The authors thank Nicolas Allegre, Maud Peyny and Jean-Philippe Da Ponte for their excellent technical assistance. This work was supported by the Agence Nationale de la Recherche (ANR-JC-CARDIAC-SPE), the INSERM starting grant, ANR ID-CELL-SPE grant, Equipe FRM and the AFM 15845 grant.

1. Fly Line Generation <ol><li> Generare due costrutti differenti. Nel primo costrutto, RpL10A cDNA (ribosomiale proteina subunità L10A) viene clonato a valle di GFP in pUASP-PL-GFP-nter plasmide (versione modificata dal 32). L&#39;uso di un promotore germinale permette un utilizzo più polivalente della linea transgenica. NOTA: Ottenere il secondo costrutto clonando la sequenza di regolamentazione di guida espressione tessuto-specifica del gene slouch monte di GAL4 (TF) utilizzando pPTGAL4 plasmide. </li><li> Iniettare plasmidi separatamente in w 1118 mosche e inserire costrutti in volo genoma mediante inserimento P-elemento (secondo procedura standard) 33. </li><li> Selezionare i trasformanti, al fine di recuperare linee di volo con costrutti su due cromosomi diversi. La linea TRAP finale viene creata combinando queste due linee (croci genetici) al fine di ottenere una linea a doppio transgenici stabile. F0: W-; Cyo, UAS EGFP :: RpL10A; MKRS / TM6Bx w-; Cyo / Scu; Slouch Gal4 / TM6B. F1: W-; Cyo, UAS EGFP :: RpL10A; Slouch Gal4 / TM6B. Massively amplificare questa linea e raccogliere gli embrioni desiderato-in scena. </li></ol> 2. embrioni Collection <ol><li> Preparare 8 grandi gabbie di popolazione cilindrica contenente circa 40 g di giovani mosche per gabbia (circa 180.000 mosche / gabbia). </li><li> Procedere con i cosiddetti pre-lai che permettono mosche per eliminare gli embrioni in via di sviluppo dalle loro ovidotti. Per questo, gettare le mosche per 1 ora su due piatti 11 centimetri di diametro petri contenenti un miscuglio di agar e succo d&#39;uva solidificato e coprire ⅓ della superficie con appena fatta lievito in pasta. Dopo 3 scambi di uva piastre succo di raccogliere gli embrioni reali su piatti appena fatti simili. NOTA: Il tempo di incubazione varia a seconda dello sviluppo finestra temporale studiato. </li><li> Rimuovere le piastre da gabbie e lasciarli alla stessa temperatura per il tempo necessario per ottenere la corretta fase di sviluppo (ad esempio, 3 ore di ovideposizione + 10 hr di Additionale incubazione dà embrioni da stadio 10-13 ore dopo la deposizione delle uova (AEL)). Risospendere il contenuto di piatto (embrioni, lievito in pasta, mosche morte) con 50 ml di acqua con una spazzola. </li><li> Passare attraverso una serie di setacci (700 micron, 355 micron, 112 micron) per separare embrioni da mosche e le restanti parti del corpo e raccogliere embrioni trattenuta dal setaccio di diametro minore, poi lavare brevemente in acqua deionizzata. Non utilizzare più di 18 piatti per la raccolta in quanto può ostruire i setacci. </li><li> Embrioni Dechorionate in 4,5% di candeggina in acqua deionizzata per 2 minuti e risciacquare abbondantemente con acqua deionizzata per 30-60 secondi. Incubare gli embrioni in PBS 0,01% Tween 20, 100 mg / ml cicloeximide, per 5-10 minuti a temperatura ambiente sotto agitazione. </li><li> Embrioni secco su fogli assorbenti cellulosa e trasferirli in provette da microcentrifuga. Pesare i tubi e flash-congelare gli embrioni per immersione in azoto liquido. In questa fase, gli embrioni secchi possono essere conservati per alcuni mesi a -80 ° C. </li></ol><pclass = &quot;jove_title&quot;&gt; 3. Preparazione di biglie magnetiche accoppiate a GFP anticorpi <ol><li> Risospendere accuratamente Protein G sfere magnetiche nella bottiglia originale di agitazione. </li><li> Trasferimento 90 ml di perline per un tubo RNasi-free e di raccoglierli in un magnete (30-60 sec). 90 microlitri di perline è necessario eseguire immunoprecipitazione (IP) con 1 ml di lisato contenenti 60-80 mg / mL proteine. Rispettare i rapporti per evitare la saturazione tallone. Utilizzare diversi tubi secondo la quantità di proteine. </li><li> Perline Lavare con 1 × PBS 0,01% di Tween 20 (500 microlitri) e raccogliere perline sul magnete per scartare il surnatante. Aggiungere 30 mg di anticorpo GFP in 350 ml di PBS 0,01% Tween 20 al tallone e incubare con lenta fine oltre fine miscelazione per 30 minuti a RT. </li><li> Raccogliere perle sul magnete (30-60 sec), scartare il surnatante e lavare in 500 ml di tampone di estrazione polysome (Hepes 10 mM, KCl 150 mm, MgCl 2 a 5 mm, DTT 0.5 mm, Triton 1%, cicloesimmide 100 mg / ml , Protease inibitore 1 ×, inibitore della RNasi 100 U). </li><li> Raccogliere