Name: trap-rc, translating ribosome affinity purification from rare cell populations of drosophila embryos
Uploaded: 2015-09-10T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 26 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about TRAP-rc, Translating Ribosome Affinity Purification from Rare Cell Populations of Drosophila Embryos at JoVE.com

The authors thank Nicolas Allegre, Maud Peyny and Jean-Philippe Da Ponte for their excellent technical assistance. This work was supported by the Agence Nationale de la Recherche (ANR-JC-CARDIAC-SPE), the INSERM starting grant, ANR ID-CELL-SPE grant, Equipe FRM and the AFM 15845 grant.

1. Fly Line Generation <ol><li> Generare due costrutti differenti. Nel primo costrutto, RpL10A cDNA (ribosomiale proteina subunità L10A) viene clonato a valle di GFP in pUASP-PL-GFP-nter plasmide (versione modificata dal 32). L&#39;uso di un promotore germinale permette un utilizzo più polivalente della linea transgenica. NOTA: Ottenere il secondo costrutto clonando la sequenza di regolamentazione di guida espressione tessuto-specifica del gene slouch monte di GAL4 (TF) utilizzando pPTGAL4 plasmide. </li><li> Iniettare plasmidi separatamente in w 1118 mosche e inserire costrutti in volo genoma mediante inserimento P-elemento (secondo procedura standard) 33. </li><li> Selezionare i trasformanti, al fine di recuperare linee di volo con costrutti su due cromosomi diversi. La linea TRAP finale viene creata combinando queste due linee (croci genetici) al fine di ottenere una linea a doppio transgenici stabile. F0: W-; Cyo, UAS EGFP :: RpL10A; MKRS / TM6Bx w-; Cyo / Scu; Slouch Gal4 / TM6B. F1: W-; Cyo, UAS EGFP :: RpL10A; Slouch Gal4 / TM6B. Massively amplificare questa linea e raccogliere gli embrioni desiderato-in scena. </li></ol> 2. embrioni Collection <ol><li> Preparare 8 grandi gabbie di popolazione cilindrica contenente circa 40 g di giovani mosche per gabbia (circa 180.000 mosche / gabbia). </li><li> Procedere con i cosiddetti pre-lai che permettono mosche per eliminare gli embrioni in via di sviluppo dalle loro ovidotti. Per questo, gettare le mosche per 1 ora su due piatti 11 centimetri di diametro petri contenenti un miscuglio di agar e succo d&#39;uva solidificato e coprire ⅓ della superficie con appena fatta lievito in pasta. Dopo 3 scambi di uva piastre succo di raccogliere gli embrioni reali su piatti appena fatti simili. NOTA: Il tempo di incubazione varia a seconda dello sviluppo finestra temporale studiato. </li><li> Rimuovere le piastre da gabbie e lasciarli alla stessa temperatura per il tempo necessario per ottenere la corretta fase di sviluppo (ad esempio, 3 ore di ovideposizione + 10 hr di Additionale incubazione dà embrioni da stadio 10-13 ore dopo la deposizione delle uova (AEL)). Risospendere il contenuto di piatto (embrioni, lievito in pasta, mosche morte) con 50 ml di acqua con una spazzola. </li><li> Passare attraverso una serie di setacci (700 micron, 355 micron, 112 micron) per separare embrioni da mosche e le restanti parti del corpo e raccogliere embrioni trattenuta dal setaccio di diametro minore, poi lavare brevemente in acqua deionizzata. Non utilizzare più di 18 piatti per la raccolta in quanto può ostruire i setacci. </li><li> Embrioni Dechorionate in 4,5% di candeggina in acqua deionizzata per 2 minuti e risciacquare abbondantemente con acqua deionizzata per 30-60 secondi. Incubare gli embrioni in PBS 0,01% Tween 20, 100 mg / ml cicloeximide, per 5-10 minuti a temperatura ambiente sotto agitazione. </li><li> Embrioni secco su fogli assorbenti cellulosa e trasferirli in provette da microcentrifuga. Pesare i tubi e flash-congelare gli embrioni per immersione in azoto liquido. In questa fase, gli embrioni secchi possono essere conservati per alcuni mesi a -80 ° C. </li></ol><pclass = &quot;jove_title&quot;&gt; 3. Preparazione di biglie magnetiche accoppiate a GFP anticorpi <ol><li> Risospendere accuratamente Protein G sfere magnetiche nella bottiglia originale di agitazione. </li><li> Trasferimento 90 ml di perline per un tubo RNasi-free e di raccoglierli in un magnete (30-60 sec). 90 microlitri di perline è necessario eseguire immunoprecipitazione (IP) con 1 ml di lisato contenenti 60-80 mg / mL proteine. Rispettare i rapporti per evitare la saturazione tallone. Utilizzare diversi tubi secondo la quantità di proteine. </li><li> Perline Lavare con 1 × PBS 0,01% di Tween 20 (500 microlitri) e raccogliere perline sul magnete per scartare il surnatante. Aggiungere 30 mg di anticorpo GFP in 350 ml di PBS 0,01% Tween 20 al tallone e incubare con lenta fine oltre fine miscelazione per 30 minuti a RT. </li><li> Raccogliere perle sul magnete (30-60 sec), scartare il surnatante e lavare in 500 ml di tampone di estrazione polysome (Hepes 10 mM, KCl 150 mm, MgCl 2 a 5 mm, DTT 0.5 mm, Triton 1%, cicloesimmide 100 mg / ml , Protease inibitore 1 ×, inibitore della RNasi 100 U). </li><li> Raccogliere perline sul magnete e aggiungere 500 ml di tampone di bloccaggio (BSA 0,1 mg / mL, tRNA di lievito 0,1 mg / mL, glicogeno 0,1 mg / mL di tampone di estrazione polysome). </li><li> Incubare per 30 minuti a temperatura ambiente e ripetere questo passaggio una volta con tampone di bloccaggio fresca. </li><li> Raccogliere perline sul magnete e sciacquare in 500 ml di tampone di estrazione polysome, poi ricordare perline e procedere immediatamente alla fase immunopurificazione (paragrafo 6). </li></ol> 4. Preparazione del lisato <ol><li> Prima di iniziare, impostare il programma sul multi-direzionale perline velocità veloce grinder: 2 × 10 sec a 5.000 giri, 15 sec di pausa. Trasferimento degli embrioni secchi (1,5 g) a 15 ml provette prechilled su ghiaccio contenente tampone di estrazione polysome, e omogeneizzare subito. Omogeneizzare 1,5 g di embrioni in 4 ml di tampone di estrazione polysome. </li><li> Diffusione omogeneizzato embrioni in due prechilled 2 mL e macinare il Embryos eseguendo il programma omogeneizzatore. Trasferire il lisato in microprovette prechilled fresche su ghiaccio e preparare un surnatante postnuclear per centrifugazione a 4 ° C per 10 min a 2.000 g. </li><li> Trasferire il surnatante in una provetta prechilled fresco sul ghiaccio, aggiungere 1/100 volume del campione del 10% Nonidet P-40 per il surnatante (concentrazione finale = 0,1%), e mescolare con cura capovolgendo la provetta. </li><li> Pulse-centrifuga il campione in un minicentrifuga per raccogliere il liquido sul fondo della provetta, aggiungere 1/9 volume del campione di 300 mM 1,2-Diheptanoyl-sn-glicero-3-fosfocolina (DHPC) (concentrazione finale = 30 mM ), mescolare delicatamente invertendo il tubo, e incubare la miscela in ghiaccio per 5 min (mix invertendo più volte durante l&#39;incubazione). </li><li> Preparare il supernatante post-mitocondriale mediante centrifugazione a 4 ° C per 10 min a 20.000 g. Misurare concentrazione proteica con il metodo Bradford: concentrazione nel lisato deve essere compresa tra 60-80 mg / ml. Take il surnatante in una nuova provetta prechilled fresco e procedere immediatamente alla fase di pre-assorbimento (sezione 5). </li></ol> 5. Pre-assorbimento <ol><li> Risospendere accuratamente le sfere magnetiche agitando con attenzione e trasferire 30 ml di perle in una provetta a temperatura ambiente (30 ml di perline / 1 ml di lisato embrionale). </li><li> Raccogliere perle sul magnete, pipetta il surnatante e risospendere le sfere nel buffer di estrazione polysome (500 microlitri). Raccogliere perle sul magnete, aggiungere lisato embrionale, e incubare per 1 ora a 4 ° C su un rotatore. <ol><li> Rimuovere perline e tenere surnatante in ghiaccio per il passo immunopurificazione. Prima immunopurificazione, tenere 100 ml di surnatante (ingresso) per confrontare campione di RNA globale con il campione di RNA raccolti dopo immunopurificazione, mediante RT-qPCR per esempio. </li></ol></li></ol> 6. immunopurificazione <ol><li> Aggiungere 1 ml (corrispondente a 60-80 mg / ml di proteine) dilisato pre-assorbito in una provetta RNasi-free contenente 90 ml di perline bloccati accoppiate ad anticorpi GFP. Incubare i campioni a 4 ° C per 2 ore con miscelazione end-over-end dolce in un rotatore tubo. In alternativa, eseguire l&#39;incubazione O / N a 4 ° C. </li><li> Dopo l&#39;incubazione, raccogliere perline sul magnete. Utilizzare un minicentrifuga a girare giù le perline, poi li risospendere in 500 ml di tampone di lavaggio (Hepes 10mm, KCl 350mm, MgCl 2 5mm, Nonidet P-40 1%, DTT 0,5 mm cicloesimmide 100 mg / ml, RNasi inibitore 100 U ) e alla loro raccolta sul magnete. Ripetere questa operazione altre due volte. </li><li> Modificare le perle in una nuova provetta RNasi-free prechilled e lavare due volte. Raccogliere perline su un magnete e procedere alla estrazione di RNA con l&#39;aggiunta di 1 ml di Trizol direttamente ai talloni e seguire le istruzioni del produttore. </li></ol> 7. RNA Pulizia e valutazione della qualità <ol><li> Utilizzare un kit RNeasy Micro secondo le istruzioni del produttore. Al termine, Elute RNA con (x) ml di acqua RNase-free. Caldo per 2 minuti a 60 ° C, e conservare a scatto congelati campioni a -80 ° C. Controllare RNA qualità utilizzando bioanalizzatore (seguire le istruzioni del produttore). </li><li> Per verificare la specificità del Traped RNA, eseguire trascrizione inversa su 3 ng di RNA purificato (input e IP) secondo le istruzioni del produttore (apice III). Utilizzare il cDNA ottenuto per qPCR utilizzando set di primer gene-specifici. </li></ol>

