzioni anestesia (chiaramente); dewar piccola con azoto liquido, contenitore isolato sotto ghiaccio, tubi e piastra a 24 pozzetti per la raccolta di sangue e campioni di tessuto (Tabella 1), strumenti chirurgici ( Tabella 2, Figura 2), e soluzioni per pulire gli strumenti (Tabella 1). </li><li> Area B: Disporre i seguenti elementi: microscopio da dissezione; catetere cuore destro collegato a un&#39;unità di controllo della pressione che è collegato ad un amplificatore e computer portatile. Il catetere viene inserito inun becker contenente acqua. Disporre di strumenti chirurgici (Tabella 2), pezzi di taglio di sutura per lunghezza ottimale e inseriti in una pesa barca; nastro (nastro autoclave è ottimale), tagliati in lunghezza ottimale e larghezza e allineati sul banco microscopio o di laboratorio per un facile accesso, tamponi di cotone e Depilatore soluzione. Calibrare il catetere all&#39;inizio dello studio. </li><li> Area C: Disporre le seguenti voci: lente d&#39;ingrandimento lente, cannula tracheale, siringhe da 1 ml, con taglio di sutura per lunghezza ottimale e inserito in un peso barca, piccolo dewar con azoto liquido, contenitore isolato sotto ghiaccio, tubi e 24 pozzetti per la raccolta BAL e campioni di tessuto (Tabella 1), strumenti chirurgici (Tabella 2), soluzioni per eseguire BAL e per la pulizia della cannula tracheale e gli strumenti (Tabella 1). </li></ol></li></ol> 2. Cateterismo cardiaco destro <ol><li> Pesare mouse utilizzando una bilancia di precisione con un leggero posizionando il mouse in una pesata bavena. Assicurati di gestire l&#39;animale delicato e silenzioso. Registrare il peso. Il protocollo descritto funziona meglio per topi che sono 20 go più perché il diametro della vena giugulare deve accogliere il catetere di pressione, è possibile cateterizzare piccoli topi (17 g o più) purché la vena è abbastanza grande. </li><li> Anestetizzare il mouse per iniezione con Avertin a seconda del peso corporeo (10 microlitri / g), ad esempio per dare 20 g 200 pl, per dare 25 g 250 microlitri, per dare 30 g 300 ul. Il volume di iniezione esatta deve essere regolato a seconda del ceppo di topo. Assicurati di gestire l&#39;animale delicato e silenzioso perché lo stress può alterare la risposta al anestetico. </li><li> Una volta che il mouse è sedato, posto su due pieghe carta velina. Prendere nota del numero ID sulla carta. Strofinare delicatamente la rimozione lozione per capelli nella parte ventrale del collo per cancellare il campo operatorio. Posizionare il mouse avanti sulla carta e attendere per 1-2 min. </li><li> Eliminare i peli sotto l&#39;aspetto ventraledel collo accarezzando delicatamente i capelli contro la direzione della crescita dei capelli con tamponi di cotone. </li><li> Attentamente determinare la profondità sufficiente di anestesia controllando l&#39;assenza del riflesso punta: il mouse non reagisce pizzicamento delle sue dita. </li><li> Di lavoro in modo rapido e rilassato, il resto del cateterismo cardiaco destro non dovrebbe richiedere più di 10 minuti, in modo ottimale 3-6 min. È importante che il tessuto non si asciuga, perché il catetere deve scivolare nella vena e muoversi all&#39;interno della vena su un livello di umidità. Temporizzazione consistente della procedura è importante per la generazione di dati comparabili fra i gruppi. </li><li> Mouse avanti Posto su carta velina e il trasferimento con la carta velina sul polistirolo bordo. Fissare le zampe e la testa in posizione con del nastro autoclave. </li><li> Fare un&#39;incisione della pelle da mandibole allo sterno (sterno). </li><li> Sezionare con cura verso l&#39;alto della tiroide grandi verso le mandibole per esporre la vena giugulare destra unnd trachea. </li><li> Luogo polistirolo bordo tenendo premuto il mouse sotto il microscopio dissezione con il piano di messa a fuoco già in atto e l&#39;obiettivo a circa 0,8 x ingrandimento (ingrandimento totale [x lente oculare] è di circa 8x. </li><li> Attenzione microdissect la vena giugulare destra rimuovendo circostante tessuto connettivo con una pinza chirurgica. </li><li> Posto due pezzi di sutura sopra la vena giugulare destra. Legare la sutura più vicina alle mandibole per chiudere il flusso di sangue nella vena di un filo piccolo, posizionare la sutura che è più vicino allo sterno / sterno in un nodo allentato attorno alla vena. Si può utilizzare il filo &#39;di sangue per trovare poi il foro nella vena, ciò dovesse rendersi necessario. </li><li> Respirare e rilassarsi (sciogliere i muscoli del collo e della mascella) di tenere gli occhi sulla vena attraverso l&#39;oculare. Questo farà sì che le mani e le dita si muovono in modo sicuro, senza intoppi e rilassata. Tenendo la vena con pinza sul lato più vicinole mandibole, un foro nella vena tra le due suture utilizzando micro-forbici operati da dall&#39;altro. Metti giù le micro-forbici, e mantenendo quel rilassato mano, sentire per il catetere. Recuperare il catetere delicatamente tenendolo tra il pollice e l&#39;indice (Figura 3). Inserire il catetere nel foro della vena. </li><li> Delicatamente avanzare il catetere nel cuore destro (Figura 3). Osservare i segni al catetere che danno un indice approssimativo di quanto il catetere deve essere inserito e osservare il monitor. Una volta che le curve di pressione vengono visualizzati, serrare leggermente la sutura inferiore intorno al catetere. Poiché il catetere presenta resistenza alla trazione che dà una bobina, e perché il battito cardiaco e la respirazione del mouse aggiungere movimento, inoltre apporre il catetere con nastro. </li><li> Misurazioni della pressione record per 2 minuti per una successiva analisi (Figura 4). </li><li> Aprire la sutura tenendo il catetere, poi delicatamente Retrieve catetere. Pulire la parte dietro il trasduttore di pressione, posizionare nuovamente dentro il bicchiere con acqua. Non toccare il trasduttore di pressione. </li><li> Trasferire il mouse sopra la carta velina per area A per l&#39;eutanasia, la raccolta di sangue e di tessuto milza. Pulire gli strumenti chirurgici. </li><li> Avviare la procedura con l&#39;animale successivo. Quando la temporizzazione permette, iniettare l&#39;anestetico in attesa di registrare la curva di pressione (2,15). </li></ol> 3. Raccolta di campioni di sangue e Milza <ol><li> Iniettare la soluzione barbiturici, 400 microlitri per topo e attendere 1-2 min. Questa viene eseguita di routine nel nostro laboratorio per evitare la possibilità che i topi inavvertitamente recuperare da Avertin-anestesia, mentre dissanguamento. Normalizzazione appropriata dell&#39;esperimento è ottenuta iniettando la stessa dose di soluzione barbiturico per topo, e attendendo la stessa quantità di tempo prima della raccolta del sangue. Se consentito dal Animal Care istituzionale e uso Comitato epurché gli animali sono attentamente monitorati per la profondità di anestesia prima dissanguamento, questo passaggio può essere omesso. </li><li> Fai incisione nell&#39;addome. Aprire la vena caudale (vena cava) e raccogliere il sangue con una pipetta di trasferimento. </li><li> Rimuovere la milza, o un pezzo di milza nel tubo Eppendorf e congelare a scatto in azoto liquido, o nella piastra a 24 pozzetti in un tampone contenente ben Hanks per la preparazione successiva delle singole cellule. </li><li> Trasferire il mouse sopra la carta velina per area di lavoro C per la raccolta di BAL, linfonodo drenante polmone, polmone, e tessuti cardiaci. Pulire gli strumenti chirurgici. </li></ol> 4. Raccolta di polmone e Campioni Cuore <ol><li> Staccare il libero trachea del muscolo e del tessuto connettivo. Pinza messa sotto la trachea, tirare sutura attraverso. Delicatamente generare tratto sufficiente per tagliare un buco. Mantenere il tratto gentile, inserire la cannula tracheale con un movimento un po &#39;di svolta, e sutura cannula into posto. Per l&#39;inserimento della cannula tracheale, assicurarsi che la trachea è umido, eventualmente aggiungere una goccia di soluzione di Hanks. Nel corso della procedura, respirare, rilassare collo e muscoli della mascella, per mantenere i movimenti della mano sicura e agevole. </li><li> Dissect aprire la gabbia toracica con attenzione rimuovendo lo sterno a partire dalla fine addominale. Non disturbare il contenuto del torace, perché questo rende molto difficile trovare il linfonodo. </li><li> Eseguire lavaggio broncoalveolare (BAL) delicatamente inserendo 1 ml di tampone Hanks, ruotare leggermente la siringa e recuperare BAL. Ripetere 3 volte, tubo stretto e posto sul ghiaccio. Durante tutta la procedura, tenere gli occhi sulla estremità della cannula tracheale che collega alla siringa. Uno sguardo al torace per osservare l&#39;inflazione e la deflazione dei polmoni. </li><li> Harvest linfonodi polmonari tenendo gabbia toracica parete con un set di pinze, trovare e recuperare il linfonodo con un altro pinza. Luogo linfonodo in 24 pozzetti. È importante kora dove cercare: partendo dal collo, trovare l&#39;entrata della gabbia toracica dal lato destro del mouse e guardare sopra la colonna vertebrale (Figura 5). </li><li> Harvest cuore e il luogo su carta velina. Isolare il cuore destro con attenzione dissezione lungo il setto. Trasferimento a lavoro-area A pesare, registrare il peso e il luogo in provette eppendorf a scatto congelamento in azoto liquido. </li><li> Posizionare sutura intorno al lobo polmonare sinistro per chiudere il bronco principale. Staccare il polmone sinistro lobo libero, posto nel tubo eppendorf e congelare in azoto liquido a scatto, o il luogo in un pozzetto di una piastra a 24 pozzetti contenenti soluzione di Hanks per l&#39;isolamento successivo di sospensioni di cellule singole. </li><li> Inserisci ca. 0,5 ml di soluzione tamponata di formaldeide attraverso la cannula tracheale nei lobi polmonari rimanenti. Dopo l&#39;inflazione, sezionare i lobi polmonari fuori del torace e del luogo in tubo da 50 ml contenente una soluzione di formaldeide. Per un progetto di studio alternativo, i polmoni possono essere gonfiati con ottiMal di taglio dei media (OCT, diluito 1:4 con PBS) e congelato in uno stampo contenente ottobre non diluiti per la preparazione successiva di sezioni congelate. Un altro disegno dello studio potrebbe richiedere di ottenere tessuto polmonare congelato a scatto e sospensioni di cellule singole dai polmoni. In tal caso, non è necessario inflazione: sezionare i lobi polmonari rimanenti; recuperarli dal torace e posto nella piastra a 24 pozzetti in un tampone contenente ben Hanks. </li><li> Rimuovere cannula tracheale, pulita risciacquo con tampone Hanks, pulire strumenti chirurgici. </li></ol> 5. L&#39;analisi delle curve di pressione generate dallo catetere cardiaco destro I dati relativi alla pressione registrati destro ventricolare vengono analizzati utilizzando LabChart 7 software senza conoscere l&#39;identità di gruppo di ogni registrazione. Più di 20 curve sono selezionati in modo casuale e la differenza tra la massima e la pressione ventricolare minima per ogni curva misurata (AP). Il AP medio è calcolato per ottenere il diritto vpressione sistolica entricular.