perline sul magnete e aggiungere 500 ml di tampone di bloccaggio (BSA 0,1 mg / mL, tRNA di lievito 0,1 mg / mL, glicogeno 0,1 mg / mL di tampone di estrazione polysome). </li><li> Incubare per 30 minuti a temperatura ambiente e ripetere questo passaggio una volta con tampone di bloccaggio fresca. </li><li> Raccogliere perline sul magnete e sciacquare in 500 ml di tampone di estrazione polysome, poi ricordare perline e procedere immediatamente alla fase immunopurificazione (paragrafo 6). </li></ol> 4. Preparazione del lisato <ol><li> Prima di iniziare, impostare il programma sul multi-direzionale perline velocità veloce grinder: 2 × 10 sec a 5.000 giri, 15 sec di pausa. Trasferimento degli embrioni secchi (1,5 g) a 15 ml provette prechilled su ghiaccio contenente tampone di estrazione polysome, e omogeneizzare subito. Omogeneizzare 1,5 g di embrioni in 4 ml di tampone di estrazione polysome. </li><li> Diffusione omogeneizzato embrioni in due prechilled 2 mL e macinare il Embryos eseguendo il programma omogeneizzatore. Trasferire il lisato in microprovette prechilled fresche su ghiaccio e preparare un surnatante postnuclear per centrifugazione a 4 ° C per 10 min a 2.000 g. </li><li> Trasferire il surnatante in una provetta prechilled fresco sul ghiaccio, aggiungere 1/100 volume del campione del 10% Nonidet P-40 per il surnatante (concentrazione finale = 0,1%), e mescolare con cura capovolgendo la provetta. </li><li> Pulse-centrifuga il campione in un minicentrifuga per raccogliere il liquido sul fondo della provetta, aggiungere 1/9 volume del campione di 300 mM 1,2-Diheptanoyl-sn-glicero-3-fosfocolina (DHPC) (concentrazione finale = 30 mM ), mescolare delicatamente invertendo il tubo, e incubare la miscela in ghiaccio per 5 min (mix invertendo più volte durante l&#39;incubazione). </li><li> Preparare il supernatante post-mitocondriale mediante centrifugazione a 4 ° C per 10 min a 20.000 g. Misurare concentrazione proteica con il metodo Bradford: concentrazione nel lisato deve essere compresa tra 60-80 mg / ml. Take il surnatante in una nuova provetta prechilled fresco e procedere immediatamente alla fase di pre-assorbimento (sezione 5). </li></ol> 5. Pre-assorbimento <ol><li> Risospendere accuratamente le sfere magnetiche agitando con attenzione e trasferire 30 ml di perle in una provetta a temperatura ambiente (30 ml di perline / 1 ml di lisato embrionale). </li><li> Raccogliere perle sul magnete, pipetta il surnatante e risospendere le sfere nel buffer di estrazione polysome (500 microlitri). Raccogliere perle sul magnete, aggiungere lisato embrionale, e incubare per 1 ora a 4 ° C su un rotatore. <ol><li> Rimuovere perline e tenere surnatante in ghiaccio per il passo immunopurificazione. Prima immunopurificazione, tenere 100 ml di surnatante (ingresso) per confrontare campione di RNA globale con il campione di RNA raccolti dopo immunopurificazione, mediante RT-qPCR per esempio. </li></ol></li></ol> 6. immunopurificazione <ol><li> Aggiungere 1 ml (corrispondente a 60-80 mg / ml di proteine) dilisato pre-assorbito in una provetta RNasi-free contenente 90 ml di perline bloccati accoppiate ad anticorpi GFP. Incubare i campioni a 4 ° C per 2 ore con miscelazione end-over-end dolce in un rotatore tubo. In alternativa, eseguire l&#39;incubazione O / N a 4 ° C. </li><li> Dopo l&#39;incubazione, raccogliere perline sul magnete. Utilizzare un minicentrifuga a girare giù le perline, poi li risospendere in 500 ml di tampone di lavaggio (Hepes 10mm, KCl 350mm, MgCl 2 5mm, Nonidet P-40 1%, DTT 0,5 mm cicloesimmide 100 mg / ml, RNasi inibitore 100 U ) e alla loro raccolta sul magnete. Ripetere questa operazione altre due volte. </li><li> Modificare le perle in una nuova provetta RNasi-free prechilled e lavare due volte. Raccogliere perline su un magnete e procedere alla estrazione di RNA con l&#39;aggiunta di 1 ml di Trizol direttamente ai talloni e seguire le istruzioni del produttore. </li></ol> 7. RNA Pulizia e valutazione della qualità <ol><li> Utilizzare un kit RNeasy Micro secondo le istruzioni del produttore. Al termine, Elute RNA con (x) ml di acqua RNase-free. Caldo per 2 minuti a 60 ° C, e conservare a scatto congelati campioni a -80 ° C. Controllare RNA qualità utilizzando bioanalizzatore (seguire le istruzioni del produttore). </li><li> Per verificare la specificità del Traped RNA, eseguire trascrizione inversa su 3 ng di RNA purificato (input e IP) secondo le istruzioni del produttore (apice III). Utilizzare il cDNA ottenuto per qPCR utilizzando set di primer gene-specifici. </li></ol>

