Name: transcutaneous assessment of renal function in conscious rodents
Uploaded: 2016-03-26T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 18 s
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ZHP was supported by the Marie-Curie project: NephroTools.

esperimenti necessari per sviluppare il protocollo sono stati eseguiti secondo le normative nazionali ed è stato approvato dal comitato etico della scienza locale (Regierungspräsidium Karlsruhe). 1. Preparazione di FITC-sinistrin soluzione per l&#39;iniezione <ol><li> Sciogliere FITC-sinistrin in soluzione salina fisiologica per preparare una soluzione madre. La dose raccomandata nei topi è di 7,5 mg / 100 g di peso corporeo (BW), mentre nei ratti 5 mg / 100 g BW FITC-sinistrin è preferibile. Per i topi, preparare una soluzione di soluzione FITC-sinistrin a 15 mg / ml, mentre per i ratti preparare a una concentrazione di 40 mg / ml. Nota: Soluzione FITC-sinistrin può essere preparato in anticipo e conservati a -20 ° C al riparo dalla luce. </li></ol> 2. Preparazione degli animali <ol><li> Acclimatare animali per almeno una settimana prima della loro introduzione in ogni esperimento. </li><li> Anestetizzare l&#39;animale utilizzando 5% isoflurano a 5 l / min O 2 </sub&gt; Flusso per 2 minuti. </li><li> Verificare che l&#39;animale sia adeguatamente anestetizzato osservando il suo respiro, che diventa più lenta e profonda, e verificare assenza di reazione con una mancanza di una risposta dito del piede. </li><li> Una volta che l&#39;animale è addormentato, ridurre l&#39;anestesia al 2,5% isoflurano a 2 L / min O 2 portata e prendere il BW. </li><li> Rimuovere il pelo dal fianco del dorso dell&#39;animale con un rasoio elettrico. Radere una superficie leggermente più grande l&#39;area che verrà occupata dal cerotto biadesivo, che ha dimensioni di 3 cm x 6 cm. </li><li> Successivamente applicare la crema depilazione per un breve periodo (2-3 min) per rimuovere il pelo rimanente. </li><li> Lavare accuratamente l&#39;area fino a quando la crema è stato completamente rimosso, come la crema in sé può essere fluorescente. Nota: Evitare di graffiare la pelle dell&#39;animale in quanto può produrre irritazione / edema. Se l&#39;area depilata mostra la pigmentazione della pelle, radere un&#39;area maggiore fino a quando un punto non pigmentato per laparte ottica del dispositivo risulta. Si raccomanda di radersi 24 ore in anticipo per ridurre al minimo l&#39;esposizione all&#39;anestesia. </li></ol> 3. Dispositivo Preparazione <ol><li> Posizionare il dispositivo ottico per misurare la funzione renale su un lato del cerotto biadesivo, posizionando la parte ottica sopra la finestra trasparente (Figura 1) lasciando la parte opposta con la pellicola protettiva. Nota: Quando si lavora con piccoli roditori, ridurre le dimensioni del patch come mostrato nella Figura 2. </li><li> Attaccare un pezzo di cerotto biadesivo di dimensione corrispondente alla batteria come illustrato in figura 3. </li></ol> 4. Fissaggio del dispositivo sull&#39;animale <ol><li> Calcolare il volume appropriato di iniezione in base al peso corporeo dell&#39;animale. </li><li> Anestetizzare l&#39;animale con isoflurano come precedentemente indicato sezioni 2.1-2.3. </li><li> Tagliare un pezzo di garza tubolare elastico benda of circa 1 cm di lunghezza superiore alla larghezza del cerotto biadesivo da utilizzare. </li><li> Estrarre il bendaggio elastico della garza sulla testa dell&#39;animale e posto sulla schiena, lasciando la zona rasata scoperto. Nota: In alternativa, fissare il dispositivo utilizzando solo nastro adesivo, ma essere consapevoli di indebite pressioni sul dispositivo. </li><li> Collegare la batteria al dispositivo inserendo la spina della batteria alla porta corrispondente sul dispositivo. Dopo che rimuovere il foglio protettivo dal pezzo di cerotto e montare la batteria sulla superficie superiore del dispositivo (Figura 4A). Assicurarsi che la batteria sia collegato correttamente controllando che il dispositivo inizia a lampeggiare. Nota: Nei ratti, la batteria può essere anche fissato direttamente sul cerotto, accanto al dispositivo (Figura 4B). </li><li> Rimuovere la protezione dal cerotto con il dispositivo di azionamento e posizionarlo sulla zona rasata sul dorso dell&#39;animale tenendolos bordi finché non viene risolta correttamente. </li><li> Coprire il dispositivo con il tubolare benda di garza elastica aderente alla superficie adesiva del cerotto (Figura 5). </li><li> Correttamente allungare la benda tubolare sull&#39;addome dell&#39;animale, garantendo che gli arti possono muoversi liberamente. </li><li> Per una fissazione e protezione del dispositivo migliore, applicare una striscia di nastro adesivo seguendo la forma del dispositivo e che copre i fili della batteria. </li><li> Misurare sfondo per 1 a 3 min, senza mettere pressione sul dispositivo </li></ol> 5. FITC-sinistrin Amministrazione e Procedura di misurazione <ol><li> Se necessario, riscaldare la coda dell&#39;animale con acqua calda prima iniezione o una piastra riscaldante a temperatura controllata lungo tutto il procedimento. </li><li> Iniettare attraverso vena della coda il volume appropriato di soluzione FITC-sinistrin magazzino. Il volume di iniezione dipende BW animali e, pertanto, deve essere calcolato per ogni singolo considering la dose desiderata e la concentrazione di soluzione di riserva, già citato nel paragrafo 1.1. </li><li> Assicurarsi che tutta la soluzione FITC-sinistrin viene somministrato per via endovenosa e non per via sottocutanea. Nota: In alternativa, coniugati con sinistrin può essere somministrato tramite un catetere endovenoso pre-impiantato uscito alla nuca nei roditori o tramite iniezione orbitale retrò nei topi. </li><li> Cautela, restituire l&#39;animale a sua gabbia casa evitando forti movimenti e qualsiasi pressione sul dispositivo, come sarebbe introdurre artefatti di movimento. </li><li> Posizionare la gabbia casa in un luogo tranquillo per evitare che l&#39;animale è disturbato. </li><li> Eseguire la misurazione per almeno 1 ora se si lavora con i topi e 2 ore quando si usa ratti. Durante questo periodo, il dispositivo ottico misurerà attraverso la pelle la fluorescenza emessa da FITC-sinistrin. Nota: Durante il periodo di registrazione l&#39;animale deve essere ospitati solo. Inoltre approvvigionamento idrico, nonché sporgentistrutture come i coperchi filo, devono essere rimossi per evitare di danneggiare i dispositivi e di movimento artefatti elettronici a causa di urti con oggetti. </li></ol> Rimozione 6. Dispositivo <ol><li> Una volta che il periodo di registrazione è finita, rimuovere il dispositivo senza anestesia; tuttavia, se necessario, anestetizzare l&#39;animale brevemente sotto 5% isoflurano a 5 l / min O 2 tasso di consegna durante la 2 min. </li><li> Con cautela, tirare fuori il nastro adesivo, poi la benda tubolare. </li><li> staccare delicatamente il cerotto biadesivo dalla pelle e restituire l&#39;animale al suo normale gabbia casa. </li></ol> 7. Leggi di dati <ol><li> Scollegare la batteria dal dispositivo e rimuovere la patch adesivo. Nota: I dati vengono memorizzati sul dispositivo fino a quando inizia una nuova misurazione. Quando è collegato una batteria i dati memorizzati vengono sovrascritti con le nuove registrazioni. Pertanto, non ricollegare la batteria prima di scaricare i dati daldispositivo. Vi è un periodo di grazia di 10 secondi destinato a reconnections accidentali della batteria. </li><li> Collegare il dispositivo a un PC utilizzando un cavo micro USB e scaricare i dati utilizzando il software in dotazione. Il file di output è un file .csv che può essere aperto e modificato con un programma di foglio di calcolo. </li><li> Aprire il file di dati con il software specifico per il dispositivo ottico e generare la curva cinetica di eliminazione utilizzando i protocolli software. </li><li> Analizzare la curva seguendo le istruzioni fornite con il dispositivo ottico. Poco, per la valutazione dei dati, impostare il segnale di fondo misurata prima somministrazione FITC-sinistrin e segnare l&#39;inizio della fase di escrezione esponenziale del marcatore, che di solito avviene 15 min e 45 min dopo l&#39;iniezione del bolo, in topi e ratti rispettivamente . Nota: il software visualizza automaticamente la FITC-sinistrin emivita (t 1/2) con un valore di R 2, determinato da un 1-Comparmodello di tment. t 1/2 può essere utilizzato per calcolare il GFR utilizzando un fattore di conversione 9,10. </li></ol>

