Un protocollo fornisce un modello semplice per valutare l'integrità sinaptica in modo dipendente dall'età. Quindi possiamo studiare le malattie neurodegenerative nei tessuti che sono suscettibili sia all'analisi strutturale che a quella funzionale. Questa tecnica facilita la conservazione del tessuto neuronale e muscolare dalle giunzioni neuromuscolari muscolari longitudinali dorsali.
Per indagare in modo completo la funzione sinaptica nel tempo e i tessuti difficili da lavorare. Questo metodo può essere applicato allo studio di malattie neurodegenerative tra cui SS, Parkinson, Huntington e morbo di Alzheimer. Prima di iniziare la dissezione tagliare circa 10 millimetri dalla punta di una pipetta da 200 microlitri.
Dopo aver somministrato l'anestesia, gioca da sei a 10 mosche in una piastra di Petri di sei centimetri contenente il 70% di etanolo e usa un pennello per sorseggiare delicatamente unire ogni mosca. Dopo uno o due minuti, utilizzare le forcep per trasferire una mosca per le gambe o le ali su una piastra di dissezione rivestita in elastomero in silicone contenente da sette a 10 millilitri di PBS al microscopio sezionato. Con la mosca sommersa nel PBS, usa le forcette contundenti Dumont numero cinque per rimuovere con cura le ali e utilizzare span una forbice di dissezione a molla a bordo dritto per fare una piccola incisione nel lato ventrale della cuticola per rimuovere le gambe.
Tenendo le forbici di dissezione in una mano e le forcette smussate nell'altra, posizionare il lato ventrale della mosca verso l'alto e tenere il campione in posizione con le forcep, rimuovere la testa e l'addome con le forbici. Utilizzare una pipetta da 200 microlitri impostata su 40 microlitri e la punta della pipetta modificata per raccogliere i toraci e posizionare i campioni di tessuto isolati in un tubo opportunamente etichettato contenente 900 microlitri di PBS e 150 microlitri di formaldeide al 32%. Dopo 30 minuti a temperatura ambiente, utilizzare una pipetta Pasteur per rimuovere il fissatore e risciacquare i strati tre volte con 1,5 millilitri di PBS per lavaggio.
Prima di iniziare le bisezioni Don guanti protettivi criogenici e occhiali di sicurezza e riempire un pallone turistico con azoto liquido. Usa un demolitore di lame per afferrare una lama di piume con un angolo e piegare la lama per rompere un piccolo pezzo. Utilizzare l'interruttore a lama per bloccare la lama in posizione e utilizzare una pipetta Pasteur in vetro per rimuovere tutto il PBS dai tubi campione.
Utilizzare pinzette criogeniche per immergere i tubi nel pallone di azoto liquido. Dopo 10 secondi, utilizzare una pipetta Pasteur per aggiungere circa 300 microlitri di PBS ghiacciato a ciascun tubo sul ghiaccio e posizionare un povero lato ventrale dell'ascia su in una piastra di dissezione rivestita di elastomero siliconico di 10 centimetri contenente PBS ghiacciato. Usa una coppia opaca di forcep per posizionare il torace e trovare un paio di forcep, per rimuovere alcuni dei gangli toracici per esporre la linea mediana del torace.
Usando la linea mediana del torace come guida, usa il gioco per fare un taglio superficiale attraverso un terzo del torace e usa le forcep smussate per posizionare il torace con un angolo di 45 gradi. Utilizzare la lama per tagliare direttamente lungo la linea mediana del torace per ottenere due emithoraces e per effettuare con attenzione uno o due tagli per rimuovere il tessuto in eccesso senza danneggiare i muscoli longitudinali dorsali. Quindi posizionare i campioni di tessuto muscolare in un tubo di PBS opportunamente etichettato.
Quando tutti i campioni di torace sono stati bieticati permeabilizzano i tessuti nel tampone di blocco per almeno un'ora a quattro gradi Celsius. Al termine dell'incubazione, il vortice ha preparato al momento la soluzione di macchia strutturale e aggiungere 150 microlitri della macchia a ciascun campione per un'incubazione di due ore su un rotatore a temperatura ambiente al buio. Dopo la colorazione lavare i campioni in PBST e posizionare cinque etichette di rinforzo impilate e tagliate a mezzo millimetro di distanza su uno scivolo al microscopio di vetro.
Utilizzare una punta di micro pipetta modificata per trasferire i Thorace su ogni diapositiva e utilizzare una salvietta da laboratorio per rimuovere eventuali PBST in eccesso. Utilizzare le forcep per disporre i campioni in modo che i Thoraces siano rivolti verso l'alto. Quando i campioni sono correttamente orientati, utilizzare una punta di pipetta da 200 microlitri per applicare 70 microlitri di supporto di montaggio su ogni diapositiva e coprire ogni diapositiva con uno slittamento di copertura.
Quindi utilizzare lo smalto per unghie per rivestire generosamente i bordi esterni del coperchio scivola per ottenere una tenuta completa intorno a ciascun tessuto. Per valutare l'integrità sinaptica. Le giunzioni neuromuscolari possono essere macchiate con perossidasi di rafano e neuroni motori Floe tin in proteina legante il catrame di 43 mutani di Kilodalton hanno colorazione perossidasi da poco o nessun rafano entro il giorno 21, mentre la proteina di tipo selvatico rimane intatta.
Non si osservano differenze visibili nella colorazione muscolare. Oltre alla colorazione strutturale del muscolo longitudinale dorsale, l'etichettatura della giunzione neuromuscolare muscolare longitudinale può anche fornire una valutazione dell'integrità sinaptica con marcatori pre sinaptici e post sinaptici. Si noti che il congelamento flash dell'azoto liquido facilita una bisezione di successo in quanto il tessuto congelato non flash è più suscettibile ai danni durante la dissezione.
Seguendo questa procedura i campioni di conservazione possono essere analizzati con microscopia confocale per misurare uno specifico aspetti della struttura sinaptica.