<ol>
	<li>Price, L. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammation+in+pulmonary+arterial+hypertension.">Inflammation in pulmonary arterial hypertension.</a> Chest. 141, 210-221 (2012).</li><li>Olschewski, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+pathophysiology+and+therapy+of+pulmonary+hypertension.">Cellular pathophysiology and therapy of pulmonary hypertension.</a> J. Lab. Clin. Med. 138, 367-377 (2001).</li><li>Hassoun, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammation,+growth+factors,+and+pulmonary+vascular+remodeling.">Inflammation, growth factors, and pulmonary vascular remodeling.</a> J. Am. Coll. Cardiol. 54, S10-S19 (2009).</li><li>Rabinovitch, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+pathogenesis+of+pulmonary+arterial+hypertension.">Molecular pathogenesis of pulmonary arterial hypertension.</a> J. Clin. Invest. 118, 2372-2379 (2008).</li><li>Steudel, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sustained+pulmonary+hypertension+and+right+ventricular+hypertrophy+after+chronic+hypoxia+in+mice+with+congenital+deficiency+of+nitric+oxide+synthase+3.">Sustained pulmonary hypertension and right ventricular hypertrophy after chronic hypoxia in mice with congenital deficiency of nitric oxide synthase 3.</a> J. Clin. Invest. 101, 2468-2477 (1998).</li><li>Zaidi, S. H., You, X. M., Ciura, S., Husain, M., Rabinovitch, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overexpression+of+the+serine+elastase+inhibitor+elafin+protects+transgenic+mice+from+hypoxic+pulmonary+hypertension.">Overexpression of the serine elastase inhibitor elafin protects transgenic mice from hypoxic pulmonary hypertension.</a> Circulation. 105, 516-521 (2002).</li><li>Guignabert, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tie2-mediated+loss+of+peroxisome+proliferator-activated+receptor-gamma+in+mice+causes+PDGF+receptor-beta-dependent+pulmonary+arterial+muscularization.">Tie2-mediated loss of peroxisome proliferator-activated receptor-gamma in mice causes PDGF receptor-beta-dependent pulmonary arterial muscularization.</a> Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 297, L1082-L1090 (2009).</li><li>West, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pulmonary+hypertension+in+transgenic+mice+expressing+a+dominant-negative+BMPRII+gene+in+smooth+muscle.">Pulmonary hypertension in transgenic mice expressing a dominant-negative BMPRII gene in smooth muscle.</a> Circ. Res. 94, 1109-1114 (2004).</li><li>Cook, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+eNO+and+pulmonary+iNOS+expression+in+eNOS+null+mice.">Increased eNO and pulmonary iNOS expression in eNOS null mice.</a> Eur. Respir. J. 21, 770-773 (2003).</li><li>West, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mice+expressing+BMPR2R899X+transgene+in+smooth+muscle+develop+pulmonary+vascular+lesions.">Mice expressing BMPR2R899X transgene in smooth muscle develop pulmonary vascular lesions.</a> Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 295, L744-L755 (2008).</li><li>Tu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autocrine+fibroblast+growth+factor-2+signaling+contributes+to+altered+endothelial+phenotype+in+pulmonary+hypertension.">Autocrine fibroblast growth factor-2 signaling contributes to altered endothelial phenotype in pulmonary hypertension.</a> Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 45, 311-322 (2011).</li><li>Daley, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pulmonary+arterial+remodeling+induced+by+a+Th2+immune+response.">Pulmonary arterial remodeling induced by a Th2 immune response.</a> J. Exp. Med. 205, 361-372 (2008).</li><li>Song, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammation,+endothelial+injury,+and+persistent+pulmonary+hypertension+in+heterozygous+BMPR2-mutant+mice.">Inflammation, endothelial injury, and persistent pulmonary hypertension in heterozygous BMPR2-mutant mice.</a> Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 295, 677-690 (2008).</li><li>Thibault, H. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noninvasive+assessment+of+murine+pulmonary+arterial+pressure:+validation+and+application+to+models+of+pulmonary+hypertension.">Noninvasive assessment of murine pulmonary arterial pressure: validation and application to models of pulmonary hypertension.</a> Circulation. Cardiovascular imaging. 3, 157-163 (2010).</li><li>Otto, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pulmonary+hypertension+and+right+heart+failure+in+pituitary+adenylate+cyclase-activating+polypeptide+type+I+receptor-deficient+mice.">Pulmonary hypertension and right heart failure in pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide type I receptor-deficient mice.</a> Circulation. 110, 3245-3251 (2004).</li><li>Burton, V. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Attenuation+of+leukocyte+recruitment+via+CXCR1/2+inhibition+stops+the+progression+of+PAH+in+mice+with+genetic+ablation+of+endothelial+BMPR-II.">Attenuation of leukocyte recruitment via CXCR1/2 inhibition stops the progression of PAH in mice with genetic ablation of endothelial BMPR-II.</a> Blood. 118, 4750-4758 (2011).</li><li>Fujita, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pulmonary+hypertension+in+TNF-alpha-overexpressing+mice+is+associated+with+decreased+VEGF+gene+expression.">Pulmonary hypertension in TNF-alpha-overexpressing mice is associated with decreased VEGF gene expression.</a> J. Appl. Physiol. 93, 2162-2170 (2002).</li><li>Motley, H. L., Cournand, A., Werko, L., Himmelstein, A., Dresdale, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Influence+of+Short+Periods+of+Induced+Acute+Anoxia+Upon+Pulmonary+Artery+Pressures+in+Man.">The Influence of Short Periods of Induced Acute Anoxia Upon Pulmonary Artery Pressures in Man.</a> Am. J. Physiol. 150, 315-320 (1947).</li><li>Liljestrand, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+Pulmonary+Arterial+Blood+Pressure.">Regulation of Pulmonary Arterial Blood Pressure.</a> Arch. Intern. Med. 81, 162-172 (1948).</li><li>Euler, U. S. V., Liljestrand, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Observations+on+the+pulmonary+arterial+blood+pressure+in+the+cat.">Observations on the pulmonary arterial blood pressure in the cat.</a> Acta Physiol. Scand. 12, 301-320 (1946).</li><li>Van den Broeck, W., Derore, A., Simoens, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anatomy+and+nomenclature+of+murine+lymph+nodes:+Descriptive+study+and+nomenclatory+standardization+in+BALB/cAnNCrl+mice.">Anatomy and nomenclature of murine lymph nodes: Descriptive study and nomenclatory standardization in BALB/cAnNCrl mice.</a> Journal of immunological. 312, 12-19 (2006).</li><li>Rabinovitch, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Angiotensin+II+prevents+hypoxic+pulmonary+hypertension+and+vascular+changes+in+rat.">Angiotensin II prevents hypoxic pulmonary hypertension and vascular changes in rat.</a> Am. J. Physiol. 254, 500-508 (1988).