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C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+transformation+of+Drosophila+with+transposable+element+vectors.">Genetic transformation of Drosophila with transposable element vectors.</a> Science. 218, 348-353 (1982).</li><li>Ingolia, N. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ribosome+profiling+reveals+pervasive+translation+outside+of+annotated+protein-coding+genes.">Ribosome profiling reveals pervasive translation outside of annotated protein-coding genes.</a> Cell reports. 8, 1365-1379 (2014).</li></ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Questo documento descrive un protocollo modificato Translating ribosoma Affinity Purification (soprannominato &#39;TRAP-rc&#39;) dedicato allo studio delle popolazioni di cellule rare in embrioni di Drosophila. Le informazioni sono fornite sui passaggi chiave per il successo l&#39;isolamento di RNA specifico con una resa adatta per microarray o l&#39;analisi di RNA-Seq, cioè 1) la quantità di materiale biologico necessario e procedure ottimizzate per embrione lisi e l&#39;estrazione polysome; 2) perline / anticorpo-to-lisato di copertura del immunoprecipitazione ottimale; 3) passi permettendo la riduzione di fondo tra cui lavaggio composizione del tampone in modo da eseguire esperimenti TRAP-rc con elevata specificità e sensibilità. Questo protocollo produce dati riproducibili rendendo prontamente applicato ad altri tipi di cellule. Questa tecnica permette di analizzare l&#39;espressione genica differenziale a livello di mRNA e attivamente tradurre e quindi aprire la strada per comprendere l&#39;espressione della proteina in una specifica<html> tipo di cellula ific in un intervallo di tempo specifico. Si noti tuttavia che la proteina abbondanza dipenderà dalla velocità dei processi di traduzione e degradazione. Una limitazione importante del metodo TRAP è la sua incapacità di misurare il contenuto proteico in maniera quantitativa accurata o per rilevare modificazioni post-traduzionali. Migliorare la quantificazione misurando la densità ribosoma lungo il corpo mRNA e, in tal modo, in maniera cella-tipo specifico può fare TRAP combinato con ribosoma footprinting uno strumento molto potente. In un recente lavoro 34, questa combinazione è stata eseguita in embrionali renali 293 cellule umane. Gli autori correvano footprinting nucleasi seguita da purificazione per affinità di una forma biotinilata inducibile di RpL10A utilizzando perline streptavidina. Questa è una prova di principio che è possibile eseguire footprinting ribosoma in un intero organismo mirando nel contempo un tipo specifico di cellule, la limitazione è la quantità di materiale biologico necessario per gli scopi. &quot;&gt; Esecuzione di esperimenti TRAP in parallelo con analisi trascrittomica globali permetterà di monitorare le proporzioni tra neo-trascritto e actively- tradurre RNA. Questo sarà profondamente informativo dei potenziali meccanismi post-trascrizionali che si svolgono in contesti di sviluppo specifici o popolazioni di cellule specifiche microRNA -da per esempio. In conclusione, TRAP è un metodo molto efficiente, specifico e sensibile per identificare RNA legati ai ribosomi attivamente-traducono in maniera specifica delle cellule. Questo metodo può essere utilizzato in un&#39;ampia varietà di organismi e tipi di tessuto. Il nuovo protocollo TRAP-rc qui descritto è stato ottimizzato per popolazioni cellulari rari (meno dell&#39;1% del numero di cellule totale) e per una quantità di materiale sufficiente per la finale successive analisi a livello dell&#39;intero genoma. Una possibile limitazione di questo metodo è il requisito di un driver forte da produrre ribosomi targhette in quantità sufficiente di compete con quelli senza tag endogeni nel tipo di cellula bersaglio. In un recente studio 25, autori hanno stimato al 10-30% il rapporto di tag rispetto ribosomi senza tag. Per superare questo problema crescente-EGFP UAS-RpL10A numero di copie dovrebbe migliorare notevolmente questo equilibrio. In alternativa, aggiungendo al background genetico descritto un transgene UAS-GAL4 amplifica la produzione di proteine ​​GAL4 e, indirettamente, aumentare l&#39;espressione di RpL10A-EGFP. Questo dovrebbe favorire una migliore occupazione dei ribosomi targhetta su mRNA. Si noti che questo approccio già efficiente può essere reso ancora più potente, adattando metodi complementari per portare un aspetto più quantitativa o per scoprire e svelare i meccanismi molecolari che sono essenziali per il controllo dell&#39;espressione genica.