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NG detiene un brevetto sulla produzione di FITC-sinistrin.

Il presente lavoro descrive la procedura per determinare la funzione renale nei roditori coscienti utilizzando un dispositivo miniaturizzato ed il esogeno marcatore renale FITC-sinistrin. Come detto prima, questo metodo presenta diversi vantaggi rispetto ai procedimenti tradizionali di passaggio urinario e plasma. Uno di questi è l&#39;indipendenza dal sangue e nelle urine di campionamento che porta a grandi risparmi in termini di consumo, tempo e, naturalmente, stress animale. Come mostrato nella Tabella 2, il esogeno marcatore renale FITC-sinistrin e la misurazione della cinetica di eliminazione attraverso la pelle permettono l&#39;impatto delle patologie renali sulla funzione renale da studiare 9,10,14-18. La raccolta di serie di campioni di sangue necessarie per valutare la clearance plasmatica o biomarcatori di malattia renale sono stressante per l&#39;animale, ingombrante e in termini di tempo per i ricercatori. Pertanto, le misure sequenziali all&#39;interno dello stesso animale sono stati limdisattivato da il benessere degli animali e motivi metodologici. La riproducibilità dimostrato all&#39;interno animale della misura transcutanea 13 lo rende un metodo ideale per rilevare i cambiamenti nella funzione renale a causa di progressione della malattia o invecchiamento. Per la stessa ragione, può anche essere estremamente utile per studiare l&#39;efficacia di approcci terapeutici. Due passaggi critici per il successo applicazione di questa tecnologia sono la fissazione del dispositivo ottico sull&#39;animale e la corretta gestione del marcatore. Il dispositivo deve essere opportunamente fissato al fine di evitare artefatti di movimento. A tal fine, impedendo l&#39;attacco e il distacco del cerotto biadesivo è fondamentale in quanto può portare alla perdita delle sue proprietà adesive e in definitiva una fissazione contenuti sull&#39;animale. Come accennato nel protocollo, l&#39;immobilizzazione e la protezione del dispositivo ottico coprendolo con del nastro adesivo è un approccio efficace per garantire un Adequate fissazione. Quando si esegue l&#39;iniezione in bolo FITC-sinistrin è fondamentale per gestire tutta la sostanza per via endovenosa e non per via sottocutanea. Il rilascio del marcatore nel tessuto sottocutaneo può essere facilmente identificato da un anello giallo che circonda la coda dell&#39;animale prodotto dal proprio colore di FITC-sinistrin. Una iniezione sottocutanea si manifesta in genere come una curva più piatta e il tempo marcatore escrezione prolungata. L&#39;eventuale limitazione di questo metodo è più legato al marcatore usato rispetto alla tecnologia in sé. Quando un edema è presente nella pelle di un animale, non sarebbe raccomandato la valutazione transcutanea della funzione renale, in quanto vi è un vano aggiuntivo che potrebbe alterare le dinamiche di escrezione di FITC-sinistrin. Allo stesso modo, la pelle pigmentata può limitare l&#39;uso della tecnica dovuta alla sovrapposizione di eccitazione ed emissione spettri di FITC-sinistrin e melanina. Tuttavia, in animali con pigmentazione cutanea a chiazze, il problema è risolto posizionando l&#39;otticaparte del dispositivo in una zona non pigmentato. È possibile modificare diversi aspetti della valutazione transcutanea della funzione renale in modo da adattare la procedura per diverse specie animali e / o approcci. Per esempio, il dosaggio FITC-sinistrin raccomandati o la lunghezza della misura può essere regolata a seconda dell&#39;obiettivo dell&#39;esperimento e di specie diverse o modelli animali. Questa adattabilità del metodo è già stata confermata dalla sua applicazione di successo in diverse specie di roditori e diversi tipi di ceppi con condizioni di salute diverse. Inoltre, la valutazione transcutanea della funzione renale è stato recentemente validato in cani e gatti 12 con ottimi risultati. A causa delle differenze indubbie tra questi animali e roditori, questo studio ha determinato la dose appropriata di FITC-sinistrin per entrambi, cani e gatti, ed è eseguito un tempo molto più lungo di misura, 4 ore invece di 1 o 2 ore di usod nei roditori. Presi insieme, l&#39;uso di questa tecnica ci può aiutare a ottenere informazioni più precise in nefrologia, tra cui una migliore comprensione della progressione della malattia renale e l&#39;effetto delle terapie. Le caratteristiche della valutazione transcutanea della funzione renale pone come una tecnica adatta per essere applicata in campo clinico umano e veterinario nel futuro, e devono essere considerati come una tecnologia promettente per sostituire gli approcci tradizionali.