</li><li>Rabinovitch, M., Gamble, W., Nadas, A. S., Miettinen, O. S., Reid, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rat+pulmonary+circulation+after+chronic+hypoxia:+hemodynamic+and+structural+features.">Rat pulmonary circulation after chronic hypoxia: hemodynamic and structural features.</a> Am. J. Physiol. 236, 818-827 (1979).</li><li>Rabinovitch, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+pulmonary+blood+flow+affect+vascular+response+to+chronic+hypoxia+in+rats.">Changes in pulmonary blood flow affect vascular response to chronic hypoxia in rats.</a> Circ. Res. 52, 432-441 (1983).</li><li>Kugathasan, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+angiopietin-1-Tie2+pathway+prevents+rather+than+promotes+pulmonary+arterial+hypertension+in+transgenic+mice.">The angiopietin-1-Tie2 pathway prevents rather than promotes pulmonary arterial hypertension in transgenic mice.</a> J. Exp. Med. 206, 2221-2234 (2009).</li><li>Bearer, C., Emerson, R. K., ORiordan, M. A., Roitman, E., Shackleton, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maternal+tobacco+smoke+exposure+and+persistent+pulmonary+hypertension+of+the+newborn.">Maternal tobacco smoke exposure and persistent pulmonary hypertension of the newborn.</a> Environ. Health Persp. , 105-202 (1997).</li><li>Graham, B. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Schistosomiasis-induced+experimental+pulmonary+hypertension:+role+of+interleukin-13+signaling.">Schistosomiasis-induced experimental pulmonary hypertension: role of interleukin-13 signaling.</a> Am. J. Pathol. 177, 1549-1561 (2010).</li><li>Butrous, G., Ghofrani, H. A., Grimminger, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pulmonary+vascular+disease+in+the+developing+world.">Pulmonary vascular disease in the developing world.</a> Circulation. 118, 1758-1766 (2008).</li><li>Crosby, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Praziquantel+reverses+pulmonary+hypertension+and+vascular+remodeling+in+murine+schistosomiasis.">Praziquantel reverses pulmonary hypertension and vascular remodeling in murine schistosomiasis.</a> Am. J. Respir. Crit. Care Med. 184, 467-473 (2011).</li></ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Il flusso sperimentale qui descritto consente la misurazione rapida e simultanea della pressione sistolica ventricolare destra e la raccolta di campioni per l&#39;analisi delle risposte nel cuore, i polmoni e il sistema immunitario in topi. La procedura combina misure di fisiologia cardiaca, micro-dissezione e la raccolta dei tessuti successivo per studi sulle cellule vive, analisi istologiche, o omiche-analisi dei tessuti. La procedura completa richiede meno di 20 minuti per topo. A causa della zona lavoro organizzato ...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td><td> Commenti (opzionale) </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Reagenti </td></tr><tr><td> 2-metil-2-butanolo </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 152463 </td><td></td></tr><tr><td> 2,2,2-Tribromoethanol </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> T48402 </td><td></td></tr><tr><td> disinfettante sapone (copertura Spray TB più Steris) </td><td> Fisher Scientific </td><td> 1629-1608 </td><td></td></tr><tr><td> Alcool etilico, 200 Proof, Absolute, anidro ACS / USP Grade </td><td> PHARMCO-AAPER </td><td> 111000200 </td><td> Diluire al 70% con acqua distillata </td></tr><tr><td> Formaldeide soluzione </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> F1635-500ML </td><td> Diluire a un 7-10% formaconcentrazione ldehyde ad una concentrazione di PBS 1x utilizzando PBS soluzione madre e acqua </td></tr><tr><td> Hanks soluzione, no, calcio e magnesio </td><td> Fisher Scientific </td><td> 21-022-CV </td><td></td></tr><tr><td> Ottobre </td><td> Tissue-Tek </td><td> 4583 </td><td></td></tr><tr><td> Penicillina (10.000 U / ml) / streptomicina (10.000 mg / ml) soluzione </td><td> Thermo Scientific </td><td> SV30010 </td><td></td></tr><tr><td> Tampone fosfato salino (PBS), nessun calcio, magnesio no, soluzioni 1x e 10x </td><td> Fisher Scientific </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Pentobarbital di sodio 26% </td><td> Fort Dodge Animal Health </td><td> NDC 0856-0471-01 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Labware </td></tr><tr><td> Piatti 12, 24, 96 e </td><td> Falco </td><td></td><td></td></tr&gt; <tr><td> Trasferimento Pipettare </td><td> Fisher Scientific </td><td> 13-711-9BM </td><td></td></tr><tr><td> Tube, EDTA rivestito </td><td> Sarstedt </td><td> 2013-08 </td><td></td></tr><tr><td> Provette 0,65 ml e 1,7 ml micro-centrifuga </td><td> VWR </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Tubi 12 x 75 mm polipropilene </td><td> Fisher Scientific </td><td> 14-956-1D </td><td></td></tr><tr><td> Tubi, di varie dimensioni, in polipropilene </td><td> Fisher Scientific </td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Strumenti </td></tr><tr><td> Pinza, Dumon # 5 Belle </td><td> Strumenti Scienza Belle </td><td> 11254-20 </td><td></td></tr><tr><td> Pinze, extra fini Graefe-0.5mm punte curve </td><td> Strumenti Scienza Belle </td><td> 11152-10 </td><td></td></tr><tr><td> Pinze, extra fine Graefe-0.5mm punte diritte </td><td> Strumenti Scienza Belle </td><td> 11150-10 </td><td></td></tr><tr><td> Cannula 18GA, 19 ga </td><td> BD </td><td> Precision Glide Aghi </td><td> Tagliare alla lunghezza ottimale, smussati e fuori gracchiò per creare una superficie ruvida esterna </td></tr><tr><td> Forbici, forbici dissettore-sottili lame 9 centimetri </td><td> Strumenti Scienza Belle </td><td> 14081-09 </td><td></td></tr><tr><td> Sutura per BAL, sutura di seta intrecciata, 4-0 </td><td> Strumenti Scienza Belle </td><td> SP116 </td><td></td></tr><tr><td> Sutura per cateterismo cardiaco destro, sutura di seta intrecciata, 6-0 </td><td> Teleflex Medical </td><td> 18020-60 </td><td></td></tr><tr><td> Siringa, 1 ml </td><td> BD </td><td> 309659 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Attrezzatura </td></tr><tr><td> Amplificatore, PowerLab 4/30 </td&gt; <td> ADInstrument </td><td> Modello ML866 </td><td></td></tr><tr><td> Catetere, pressione F1.4 </td><td> Millar Instruments, Inc </td><td> 840-6719 </td><td></td></tr><tr><td> Dissezione Microscopio </td><td> Variscope </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Pinze, forbici Vännäs primavera-2mm lame </td><td> Strumenti Scienza Belle </td><td> 15000-00 </td><td></td></tr><tr><td> Lente luminosa alogena Desk </td><td> Fisher Scientific </td><td> 11-990-56 </td><td></td></tr><tr><td> Computer portatile </td><td> Asus </td><td> Numero di modello A52F i5 processore; 15 pollici </td><td></td></tr><tr><td> Fonte di luce </td><td> Amscope </td><td> HL-250-A </td><td></td></tr><tr><td> Unità di controllo della pressione </td><td> Millar Instruments, Inc </td><td> PCU-2000 </td><td></td></tr><tr><td> Software, Labchart-Pro V.7 </td><td> DC Instruments </td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