Capire come le cellule acquisiscono proprietà specifiche durante lo sviluppo è fondamentale al fine di apprezzare la complessità di organi e il loro potenziale evoluzione verso condizioni patologiche. Vi è una grande spinta di ricerca per decifrare le reti di regolazione genica che sottostanno specificazione cellulare e la differenziazione da unrevealing profili di espressione genica a livello mondiale, Pol II lo stato di associazione, trascrizione fattore di occupazione su sequenze regolatrici o modificazioni post-traduzionali degli istoni. Per valutare l&#39;espressione genica in un microarray livello globale e sono utilizzati approcci RNA-Seq. Microarrays consentono di rilevare mRNA abbondanza, mentre RNA-Seq è meglio orientata a informare sui diversi tipi di RNA, tra cui codifica e RNA non codificanti, come microRNA, lncRNAs o snRNAs. Tuttavia, queste tecniche non possono distinguere attivamente-trascritte, steady-state mRNA, attivamente-traducendo mRNA, e mRNA di entrare nel processo di degradazione. Misurazione steady-stmangiato livelli di mRNA è noto per essere una cattiva stima composizione proteoma 1-3. Al contrario, l&#39;identificazione e attivamente tradurre mRNA fornisce un quadro più preciso della produzione di proteine. Tuttavia, gli studi trascrittomica sono principalmente state condotte a livello intero organismo confrontando il guadagno o la perdita di funzione di un fattore specifico di wild-type condizioni 4-7 o sul tessuto sezionato, rendendo profili di espressione genica di difficile interpretazione. I recenti progressi nella strumenti di targeting cellulari, purificazione per affinità e miglioramenti della sensibilità consentono ora di effettuare il genoma a livello di analisi su piccole popolazioni di cellule o cellule anche singoli in un organismo vivente. In Drosophila, grandi collezioni di linee transgeniche permettono specifica temporale e spaziale di mira diversi tessuti e sottopopolazioni di cellule attraverso il sistema GAL4 / UAS 8-10 cedendo quantificazione più accurata dei meccanismi molecolari necessari per la funzione delle cellule. 11. Questo metodo basato su gradiente di saccarosio centrifugazione permette la selezione della frazione polysome e determinazione di mRNA tradotto genoma-larga se analizzati con microarray o sequenziamento. Polysome isolamento può essere accoppiato con nucleasi digestione per identificare impronte ribosomiale corrispondenti ai frammenti di RNA protetti dai ribosomi durante il processo di traduzione 12. Footprinting ribosomiale aumenta la precisione di quantificazione della traduzione RNA e risoluzione RNA-livello di sequenza e posizionamento ribosoma, consente di misurare la frequenza di traduzione. Tuttavia, fino ad oggi non è stato applicato a isolamento specifico a cellule translatomes, principalmente a causa della forte diminuzione della resa RNA ottenuto alla fine del processo footprinting ribosoma. Dato che la selezione del formato di RNA può generare potenziale falso-positives provenienti da diversi RNP che potrebbe anche essere proteggono l&#39;RNA in un modo simile, sono necessari ulteriori sviluppi per migliorare ribosomiale footprinting e adattarlo agli approcci specifici delle cellule. Uno di tali metodi, chiamato Traducendo ribosoma Affinity Purification (TRAP) è stata descritta nel 2008 da Heiman et al. e applicato per isolare il translatome da un sottoinsieme di neuroni nei topi. Con epitopi codifica una proteina ribosomiale in modo cellula-tipo specifico, polisomi possono essere selettivamente purificati senza il passaggio laboriosa di dissociazione delle cellule e smistamento. In questo caso, i 60S proteina ribosomale L10A sulla superficie del ribosoma stata contrassegnate con eGFP 13. Dal 2008, diversi studi hanno usato questo metodo in specie diverse, dai topi 14-19 a X. laevis 20,21, 22,23 e zebrafish Arabidopsis thaliana 24. Il metodo TRAP è stato adattato al modello Drosophila e usato per purify mRNA da cellule neuronali 25 e astrociti 26 specifiche cellule-tipo. Il sistema GAL4 / UAS binario versatile è stato utilizzato per esprimere la GFP-tagged RpL10A in maniera tessuto-specifica. Capi di mosche adulti sono stati sezionati per effettuare la selezione polysome da cellule neuronali (bersaglio da pan-neurali conducente Elav-GAL4) e RNA isolati sono stati sequenziati. Il gran numero di geni up-regolati corrispondeva a quelle note per essere espressa nel sistema nervoso, indicando che l&#39;approccio ha buona specificità e ci spinge per adattarlo alle popolazioni cellulari rare (meno dell&#39;1% delle cellule) presente in embrioni di Drosophila . Nell&#39;ambito del modello Drosophila, la fase embrionale è un modello di scelta per lo studio dei processi di sviluppo, come gli attori molecolari e dei movimenti morfogenetici sono evolutivamente conservati. Gli approcci trascrittomica solo specifici tessuti condotti finora in questo modello sono stati condotti utilizzando cellule o nucleare cosìrting e sono stati in grado di studiare steady-state trascrittoma 27-31 solo, creando la necessità di metodi dedicati al tessuto / cellule-specifiche translatome profiling in volo embrione. Qui riportiamo il primo protocollo TRAP dedicata agli embrioni di Drosophila. Con questo metodo, impegnati in-traduzione dell&#39;mRNA in una popolazione di cellule molto ristretto di circa 100 cellule muscolari per embrione è stato isolato con successo con alta qualità e specificità. Il GAL4 / sistema UAS binario è usato per guidare l&#39;espressione di RpL10A GFP-tagged in sottopopolazione di muscoli senza alcuna tossicità, non fenotipi apparenti o ritardo dello sviluppo, come illustrato in precedenza 25. Embrioni di Drosophila in possesso di 30 muscoli per hemisegment che daranno luogo alla muscolatura della larva. Usando una regione regolatrice scoperto in prossimità del gene dell&#39;identità cava, 6 dei 30 muscoli multi-nucleate sono presi di mira. In questo saggio, ribosomi sono immobilizzati sulla mRNA utilizzando l&#39;allungamento traduzioneinibitori cicloesimide. Estratti citosolici vengono poi utilizzati per la purificazione di affinità con sfere magnetiche GFP anticorpi rivestite. Qualità di RNA purificato è stato convalidato utilizzando Bioanalyzer. Quantitative PCR di trascrizione inversa (RT-qPCR) è stato utilizzato per determinare la specificità e la sensibilità di isolamento mRNA e ha dimostrato che il nostro protocollo ottimizzato è altamente efficiente.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma&#160;</td>
			<td>H4034-1006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,2-diheptanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine&#160;</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>850306P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycogen</td>
			<td>thermo scientific&#160;</td>
			<td>R0561</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Purified BSA 100X&#160;</td>
			<td>Biolabs</td>
			<td>B9001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast tRNA&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>R5636</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Super RNase In&#160;</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM2694</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody GFP clone N86/38</td>
			<td>UC DAVIS/NIH Neuromab Faculty Antibodies Incorporated</td>
			<td>75-132&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nonidet P40&#160;</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11754595001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precellys 24 Lysis homogenisation&#160;</td>
			<td>Bertin Technology</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease free water&#160;</td>
			<td>Nalgene</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dynabeads ProteinG</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10004D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride (KCl)</td>
			<td>Applied Biosystem&#160;</td>
			<td>AM96406</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Chloride (MgCl2)&#160;</td>
			<td>Applied Biosystem&#160;</td>
			<td>AM95306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cellulose waddin unbleached&#160;</td>
			<td>VWR</td>
			<td>115-2597&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sieves 112, 355, 710 um&#160;</td>
			<td>Retsch</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRiZol&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15596-018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MagRack 6</td>
			<td>GE HealthCare&#160;</td>
			<td>28948964</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low binding filter tips&#160;</td>
			<td>ClearLine</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rnase free tube 1,5 mL&#160;</td>
			<td>ClearLine</td>
			<td>390689DD</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20&#160;</td>
			<td>Fischer Bioreagent&#160;</td>
			<td>BP337-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cycloheximide&#160;</td>
			<td>Sigma&#160;</td>
			<td>C1985</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease inhibitor tablets, Mini-Complete, EDTA-free&#160;</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11836170001</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