velocità di filtrazione glomerulare (GFR) è il miglior parametro per valutare la funzione renale complessiva. Il gold standard per determinare GFR si basa sulla clearance urinaria o plasma di marcatori renali esogeni, come inulina 1. Tuttavia, queste procedure sono molto tempo e complicate, che richiedono la raccolta di sangue serie e / o campioni di urina e test di laboratorio posteriori per l&#39;analisi. Inoltre, questi metodi sono invasivi e stressante per gli animali, limitando il numero di volte e la frequenza in cui le misurazioni possono essere ripetute. Un certo numero di approcci alternativi sono stati sviluppati per semplificare le procedure classiche per determinare GFR, ma ancora contare su urine e nel plasma di campionamento 2-4 e / o richiedere l&#39;anestesia profonda 5,6, che è noto per influenzare l&#39;emodinamica e la funzione renale 7, 8. Prodotti finali del metabolismo, come creatinina, sono anche ampiamente utilizzati per stimare la funzione renale. Tuttavia, è noto che il AccurACY di questi marcatori endogeni non è ottimale e, inoltre, per analizzarli, urine o il prelievo di sangue è anche indispensabile. Qui si descrive una metodologia transcutanea per valutare la funzione renale in animali coscienti. Questo metodo è più semplice e più veloce rispetto ai metodi tradizionali e solo minimamente invasiva. Con questa tecnica, utilizzando un dispositivo ottico miniaturizzato e -sinistrin esogeno renale marcatore fluoresceina isotiocianato (FITC), è possibile determinare la funzione renale quasi in tempo reale senza la necessità di plasma o campionamento urine e senza cateterizzazione chirurgico per somministrazione della sostanza. Grazie a queste caratteristiche, il metodo è adatto per effettuare misurazioni sequenziali nello stesso animale. FITC-sinistrin è un marcatore renale liberamente filtrato dal glomerulo, senza riassorbimento tubulare e secrezione. La parte ottica del dispositivo miniaturizzato costituito da due diodi emettitori di luce (LED), che eccitanoil marcatore somministrato e un fotodiodo per rilevare la fluorescenza emessa attraverso la pelle. I dati registrati vengono memorizzati nella memoria interna integrata nel dispositivo e possono essere utilizzati per generare la cinetica di eliminazione curva di FITC-sinistrin. L&#39;alimentazione è fornita da una piccola batteria al litio ricaricabile. Per informazioni più dettagliate sul dispositivo e dei suoi singoli componenti fare riferimento alla Schreiber et al. 9. Il dispositivo è facilmente montato sul corpo animale con un cerotto biadesivo trasporta una finestra trasparente per i componenti ottici. I risultati sono prontamente disponibili dopo il periodo di registrazione è finita. Con il metodo e protocollo fornito qui, si introduce una tecnologia promettente che potrebbe sostituire l&#39;attuale gold standard per determinare GFR, non solo nella ricerca, ma anche in campo clinico.