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Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Questo documento descrive un protocollo modificato Translating ribosoma Affinity Purification (soprannominato &#39;TRAP-rc&#39;) dedicato allo studio delle popolazioni di cellule rare in embrioni di Drosophila. Le informazioni sono fornite sui passaggi chiave per il successo l&#39;isolamento di RNA specifico con una resa adatta per microarray o l&#39;analisi di RNA-Seq, cioè 1) la quantità di materiale biologico necessario e procedure ottimizzate per embrione lisi e l&#39;estrazione polysome; 2) perline / anticorpo-to-lisato di copertura del immunoprecipitazione ottimale; 3) passi permettendo la riduzione di fondo tra cui lavaggio composizione del tampone in modo da eseguire esperimenti TRAP-rc con elevata specificità e sensibilità. Questo protocollo produce dati riproducibili rendendo prontamente applicato ad altri tipi di cellule. Questa tecnica permette di analizzare l&#39;espressione genica differenziale a livello di mRNA e attivamente tradurre e quindi aprire la strada per comprendere l&#39;espressione della proteina in una specifica<html> tipo di cellula ific in un intervallo di tempo specifico. Si noti tuttavia che la proteina abbondanza dipenderà dalla velocità dei processi di traduzione e degradazione. Una limitazione importante del metodo TRAP è la sua incapacità di misurare il contenuto proteico in maniera quantitativa accurata o per rilevare modificazioni post-traduzionali. Migliorare la quantificazione misurando la densità ribosoma lungo il corpo mRNA e, in tal modo, in maniera cella-tipo specifico può fare TRAP combinato con ribosoma footprinting uno strumento molto potente. In un recente lavoro 34, questa combinazione è stata eseguita in embrionali renali 293 cellule umane. Gli autori correvano footprinting nucleasi seguita da purificazione per affinità di una forma biotinilata inducibile di RpL10A utilizzando perline streptavidina. Questa è una prova di principio che è possibile eseguire footprinting ribosoma in un intero organismo mirando nel contempo un tipo specifico di cellule, la limitazione è la quantità di materiale biologico necessario per gli scopi. &quot;&gt; Esecuzione di esperimenti TRAP in parallelo con analisi trascrittomica globali permetterà di monitorare le proporzioni tra neo-trascritto e actively- tradurre RNA. Questo sarà profondamente informativo dei potenziali meccanismi post-trascrizionali che si svolgono in contesti di sviluppo specifici o popolazioni di cellule specifiche microRNA -da per esempio. In conclusione, TRAP è un metodo molto efficiente, specifico e sensibile per identificare RNA legati ai ribosomi attivamente-traducono in maniera specifica delle cellule. Questo metodo può essere utilizzato in un&#39;ampia varietà di organismi e tipi di tessuto. Il nuovo protocollo TRAP-rc qui descritto è stato ottimizzato per popolazioni cellulari rari (meno dell&#39;1% del numero di cellule totale) e per una quantità di materiale sufficiente per la finale successive analisi a livello dell&#39;intero genoma. Una possibile limitazione di questo metodo è il requisito di un driver forte da produrre ribosomi targhette in quantità sufficiente di compete con quelli senza tag endogeni nel tipo di cellula bersaglio. In un recente studio 25, autori hanno stimato al 10-30% il rapporto di tag rispetto ribosomi senza tag. Per superare questo problema crescente-EGFP UAS-RpL10A numero di copie dovrebbe migliorare notevolmente questo equilibrio. In alternativa, aggiungendo al background genetico descritto un transgene UAS-GAL4 amplifica la produzione di proteine ​​GAL4 e, indirettamente, aumentare l&#39;espressione di RpL10A-EGFP. Questo dovrebbe favorire una migliore occupazione dei ribosomi targhetta su mRNA. Si noti che questo approccio già efficiente può essere reso ancora più potente, adattando metodi complementari per portare un aspetto più quantitativa o per scoprire e svelare i meccanismi molecolari che sono essenziali per il controllo dell&#39;espressione genica.

