Questo protocollo mira a ottenere RNA specifici di tipi cellulari di alta qualità da un piccolo numero di cellule in un tessuto complesso senza selezione cellulare. Impiega un modello murino recentemente disponibile che consente ai ricercatori di isolare un RNA legato al ribosoma utilizzando il pull down GLP. Il metodo è adatto anche per isolare gli RNA legati al ribosoma da qualsiasi cellula che esprime EGFP.
Per iniziare, aggiungere due millilitri di tampone di lavoro per omogeneizzazione ghiacciata a un set di smerigliatrici di tessuto di vetro. Posizionare rapidamente il campione congelato nel macinino e omogeneizzare il tessuto con 30 colpi sul ghiaccio usando un pestello sciolto. trasferire l'omogenato in un tubo inferiore rotondo da due millilitri e centrifugare a 12.000 g per 10 minuti a quattro gradi Celsius.
Quindi trasferire il surnatante in un nuovo tubo da due millilitri senza disturbare il pellet, riservando 100 microlitri come input. Incubare il surnatante con l'anticorpo anti-GFP a quattro gradi Celsius su un rotatore terminale durante la notte. Trasferire la miscela omogenato e anticorpale in un nuovo tubo inferiore rotondo da due millilitri contenente perle di proteine g lavate e incubato di quattro gradi Celsius su rotatore a 24 RPM per due ore.
Separare le sfere magnetiche dal surnatante usando un rack magnetico. Salvare il surnatante come frazione negativa che contiene gli RNA nelle cellule EGFP negative e gli RNA nelle cellule EGFP positive che non sono legate ai ribosomi. Aggiungere un millilitro di tampone di lavaggio ad alto sale alle perline e ruotare brevemente il tubo per lavare le perline.
Quindi posizionare il tubo in un rack magnetico. Rimuovere il tampone di lavaggio e ripetere i passaggi di lavaggio altre due volte per ottenere il complesso RNA ribosoma delle perle dalle cellule EGFP positive. Incubare le perle con 50 microlitri di tampone di estrazione dal kit di isolamento dell'RNA in un ThermoMixer per 30 minuti per rilasciare RNA dalle perle.
Separare le perline con un rack magnetico e trasferire il surnatante in un tubo da 1,5 millilitri. Centrifugare il tubo a 3000 g per due minuti. Quindi pipettare il surnatante in un nuovo tubo da 1,5 millilitri.
Per pre-condizionare la colonna di purificazione dell'RNA, pipettare 250 microlitri di tampone di condizionamento sulla colonna di purificazione e incubare per cinque minuti a temperatura ambiente. Quindi centrifugare la colonna a 16.000 g per un minuto. Pipettare un volume uguale di etanolo al 70% nell'estratto cellulare e mescolare bene mediante pipettaggio.
Pipettare fino a 200 microlitri della miscela nella colonna di purificazione dell'RNA precondizionata. Per ridurre la perdita di campioni non riempire la colonna più dell'80% della sua capacità. Ripeti questo passaggio più volte fino a quando tutti gli RNA vengono raccolti nella stessa colonna di ogni frazione.
Centrifugare la colonna per due minuti per legare l'RNA alla membrana nella colonna. Quindi continuare la centrifugazione per 30 secondi. Eliminare il flusso attraverso e pipettare 100 microlitri di tampone di lavaggio uno nella colonna.
Centrifugare per un minuto, quindi scartare il flusso attraverso. Pipetta 75 microlitri di soluzione di DNA si mescolano direttamente nella membrana della colonna di purificazione. Incubare a temperatura ambiente per 15 minuti.
Quindi, pipettare 40 microlitri di tampone di lavaggio uno nella colonna e centrifugare per altri 30 secondi. Scartare il flusso attraverso. Pipettare 100 microlitri di tampone di lavaggio due nella colonna e centrifugare a 8.000 g per un minuto.
Scartare il flusso attraverso. Acquista PET 100 microlitri di tampone di lavaggio due nella colonna e centrifugare a 16.000 g per due minuti. Scartare il flusso attraverso e centrifugare nuovamente la stessa colonna a 16.000 g per un minuto per rimuovere tutte le tracce di tampone di lavaggio.
Trasferire la colonna in una nuova provetta da microcentrifuga da 1,5 millilitri. pipettare 12 microlitri di acqua priva di RNasi direttamente sulla membrana della colonna di purificazione assicurandosi che la punta della pipetta non tocchi la membrana. Incubare a temperatura ambiente per un minuto e centrifugare a 1000 g per un minuto.
Quindi a 16.000 G per un minuto per eluire l'RNA. Utilizzare un bioanalizzatore per valutare la qualità e la quantità dell'RNA estratto. Conservare gli RNA in un congelatore a 80 gradi o inviarli per ulteriori analisi.
Topi portatori di entrambi gli alleli genici geneticamente modificati, Gli1-CreERT2 e NuTRAP ci viene iniettato tamoxifene una volta al giorno, a giorni alterni per tre iniezioni. L'analisi di immunofluorescenza dei tessuti raccolti mostra che l'EGFP era espresso nelle cellule interstiziali nei testicoli. EGFP è stato trovato anche nelle cellule capsulari surrenali nei topi Gli1-CreERT2, NuTRAP.
In Sonic Hedgehog-CreERT2, topi NuTRAP La popolazione cellulare positiva all'EGFP risiede nella corteccia esterna della ghiandola surrenale sotto la capsula, confermando l'espressione delle cellule pre-esprimenti EGFP. Dopo l'estrazione degli RNA specifici del tipo cellulare, l'RNA estratto è stato inviato per l'analisi dei microarray. I risultati hanno mostrato che circa 3000 geni sono stati arricchiti nella frazione positiva, rispetto ai geni nella frazione negativa, mentre circa 4.000 geni sono stati arricchiti nella frazione negativa.
Tra i geni differenziali espressi, i geni associati alle cellule di Leydig Hsd11b1 e Hsd3b6 sono stati arricchiti nella frazione positiva. Nella frazione negativa, i geni associati alla cellula di Sertoli Desert Hedgehog e Gstm6 sono stati arricchiti. Solo pochi geni differenzialmente espressi sono stati identificati confrontando la frazione negativa con l'input.
La RT-PCR quantitativa in tempo reale è stata utilizzata per confermare l'espressione di geni chiave nelle frazioni positiva e negativa. Analogamente a quanto riscontrato nel test microarray, gli enzimi steroidogenici 3-beta idrossi steroide deidrogenasi e l'enzima di scissione della catena laterale del colesterolo sono stati arricchiti nella frazione positiva. Nel frattempo, il fattore di trascrizione nove del marcatore cellulare Sertoli SRY box e la proteina tre del complesso sinaptonemale del marcatore delle cellule germinali sono stati arricchiti nella frazione negativa.
Quando si tenta questo protocollo, è importante preparare un tampone di lavoro di omogeneizzazione fresco Aggiungere DTT, ribonucleasi ricombinante cicloeximide e cocktail inibitore della proteinasi alla soluzione madre di omogeneizzazione solo prima dell'uso. È anche importante preparare i tamponi freschi a basso contenuto di sale e i tamponi di lavaggio ad alto contenuto di sale prima dell'uso.