right ventricular systolic pressure measurements in combination with harvest of lung and immune tissue samples in mice

La funzione del cuore destro è di pompare sangue attraverso i polmoni, collegando così fisiologia del cuore destro e fisiologia vascolare polmonare. L&#39;infiammazione è un modificatore comune di cuore e funzione polmonare, elaborando infiltrazione cellulare, la produzione di citochine e fattori di crescita, e avviando processi di rimodellamento 1. Rispetto al ventricolo sinistro, il ventricolo destro è una pompa a bassa pressione che opera in una zona relativamente ristretta di variazioni di pressione. Aumentato la pressione arteriosa polmonare sono associati con un aumento della pressione nel letto vascolare polmonare e ipertensione polmonare 2. L&#39;ipertensione polmonare è spesso associata a malattie polmonari infiammatorie, ad esempio cronica ostruttiva, o malattie autoimmuni 3. Poiché l&#39;ipertensione polmonare conferisce una prognosi negativa per la qualità della vita e la speranza di vita, gran parte della ricerca è orientata verso la comprensione dei meccanismi che might essere gli obiettivi per 4 intervento farmaceutico. La sfida principale per lo sviluppo di strumenti di gestione efficaci per l&#39;ipertensione polmonare rimane la complessità della comprensione simultanea di cambiamenti molecolari e cellulari nel cuore destro, i polmoni e il sistema immunitario. Qui, presentiamo un workflow procedurale per la misurazione rapida e precisa delle variazioni di pressione nel cuore destro di topi e la raccolta simultanea di campioni dal cuore, polmoni e tessuti immunitarie. Il metodo si basa sulla cateterizzazione diretta del ventricolo destro attraverso la vena giugulare in stretta a torso topi, sviluppato alla fine del 1990 come parametro di misurazione della pressione in arteria polmonare 5-13. La squadra ha organizzato approccio facilita una tecnica molto rapida diritto cateterismo cardiaco. Ciò rende possibile effettuare le misure in topi che spontaneamente respirano aria ambiente. L&#39;organizzazione del flusso di lavoro in distinte aree di lavoro-riduce il tempo di ritardo e si apre la possibilità di eseguire contemporaneamente esperimenti di fisiologia e di raccolta dei tessuti immunitario, cardiache e polmonari. Il flusso di lavoro procedurale qui descritto può essere adattato per una vasta gamma di ambienti di laboratorio e disegni di studio, da piccoli, esperienze mirate, di grandi saggi di screening di stupefacenti. L&#39;acquisizione contemporanea dei dati di fisiologia cardiaca che può essere ampliato per includere l&#39;ecocardiografia 5,14-17 e la raccolta dei tessuti del cuore, del polmone e del sistema immunitario riduce il numero di animali necessari per ottenere i dati che si muovono la base delle conoscenze scientifiche in avanti. Il flusso di lavoro procedurale qui presentato fornisce anche una base ideale per la conoscenza delle reti che collegano immunitario, polmoni e la funzione del cuore. Gli stessi principi descritti qui possono essere adattati per studiare altri organi o aggiuntiva come richiesto.