<table><tbody><tr><td>NIC-Kidney device</td><td>Mannheim Pharma &amp;amp; Diagnostics GmbH</td><td></td><td>Software, batteries and chargers are provided together with the device/s. Orderings should be done through info@mapdiagnostics.com</td></tr><tr><td>FITC-sinistrin</td><td>Mannheim Pharma &amp;amp; Diagnostics GmbH</td><td></td><td>Orderings should be done through info@mapdiagnostics.com</td></tr><tr><td>Double-sided adhesive patch</td><td>Mannheim Pharma &amp;amp; Diagnostics GmbH</td><td></td><td>Orderings should be done through info@mapdiagnostics.com</td></tr><tr><td>Isis Rodent electric shaver</td><td>Braun Aesculap&amp;nbsp;</td><td>GT420</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Abbott GmbH&amp;nbsp;</td><td>PZN4831850</td><td></td></tr><tr><td>Leukosilk adhesive tape</td><td>BSN medical</td><td>102200</td><td></td></tr><tr><td>Tubular elastic gauze bandage&amp;nbsp;</td><td>MaiMed Medical GmbH</td><td>73012</td><td>There are different sizes available. Size 1 is recommended for mice.</td></tr><tr><td>Veet depilation cream</td><td>Reckitt Benckiser</td><td>PZN7768307</td><td>Sensitive skin formulation is recommended as is more gentle with the skin of the animals</td></tr><tr><td>Micro USB cable</td><td>Samsung</td><td>APCBU10BBE</td><td></td></tr><tr><td>Deltajonin Physiologic solution</td><td>AlleMan Pharma GmbH</td><td>3366954</td><td>Alternatively, it can be used saline or PBS&amp;nbsp;</td></tr></tbody></table>

transcutaneous assessment of renal function in conscious rodents

Glomerular filtration rate (GFR) is the gold standard to assess overall kidney function. However, traditional methods to evaluate GFR are cumbersome and time-consuming. In addition, serial blood or urine samples are required, with the associated stress for the experimental animals. A recent technique significantly reduces the investment in time and resources, minimizing the invasiveness and the animal stress, but being equally valid as the traditional approaches. The method measures transcutaneously renal function. Using an optical device and the exogenous renal marker fluorescein isothiocyanate (FITC)-sinistrin, this technique is capable of measuring the elimination kinetics of the marker through the skin. With neither blood nor urine samples nor the associated laboratory assays needed, the results of the transcutaneous measurement are almost instantaneously available. The method has been already validated in different species and successfully applied in several models of renal pathology. Moreover, due to its minimally invasive characteristics, it is suitable for sequential measurements within the same animal. Here is provided a detailed protocol to carry out the transcutaneous assessment of renal function in rodents.

La configurazione della misurazione transcutanea è molto semplice e veloce: il dispositivo è posto sul cerotto biadesivo (Figura 1) e regolata in dimensioni se necessario (Figura 2), la batteria è disposta (figura 3) e connesso (Figura 4). Questo metodo per valutare la funzionalità renale è già stato validato in diverse specie in confronto con l&#39;approccio tradizionale della clearance plasmatica 9,11,12. Seguendo il protocollo qui esposta, Schreiber et al. dimostrato la validità della tecnica in diversi modelli murini, mostrando risultati molto simili tra la misurazione e clearance plasmatica transcutanea per tutti i gruppi studiati (Tabella 1) 9. In questo lavoro la t ottenuto 1/2 è stato convertito in GFR utilizzando un mouse specifico di conversione semi-empiricafattore. La consistenza della valutazione transcutanea della funzione renale è stata anche dimostrata utilizzando diversi ceppi di topi. Misurazioni sequenziali entro 3 giorni, nello stesso animale ha mostrato un coefficiente delle varianze di 3,0-6,2% 13. In questo studio non vi era alcuna conversione di GFR, ma i risultati sono stati espressi ed interpretati direttamente in termini di t 1/2. La possibilità di avere i risultati quasi in tempo reale è uno dei grandi vantaggi di questo metodo. Dopo il periodo di registrazione, i risultati sono immediatamente disponibili per l&#39;analisi e il software fornito visualizza la curva escrezione di FITC-sinistrin istantaneamente (Figura 6). Entro lo stesso software t 1/2 di FITC-sinistrin può essere ottenuta, che può essere utilizzato direttamente come parametro per valutare la funzione renale di convertito in termini di GFR. Figura 7 </strong&gt; mostra come appare la curva di escrezione FITC-sinistrin misurata transcutanea in un animale con insufficienza renale. Quando la funzione renale è influenzato, coniugati con sinistrin t 1/2 aumenta a causa della ridotta escrezione della sostanza e l&#39;aspetto dei cambiamenti curva. In genere, la curva misurata non torna al livello di fondo e presenta una superficie maggiore sotto la curva. Nello stesso animale, misurazione da pre a post-infortunio possono sperimentare un aumento dell&#39;intensità massima di fluorescenza a causa di accumulo del marcatore causato dalla sua escrezione ridotta. In presenza di insufficienza renale, la curva transcutanea misurata di FITC-sinistrin può mostrare uno stato di equilibrio a causa di funzione gravemente compromessa (Figura 7B). L&#39;uso del dispositivo miniaturizzato in diversi ceppi di roditori con differente stato sanitario ha dimostrato che questa tecnica è adatto e abbastanza sensibile per rilevare i cambiamenti due alla malattia renale e l&#39;invecchiamento. La tabella 2 mostra una sintesi dei modelli murini studiati fino ad oggi con questo metodo. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/53767/53767fig1.jpg" /> Figura 1. Il posizionamento del dispositivo sul cerotto biadesivo. Il dispositivo è montato sul posizionamento cerotto sua parte ottica nella finestra trasparente. <img alt="figura 2" src="/files/ftp_upload/53767/53767fig2.jpg" /> Figura 2. Adattamento cerotto adesivo per piccole dimensioni roditori. Per uso in piccoli animali si consiglia di ridurre le dimensioni del patch. A: utilizzare il dispositivo come una guida per tagliare la patch correttamente. B: Una volta che la dimensione desiderata è stata ottenuta, il dispositivo può essere disposto sulla superficie adesiva del cerotto. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53767/53767fig2large.jpg" target="_blank">P</a>leasing clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/53767/53767fig3.jpg" /> Figura 3. Preparazione della batteria. Per collegare il dispositivo alla batteria, tagliare un pezzetto di cerotto adesivo su due lati (A e B) e posizionarlo sulla superficie della batteria (C). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53767/53767fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare un grande versione di questa figura.</a> <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/53767/53767fig4.jpg" /> Figura 4. Collegamento e posizionamento della batteria durante la misurazione. (A) In piccoli roditori come topi, a causa dello spazio ridotto, la batteria deve essere collocato sulla parte superiore del dispositivo. (B) In animali più grandi della batteria cun essere posizionato accanto al dispositivo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53767/53767fig4large.jpg" target="_blank">Fai clic qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/53767/53767fig5.jpg" /> Figura 5. Il posizionamento del tubo benda di garza elastica in un topo. Il bendaggio tubolare dovrebbe coprire la patch biadesivo senza interferire con la libera circolazione degli arti per il comfort dell&#39;animale. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53767/53767fig5large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande questa figura.</a> <img alt="Figura 6" src="/files/ftp_upload/53767/53767fig6.jpg" /> Figura 6. immagine rappresentativa di una curva eliminazione di FITC-sinistrin. Il segnale generato dal FITC-sinistrin viene rilevato transcutaneamente e memorizzati nella memoria interna del dispositivo. Quando i dati registrati vengono scaricati su un PC, il software genera una curva simile a quella presentata nell&#39;immagine. Asse Y mostra l&#39;intensità di fluorescenza registrata [AU], emessa dal marcatore FITC-sinistrin iniettata, mentre asse X rappresenta la durata della misurazione nel tempo [min]. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53767/53767fig6large.jpg" target="_blank">Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 7" src="/files/ftp_upload/53767/53767fig7.jpg" /> Figura 7. immagine rappresentante di una curva eliminazione di FITC-sinistrin in animali con insufficienza renale. (A) Curva eliminazione FITC-sinistrin negli animali con ridotta funzionalità renale mostra in genere una maggiore area sotto la curva e l&#39;incapacità di raggiungere la linea di base all&#39;interno del normale periodo di misurazione<html> . (B) In animali gravemente compromessa la curva transcutanea misurata può mostrare uno stato stazionario che indica l&#39;insufficienza renale. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53767/53767fig7large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Tabella 1" src="/files/ftp_upload/53767/53767table1.jpg" /> Tabella 1. La convalida della misura transcutanea confrontando con la clearance plasmatica tradizionale. La misurazione transcutanea della funzione renale è stato convalidato in diversi modelli murini (sana e unilateralmente nephrectomized (UNX C57BL) / 6-129 SV topi e modello murino di nefronoftisi ( PCY)) per confronto con clearance plasmatica. I valori sono medie ± SD. GFR, velocità di filtrazione glomerulare 9. /53767/53767table2.jpg &quot;/&gt; Tabella 2. Modelli murini studiate usando la misura transcutanea UNX, unilateralmente nephrectomized.; ACE, inibitori dell&#39;enzima di conversione; T gumodwt / peso, transgenico uromodulina knockout, SD, Sprague Dawley ratto; PKD, la malattia del rene policistico.