Capire come le cellule acquisiscono proprietà specifiche durante lo sviluppo è fondamentale al fine di apprezzare la complessità di organi e il loro potenziale evoluzione verso condizioni patologiche. Vi è una grande spinta di ricerca per decifrare le reti di regolazione genica che sottostanno specificazione cellulare e la differenziazione da unrevealing profili di espressione genica a livello mondiale, Pol II lo stato di associazione, trascrizione fattore di occupazione su sequenze regolatrici o modificazioni post-traduzionali degli istoni. Per valutare l&#39;espressione genica in un microarray livello globale e sono utilizzati approcci RNA-Seq. Microarrays consentono di rilevare mRNA abbondanza, mentre RNA-Seq è meglio orientata a informare sui diversi tipi di RNA, tra cui codifica e RNA non codificanti, come microRNA, lncRNAs o snRNAs. Tuttavia, queste tecniche non possono distinguere attivamente-trascritte, steady-state mRNA, attivamente-traducendo mRNA, e mRNA di entrare nel processo di degradazione. Misurazione steady-stmangiato livelli di mRNA è noto per essere una cattiva stima composizione proteoma 1-3. Al contrario, l&#39;identificazione e attivamente tradurre mRNA fornisce un quadro più preciso della produzione di proteine. Tuttavia, gli studi trascrittomica sono principalmente state condotte a livello intero organismo confrontando il guadagno o la perdita di funzione di un fattore specifico di wild-type condizioni 4-7 o sul tessuto sezionato, rendendo profili di espressione genica di difficile interpretazione. I recenti progressi nella strumenti di targeting cellulari, purificazione per affinità e miglioramenti della sensibilità consentono ora di effettuare il genoma a livello di analisi su piccole popolazioni di cellule o cellule anche singoli in un organismo vivente. In Drosophila, grandi collezioni di linee transgeniche permettono specifica temporale e spaziale di mira diversi tessuti e sottopopolazioni di cellule attraverso il sistema GAL4 / UAS 8-10 cedendo quantificazione più accurata dei meccanismi molecolari necessari per la funzione delle cellule. 11. Questo metodo basato su gradiente di saccarosio centrifugazione permette la selezione della frazione polysome e determinazione di mRNA tradotto genoma-larga se analizzati con microarray o sequenziamento. Polysome isolamento può essere accoppiato con nucleasi digestione per identificare impronte ribosomiale corrispondenti ai frammenti di RNA protetti dai ribosomi durante il processo di traduzione 12. Footprinting ribosomiale aumenta la precisione di quantificazione della traduzione RNA e risoluzione RNA-livello di sequenza e posizionamento ribosoma, consente di misurare la frequenza di traduzione. Tuttavia, fino ad oggi non è stato applicato a isolamento specifico a cellule translatomes, principalmente a causa della forte diminuzione della resa RNA ottenuto alla fine del processo footprinting ribosoma. Dato che la selezione del formato di RNA può generare potenziale falso-positives provenienti da diversi RNP che potrebbe anche essere proteggono l&#39;RNA in un modo simile, sono necessari ulteriori sviluppi per migliorare ribosomiale footprinting e adattarlo agli approcci specifici delle cellule. Uno di tali metodi, chiamato Traducendo ribosoma Affinity Purification (TRAP) è stata descritta nel 2008 da Heiman et al. e applicato per isolare il translatome da un sottoinsieme di neuroni nei topi. Con epitopi codifica una proteina ribosomiale in modo cellula-tipo specifico, polisomi possono essere selettivamente purificati senza il passaggio laboriosa di dissociazione delle cellule e smistamento. In questo caso, i 60S proteina ribosomale L10A sulla superficie del ribosoma stata contrassegnate con eGFP 13. Dal 2008, diversi studi hanno usato questo metodo in specie diverse, dai topi 14-19 a X. laevis 20,21, 22,23 e zebrafish Arabidopsis thaliana 24. Il metodo TRAP è stato adattato al modello Drosophila e usato per purify mRNA da cellule neuronali 25 e astrociti 26 specifiche cellule-tipo. Il sistema GAL4 / UAS binario versatile è stato utilizzato per esprimere la GFP-tagged RpL10A in maniera tessuto-specifica. Capi di mosche adulti sono stati sezionati per effettuare la selezione polysome da cellule neuronali (bersaglio da pan-neurali conducente Elav-GAL4) e RNA isolati sono stati sequenziati. Il gran numero di geni up-regolati corrispondeva a quelle note per essere espressa nel sistema nervoso, indicando che l&#39;approccio ha buona specificità e ci spinge per adattarlo alle popolazioni cellulari rare (meno dell&#39;1% delle cellule) presente in embrioni di Drosophila . Nell&#39;ambito del modello Drosophila, la fase embrionale è un modello di scelta per lo studio dei processi di sviluppo, come gli attori molecolari e dei movimenti morfogenetici sono evolutivamente conservati. Gli approcci trascrittomica solo specifici tessuti condotti finora in questo modello sono stati condotti utilizzando cellule o nucleare cosìrting e sono stati in grado di studiare steady-state trascrittoma 27-31 solo, creando la necessità di metodi dedicati al tessuto / cellule-specifiche translatome profiling in volo embrione. Qui riportiamo il primo protocollo TRAP dedicata agli embrioni di Drosophila. Con questo metodo, impegnati in-traduzione dell&#39;mRNA in una popolazione di cellule molto ristretto di circa 100 cellule muscolari per embrione è stato isolato con successo con alta qualità e specificità. Il GAL4 / sistema UAS binario è usato per guidare l&#39;espressione di RpL10A GFP-tagged in sottopopolazione di muscoli senza alcuna tossicità, non fenotipi apparenti o ritardo dello sviluppo, come illustrato in precedenza 25. Embrioni di Drosophila in possesso di 30 muscoli per hemisegment che daranno luogo alla muscolatura della larva. Usando una regione regolatrice scoperto in prossimità del gene dell&#39;identità cava, 6 dei 30 muscoli multi-nucleate sono presi di mira. In questo saggio, ribosomi sono immobilizzati sulla mRNA utilizzando l&#39;allungamento traduzioneinibitori cicloesimide. Estratti citosolici vengono poi utilizzati per la purificazione di affinità con sfere magnetiche GFP anticorpi rivestite. Qualità di RNA purificato è stato convalidato utilizzando Bioanalyzer. Quantitative PCR di trascrizione inversa (RT-qPCR) è stato utilizzato per determinare la specificità e la sensibilità di isolamento mRNA e ha dimostrato che il nostro protocollo ottimizzato è altamente efficiente.