Il risultato primario per ottenere giuste curve di pressione cardiaca si ottiene il corretto posizionamento del catetere cuore destro. La forma delle curve tempo la pressione è fondamentale perché il corretto posizionamento del catetere all&#39;interno del ventricolo destro comporterà altipiani pressione (Figura 4). Spine ricurve, invece, indicano un catetere che viene spostato dal respiro o battito cardiaco movimento contro la parete del ventricolo destro. Per rilevare potenziali problemi con la fas...

Watch this Scientific Journal Video about Right Ventricular Systolic Pressure Measurements in Combination with Harvest of Lung and Immune Tissue Samples in Mice at JoVE.com

Right Ventricular Systolic Pressure Measurements in Combination with Harvest of Lung and Immune Tissue Samples in Mice | Immunology and Infection | Video

Right Ventricular Systolic Pressure Measurements in Combination with Harvest of Lung and Immune Tissue Samples in Mice

Un protocollo specifico e rapido per indagare contemporaneamente la funzione del cuore destro, infiammazione polmonare, e la risposta immunitaria viene descritto come strumento di apprendimento. Video e dati descrivono fisiologia e tecniche di microdissezione organizzata in un approccio di squadra che è adattabile per essere utilizzato per piccole e grandi dimensioni studi.

Ventricolo destro di pressione sistolica Misure in combinazione con raccolta di campioni di tessuto polmonare e immunitaria nei topi

The function of the right heart is to pump blood through the lungs, thus linking right heart physiology and pulmonary vascular physiology. Inflammation is ...

right-ventricular-systolic-pressure-measurements-combination-with

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Biology

Immunology and Infection

Human Biology

Circulatory and Pulmonary Systems

SCIENTISTS IN ACTION

25.0K Views.  New York University School of Medicine, Tuxedo. Un protocollo specifico e rapido per indagare contemporaneamente la funzione del cuore destro, infiammazione polmonare, e la risposta immunitaria viene descritto come strumento di apprendimento. Video e dati descrivono fisiologia e tecniche di microdissezione organizzata in un approccio di squadra che è adattabile per essere utilizzato per piccole e grandi dimensioni studi.

Video: Right Ventricular Systolic Pressure Measurements in Combination with Harvest of Lung and Immune Tissue Samples in Mice

Seven Steps to Stellate Cells

Hepatic stellate cells are liver-resident cells of star-like morphology and are located in the space of Disse between liver sinusoidal endothelial cells and hepatocytes1,2. Stellate cells are derived from bone marrow precursors and store up to 80% of the total body vitamin A1, 2. Upon activation, stellate cells differentiate into myofibroblasts to produce extracellular matrix, thus contributing to liver fibrosis3. Based on their ability to contract, myofibroblastic stellate cells can regulate the vascular tone associated with portal hypertension4. Recently, we demonstrated that hepatic stellate cells are potent antigen presenting cells and can activate NKT cells as well as conventional T lymphocytes5. 