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Transcutaneous Assessment of Renal Function in Conscious Rodents

Determination of glomerular filtration rate (GFR) is the gold standard to assess overall kidney function. However, traditional procedures to measure this parameter are cumbersome and require a large investment of time. Here we describe a faster and minimally invasive method to determinate GFR transcutaneously.

La valutazione transcutanea della funzione renale nei roditori Conscious

Glomerular filtration rate (GFR) is the gold standard to assess overall kidney function. However, traditional methods to evaluate GFR are cumbersome and ...

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Research

JoVE Journal

Medicine

12.4K Views.  Medical Faculty Mannheim, University of Heidelberg. Determination of glomerular filtration rate (GFR) is the gold standard to assess overall kidney function. However, traditional procedures to measure this parameter are cumbersome and require a large investment of time. Here we describe a faster and minimally invasive method to determinate GFR transcutaneously.

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Quantifying Glomerular Permeability of Fluorescent Macromolecules Using 2-Photon Microscopy in Munich Wistar Rats

Kidney diseases involving urinary loss of large essential macromolecules, such as serum albumin, have long been thought to be caused by alterations in the permeability barrier comprised of podocytes, vascular endothelial cells, and a basement membrane working in unison. Data from our laboratory using intravital 2-photon microscopy revealed a more permeable glomerular filtration barrier (GFB) than previously thought under physiologic conditions, with retrieval of filtered albumin occurring in an early subset of cells called proximal tubule cells (PTC)1,2,3.
Previous techniques used to study renal filtration and establishing the characteristic of the filtration barrier involved micropuncture of the lumen of these early tubular segments with sampling of the fluid content and analysis4. These studies determined albumin concentration in the luminal fluid to be virtually non-existent; corresponding closely to what is normally detected in the urine. However, characterization of dextran polymers with defined sizes by this technique revealed those of a size similar to serum albumin had higher levels in the tubular lumen and urine; suggesting increased permeability5.
Herein is a detailed outline of the technique used to directly visualize and quantify glomerular fluorescent albumin permeability in vivo. This method allows for detection of filtered albumin across the filtration barrier into Bowman's space (the initial chamber of urinary filtration); and also allows quantification of albumin reabsorption by proximal tubules and visualization of subsequent albumin transcytosis6. The absence of fluorescent albumin along later tubular segments en route to the bladder highlights the efficiency of the retrieval pathway in the earlier proximal tubule segments. Moreover, when this technique was applied to determine permeability of dextrans having a similar size to albumin virtually identical permeability values were reported2. These observations directly support the need to expand the focus of many proteinuric renal diseases to included alterations in proximal tubule cell reclamation.