trap-rc, translating ribosome affinity purification from rare cell populations of drosophila embryos

Measuring levels of mRNAs in the process of translation in individual cells provides information on the proteins involved in cellular functions at a given point in time. The protocol dubbed Translating Ribosome Affinity Purification (TRAP) is able to capture this mRNA translation process in a cell-type-specific manner. Based on the affinity purification of polysomes carrying a tagged ribosomal subunit, TRAP can be applied to translatome analyses in individual cells, making it possible to compare cell types during the course of developmental processes or to track disease development progress and the impact of potential therapies at molecular level. Here we report an optimized version of the TRAP protocol, called TRAP-rc (rare cells), dedicated to identifying engaged-in-translation RNAs from rare cell populations. TRAP-rc was validated using the Gal4/UAS targeting system in a restricted population of muscle cells in Drosophila embryos. This novel protocol allows the recovery of cell-type-specific RNA in sufficient quantities for global gene expression analytics such as microarrays or RNA-seq. The robustness of the protocol and the large collections of Gal4 drivers make TRAP-rc a highly versatile approach with potential applications in cell-specific genome-wide studies.

Il sistema muscolo somatiche embrionali Drosophila è composto da 30 muscoli per hemisegment, e ogni muscolo ha un insieme specifico di proprietà: codice di geni di identità, la posizione, il numero di eventi di fusione, siti di attacco e innervazione. Identificare tradotto mRNA in uno specifico sottoinsieme muscolo fornirà informazioni sulle proteine ​​necessarie per formare queste caratteristiche muscolari specifici. Utilizzando il metodo basato TRAP-RNA da una sottopopolazione di muscoli che esprimono il gene cava di identità è stato purificato (Figura 1A-B). Una delle principali preoccupazioni di questo approccio è la qualità e la specificità del RNA isolato. Il protocollo ottimizzato riportata qui ha permesso il recupero sistematico di RNA di alta qualità valutata con l&#39;analisi Bioanalyzer. Il profilo mostra ottenuti senza degradazione dell&#39;RNA (Figura 1C). In altri studi sviluppati attorno al metodo TRAP, questioni sono state sollevate sopra la specificità dei dati. Qui improve il metodo per sopprimere sfondo legato al legame del RNA alle perline o tubi non specifici e l&#39;ottimizzazione del tampone di lavaggio. Al fine di valutare il livello di fondo e l&#39;efficienza di isolare le cellule-slouch esprimere, abbiamo condotto studi RT-qPCR su 3 repliche dello stesso stadio embrionale. Piegare-arricchimenti di 4 geni diversi (MEF2, cava, prospero, soxNeuro) sono stati calcolati rispetto a input e normalizzato contro il gene RpL32 (Figura 1D). Questi risultati hanno mostrato l&#39;arricchimento di 2,3 volte di MEF2 gene pan-muscolari e l&#39;arricchimento 5.6 volte del gene slouch. Al contrario, i due geni espressi nel sistema nervoso sono stati confrontati impoverito all&#39;ingresso. Molto simili modificare valori piega sono stati osservati su 3 repliche biologiche, dimostrando che il protocollo è robusto. Con autista Slouch-GAL4 e partendo da 1,5 g, intorno 1,5x10 ^ 6 embrioni sono stati ottenuti che contengono le 100 cellule GFP / embrione (totale di 150 × 10 ^ 6 positivocellule). Dopo aver eseguito l&#39;esperimento TRAP, la resa è di circa 25-45 ng di RNA specifico a seconda della percentuale di interessi. Questo materiale è sufficiente per eseguire analisi di microarray o RNA-Seq utilizzando un protocollo di amplificazione per costruire una libreria di RNA-Seq. L&#39;efficienza dipende fortemente dalla forza del driver usato per esprimere RpL10A-EGFP. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/52985/52985fig1.jpg" /> Figura 1. La qualità e la valutazione specificità del TRAP-RNA isolato da Slouch-GAL4&gt; embrioni UASRpL10A-EGFP. (AB) immagini confocali di uno stadio embrionale-16 mostra espressione RpL10A-EGFP specificamente nelle cellule muscolari sei Slouch per hemisegment (A). Co-localizzazione di RpL10A-EGFP con il Beta3tubulin generale marcatore muscolare si osserva sulla foto merge (B). (C) Controllo della qualità dei Traped RNA ran su Bioanalyzer mostrando perfetta integrità di rRNA 18S e 28S. Analisi (D) RT-qPCR mostrando elevata specificità degli esperimenti mRNA TRAP-isolato su 3 repliche biologiche di stage-16 embrioni. Piegare variazione è calcolata rispetto all&#39;ingresso e normalizzata contro il gene RpL32. Trascrizioni MEF2 presenti in tutti i lignaggi muscolari sono 2,3 volte arricchita, rispetto all&#39;ingresso, mentre le trascrizioni slouch più ristretti sono-5.6-fold arricchito. Cellule neurali che esprimono prospero e geni soxN sono esaurite 2,2 volte e 5,5 volte, rispettivamente. Barre di errore rappresentano la deviazione standard (n = 3). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52985/52985fig1large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a>

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TRAP-rc, Translating Ribosome Affinity Purification from Rare Cell Populations of Drosophila Embryos

Translating Ribosome Affinity Purification (TRAP) is able to capture cell-type-specific translation of mRNA. Here we report the first TRAP protocol dedicated to isolation of mRNA in rare cell populations of Drosophila embryos.

TRAP-rc, Translating Ribosome Affinity Purification da popolazioni di cellule rare<em&gt; Drosophila</em&gt; Embrioni

Measuring levels of mRNAs in the process of translation in individual cells provides information on the proteins involved in cellular functions at a given ...

trap-rc-translating-ribosome-affinity-purification-from-rare-cell

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Biology

TRAP-rc, Translating Ribosome Affinity Purification from Rare Cell Populations of Drosophila Embryos

17.7K Views.  University of Clermont-Ferrand. Translating Ribosome Affinity Purification (TRAP) is able to capture cell-type-specific translation of mRNA. Here we report the first TRAP protocol dedicated to isolation of mRNA in rare cell populations of Drosophila embryos. 

Video: TRAP-rc, Translating Ribosome Affinity Purification from Rare Cell Populations of Drosophila Embryos

Preparation of Neuronal Cultures from Midgastrula Stage Drosophila Embryos

This video illustrates the procedure for making primary neuronal cultures from midgastrula stage Drosophila embryos. The methods for collecting embryos and their dechorionation using bleach are demonstrated. Using a glass pipet attached to a mouth suction tube, we illustrate the removal of all cells from single embryos. The method for dispersing cells from each embyro into a small (5 l) drop of medium on an uncoated glass coverslip is demonstrated. A view through the microscope at 1 hour after plating illustrates the preferred cell density. Most of the cells that survive when grown in defined medium are neuroblasts that divide one or more times in culture before extending neuritic processes by 12-24 hours. A view through the microscope illustrates the level of neurite outgrowth and branching expected in a healthy culture at 2 days in vitro. The cultures are grown in a simple bicarbonate based defined medium, in a 5% CO2 incubator at 22-24&deg;C. Neuritic processes continue to elaborate over the first week in culture and when they make contact with neurites from neighboring cells they often form functional synaptic connections. Neurons in these cultures express voltage-gated sodium, calcium, and potassium channels and are electrically excitable. This culture system is useful for studying molecular genetic and environmental factors that regulate neuronal differentiation, excitability, and synapse formation/function.

This video demonstrates the preparation of primary neuronal cultures from midgastrula stage Drosophila embryos. Views of live cultures show cells 1 hour after plating and differentiated neurons after 2 days of growth in a bicarbonate-based defined medium. The neurons are electrically excitable and form synaptic connections.