 Here we present a method for the efficient preparation of hepatic stellate cells from mouse liver. Due to their perisinusoidal localization, the isolation of hepatic stellate cells is a multi-step process. In order to render stellate cells accessible to isolation from the space of Disse, mouse livers are perfused in situ with the digestive enzymes Pronase E and Collagenase P. Following perfusion, the liver tissue is subjected to additional enzymatic treatment with Pronase E and Collagenase P in vitro. Subsequently, the method takes advantage of the massive amount of vitamin A-storing lipid droplets in hepatic stellate cells. This feature allows the separation of stellate cells from other hepatic cell types by centrifugation on an 8% Nycodenz gradient. The protocol described here yields a highly pure and homogenous population of stellate cells. Purity of preparations can be assessed by staining for the marker molecule glial fibrillary acidic protein (GFAP), prior to analysis by fluorescence microscopy or flow cytometry. Further, light microscopy reveals the unique appearance of star-shaped hepatic stellate cells that harbor high amounts of lipid droplets. 


 Taken together, we present a detailed protocol for the efficient isolation of hepatic stellate cells, including representative images of their morphological appearance and GFAP expression that help to define the stellate cell entity.

Here we describe a method for the isolation of hepatic stellate cells from mouse liver. For stellate cell purification, mouse livers are digested in situ and in vitro by pronase-collagenase treatment prior to density gradient centrifugation. This technique yields highly pure hepatic stellate cells.

Sette passi per Stellate Cellule

Hepatic stellate cells are liver-resident  cells of star-like morphology and are located in the space of Disse between  liver sinusoidal endothelial cells ...

Ricerca

Immunologia e infezioni

Measuring Bacterial Load and Immune Responses in Mice Infected with Listeria monocytogenes

Listeria monocytogenes (Listeria) is a Gram-positive facultative intracellular pathogen1. Mouse studies typically employ intravenous injection of Listeria, which results in systemic infection2. After injection, Listeria quickly disseminates to the spleen and liver due to uptake by CD8&alpha;+ dendritic cells and Kupffer cells3,4. Once phagocytosed, various bacterial proteins enable Listeria to escape the phagosome, survive within the cytosol, and infect neighboring cells5. During the first three days of infection, different innate immune cells (e.g. monocytes, neutrophils, NK cells, dendritic cells) mediate bactericidal mechanisms that minimize Listeria proliferation. CD8+ T cells are subsequently recruited and responsible for the eventual clearance of Listeria from the host, typically within 10 days of infection6.
Successful clearance of Listeria from infected mice depends on the appropriate onset of host immune responses6	. There is a broad range of sensitivities amongst inbred mouse strains7,8. Generally, mice with increased susceptibility to Listeria infection are less able to control bacterial proliferation, demonstrating increased bacterial load and/or delayed clearance compared to resistant mice. Genetic studies, including linkage analyses and knockout mouse strains, have identified various genes for which sequence variation affects host responses to Listeria infection6,8-14. Determination and comparison of infection kinetics between different mouse strains is therefore an important method for identifying host genetic factors that contribute to immune responses against Listeria. Comparison of host responses to different Listeria strains is also an effective way to identify bacterial virulence factors that may serve as potential targets for antibiotic therapy or vaccine design.
We describe here a straightforward method for measuring bacterial load (colony forming units [CFU] per tissue) and preparing single-cell suspensions of the liver and spleen for FACS analysis of immune responses in Listeria-infected mice. This method is particularly useful for initial characterization of Listeria infection in novel mouse strains, as well as comparison of immune responses between different mouse strains infected with Listeria. We use the Listeria monocytogenes EGD strain15 that, when cultured on blood agar, exhibits a characteristic halo zone around each colony due to &beta;-hemolysis1 (Figure 1). Bacterial load and immune responses can be determined at any time-point after infection by culturing tissue homogenate on blood agar plates and preparing tissue cell suspensions for FACS analysis using the protocols described below. We would note that individuals who are immunocompromised or pregnant should not handle Listeria, and the relevant institutional biosafety committee and animal facility management should be consulted before work commences.

Measuring Bacterial Load and Immune Responses in Mice Infected with Listeria monocytogenes

Listeria monocytogenes is a model organism for studying immune responses and genetic susceptibility to intracellular bacteria in mice. This method enables one to measure bacterial load and generate single-cell suspensions of the liver and spleen from mice for FACS analysis to determine changes in immune cells due to Listeria infection.

Misurazione della carica batterica e Risposte immunitarie in topi infettati con Listeria monocytogenes</em

Listeria monocytogenes (Listeria) is a Gram-positive facultative intracellular pathogen1. Mouse studies typically employ intravenous injection of ...

Induction of Maternal Immune Activation in Mice at Mid-gestation Stage with Viral Mimic Poly(I:C)

Maternal immune activation (MIA) model is increasingly well appreciated as a rodent model for the environmental risk factor of various psychiatric disorders. Numerous studies have demonstrated that MIA model is able to show face, construct, and predictive validity that are relevant to autism and schizophrenia. To model MIA, investigators often use viral mimic polyinosinic:polycytidylic acid (poly(I:C)) to activate the immune system in pregnant rodents. Generally, the offspring from immune activated dam exhibit behavioral abnormalities and physiological alterations that are associated with autism and schizophrenia. However, poly(I:C) injection with different dosages and at different time points could lead to different outcomes by perturbing brain development at different stages. Here we provide a detailed method of inducing MIA by intraperitoneal (i.p.) injection of 20 mg/kg poly(I:C) at mid-gestational embryonic 12.5 days (E12.5). This method has been shown to induce acute inflammatory response in the maternal-placental-fetal axis, which ultimately results in the brain perturbations and behavioral phenotypes that are associated with autism and schizophrenia.

Induction of Maternal Immune Activation in Mice at Mid-gestation Stage with Viral Mimic PolyI:C

Maternal immune activation (MIA) is a model for an environmental risk factor of autism and schizophrenia. The goal of this article is to provide a step-by-step procedure of how to induce MIA in the pregnant mice in order to enhance the reproducibility of this model.

Induzione di materna immunitario attivazione nei topi a Mid-gestazione stage con Viral Mimic poli (I: C)

Maternal immune activation (MIA) model is increasingly well appreciated as a rodent model for the environmental risk factor of various psychiatric ...

