Per un composto che deve essere somministrato direttamente nel flusso sanguigno, l'ottimizzazione della somministrazione endovenosa è la parte fondamentale della procedura sperimentale. Il nostro protocollo dettagliato fornisce istruzioni dettagliate per eseguire il dosaggio di boli endovenosi multipli attraverso la vena giugulare di topo e come eseguire cateterismi arteriosi e ventricolari destri per un'accurata valutazione emodinamica nel modello di ipertensione arteriosa polmonare ipossia di topo. Le procedure qui presenti sono risultati importanti per i ricercatori interessati alla radice IV della piattaforma di somministrazione di composti per sviluppare un trattamento per l'ipertensione arteriosa primaria.
I ricercatori possono utilizzare questo metodo di iniezione in bolo della vena giugulare per lo screening dei composti per lo sviluppo di farmaci in qualsiasi modello murino di malattia. L'iniezione in bolo endovenoso e le misurazioni della pressione sanguigna richiedono molta pratica. Per iniziare, rimuovere il topo dalla camera di anestesia.
Posizionare il topo anestetizzato in posizione supina su una piattaforma di iniezione sotto un microscopio da dissezione. Mantenere l'anestesia tramite un cono nasale con isoflurano all'1,5% e trattenere delicatamente le quattro gambe con nastro adesivo per immobilizzare il corpo. Strofinare delicatamente l'area chirurgica tre volte con tre cicli alternati di soluzione di iodio povidone ed etanolo al 70%.
Dopo aver eseguito un taglio longitudinale di 0,5 centimetri, utilizzare una pinza per separare il muscolo e i tessuti adiposi e individuare la vena giugulare esterna destra. Quindi inserire un ago sterile da 28 G nella vena giugulare. Con lo smusso dell'ago rivolto verso l'alto.
Premere lentamente lo stantuffo della siringa per iniettare il composto nella vena. Lasciare che l'ago rimanga all'interno della vena per altri 10 secondi per evitare il riflusso. Rimuovere l'ago e utilizzare un batuffolo di cotone per esercitare pressione sul sito di iniezione per prevenire il sanguinamento.
Suturare la pelle con sutura 5/0 e posizionare l'animale in una gabbia di recupero con il fondo della gabbia coperto da un tovagliolo di carta senza lettiera. Innanzitutto, misurare la distanza tra il sito di inserimento del catetere e la posizione desiderata della punta del catetere. Segnare due contrassegni di distanza del catetere per fornire un'indicazione visiva della profondità di inserimento, applicare l'unguento veterinario direttamente sulla superficie oculare degli occhi del topo per prevenire la secchezza.
Posizionare il topo in posizione supina su una piattaforma di iniezione sotto un microscopio da dissezione. Dopo aver inciso la pelle dalla mandibola allo sterno, separare le ghiandole salivari ed esporre la trachea. Metti 0,5 millilitri di PBS nella cavità per rallentare lo sviluppo dello spasmo vascolare mentre manipoli l'arteria carotide.
Isolare con cura una sezione di cinque millimetri dell'arteria carotide destra posizionando un pezzo di carta bianca sotto il vaso come sfondo. Usando un 8-0 sutura, fare un nodo permanente per chiudere l'estremità cranica del vaso. Successivamente, fai il primo nodo sciolto per occludere temporaneamente il flusso sanguigno dall'aorta.
Quindi fare il secondo nodo sciolto tra le prime due suture. Utilizzando un ago da 25G, praticare un piccolo foro abbastanza grande da far passare il catetere in linea con il vaso tra il nodo permanente e il secondo nodo sciolto. Tenere il catetere a 1,5 pollici dalla punta e inserire delicatamente la punta del catetere attraverso il foro dell'arteria.
Stringere il secondo nodo sciolto attorno al catetere e al vaso che consente ancora il passaggio del catetere. Sciogliere delicatamente il primo nodo sciolto. Continuare a inserire il catetere verso l'aorta ascendente in base al segno sul catetere fino a quando l'analisi della pressione non mostra un profilo della pressione arteriosa.
Registra i dati della pressione arteriosa sistemica utilizzando il sistema di acquisizione dati e il software. Allentare il nodo di sutura centrale per consentire l'estrazione del catetere. Quindi allacciare il primo nodo sciolto per evitare sanguinamenti ed estrarre il catetere dall'arteria carotide.
Isolare con cura la vena giugulare esterna destra dal tessuto connettivo circostante. Usando un 8-0 sutura, legare tutti i piccoli rami e fare un nodo permanente per chiudere l'estremità cranica del vaso. Quindi fai un nodo sciolto sull'estremità caudale del vaso.
Usa un ago da 25G per fare un piccolo foro prossimale al nodo permanente. Tenere il catetere e inserire il catetere nel taglio della vena e stringere il nodo caudale attorno al catetere e al vaso. Spingere lentamente il catetere nel cuore destro.
Monitorare la profondità della punta del catetere in base al segno del catetere. Valutare la posizione della punta del catetere in base al tracciamento dell'onda di pressione nel software. Quando la punta del catetere si trova nel ventricolo destro, il monitor mostrerà un tipico tracciato della pressione sistolica del ventricolo destro.
Tenere stabile il catetere e raccogliere i dati per cinque minuti. Al termine della registrazione, estrarre con cautela il catetere e osservare che non vi sia alcuna registrazione della pressione. Annoda il nodo caudale attorno al recipiente.
Riposizionare il catetere nella soluzione PBS. Durante il cateterismo del ventricolo destro in un topo C57 nero controllato da normossia, è stato ottenuto un accesso riuscito alla camera ventricolare destra, come si è visto dal cambiamento della forma d'onda emodinamica in diverse regioni del sistema venoso. La pressione arteriosa sistemica e la pressione sistolica ventricolare destra sono state misurate in un topo a torace chiuso quattro settimane dopo l'esposizione a ipossia o normossia.
Rispetto al gruppo normossia, la pressione sistolica ventricolare destra è risultata significativamente aumentata nel gruppo ipossia. Il trattamento con il composto di micro RNA 7C1/let-7 ha determinato una significativa diminuzione della pressione sistolica ventricolare destra rispetto al gruppo ipossia, mentre la pressione arteriosa sistemica non è cambiata in nessun gruppo. La valutazione della pressione sistolica del ventricolo rosso nei topi a torace chiuso è una sfida a causa della complessa anatomia del ventricolo rosso.
Gli sperimentatori devono evitare tentativi prolungati e ripetuti di cateterismo ventricolare rosso. La nostra procedura di dosaggio giugulare e bolo può essere utilizzata per lo screening di composti per lo sviluppo di farmaci in qualsiasi modello murino di malattia. Possiamo utilizzare la radice IV della piattaforma di somministrazione del composto per sviluppare un trattamento per l'ipertensione arteriosa polmonare.