<table><tbody><tr><td>HEPES</td><td>Sigma&amp;nbsp;</td><td>H4034-1006</td><td></td></tr><tr><td>1,2-diheptanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine&amp;nbsp;</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>850306P</td><td></td></tr><tr><td>Glycogen</td><td>thermo scientific&amp;nbsp;</td><td>R0561</td><td></td></tr><tr><td>Purified BSA 100X&amp;nbsp;</td><td>Biolabs</td><td>B9001</td><td></td></tr><tr><td>Yeast tRNA&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>R5636</td><td></td></tr><tr><td>Super RNase In&amp;nbsp;</td><td>Ambion</td><td>AM2694</td><td></td></tr><tr><td>Antibody GFP clone N86/38</td><td>UC DAVIS/NIH Neuromab Faculty Antibodies Incorporated</td><td>75-132&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Nonidet P40&amp;nbsp;</td><td>Roche</td><td>11754595001</td><td></td></tr><tr><td>Precellys 24 Lysis homogenisation&amp;nbsp;</td><td>Bertin Technology</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nuclease free water&amp;nbsp;</td><td>Nalgene</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads ProteinG</td><td>Invitrogen</td><td>10004D</td><td></td></tr><tr><td>Potassium chloride (KCl)</td><td>Applied Biosystem&amp;nbsp;</td><td>AM96406</td><td></td></tr><tr><td>Magnesium Chloride (MgCl2)&amp;nbsp;</td><td>Applied Biosystem&amp;nbsp;</td><td>AM95306</td><td></td></tr><tr><td>Cellulose waddin unbleached&amp;nbsp;</td><td>VWR</td><td>115-2597&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Sieves 112, 355, 710 um&amp;nbsp;</td><td>Retsch</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TRiZol&amp;nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>15596-018</td><td></td></tr><tr><td>MagRack 6</td><td>GE HealthCare&amp;nbsp;</td><td>28948964</td><td></td></tr><tr><td>Low binding filter tips&amp;nbsp;</td><td>ClearLine</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rnase free tube 1.5 ml&amp;nbsp;</td><td>ClearLine</td><td>390689DD</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20&amp;nbsp;</td><td>Fischer Bioreagent&amp;nbsp;</td><td>BP337-500</td><td></td></tr><tr><td>Cycloheximide&amp;nbsp;</td><td>Sigma&amp;nbsp;</td><td>C1985</td><td></td></tr><tr><td>Protease inhibitor tablets, Mini-Complete, EDTA-free&amp;nbsp;</td><td>Roche</td><td>11836170001</td><td></td></tr></tbody></table>

trap-rc, translating ribosome affinity purification from rare cell populations of drosophila embryos