Flow Cytometric Analysis of Natural Killer Cell Lytic Activity in Human Whole Blood

NK cell cytotoxicity is a widely used measure to determine the effect of outside intervention on NK cell function. However, the accuracy and reproducibility of this assay can be considered unstable, either because of user&#39;s errors or because of the sensitivity of NK cells to experimental manipulation. To eliminate these issues, a workflow that reduces them to a minimum was established and is presented here. To illustrate, we obtained blood samples, at various time points, from runners (n = 4) that were submitted to an intense bout of exercise. First, NK cells are simultaneously identified and isolated through CD56 tagging and magnetic-based sorting, directly from whole blood and from as little as one milliliter. The sorted NK cells are removed of any reagent or capping antibodies. They can be counted in order to establish an accurate NK cell count per milliliter of blood. Secondly, the sorted NK cells (effectors cells or E) can be mixed with 3,3&#39;-Diotadecyloxacarbocyanine Perchlorate (DiO) tagged K562 cells (target cells or T) at an assay-optimal 1:5 T:E ratio, and analyzed using an imaging flow-cytometer that allows for the visualization of each event and the elimination of any false positive or false negatives (such as doublets or effector cells). This workflow can be completed in about 4 h, and allows for very stable results even when working with human samples. When available, research teams can test several experimental interventions in human subjects, and compare measurements across several time points without compromising the data&#39;s integrity.

This work describes an advanced workflow for the accurate and fast determination of NK (Natural Killer) cell count and NK cell cytotoxicity in human blood samples.

Flusso analisi di citometria di Natural Killer cellulare Lytic attività nel Sangue umano intero

NK cell cytotoxicity is a widely used measure to determine the effect of outside intervention on NK cell function. However, the accuracy and ...

Assessment of the Cytotoxic and Immunomodulatory Effects of Substances in Human Precision-cut Lung Slices

Respiratory diseases in their broad diversity need appropriate model systems to understand the underlying mechanisms and enable development of new therapeutics. Additionally, registration of new substances requires appropriate risk assessment with adequate testing systems to avoid the risk of individuals being harmed, for example, in the working environment. Such risk assessments are usually conducted in animal studies. In view of the 3Rs principle and public skepticism against animal experiments, human alternative methods, such as precision-cut lung slices (PCLS), have been evolving. The present paper describes the ex vivo technique of human PCLS to study the immunomodulatory potential of low-molecular-weight substances, such as ammonium hexachloroplatinate (HClPt). Measured endpoints include viability and local respiratory inflammation, marked by altered secretion of cytokines and chemokines. Pro-inflammatory cytokines, tumor necrosis factor alpha (TNF-&#945;), and interleukin 1 alpha (IL-1&#945;) were significantly increased in human PCLS after exposure to a sub-toxic concentration of HClPt. Even though the technique of PCLS has been substantially optimized over the past decades, its applicability for the testing of immunomodulation is still in development. Therefore, the results presented here are preliminary, even though they show the potential of human PCLS as a valuable tool in respiratory research.

In view of the 3Rs principle, respiratory models as alternatives to animal studies are evolving. Especially for risk assessment of respiratory substances, there is a lack of appropriate assays. Here, we describe the use of human precision-cut lung slices for the assessment of airborne substances.

Valutazione dei citotossici e gli effetti immunomodulatori di sostanze in fette di polmone umano di taglio di precisione

Respiratory diseases in their broad diversity need appropriate model systems to understand the underlying mechanisms and enable development of new ...

Application of Consistent Massage-Like Perturbations on Mouse Calves and Monitoring the Resulting Intramuscular Pressure Changes

Massage is generally recognized to be beneficial for relieving pain and inflammation. Although previous studies have reported anti-inflammatory effects of massage on skeletal muscles, the molecular mechanisms behind are poorly understood. We have recently developed a simple device to apply local cyclical compression (LCC), which can generate intramuscular pressure waves with varying amplitudes. Using this device, we have demonstrated that LCC modulates inflammatory responses of macrophages in situ and alleviates immobilization-induced muscle atrophy. Here, we describe protocols for the optimization and application of LCC as a massage-like intervention against immobilization-induced inflammation and atrophy of skeletal muscles of mouse hindlimbs. The protocol that we have developed can be useful for investigating the mechanism underlying beneficial effects of physical exercise and massage. Our experimental system provides a prototype of the analytical approach to elucidate the mechanical regulation of muscle homeostasis, although further development needs to be made for more comprehensive studies.

Here we describe the protocols for applying defined mechanical loads to mouse calves and for monitoring the concomitant intramuscular pressure changes. The experimental systems that we have developed can be useful for investigating the mechanism behind the beneficial effects of physical exercise and massage.

Applicazione di perturbazioni costanti simili a massaggi sui vitelli per topi e monitoraggio dei conseguenti cambiamenti di pressione intramuscolare

Massage is generally recognized to be beneficial for relieving pain and inflammation. Although previous studies have reported anti-inflammatory effects of ...

Recurrent Escherichia coli Urinary Tract Infection Triggered by Gardnerella vaginalis Bladder Exposure in Mice

Recurrent urinary tract infections (rUTI) caused by uropathogenic Escherichia coli (UPEC) are common and costly. Previous articles describing models of UTI in male and female mice have illustrated the procedures for bacterial inoculation and enumeration in urine and tissues. During an initial bladder infection in C57BL/6 mice, UPEC establish latent reservoirs inside bladder epithelial cells that persist following clearance of UPEC bacteriuria. This model builds on these studies to examine rUTI caused by the emergence of UPEC from within latent bladder reservoirs. The urogenital bacterium Gardnerella vaginalis is used as the trigger of rUTI in this model because it is frequently present in the urogenital tracts of women, especially in the context of vaginal dysbiosis that has been associated with UTI. In addition, a method for in situ bladder fixation followed by scanning electron microscopy (SEM) analysis of bladder tissue is also described, with potential application to other studies involving the bladder.

Recurrent Escherichia coli Urinary Tract Infection Triggered by Gardnerella vaginalis Bladder Exposure in Mice

A mouse model of uropathogenic E. coli (UPEC) transurethral inoculation to establish latent intracellular bladder reservoirs and subsequent bladder exposure to G. vaginalis to induce recurrent UPEC UTI is demonstrated. Also demonstrated are the enumeration of bacteria, urine cytology, and in situ bladder fixation and processing for scanning electron microscopy.