A technique utilizing high resolution intavital 2-photon microscopy to directly visualize and quantify gloemrular filtration in surface glomeruli. This method allows for direct determination of permeability characteristics of macromolecules in both normal and diseased states.

Quantificare permeabilità glomerulare delle Macromolecole fluorescenti usando la microscopia a due fotoni a Monaco di Baviera ratti Wistar

Kidney  diseases involving urinary loss of large essential macromolecules, such as  serum albumin, have long been thought to be caused by alterations in ...

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Early Detection of Drug-Induced Renal Hemodynamic Dysfunction Using Sonographic Technology in Rats

The kidney normally functions to maintain hemodynamic homeostasis and is a major site of damage caused by drug toxicity. Drug-induced nephrotoxicity is estimated to contribute to 19- 25% of all clinical cases of acute kidney injury (AKI) in critically ill patients. AKI detection has historically relied on metrics such as serum creatinine (sCr) or blood urea nitrogen (BUN) which are demonstrably inadequate in full assessment of nephrotoxicity in the early phase of renal dysfunction. Currently, there is no robust diagnostic method to accurately detect hemodynamic alteration in the early phase of AKI while such alterations might actually precede the rise in serum biomarker levels. Such early detection can help clinicians make an accurate diagnosis and help in in decision making for therapeutic strategy. Rats were treated with Cisplatin to induce AKI. Nephrotoxicity was assessed for six days using high-frequency sonography, sCr measurement and upon histopathology of kidney. Hemodynamic evaluation using 2D and Color-Doppler images were used to serially study nephrotoxicity in rats, using the sonography. Our data showed successful drug-induced kidney injury in adult rats by histological examination. Color-Doppler based sonographic assessment of AKI indicated that resistive-index (RI) and pulsatile-index (PI) were increased in the treatment group; and peak-systolic velocity (mm/s), end-diastolic velocity (mm/s) and velocity-time integral (VTI, mm) were decreased in renal arteries in the same group. Importantly, these hemodynamic changes evaluated by sonography preceded the rise of sCr levels. Sonography-based indices such as RI or PI can thus be useful predictive markers of declining renal function in rodents. From our sonography-based observations in the kidneys of rats that underwent AKI, we showed that these noninvasive hemodynamic measurements may consider as an accurate, sensitive and robust method in detecting early stage kidney dysfunction. This study also underscores the importance of ethical issues associated with animal use in research.

Early stage hemodynamic dysfunction is critical to the development of kidney disease. Yet, detection methodologies are limited. Recent advances in sonography provide a noninvasive, accurate option for early detection of kidney injury. This study outlines a step-by-step, sonographic methodology for detecting kidney dysfunction using a drug-induced nephrotoxicity rat model.

La diagnosi precoce del farmaco-indotta renale emodinamica erettile Utilizzando ecografica Technology di ratti

The kidney normally functions to maintain hemodynamic homeostasis and is a major site of damage caused by drug toxicity. Drug-induced nephrotoxicity is ...

Novel Approach for Simultaneous Recording of Renal Sympathetic Nerve Activity and Blood Pressure with Intravenous Infusion in Conscious, Unrestrained Mice.

Renal sympathetic nerves contribute significantly to both physiological and pathophysiological phenomena. Evaluating renal sympathetic nerve activity (RSNA) is of great interest in many areas of research such as chronic kidney disease, hypertension, heart failure, diabetes and obesity. Unequivocal assessment of the role of the sympathetic nervous system is thus imperative for proper interpretation of experimental results and understanding of disease processes. RSNA has been traditionally measured in anesthetized rodents, including mice. However, mice usually exhibit very low systemic blood pressure and hemodynamic instability for several hours during anesthesia and surgery. Meaningful interpretation of RSNA is confounded by this non-physiological state, given the intimate relationship between sympathetic nervous tone and cardiovascular status. To address this limitation of traditional approaches, we developed a new method for measuring RSNA in conscious, freely-moving mice. Mice were chronically instrumented with radio-telemeters for continuous monitoring of blood pressure as well as a jugular venous infusion catheter and custom-designed bipolar electrode for direct recording of RSNA. Following a 48-72 hour recovery period, survival rate was 100% and all mice behaved normally. At this time-point, RSNA was successfully recorded in 80% of mice, with viable signals acquired up to 4 and 5 days post-surgery in 70% and 50% of mice, respectively. Physiological blood pressures were recorded in all mice (116&plusmn;2 mmHg; n=10). Recorded RSNA increased with eating and grooming, as well-established in the literature. Furthermore, RSNA was validated by ganglionic blockade and modulation of blood pressure with pharmacological agents. Herein, an effective and manageable method for clear recording of RSNA in conscious, freely-moving mice is described.

Anesthetized mice exhibit non-physiological systemic blood pressure, which precludes meaningful assessment of autonomic tone given the intimate relationship between blood pressure and the autonomic nervous system. Thus, a novel method to simultaneously record renal sympathetic nerve activity and blood pressure with intravenous infusion in conscious mice is outlined.

Nuovo approccio per la registrazione simultanea di attività simpatica renale del nervo e pressione del sangue con l'infusione endovenosa in consapevole, topi sfrenati.

Renal sympathetic nerves contribute significantly to both physiological and pathophysiological phenomena. Evaluating renal sympathetic nerve activity ...

