La segnalazione redox disregolata è implicata nella patogenesi di diverse malattie. Lo studio della biologia redox richiede il rilevamento accurato di specie reattive dell'ossigeno in diversi compartimenti cellulari e tissutali. La spettroscopia EPR è l'unico metodo che misura i radicali liberi in modo inequivocabile.
Questo protocollo dimostra un metodo pratico per la gestione e la conservazione di campioni biologici per la spettroscopia EPR. Questi protocolli illustrano l'uso di EPR e sonde di spin in due modelli rappresentativi. Anche se possono essere adattati per valutare le specie attive in altri contesti biologici.
La progettazione dell'esperimento e la manipolazione del campione sono fondamentali per la sua riproducibilità. Si consiglia di considerare la densità cellulare e garantire controlli adeguati e adeguati. Iniziare lavando delicatamente le cellule crude 264.7 con un millilitro di Krebs-Henseleit Buffer o KHB, per pozzo.
E trattare le cellule con 500 microlitri di KHB, integrati con 100 micromil di DTPA per pozzo. Per pretrattare con superossido dismutasi, aggiungere 15 microlitri di materiale superossido dismutasi, o veicolo, a ciascun pozzo e posizionare la piastra a 37 gradi Celsius per 10 minuti. Al termine del pretrattamento della superossido dismutasi, aggiungere 12,5 microlitri di CMH millimolare e 40 microlitri di soluzione di lavoro PMA micromolare 125 ai pozzi appropriati e incubare a 37 gradi Celsius per 50 minuti.
Posizionare immediatamente le piastre sul ghiaccio e raccogliere il tampone da ogni pozzo in singoli tubi da 1,5 millilitri sul ghiaccio. Successivamente, aggiungere 100 microlitri di KHB fresco più DTPA a ciascun pozzo e raschiare delicatamente le cellule dal fondo di ogni pozzo. Quindi rimospendare le sospensioni cellulari con pipettazione e trasferire le celle in singoli tubi da 1,5 millilitri sul ghiaccio.
Per il rilevamento del superossido a temperatura ambiente, caricare prima 50 microlitri di un tampone o di un campione cellulare in un tubo capillare e sigillare il tubo. Posizionare immediatamente il tubo nella risonanza paramagnetica elettronica, o EPR, spettrometro e impostare i parametri di acquisizione EPR per le misurazioni della temperatura ambiente. Testare sempre un campione vuoto di tampone contenente la stessa concentrazione di sonda trattata nelle stesse condizioni sperimentali di un controllo.
Per il rilevamento del superossido a 77 gradi Kelvin, caricare 150 microlitri di un campione in un pezzo da uno a due pollici di politetrafluoroetilene dritto, o PTFE, tubi, con un tappo di gomma ad un'estremità. Sigillare l'altra estremità del tubo con un secondo tappo e lampeggiare congelare il campione in azoto liquido. Quindi rimuovere rapidamente i tappi e posizionare il tubo PTFE in un criotubo etichettato per lo stoccaggio dell'azoto liquido.
Per le misurazioni dell'EPR, riempire il dewar delle dita dello spettrometro EPR con azoto liquido e posizionare i tubi PTFE contenenti il campione nell'azoto liquido. Posizionare il dewar delle dita nello spettrometro EPR e impostare i parametri di acquisizione EPR per le misurazioni a 77 gradi Kelvin. Per il rilevamento del ROS nel tessuto polmonare congelato, posizionare il tessuto sul ghiaccio secco e utilizzare una pinzetta per stabilizzare il tessuto congelato dal flash sul ghiaccio secco.
Tagliare il campione in cinque pezzi da 15 milligrammi e pesare i pezzi in un tubo tarato da 1,5 millilitri. Aggiungere 196 microlitri di KHB più DTPA e quattro microlitri di CMH al campione e incubare il campione polmonare per un'ora in un bagno d'acqua di 37 gradi Celsius prima di pellettare i frammenti di tessuto con una breve centrifugazione. Quindi posizionare il campione sul ghiaccio prima di trasferire 150 microlitri del supernatante in un pezzo di tubi PTFE per il congelamento flash in preparazione della misurazione EPR come appena dimostrato.
La valutazione della produzione totale di superossido in 264,7 cellule grezze stimolate con PMA come dimostrato, rivela che la concentrazione di nitroxide sia nella sospensione cellulare che nel tampone delle cellule trattate con PMA è simile, a causa della natura permeabile e del rapido equilibrio della sonda di spin. Il segnale dei radicali nitroxide aumenta nelle cellule grezze 264,7 stimolate con PMA, rispetto alle cellule di controllo, ma non nelle cellule pretrattate con superossido impermeabile cellulare dismutasi. Anche la concentrazione di nitroxide ottenuta a basse temperature in cellule grezze 264,7 dopo stimolazione con PMA è attenuata in presenza di superossido dismutasi coerente con i dati sulla temperatura ambiente.
La concentrazione di nitroxide è aumentata nel sangue e nel liquido di lavanda broncoalveolare dei topi bleo e dei topi trattati, nonché all'interno dei supernanti dei pezzi di tessuto polmonare raccolti da topi bleo e animali feriti, rispetto ai controlli trattati con PBS. Inoltre, dopo l'iniezione retro-orbitale della sonda di spin, i topi bleo e gli animali trattati dimostrano un segnale della sonda di spin più elevato rispetto ai controlli. Questi protocolli pratici consentiranno ai ricercatori di testare la produzione di radicali liberi in diversi compartimenti cellulari e campioni biologici da parte dell'EPR, comprese le misurazioni a bassa temperatura.