Measuring levels of mRNAs in the process of translation in individual cells provides information on the proteins involved in cellular functions at a given point in time. The protocol dubbed Translating Ribosome Affinity Purification (TRAP) is able to capture this mRNA translation process in a cell-type-specific manner. Based on the affinity purification of polysomes carrying a tagged ribosomal subunit, TRAP can be applied to translatome analyses in individual cells, making it possible to compare cell types during the course of developmental processes or to track disease development progress and the impact of potential therapies at molecular level. Here we report an optimized version of the TRAP protocol, called TRAP-rc (rare cells), dedicated to identifying engaged-in-translation RNAs from rare cell populations. TRAP-rc was validated using the Gal4/UAS targeting system in a restricted population of muscle cells in Drosophila embryos. This novel protocol allows the recovery of cell-type-specific RNA in sufficient quantities for global gene expression analytics such as microarrays or RNA-seq. The robustness of the protocol and the large collections of Gal4 drivers make TRAP-rc a highly versatile approach with potential applications in cell-specific genome-wide studies.

Il sistema muscolo somatiche embrionali Drosophila è composto da 30 muscoli per hemisegment, e ogni muscolo ha un insieme specifico di proprietà: codice di geni di identità, la posizione, il numero di eventi di fusione, siti di attacco e innervazione. Identificare tradotto mRNA in uno specifico sottoinsieme muscolo fornirà informazioni sulle proteine ​​necessarie per formare queste caratteristiche muscolari specifici. Utilizzando il metodo basato TRAP-RNA da una sottopopolazione di muscoli che esprimono il gene cava di identità è stato purificato (Figura 1A-B). Una delle principali preoccupazioni di questo approccio è la qualità e la specificità del RNA isolato. Il protocollo ottimizzato riportata qui ha permesso il recupero sistematico di RNA di alta qualità valutata con l&#39;analisi Bioanalyzer. Il profilo mostra ottenuti senza degradazione dell&#39;RNA (Figura 1C). In altri studi sviluppati attorno al metodo TRAP, questioni sono state sollevate sopra la specificità dei dati. Qui improve il metodo per sopprimere sfondo legato al legame del RNA alle perline o tubi non specifici e l&#39;ottimizzazione del tampone di lavaggio. Al fine di valutare il livello di fondo e l&#39;efficienza di isolare le cellule-slouch esprimere, abbiamo condotto studi RT-qPCR su 3 repliche dello stesso stadio embrionale. Piegare-arricchimenti di 4 geni diversi (MEF2, cava, prospero, soxNeuro) sono stati calcolati rispetto a input e normalizzato contro il gene RpL32 (Figura 1D). Questi risultati hanno mostrato l&#39;arricchimento di 2,3 volte di MEF2 gene pan-muscolari e l&#39;arricchimento 5.6 volte del gene slouch. Al contrario, i due geni espressi nel sistema nervoso sono stati confrontati impoverito all&#39;ingresso. Molto simili modificare valori piega sono stati osservati su 3 repliche biologiche, dimostrando che il protocollo è robusto. Con autista Slouch-GAL4 e partendo da 1,5 g, intorno 1,5x10 ^ 6 embrioni sono stati ottenuti che contengono le 100 cellule GFP / embrione (totale di 150 × 10 ^ 6 positivocellule). Dopo aver eseguito l&#39;esperimento TRAP, la resa è di circa 25-45 ng di RNA specifico a seconda della percentuale di interessi. Questo materiale è sufficiente per eseguire analisi di microarray o RNA-Seq utilizzando un protocollo di amplificazione per costruire una libreria di RNA-Seq. L&#39;efficienza dipende fortemente dalla forza del driver usato per esprimere RpL10A-EGFP. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/52985/52985fig1.jpg" /> Figura 1. La qualità e la valutazione specificità del TRAP-RNA isolato da Slouch-GAL4&gt; embrioni UASRpL10A-EGFP. (AB) immagini confocali di uno stadio embrionale-16 mostra espressione RpL10A-EGFP specificamente nelle cellule muscolari sei Slouch per hemisegment (A). Co-localizzazione di RpL10A-EGFP con il Beta3tubulin generale marcatore muscolare si osserva sulla foto merge (B). (C) Controllo della qualità dei Traped RNA ran su Bioanalyzer mostrando perfetta integrità di rRNA 18S e 28S. Analisi (D) RT-qPCR mostrando elevata specificità degli esperimenti mRNA TRAP-isolato su 3 repliche biologiche di stage-16 embrioni. Piegare variazione è calcolata rispetto all&#39;ingresso e normalizzata contro il gene RpL32. Trascrizioni MEF2 presenti in tutti i lignaggi muscolari sono 2,3 volte arricchita, rispetto all&#39;ingresso, mentre le trascrizioni slouch più ristretti sono-5.6-fold arricchito. Cellule neurali che esprimono prospero e geni soxN sono esaurite 2,2 volte e 5,5 volte, rispettivamente. Barre di errore rappresentano la deviazione standard (n = 3). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52985/52985fig1large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a>

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TRAP-rc, Translating Ribosome Affinity Purification from Rare Cell Populations of Drosophila Embryos

Translating Ribosome Affinity Purification (TRAP) is able to capture cell-type-specific translation of mRNA. Here we report the first TRAP protocol dedicated to isolation of mRNA in rare cell populations of Drosophila embryos.

TRAP-rc, Translating Ribosome Affinity Purification da popolazioni di cellule rare<em&gt; Drosophila</em&gt; Embrioni

Measuring levels of mRNAs in the process of translation in individual cells provides information on the proteins involved in cellular functions at a given ...

trap-rc-translating-ribosome-affinity-purification-from-rare-cell

Research

JoVE Journal

Biology

TRAP-rc, Translating Ribosome Affinity Purification from Rare Cell Populations of Drosophila Embryos

17.8K Views.  University of Clermont-Ferrand. Translating Ribosome Affinity Purification (TRAP) is able to capture cell-type-specific translation of mRNA. Here we report the first TRAP protocol dedicated to isolation of mRNA in rare cell populations of Drosophila embryos. 