A High-throughput Method for Measurement of Glomerular Filtration Rate in Conscious Mice

The measurement of glomerular filtration rate (GFR) is the gold standard in kidney function assessment. Currently, investigators determine GFR by measuring the level of the endogenous biomarker creatinine or exogenously applied radioactive labeled inulin (3H or 14C). Creatinine has the substantial drawback that proximal tubular secretion accounts for ~50% of total renal creatinine excretion and therefore creatinine is not a reliable GFR marker. Depending on the experiment performed, inulin clearance can be determined by an intravenous single bolus injection or continuous infusion (intravenous or osmotic minipump). Both approaches require the collection of plasma or plasma and urine, respectively. Other drawbacks of radioactive labeled inulin include usage of isotopes, time consuming surgical preparation of the animals, and the requirement of a terminal experiment. Here we describe a method which uses a single bolus injection of fluorescein isothiocyanate-(FITC) labeled inulin and the measurement of its fluorescence in 1-2 &mu;l of diluted plasma. By applying a two-compartment model, with 8 blood collections per mouse, it is possible to measure GFR in up to 24 mice per day using a special work-flow protocol. This method only requires brief isoflurane anesthesia with all the blood samples being collected in a non-restrained and awake mouse. Another advantage is that it is possible to follow mice over a period of several months and treatments (i.e. doing paired experiments with dietary changes or drug applications). We hope that this technique of measuring GFR is useful to other investigators studying mouse kidney function and will replace less accurate methods of estimating kidney function, such as plasma creatinine and blood urea nitrogen.

Measurement of glomerular filtration rate (GFR) is the gold standard for kidney function assessment. Here we describe a high-throughput method which allows the determination of GFR in conscious mice by using a single bolus injection, determination of fluorescein isothiocyanate (FITC)-inulin in plasma and calculation of GFR by a two-phase exponential decay model.

Un metodo ad alta velocità per la misura della velocità di filtrazione glomerulare in topi coscienti

The measurement of  glomerular filtration rate (GFR) is the gold standard in kidney function  assessment. Currently, investigators determine GFR by ...

Biologia

Transdermal Measurement of Glomerular Filtration Rate in Mice

Transdermal analysis of glomerular filtration rate (GFR) is an established technique that is used to assess renal function in mouse and rat models of acute kidney injury and chronic kidney disease. The measurement system consists of a miniaturized fluorescence detector that is directly attached to the skin on the back of conscious, freely moving animals, and measures the excretion kinetics of the exogenous GFR tracer, fluorescein-isothiocyanate (FITC) conjugated sinistrin (an inulin analog). This system has been described in detail in rats. However, because of their smaller size, measurement of transcutaneous GFR in mice presents additional technical challenges. In this paper we therefore provide the first detailed practical guide to the use of transdermal GFR monitors in mice based on the combined experience of three different investigators who have been performing this assay in mice over a number of years.

Here we describe a protocol to measure glomerular filtration rate (GFR) in conscious, freely moving mice using a transdermal GFR monitor.

Transdermico misurazione del tasso di filtrazione glomerulare in topi

Transdermal analysis of glomerular filtration rate (GFR) is an established technique that is used to assess renal function in mouse and rat models of ...

Physiology Lab Demonstration: Glomerular Filtration Rate in a Rat

Measurements of glomerular filtration rate (GFR), and the fractional excretion of sodium (Na) and potassium (K) are critical in assessing renal function in health and disease. GFR is measured as the steady state renal clearance of inulin which is filtered at the glomerulus, but not secreted or reabsorbed along the nephron. The fractional excretion of Na and K can be determined from the concentration of Na and K in plasma and urine. The renal clearance of inulin can be demonstrated in an anesthetized animal which has catheters in the femoral artery, femoral vein and bladder. The equipment and supplies used for this procedure are those commonly available in a research core facility, and thus makes this procedure a practical means for measuring renal function. The purpose of this video is to demonstrate the procedures required to perform a lab demonstration in which renal function is assessed before and after a diuretic drug. The presented technique can be utilized to assess renal function in rat models of renal disease.

The purpose of this protocol is to demonstrate the principles and techniques for measuring and calculating glomerular filtration rate, urine flow rate, and excretion of sodium and potassium in a rat. This demonstration can be used to provide students with an overall conceptual understanding of how to measure renal function.

Fisiologia Lab Dimostrazione: filtrazione glomerulare in un ratto

Measurements of glomerular filtration rate (GFR), and the fractional excretion of sodium (Na) and potassium (K) are critical in assessing renal function ...

Use of Enzymatic Biosensors to Quantify Endogenous ATP or H2O2 in the Kidney

Enzymatic microelectrode biosensors have been widely used to measure extracellular signaling in real-time. Most of their use has been limited to brain slices and neuronal cell cultures. Recently, this technology has been applied to the whole organs. Advances in sensor design have made &#160;possible the measuring of&#160;cell signaling in blood-perfused in vivo kidneys. The present protocols list the steps needed to measure ATP and H2O2 signaling in the rat kidney interstitium. Two separate sensor designs are used for the ex vivo and in vivo protocols. Both types of sensor&#160;are coated with&#160;a thin enzymatic biolayer on top of a permselectivity layer to give fast responding, sensitive and selective biosensors. The permselectivity layer protects the signal from the interferents in biological tissue, and the enzymatic layer utilizes&#160;the sequential catalytic reaction of glycerol kinase and glycerol-3-phosphate oxidase in the presence of ATP to produce H2O2. The set of sensors used for the ex vivo studies further detected analyte by oxidation of H2O2 on a platinum/iridium (Pt-Ir) wire electrode. The sensors for the&#160;in vivo studies are instead based on the reduction of H2O2 on a mediator coated gold electrode designed for blood-perfused tissue. Final concentration changes&#160;are detected by real-time amperometry followed by calibration to known concentrations of analyte. Additionally, the specificity of the amperometric signal can be confirmed by the addition of enzymes such as catalase and apyrase that break down H2O2 and ATP correspondingly. These sensors also rely heavily on accurate calibrations before and after each experiment. The following two protocols establish the study of real-time detection of ATP and H2O2 in kidney tissues, and can be further modified to extend the described method for use in other biological preparations or whole organs.