Preparazione delle Culture neuronale da Midgastrula fase embrioni di Drosophila

This video illustrates the procedure for making primary neuronal cultures from midgastrula stage Drosophila embryos. The methods for collecting embryos ...

Ricerca

Biologia

Preparation of embryos for Electron Microscopy of the Drosophila embryonic heart tube

The morphogenesis of the Drosophila embryonic heart tube has emerged as a valuable model system for studying cell migration, cell-cell adhesion and cell shape changes during embryonic development. One of the challenges faced in studying this structure is that the lumen of the heart tube, as well as the membrane features that are crucial to heart tube formation, are difficult to visualize in whole mount embryos, due to the small size of the heart tube and intra-lumenal space relative to the embryo. The use of transmission electron microscopy allows for higher magnification of these structures and gives the advantage of examining the embryos in cross section, which easily reveals the size and shape of the lumen. In this video, we detail the process for reliable fixation, embedding, and sectioning of late stage Drosophila embryos in order to visualize the heart tube lumen as well as important cellular structures including cell-cell junctions and the basement membrane.

Preparation of embryos for Electron Microscopy of the Drosophila embryonic heart tube

We describe a process for fixation, embedding, sectioning, and imaging of late stage Drosophila embryos for Trasmission Electron Microscopy of the embryonic heart tube. This technique allows for the visualization of the heart tube lumen as well as the basement membrane, which lines the lumen of the heart.

Preparazione di embrioni per la microscopia elettronica del Drosophila Tubo cuore embrionale

The morphogenesis of the Drosophila  embryonic heart tube has emerged as a valuable model system for studying cell migration, cell-cell adhesion and cell ...

In-vivo Centrifugation of Drosophila Embryos

A major strategy for purifying and isolating different types of intracellular organelles is to separate them from each other based on differences in buoyant density. However, when cells are disrupted prior to centrifugation, proteins and organelles in this non-native environment often inappropriately stick to each other. Here we describe a method to separate organelles by density in intact, living Drosophila embryos. Early embryos before cellularization are harvested from population cages, and their outer egg shells are removed by treatment with 50% bleach. Embryos are then transferred to a small agar plate and inserted, posterior end first, into small vertical holes in the agar. The plates containing embedded embryos are centrifuged for 30 min at 3000g. The agar supports the embryos and keeps them in a defined orientation. Afterwards, the embryos are dug out of the agar with a blunt needle. Centrifugation separates major organelles into distinct layers, a stratification easily visible by bright-field microscopy. A number of fluorescent markers are available to confirm successful stratification in living embryos. Proteins associated with certain organelles will be enriched in a particular layer, demonstrating colocalization. Individual layers can be recovered for biochemical analysis or transplantation into donor eggs. This technique is applicable for organelle separation in other large cells, including the eggs and oocytes of diverse species.

In-vivo Centrifugation of Drosophila Embryos

We describe a method to separate organelles by density in living Drosophila embryos. Embryos are embedded in agar and centrifuged. This technique yields reproducible separation of major organelles along the anterior-posterior embryo axis. This method facilitates colocalization experiments and yields organelle fractions for biochemical analysis and transplantation experiments.

In vivo centrifugazione di embrioni di Drosophila

A major strategy for purifying and isolating different types of intracellular organelles is to separate them from each other based on differences in ...

Upright Imaging of Drosophila Embryos

Several well-known morphogenetic gradients and cellular movements occur along the dorsal/ventral axis of the Drosophila embryo. However, the current techniques used to view such processes are somewhat limited. The following protocol describes a new technique for mounting fixed and labeled Drosophila embryos for coronal viewing with confocal imaging. This method consists of embedding embryos between two layers of glycerin jelly mounting media, and imaging jelly strips positioned upright. The first step for sandwiching the embryos is to make a thin bedding of glycerin jelly on a slide. Next, embryos are carefully aligned on this surface and covered with a second layer of jelly. After the second layer is solidified, strips of jelly are cut and flipped upright for imaging. Alternatives are described for visualizing the embryos depending upon the type of microscope stand to be used. Since all cells along the dorsal-ventral axis are imaged within a single confocal Z-plane, our method allows precise measurement and comparison of fluorescent signals without photobleaching or light scattering common to 3D reconstructions of longitudinally mounted embryos.

Upright Imaging of Drosophila Embryos

Here we present a mounting protocol for stained Drosophila embryos in an upright position that allows imaging of cross-sections using Confocal microscopy.

Imaging verticale di Drosophila Embrioni

Several well-known morphogenetic gradients and cellular movements occur along the dorsal/ventral axis of the Drosophila embryo. However, the current ...

Primary Cell Cultures from Drosophila Gastrula Embryos

Here we describe a method for preparing and culturing primary cells dissociated from Drosophila gastrula embryos. In brief, a large amount of staged embryos from young and healthy flies are collected, sterilized, and then physically dissociated into a single cell suspension using a glass homogenizer. After being plated on culture plates or chamber slides at an appropriate density in culture medium, these cells can further differentiate into several morphologically-distinct cell types, which can be identified by their specific cell markers. Furthermore, we present conditions for treating these cells with double stranded (ds) RNAs to elicit gene knockdown. Efficient RNAi in Drosophila primary cells is accomplished by simply bathing the cells in dsRNA-containing culture medium. The ability to carry out effective RNAi perturbation, together with other molecular, biochemical, cell imaging analyses, will allow a variety of questions to be answered in Drosophila primary cells, especially those related to differentiated muscle and neuronal cells.

Primary Cell Cultures from Drosophila Gastrula Embryos

We provide a detailed protocol for preparing primary cells dissociated from Drosophila embryos. The ability to carry out the effective RNAi perturbation, together with other molecular, biochemical and cell imaging methods will allow a variety of questions to be addressed in Drosophila primary cells.

Colture cellulari primarie da Drosophila Gastrula embrioni

Here we describe a method for preparing and culturing primary cells dissociated from Drosophila gastrula embryos.   In brief, a large amount of staged ...