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Purification of Low-abundant Cells in the Drosophila Visual System

Recent improvements in the sensitivity of next generation sequencing have facilitated the application of transcriptomic and genomic analyses to small numbers of cells. Utilizing this technology to study development in the Drosophila visual system, which boasts a wealth of cell type-specific genetic tools, provides a powerful approach for addressing the molecular basis of development with precise cellular resolution. For such an approach to be feasible, it is crucial to have the capacity to reliably and efficiently purify cells present at low abundance within the brain. Here, we present a method that allows efficient purification of single cell clones in genetic mosaic experiments. With this protocol, we consistently achieve a high cellular yield after purification using fluorescence activated cell sorting (FACS) (~25% of all labeled cells), and successfully performed transcriptomics analyses on single cell clones generated through mosaic analysis with a repressible cell marker (MARCM). This protocol is ideal for applying transcriptomic and genomic analyses to specific cell types in the visual system, across different stages of development and in the context of different genetic manipulations.

Here, we present a cell dissociation protocol for efficiently isolating cells present at low abundance within the Drosophila visual system through fluorescence activated cell sorting (FACS).

Purificazione di basso-abbondanti cellule nel sistema visivo della drosofila

Recent improvements in the sensitivity of next generation sequencing have facilitated the application of transcriptomic and genomic analyses to small ...

Ricerca

Genetica

An Oligonucleotide-based Tandem RNA Isolation Procedure to Recover Eukaryotic mRNA-Protein Complexes

RNA-binding proteins (RBPs) play key roles in the post-transcriptional control of gene expression. Therefore, biochemical characterization of mRNA-protein complexes is essential to understanding mRNA regulation inferred by interacting proteins or non-coding RNAs. Herein, we describe a tandem RNA isolation procedure (TRIP) that enables the purification of endogenously formed mRNA-protein complexes from cellular extracts. The two-step protocol involves the isolation of polyadenylated mRNAs with antisense oligo(dT) beads and subsequent capture of an mRNA of interest with 3&#39;-biotinylated 2&#39;-O-methylated antisense RNA oligonucleotides, which can then be isolated with streptavidin beads. TRIP was used to recover in vivo crosslinked mRNA-ribonucleoprotein (mRNP) complexes from yeast, nematodes and human cells for further RNA and protein analysis. Thus, TRIP is a versatile approach that can be adapted to all types of polyadenylated RNAs across organisms to study the dynamic re-arrangement of mRNPs imposed by intracellular or environmental cues.

A tandem RNA isolation procedure (TRIP) for recovery of endogenously formed mRNA-protein complexes is described. Specifically, RNA-protein complexes are crosslinked in vivo, polyadenylated RNAs are isolated from extracts with oligo(dT) beads, and particular mRNAs are captured with modified RNA antisense oligonucleotides. Proteins bound to mRNAs are detected by immunoblot analysis.

Una procedura di isolamento del RNA basati su Oligonucleotide Tandem recuperare mRNA-proteina eucariotica complessi

RNA-binding proteins (RBPs) play key roles in the post-transcriptional control of gene expression. Therefore, biochemical characterization of mRNA-protein ...

Biochimica

Medium-scale Preparation of Drosophila Embryo Extracts for Proteomic Experiments

Analysis of protein-protein interactions (PPIs) has become an indispensable approach to study biological processes and mechanisms, such as cell signaling, organism development, and disease. It is often desirable to obtain PPI information using in vivo material, to gain the most natural and unbiased view of the interaction networks. The fruit fly Drosophila melanogaster is an excellent platform to study PPIs in vivo, and lends itself to straightforward approaches to isolating material for biochemical experiments. In particular, fruit fly embryos represent a convenient type of tissue to study PPIs, due to the ease of collecting animals at this developmental stage and the fact that the majority of proteins are expressed in embryogenesis, thus providing a relevant environment to reveal most PPIs. Here we present a protocol for collection of Drosophila embryos at medium scale (0.5-1 g), which is an ideal amount for a wide range of proteomic applications, including analysis of PPIs by affinity purification-mass spectrometry (AP-MS). We describe our designs for 1 L and 5 L cages for embryo collections that can be easily and inexpensively set up in any laboratory. We also provide a general protocol for embryo collection and protein extraction to generate lysates that can be directly used in downstream applications such as AP-MS. Our goal is to provide an accessible means for all researchers to carry out the analyses of PPIs in vivo.

Medium-scale Preparation of Drosophila Embryo Extracts for Proteomic Experiments

The goal of this protocol is to provide a straightforward and inexpensive approach to collecting Drosophila embryos at medium scale (0.5-1 g) and preparing protein extracts that can be used in downstream proteomic applications, such as affinity purification-mass spectrometry (AP-MS).

Preparazione su media scala di<em&gt; Drosophila</em&gt; Estratti di embrioni per esperimenti proteomici

Analysis of protein-protein interactions (PPIs) has become an indispensable approach to study biological processes and mechanisms, such as cell signaling, ...

Biologia dello sviluppo

Translating Ribosome Affinity Purification (TRAP) for RNA Isolation from Endothelial Cells In Vivo

Many studies have been limited to using in vitro cellular assays and whole tissues or isolating of specific cell types from animals for in vitro analysis of transcriptome and gene expression by qPCR and RNA sequencing. Comprehensive transcriptome and gene expression analysis of specific cell types in complex tissues and organs will be critical to understand cellular and molecular mechanisms by which genes are regulated and their association with tissue homeostasis and organ functions. In this article, we demonstrate the methodology for isolation of ribosome-bound RNA directly in vivo in the vascular endothelia of animal lungs as an example. The specific materials and procedures for tissue processing and RNA purification will be described, including the assessment of RNA quality and yield as well as real time qPCR for arteriogenic gene assays. This approach, known as translating ribosome affinity purification (TRAP) technique, can be utilized for characterization of gene expression and transcriptome analysis of certain cell types directly in vivo in any specific type in complex tissues.