Use of Enzymatic Biosensors to Quantify Endogenous ATP or H2O2 in the Kidney

Enzymatic microelectrode biosensors enable real-time measurements of extracellular cell signaling in biologically-relevant concentrations. The following protocols extend the applications of biosensors to the ex vivo and in vivo detection of ATP and H2O2 in the kidney.

L&#39;utilizzo di biosensori enzimatica per quantificare endogena ATP o H<sub&gt; 2</sub&gt; O<sub&gt; 2</sub&gt; Nel rene

Enzymatic microelectrode biosensors have been widely used to measure extracellular signaling in real-time. Most of their use has been limited to brain ...

Long-Term Continuous Measurement of Renal Blood Flow in Conscious Rats

The kidneys play a crucial role in maintaining the homeostasis of body fluids. The regulation of renal blood flow (RBF) is essential to the vital functions of filtration and metabolism in kidney function. Many acute studies have been carried out in anesthetized animals to measure RBF under various conditions to determine mechanisms responsible for the regulation of kidney perfusion. However, for technical reasons, it has not been possible to measure RBF continuously (24 h/day) in unrestrained unanesthetized rats over prolonged periods. These methods allow the continuous determination of RBF over many weeks while also simultaneously recording blood pressure (BP) with implanted catheters (fluid-filled or by telemetry). RBF monitoring is carried out with rats placed in a circular servo-controlled rat cage that enables the unrestrained movement of the rat throughout the study. At the same time, the tangling of cables from the flow probe and arterial catheters is prevented. Rats are first instrumented with an ultrasonic flow probe placement on the left renal artery and an arterial catheter implanted in the right femoral artery. These are routed subcutaneously to the nape of the neck, and connected to the flowmeter and pressure transducer, respectively, to measure RBF and BP. Following surgical implantation, rats are immediately placed in the cage to recover for at least one week and stabilize the ultrasonic probe recordings. Urine collection is also feasible in this system. The surgical and post-surgical procedures for continuous monitoring are demonstrated in this protocol.

The present protocol describes a long-term continuous measurement of renal blood flow in conscious rats and simultaneously recording blood pressure with implanted catheters (fluid-filled or by telemetry).

Misurazione continua a lungo termine del flusso sanguigno renale nei ratti coscienti

The kidneys play a crucial role in maintaining the homeostasis of body fluids. The regulation of renal blood flow (RBF) is essential to the vital ...

Transdermal Measurement of Glomerular Filtration Rate in Mechanically Ventilated Piglets

Transdermal measurement of glomerular filtration rate (GFR) has been used to evaluate kidney function in conscious animals. This technique is well established in rodents to study acute kidney injury and chronic kidney disease. However, GFR measurement using the transdermal system has not been validated in pigs, a species with a similar renal system to humans. Hence, we investigated the effect of sepsis on transdermal GFR in anesthetized and mechanically ventilated neonatal pigs. Polymicrobial sepsis was induced by cecal ligation and puncture (CLP). The transdermal GFR measurement system consisting of a miniaturized fluorescence sensor was attached to the pig's shaved skin to determine the clearance of fluorescein-isothiocyanate (FITC) conjugated sinistrin, an intravenously injected GFR tracer. Our results show that at 12 h post-CLP, serum creatinine increased with a decrease in GFR. This study demonstrates, for the first time, the utility of the transdermal GFR approach in determining renal function in mechanically ventilated, neonatal pigs.

Glomerular filtration rate (GFR) is the ideal marker for assessing kidney function. However, the standard measurement method using inulin injection with serial blood and urine analysis is impractical. This article delineates a practical method to measure GFR transdermally in piglets.

Misurazione transdermica della velocità di filtrazione glomerulare nei suinetti ventilati meccanicamente

Transdermal measurement of glomerular filtration rate (GFR) has been used to evaluate kidney function in conscious animals. This technique is well ...

Cystometric and External Urethral Sphincter Measurements in Awake Rats with Implanted Catheter and Electrodes Allowing for Repeated Measurements

Lower urinary tract function is mainly assessed by means of cystometric bladder function analysis in rodents. Conventional cystometries are usually performed as terminal analysis under urethane anesthesia. It is well known that anesthetic drugs can influence bladder function. Hence, the aim of this technique is to perform cystometric measurements of the urinary bladder and external urethral sphincter in lightly restrained awake rats. For this purpose, a bladder catheter is implanted into the bladder dome. Subsequently, two electrodes are implanted bilateral to the external urethral sphincter and a ground electrode is sutured to a non-responsive skeletal muscle. The bladder catheter and the three electrodes are finally tunneled subcutaneously to the neck region and affixed to a harness. With this technique, the lower urinary tract can be measured at multiple time points in the same animal to assess lower urinary tract function. The main application of this technique is the follow-up of simultaneous urinary bladder and external urethral sphincter function in awake healthy rats and after induction of a disease or injury. Moreover, subsequent lower urinary tract monitoring can be performed during evaluation of the disease/injury and to monitor treatment efficacy.

This protocol first describes the surgical procedure of the permanent implantation of a urinary bladder catheter combined with external urethral sphincter electrodes, and second, the measurement of the function of the urinary bladder and external urethral sphincter in implanted awake animals.

Cistometrici ed esterni misure dello sfintere uretrale in ratti svegli con catetere impiantato ed elettrodi consentendo misurazioni ripetute

Lower urinary tract function is mainly assessed by means of cystometric bladder function analysis in rodents. Conventional cystometries are usually ...