Imaging Cell Shape Change in Living Drosophila Embryos

The developing Drosophila melanogaster embryo undergoes a number of cell shape changes that are highly amenable to live confocal imaging. Cell shape changes in the fly are analogous to those in higher organisms, and they drive tissue morphogenesis. So, in many cases, their study has direct implications for understanding human disease (Table 1)1-5. On the sub-cellular scale, these cell shape changes are the product of activities ranging from gene expression to signal transduction, cell polarity, cytoskeletal remodeling and membrane trafficking. Thus, the Drosophila embryo provides not only the context to evaluate cell shape changes as they relate to tissue morphogenesis, but also offers a completely physiological environment to study the sub-cellular activities that shape cells.
The protocol described here is designed to image a specific cell shape change called cellularization. Cellularization is a process of dramatic plasma membrane growth, and it ultimately converts the syncytial embryo into the cellular blastoderm. That is, at interphase of mitotic cycle 14, the plasma membrane simultaneously invaginates around each of ~6000 cortically anchored nuclei to generate a sheet of primary epithelial cells. Counter to previous suggestions, cellularization is not driven by Myosin-2 contractility6, but is instead fueled largely by exocytosis of membrane from internal stores7. Thus, cellularization is an excellent system for studying membrane trafficking during cell shape changes that require plasma membrane invagination or expansion, such as cytokinesis or transverse-tubule (T-tubule) morphogenesis in muscle.
Note that this protocol is easily applied to the imaging of other cell shape changes in the fly embryo, and only requires slight adaptations such as changing the stage of embryo collection, or using "embryo glue" to mount the embryo in a specific orientation (Table 1)8-19. In all cases, the workflow is basically the same (Figure 1). Standard methods for cloning and Drosophila transgenesis are used to prepare stable fly stocks that express a protein of interest, fused to Green Fluorescent Protein (GFP) or its variants, and these flies provide a renewable source of embryos. Alternatively, fluorescent proteins/probes are directly introduced into fly embryos via straightforward micro-injection techniques9-10. Then, depending on the developmental event and cell shape change to be imaged, embryos are collected and staged by morphology on a dissecting microscope, and finally positioned and mounted for time-lapse imaging on a confocal microscope.

Imaging Cell Shape Change in Living Drosophila Embryos

Early development of the fruit fly, Drosophila melanogaster, is characterized by a number of cell shape changes that are well suited for imaging approaches. This article will describe basic tools and methods required for live confocal imaging of Drosophila embryos, and will focus on a cell shape change called cellularization.

Imaging Forma Modifica cella in Living Drosophila Embrioni

The developing Drosophila melanogaster embryo undergoes a number of cell shape changes that are highly amenable to live confocal imaging.  Cell shape ...

Isolation and Purification of Kinesin from Drosophila Embryos

Motor proteins move cargos along microtubules, and transport them to specific sub-cellular locations. Because altered transport is suggested to underlie a variety of neurodegenerative diseases, understanding microtubule based motor transport and its regulation will likely ultimately lead to improved therapeutic approaches. Kinesin-1 is a eukaryotic motor protein which moves in an anterograde (plus-end) direction along microtubules (MTs), powered by ATP hydrolysis. Here we report a detailed purification protocol to isolate active full length kinesin from Drosophila embryos, thus allowing the combination of Drosophila genetics with single-molecule biophysical studies. Starting with approximately 50 laying cups, with approximately 1000 females per cup, we carried out overnight collections. This provided approximately 10 ml of packed embryos. The embryos were bleach dechorionated (yielding approximately 9 grams of embryos), and then homogenized. After disruption, the homogenate was clarified using a low speed spin followed by a high speed centrifugation. The clarified supernatant was treated with GTP and taxol to polymerize MTs. Kinesin was immobilized on polymerized MTs by adding the ATP analog, 5'-adenylyl imidodiphosphate at room temperature. After kinesin binding, microtubules were sedimented via high speed centrifugation through a sucrose cushion. The microtubule pellet was then re-suspended, and this process was repeated. Finally, ATP was added to release the kinesin from the MTs. High speed centrifugation then spun down the MTs, leaving the kinesin in the supernatant. This kinesin was subjected to a centrifugal filtration using a 100 KD cut off filter for further purification, aliquoted, snap frozen in liquid nitrogen, and stored at -80 &deg;C. SDS gel electrophoresis and western blotting was performed using the purified sample. The motor activity of purified samples before and after the final centrifugal filtration step was evaluated using an in vitro single molecule microtubule assay. The kinesin fractions before and after the centrifugal filtration showed processivity as previously reported in literature. Further experiments are underway to evaluate the interaction between kinesin and other transport related proteins.

Isolation and Purification of Kinesin from Drosophila Embryos

This is a protocol to isolate active full length Kinesin from Drosophila embryos for single-molecule biophysical studies. We show how to collect embryos, make the embryo lysate, and then polymerize microtubules (MTs). Kinesin is purified by immobilizing it on the MTs, spinning down the Kinesin-MT complexes, and then releasing the kinesin from the MTs via ATP addition.

Isolamento e purificazione di chinesina dal Drosophila Embrioni

Motor proteins move cargos along microtubules, and transport them to specific sub-cellular locations. Because altered transport is suggested to underlie a ...

Identification of Protein Interacting Partners Using Tandem Affinity Purification