Translating Ribosome Affinity Purification TRAP for RNA Isolation from Endothelial Cells In Vivo

We present an approach to purify ribosome-bound mRNA from vascular endothelial cells (ECs) directly in mouse brain, lung and heart tissues via EC-specific genetic tag of enhanced green fluorescence protein (EGFP)in ribosomes in combination with RNA purification.

Traduzione della purificazione dell'affinità del ribosoma (TRAP) per l'isolamento dell'RNA dalle cellule endoteliali In vivo

Many studies have been limited to using in vitro cellular assays and whole tissues or isolating of specific cell types from animals for in vitro analysis ...

Translating Ribosome Affinity Purification (TRAP) to Investigate Arabidopsis thaliana Root Development at a Cell Type-Specific Scale

In this article, we give hands-on instructions to obtain translatome data from different Arabidopsis thaliana root cell types via the translating ribosome affinity purification (TRAP) method and consecutive optimized low-input library preparation.
As starting material, we employ plant lines that express GFP-tagged ribosomal protein RPL18 in a cell type-specific manner by use of adequate promoters. Prior to immunopurification and RNA extraction, the tissue is snap frozen, which preserves tissue integrity and simultaneously allows execution of time series studies with high temporal resolution. Notably, cell wall structures remain intact, which is a major drawback in alternative procedures such as fluorescence-activated cell sorting-based approaches that rely on tissue protoplasting to isolate distinct cell populations. Additionally, no tissue fixation is necessary as in laser capture microdissection-based techniques, which allows high-quality RNA to be obtained.
However, sampling from subpopulations of cells and only isolating polysome-associated RNA severely limits RNA yields. It is, therefore, necessary to apply sufficiently sensitive library preparation methods for successful data acquisition by RNA-seq.
TRAP offers an ideal tool for plant research as many developmental processes involve cell wall-related and mechanical signaling pathways. The use of promoters to target specific cell populations is bridging the gap between organ and single-cell level that in turn suffer from little resolution or very high costs. Here, we apply TRAP to study cell-cell communication in lateral root formation.

Translating Ribosome Affinity Purification TRAP to Investigate Arabidopsis thaliana Root Development at a Cell Type-Specific Scale

Translating ribosome affinity purification (TRAP) offers the possibility to dissect developmental programs with minimal processing of organs and tissues. The protocol yields high-quality RNA from cells targeted with a green fluorescent protein (GFP)-labeled ribosomal subunit. Downstream analysis tools, such as qRT-PCR or RNA-seq, reveal tissue and cell type-specific expression profiles.

Tradurre la purificazione dell'affinità del ribosoma (TRAP) per studiare lo sviluppo della radice di Arabidopsis thaliana su una scala specifica del tipo di cella

In this article, we give hands-on instructions to obtain translatome data from different Arabidopsis thaliana root cell types via the translating ribosome ...

RiboTag Immunoprecipitation in the Germ Cells of the Male Mouse

Quantifying differences in mRNA abundance is a classic approach to understand the impact of a given gene mutation on cell physiology. However, characterizing differences in the translatome (the whole of translated mRNAs) provides an additional layer of information particularly useful when trying to understand the function of RNA regulating or binding proteins. A number of methods for accomplishing this have been developed, including ribosome profiling and polysome analysis. However, both methods carry significant technical challenges and cannot be applied to specific cell populations within a tissue unless combined with additional sorting methods. In contrast, the RiboTag method is a genetic-based, efficient, and technically straightforward alternative that allows the identification of ribosome associated RNAs from specific cell populations without added sorting steps, provided an applicable cell-specific Cre driver is available. This method consists of breeding to generate the genetic models, sample collection, immunoprecipitation, and downstream RNA analyses. Here, we outline this process in adult male mouse germ cells mutant for an RNA binding protein required for male fertility. Special attention is paid to considerations for breeding with a focus on efficient colony management and the generation of correct genetic backgrounds and immunoprecipitation in order to reduce background and optimize output. Discussion of troubleshooting options, additional confirmatory experiments, and potential downstream applications is also included. The presented genetic tools and molecular protocols represent a powerful way to describe the ribosome-associated RNAs of specific cell populations in complex tissues or in systems with aberrant mRNA storage and translation with the goal of informing on the molecular drivers of mutant phenotypes.

Here, we describe the immunoprecipitation of ribosomes and associated RNA from select populations of adult male mouse germ cells using the RiboTag system. Strategic breeding and careful immunoprecipitation result in clean, reproducible results that inform on the germ cell translatome and provide insight into the mechanisms of mutant phenotypes.

Immunoprecipitazioni RiboTag nelle cellule germinali del topo maschio

Quantifying differences in mRNA abundance is a classic approach to understand the impact of a given gene mutation on cell physiology. However, ...

Whole Mount RNA Fluorescent in situ Hybridization of Drosophila Embryos

Assessing the expression pattern of a gene, as well as the subcellular localization properties of its transcribed RNA, are key features for understanding its biological function during development. RNA in situ hybridization (RNA-ISH) is a powerful method used for visualizing RNA distribution properties, be it at the organismal, cellular or subcellular levels 1. RNA-ISH is based on the hybridization of a labeled nucleic acid probe (e.g. antisense RNA, oligonucleotides) complementary to the sequence of an mRNA or a non-coding RNA target of interest 2. As the procedure requires primary sequence information alone to generate sequence-specific probes, it can be universally applied to a broad range of organisms and tissue specimens 3. Indeed, a number of large-scale ISH studies have been implemented to document gene expression and RNA localization dynamics in various model organisms, which has led to the establishment of important community resources 4-11. While a variety of probe labeling and detection strategies have been developed over the years, the combined usage of fluorescently-labeled detection reagents and enzymatic signal amplification steps offer significant enhancements in the sensitivity and resolution of the procedure 12. Here, we describe an optimized fluorescent in situ hybridization method (FISH) employing tyramide signal amplification (TSA) to visualize RNA expression and localization dynamics in staged Drosophila embryos. The procedure is carried out in 96-well PCR plate format, which greatly facilitates the simultaneous processing of large numbers of samples.