Infezione ricorrente del tratto urinario da Escherichia coli innescata dall'esposizione alla vescica di Gardnerella vaginalis nei topi

Recurrent urinary tract infections (rUTI) caused by uropathogenic Escherichia coli (UPEC) are common and costly. Previous articles describing models of ...

Monitoring Neutrophil Elastase and Cathepsin G Activity in Human Sputum Samples

Proteases are regulators of countless physiological processes and the precise investigation of their activities remains an intriguing biomedical challenge. Among the ~600 proteases encoded by the human genome, neutrophil serine proteases (NSPs) are thoroughly investigated for their involvement in the onset and progression of inflammatory conditions including respiratory diseases. Uniquely, secreted NSPs not only diffuse within extracellular fluids but also localize to plasma membranes. During neutrophil extracellular trap (NETs) formation, NSPs become an integral part of the secreted chromatin. Such complex behavior renders the understanding of NSPs pathophysiology a challenging task. Here, detailed protocols are shown to visualize, quantify and discriminate free and membrane-bound neutrophil elastase (NE) and cathepsin G (CG) activities in sputum samples. NE and CG are NSPs whose activities have pleiotropic roles in the pathogenesis of cystic fibrosis (CF) and chronic obstructive pulmonary disease (COPD): they promote tissue remodeling, regulate downstream immune responses and correlate with lung disease severity. The protocols show how to separate fluid and cellular fraction, as well as the isolation of neutrophils from human sputum for enzymatic activity quantification via small-molecule F&#246;rster resonance energy transfer-based (FRET) reporters. To gather specific insights into the relative role of NE and CG activities, a FRET readout can be measured by different technologies: i) in vitro plate reader measurements allow for high-throughput and bulk detection of protease activity; ii) confocal microscopy spatiotemporally resolves membrane-bound activity at the cell surface; iii) small-molecule FRET flow cytometry enables for the rapid evaluation of anti-inflammatory treatments via single-cell protease activity quantification and phenotyping. The implementation of such methods opens the doors to explore NSPs pathobiology and their potential as biomarkers of disease severity for CF and COPD. Given their standardization potential, their robust readout and simplicity of transfer, the described techniques are immediately shareable for implementation across research and diagnostic laboratories.

The protocols herein described provide a guide to visualize and quantify the activity of neutrophil proteases in human sputum. The applications of such analysis span from the evaluation of anti-inflammatory treatments, to biomarker validation, drug screening and large cohort clinical studies.

Monitoraggio dell'attività neutrofila elastasi e cathepsin G nei campioni di espettorato umano

Proteases are regulators of countless physiological processes and the precise investigation of their activities remains an intriguing biomedical ...

Separation of Immune Cell Subpopulations in Peripheral Blood Samples from Children with Infectious Mononucleosis

Infectious mononucleosis (IM) is an acute syndrome mostly associated with primary Epstein&#8211;Barr virus (EBV) infection. The main clinical symptoms include irregular fever, lymphadenopathy, and significantly increased lymphocytes in peripheral blood. The pathogenic mechanism of IM is still unclear; there is no effective treatment method for it, with mainly symptomatic therapies being available. The main question in EBV immunobiology is why only a small subset of infected individuals shows severe clinical symptoms and even develop EBV-associated malignancies, whilemost individuals are asymptomatic for life with the virus.
B cells are first involved in IM because EBV receptors are presented on their surface. Natural killer (NK) cells are cytotoxic innate lymphocytes that are important for killing EBV-infected cells. The proportion of CD4+ T cells decreases while that of CD8+ T cells expands dramatically during acute EBV infection, and the persistence of CD8+ T cells is important for lifelong control of IM. Those immune cells play important roles in IM, and their functions need to be identified separately. For this purpose, monocytes are separated first from peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) of IM individuals using CD14 microbeads, a column, and a magnetic separator.
The remaining PBMCs are stained with peridinin-chlorophyll-protein (PerCP)/Cyanine 5.5 anti-CD3, allophycocyanin (APC)/Cyanine 7 anti-CD4, phycoerythrin (PE) anti-CD8, fluorescein isothiocyanate (FITC) anti-CD19, APC anti-CD56, and APC anti-CD16 antibodies to sort CD4+ T cells, CD8+ T cells, B cells, and NK cells using a flow cytometer. Furthermore, transcriptome sequencing of five subpopulations was performed to explore their functions and pathogenic mechanisms in IM.

We describe a method combining immunomagnetic beads and fluorescence-activated cell sorting to isolate and analyze defined immune cell subpopulations of peripheral blood mononuclear cells (monocytes, CD4+ T cells, CD8+ T cells, B cells, and natural killer cells). Using this method, magnetic and fluorescently labeled cells can be purified and analyzed.

Separazione delle sottopopolazioni di cellule immunitarie nei campioni di sangue periferico da bambini con mononucleosi infettiva

Infectious mononucleosis (IM) is an acute syndrome mostly associated with primary Epstein&#8211;Barr virus (EBV) infection. The main clinical symptoms ...

Induction of Periodontitis via a Combination of Ligature and Lipopolysaccharide Injection in a Rat Model

Periodontitis (PD) is a highly prevalent, chronic immune-inflammatory disease of the periodontium, that results in a loss of gingival soft tissue, periodontal ligament, cementum, and alveolar bone. In this study, a simple method of PD induction in rats is described. We provide detailed instructions for placement of the ligature model around the first maxillary molars (M1) and a combination of injections of lipopolysaccharide (LPS), derived from Porphyromonas gingivalis at the mesio-palatal side of the M1. The induction of periodontitis was maintained for 14 days, promoting the accumulation of bacteria biofilm and inflammation. To validate the animal model, IL-1&#946;, a key inflammatory mediator, was determined by an immunoassay in the gingival crevicular fluid (GCF), and alveolar bone loss was calculated using cone beam computed tomography (CBCT). This technique was effective in promoting gingiva recession, alveolar bone loss, and an increase in IL-1&#946; levels in the GCF at the end of the experimental procedure after 14 days. This method was effective in inducing PD, thus being able to be used in studies on disease progression mechanisms and future possible treatments.

Induction of Periodontitis via a Combination of Ligature and Lipopolysaccharide Injection in a Rat Model

In this study, a rat model of induction of periodontitis is presented via a combination of retentive ligature and repetitive injections of lipopolysaccharide derived from Porphyromonas gingivalis, over 14 days around the first maxillary molars. The ligation and LPS injection techniques were effective in inducing peridontitis, resulting in alveolar bone loss and inflammation.