A critical and often limiting step in understanding the function of host and viral proteins is the identification of interacting cellular or viral protein partners. There are many approaches that allow the identification of interacting partners, including the yeast two hybrid system, as well as pull down assays using recombinant proteins and immunoprecipitation of endogenous proteins followed by mass spectrometry identification1. Recent studies have highlighted the utility of double-affinity tag mediated purification, coupled with two specific elution steps in the identification of interacting proteins. This approach, termed Tandem Affinity Purification (TAP), was initially used in yeast2,3 but more recently has been adapted to use in mammalian cells4-8.
As proof-of-concept we have established a tandem affinity purification (TAP) method using the well-characterized eukaryotic translation initiation factor eIF4E9,10.The cellular translation factor eIF4E is a critical component of the cellular eIF4F complex involved in cap-dependent translation initiation10. The TAP tag used in the current study is composed of two Protein G units and a streptavidin binding peptide separated by a Tobacco Etch Virus (TEV) protease cleavage sequence. The TAP tag used in the current study is composed of two Protein G units and a streptavidin binding peptide separated by a Tobacco Etch Virus (TEV) protease cleavage sequence8. To forgo the need for the generation of clonal cell lines, we developed a rapid system that relies on the expression of the TAP-tagged bait protein from an episomally maintained plasmid based on pMEP4 (Invitrogen). Expression of tagged murine eIF4E from this plasmid was controlled using the cadmium chloride inducible metallothionein promoter.
Lysis of the expressing cells and subsequent affinity purification via binding to rabbit IgG agarose, TEV protease cleavage, binding to streptavidin linked agarose and subsequent biotin elution identified numerous proteins apparently specific to the eIF4E pull-down (when compared to control cell lines expressing the TAP tag alone). The identities of the proteins were obtained by excision of the bands from 1D SDS-PAGE and subsequent tandem mass spectrometry. The identified components included the known eIF4E binding proteins eIF4G and 4EBP-1. In addition, other components of the eIF4F complex, of which eIF4E is a component were identified, namely eIF4A and Poly-A binding protein. The ability to identify not only known direct binding partners as well as secondary interacting proteins, further highlights the utility of this approach in the characterization of proteins of unknown function.

Tandem affinity purification is a robust approach for the identification of protein binding partners. As proof of concept, this methodology was applied to the well-characterized translation initiation factor eIF4E to co-precipitate the host cell factors involved in translation initiation. This method is easily adapted to any cellular or viral protein.

Individuazione di partner proteine ​​interagenti mediante Tandem Affinity Purification

A critical and often limiting step in understanding the function of host and viral proteins is the identification of interacting cellular or viral protein ...

High-throughput Purification of Affinity-tagged Recombinant Proteins

X-ray crystallography is the method of choice for obtaining a detailed view of the structure of proteins. Such studies need to be complemented by further biochemical analyses to obtain detailed insights into structure/function relationships. Advances in oligonucleotide- and gene synthesis technology make large-scale mutagenesis strategies increasingly feasible, including the substitution of target residues by all 19 other amino acids. Gain- or loss-of-function phenotypes then allow systematic conclusions to be drawn, such as the contribution of particular residues to catalytic activity, protein stability and/or protein-protein interaction specificity.
In order to attribute the different phenotypes to the nature of the mutation - rather than to fluctuating experimental conditions - it is vital to purify and analyse the proteins in a controlled and reproducible manner. High-throughput strategies and the automation of manual protocols on robotic liquid-handling platforms have created opportunities to perform such complex molecular biological procedures with little human intervention and minimal error rates1-5.
Here, we present a general method for the purification of His-tagged recombinant proteins in a high-throughput manner. In a recent study, we applied this method to a detailed structure-function investigation of TFIIB, a component of the basal transcription machinery. TFIIB is indispensable for promoter-directed transcription in vitro and is essential for the recruitment of RNA polymerase into a preinitiation complex6-8. TFIIB contains a flexible linker domain that penetrates the active site cleft of RNA polymerase9-11. This linker domain confers two biochemically quantifiable activities on TFIIB, namely (i) the stimulation of the catalytic activity during the 'abortive' stage of transcript initiation, and (ii) an additional contribution to the specific recruitment of RNA polymerase into the preinitiation complex4,5,12 . We exploited the high-throughput purification method to generate single, double and triple substitution and deletions mutations within the TFIIB linker and to subsequently analyse them in functional assays for their stimulation effect on the catalytic activity of RNA polymerase4. Altogether, we generated, purified and analysed 381 mutants - a task which would have been time-consuming and laborious to perform manually. We produced and assayed the proteins in multiplicates which allowed us to appreciate any experimental variations and gave us a clear idea of the reproducibility of our results.
This method serves as a generic protocol for the purification of His-tagged proteins and has been successfully used to purify other recombinant proteins. It is currently optimised for the purification of 24 proteins but can be adapted to purify up to 96 proteins.

We describe a method for the affinity-tagged purification of recombinant proteins using liquid-handling robotics. This method is generally applicable to the small-scale purification of soluble His-tagged proteins in a high-throughput format.

High-throughput Purificazione di affinità-tagged proteine ​​ricombinanti

X-ray crystallography is the method of choice for obtaining a detailed view of the structure of proteins. Such studies need to be complemented by further ...

Purification of Transcripts and Metabolites from Drosophila Heads

For the last decade, we have tried to understand the molecular and cellular mechanisms of neuronal degeneration using Drosophila as a model organism. Although fruit flies provide obvious experimental advantages, research on neurodegenerative diseases has mostly relied on traditional techniques, including genetic interaction, histology, immunofluorescence, and protein biochemistry. These techniques are effective for mechanistic, hypothesis-driven studies, which lead to a detailed understanding of the role of single genes in well-defined biological problems. However, neurodegenerative diseases are highly complex and affect multiple cellular organelles and processes over time. The advent of new technologies and the omics age provides a unique opportunity to understand the global cellular perturbations underlying complex diseases. Flexible model organisms such as Drosophila are ideal for adapting these new technologies because of their strong annotation and high tractability. One challenge with these small animals, though, is the purification of enough informational molecules (DNA, mRNA, protein, metabolites) from highly relevant tissues such as fly brains. Other challenges consist of collecting large numbers of flies for experimental replicates (critical for statistical robustness) and developing consistent procedures for the purification of high-quality biological material. Here, we describe the procedures for collecting thousands of fly heads and the extraction of transcripts and metabolites to understand how global changes in gene expression and metabolism contribute to neurodegenerative diseases. These procedures are easily scalable and can be applied to the study of proteomic and epigenomic contributions to disease.

Purification of Transcripts and Metabolites from Drosophila Heads

We describe here the procedures for the extraction and purification of mRNA and metabolites from Drosophila heads. We are applying these techniques to better understand the cellular perturbations underlying neuronal degeneration. These methodologies can be easily scaled and adapted for other "omic" projects.

Purificazione di Trascrizioni e metaboliti<em&gt; Drosophila</em&gt; Teste

For the last decade, we have tried to understand the molecular and cellular mechanisms of neuronal degeneration using Drosophila as a model organism. ...