Whole Mount RNA Fluorescent in situ Hybridization of Drosophila Embryos

Here we describe a whole-mount fluorescent in situ hybridization (FISH) protocol for determining the expression and localization properties of RNAs expressed during embryogenesis in the fruit fly, Drosophila melanogaster.

Tutta la Monte RNA fluorescente<em&gt; In situ</em&gt; L&#39;ibridazione di<em&gt; Drosophila</em&gt; Embrioni

Assessing  the expression pattern of a gene, as well as the subcellular localization  properties of its transcribed RNA, are key features for ...

Biologia

Identifying Protein-protein Interaction in Drosophila Adult Heads by Tandem Affinity Purification (TAP)

Genetic screens conducted using Drosophila melanogaster (fruit fly) have made numerous milestone discoveries in the advance of biological sciences. However, the use of biochemical screens aimed at extending the knowledge gained from genetic analysis was explored only recently. Here we describe a method to purify the protein complex that associates with any protein of interest from adult fly heads. This method takes advantage of the Drosophila GAL4/UAS system to express a bait protein fused with a Tandem Affinity Purification (TAP) tag in fly neurons in vivo, and then implements two rounds of purification using a TAP procedure similar to the one originally established in yeast1 to purify the interacting protein complex. At the end of this procedure, a mixture of multiple protein complexes is obtained whose molecular identities can be determined by mass spectrometry. Validation of the candidate proteins will benefit from the resource and ease of performing loss-of-function studies in flies. Similar approaches can be applied to other fly tissues. We believe that the combination of genetic manipulations and this proteomic approach in the fly model system holds tremendous potential for tackling fundamental problems in the field of neurobiology and beyond.

Identifying Protein-protein Interaction in Drosophila Adult Heads by Tandem Affinity Purification TAP

Drosophila is famous for its powerful genetic manipulation, but not for its suitability of in-depth biochemical analysis. Here we present a TAP-based procedure to identify interacting partners of any protein of interest from the fly brain. This procedure can potentially lead to new avenues of research.

Identificare proteina-proteina interazione in<em&gt; Drosophila</em&gt; Adult capi di Tandem Affinity Purification (TAP)

Genetic screens conducted using Drosophila melanogaster (fruit fly) have made numerous milestone discoveries in the advance of biological sciences. ...

An in vivo Crosslinking Approach to Isolate Protein Complexes From Drosophila Embryos

Many cellular processes are controlled by multisubunit protein complexes. Frequently these complexes form transiently and require native environment to assemble. Therefore, to identify these functional protein complexes, it is important to stabilize them in vivo before cell lysis and subsequent purification. Here we describe a method used to isolate large bona fide protein complexes from Drosophila embryos. This method is based on embryo permeabilization and stabilization of the complexes inside the embryos by in vivo crosslinking using a low concentration of formaldehyde, which can easily cross the cell membrane. Subsequently, the protein complex of interest is immunopurified followed by gel purification and analyzed by mass spectrometry. We illustrate this method using purification of a Tudor protein complex, which is essential for germline development. Tudor is a large protein, which contains multiple Tudor domains - small modules that interact with methylated arginines or lysines of target proteins. This method can be adapted for isolation of native protein complexes from different organisms and tissues.

An in vivo Crosslinking Approach to Isolate Protein Complexes From Drosophila Embryos

Multi-component protein complexes play crucial roles during cellular function and development. Here we describe a method used to isolate native protein complexes from Drosophila embryos after in vivo crosslinking followed by purification of the crosslinked complexes for subsequent structure-function analysis.

Un In vivo La reticolazione Approccio per isolare complessi proteici da Drosophila Embrioni

Many cellular processes are controlled by multisubunit protein complexes. Frequently these complexes form transiently and require native environment to ...

Affinity-based Isolation of Tagged Nuclei from Drosophila Tissues for Gene Expression Analysis

Drosophila melanogaster embryonic and larval tissues often contain a highly heterogeneous mixture of cell types, which can complicate the analysis of gene expression in these tissues. Thus, to analyze cell-specific gene expression profiles from Drosophila tissues, it may be necessary to isolate specific cell types with high purity and at sufficient yields for downstream applications such as transcriptional profiling and chromatin immunoprecipitation. However, the irregular cellular morphology in tissues such as the central nervous system, coupled with the rare population of specific cell types in these tissues, can pose challenges for traditional methods of cell isolation such as laser microdissection and fluorescence-activated cell sorting (FACS). Here, an alternative approach to characterizing cell-specific gene expression profiles using affinity-based isolation of tagged nuclei, rather than whole cells, is described. Nuclei in the specific cell type of interest are genetically labeled with a nuclear envelope-localized EGFP tag using the Gal4/UAS binary expression system. These EGFP-tagged nuclei can be isolated using antibodies against GFP that are coupled to magnetic beads. The approach described in this protocol enables consistent isolation of nuclei from specific cell types in the Drosophila larval central nervous system at high purity and at sufficient levels for expression analysis, even when these cell types comprise less than 2% of the total cell population in the tissue. This approach can be used to isolate nuclei from a wide variety of Drosophila embryonic and larval cell types using specific Gal4 drivers, and may be useful for isolating nuclei from cell types that are not suitable for FACS or laser microdissection.

Affinity-based Isolation of Tagged Nuclei from Drosophila Tissues for Gene Expression Analysis

Drosophila tissues often contain a heterogeneous mixture of cell types.&#160;To examine gene expression in specific cell types from a particular tissue, nuclei can be genetically tagged and subsequently isolated using an affinity-based approach. Isolated nuclei can be used for downstream applications such as gene expression analysis and chromatin immunoprecipitation.

L&#39;isolamento a base di affinità di Tagged Nuclei di<em&gt; Drosophila</em&gt; tessuti per Gene Expression Analysis

Drosophila melanogaster embryonic and larval tissues often contain a highly heterogeneous mixture of cell types, which can complicate the analysis of gene ...

TRAP-rc, Translating Ribosome Affinity Purification da popolazioni di cellule rare

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