Ringraziamo Gillian Stanfield per i commenti sul manoscritto. TAJ è sostenuto dalla University of Utah Genetica formazione di Grant T32-GM007464 dal NIH NIGMS.

1. Generazione Mosaico <ol><li> Genetic Croce w FRT 19A vasca: Gal80 FLP 122 / Y; Btl-GAL4, UAS-GFP (maschi) X * FRT 19A / Bal (femmine), dove * rappresenta il mutante da esaminare. Nota: Impostare attraversare almeno un giorno prima dell&#39;esperimento, in quanto ciò permette animali di accoppiarsi in modo appropriato. </li><li> Pre-lay: croce Trasferimento a fiale volare-alimentari con una piccola macchia di pasta di lievito di birra fresco collocato sul supporto. Lasciare posare per 1 ora a 25 ° C. </li><li> Lay: animali trasferimento dal pre-lay fiala per una fiala fresco con una piccola macchia di pasta di lievito fresco. Lasciare posare per 6 ore a 25 ° C. </li><li> Adulti trasferimento al pre-laici fiala per la conservazione e l&#39;uso in esperimenti successivi. Scossa raffreddano immediatamente il flaconcino contenente lay 0-6 hr vecchi embrioni per 45 min a 38 ° C, in un bagno di acqua circolante. Nota: La superficie del cibo dovrebbe essere sotto il livello dell&#39;acqua per verificare tutteembrioni sono opportunamente calore scioccato. </li><li> Incubare calore fiale scioccato a 25 ° C per 4-5 giorni fino al terzo stadio le larve iniziano a vagare. </li></ol> 2. Screen per Mosaico Animali <ol><li> Utilizzando una pinza sottile raccogliere delicatamente errante larve terzo instar dai lati del flaconcino e metterli in refrigerati 100% glicerolo in un piccolo piatto di plastica. </li><li> Esaminare le larve utilizzando un microscopio ad alto ingrandimento-dissezione dotato di ottica a fluorescenza. Identificare le larve con espressione mosaico di cellule tracheali fluorescente. Tipicamente, questo può essere fatto a 10-20X ingrandimenti. </li></ol> 3. Fissazione di calore <ol><li> Utilizzando una pinza sottile accuratamente raccogliere animali mosaico fuori del piatto e posto in una goccia di fresco 100% di glicerolo su un mm bianco vetro vetrino da microscopio 75x25x1. Nota: animali multipli possono essere inseriti nei menu (Figura 1A). Animali possono anche essere posizionate in una goccia di glicerolo direttamente su un vetrino,ma bisogna fare attenzione durante la fissazione (passo 3.2), come gli animali si riscalda molto rapidamente e possono diventare eccessivamente fisso. </li><li> Posto vetrino sul vetro 70 ° C con blocco termico finché gli animali solo fermarsi movimento, non più di 20 sec per una diapositiva, e 10 sec per un vetrino (Figura 1B). Animali volontà guizzo inizialmente ma fermarsi e diventare rigido e allungato una volta morto. Nota: l&#39;esposizione a fonti di calore troppo lungo per evitare di danneggiare rami terminali e lumen, così come rendere il segnale GFP fioca e diffusa. Per un&#39;efficienza ottimale si raccomanda di avere il blocco di calore nella stessa stanza come i microscopi. </li><li> Utilizzando una pinza sottile accuratamente orientare tutte le larve nei menu in una sola direzione, in modo tale che tutte le larve sul vetrino sono orientate parallelamente tra loro (Figura 1C). </li><li> Posizionare delicatamente un micro vetro di copertura 18x18mm su di larve (o invertire il vetrino su un vetrino) ed evitare formazione di bolle (Figura 1D). Nota: coprioggetto non può trovarsi esattamentepiatta su larve, questo non è un problema. </li><li> Larve di immagine entro 30 min. Cellule terminali fissi di calore si degrada e segnale GFP diventerà molto diffuso. </li></ol> 4. Nel Imaging in vivo di cellule terminali tracheali <ol><li> Porre il vetrino sul palco di uno stereomicroscopio composto. Con obiettivo 5X individuare i due tronchi dorsali paralleli da anteriore a posteriore sulla superficie dorsale dell&#39;animale (Figura 1F). Individuare le due cellule terminali dorsali, direttamente tra i due tronchi dorsali. Ciò consente di identificare il segmento appropriato per l&#39;analisi. </li><li> Una volta orientato, ruotare gli animali di immagine cellule terminali desiderati. Per fare questo, spingere con attenzione il vetrino sul bordo con le pinze perpendicolari all&#39;asse lungo delle larve, lentamente rotolare le larve sotto il vetrino (figure 1E e 1G). </li><li> Selezione delle cellule terminali appropriati è fondamentale per ottenere risultati coerentie confronti tra mutanti. (FB) cellule terminali La filiale di grasso corporeo si trovano facilmente adiacente al tronco dorsale, laterale alla linea mediana. Il gruppo G cellule terminali laterali (LG) sono facilmente reperibili e si trovano appena laterale della linea mediana ventrale (Figura 1H). Nota: nelle (TR10) segmenti più anteriore (Tr1) e posteriore la disposizione delle cellule terminale è divergente da altri segmenti. Analizziamo solo cellule terminali in segmenti Tr2-TR9. Cellule terminali dorsali hanno un modello di ramificazione più stereotipati di altre cellule terminali tracheali. Questo può dipendere da ulteriori segnali autonomi non-cellule, e questo dovrebbe essere considerato al momento di decidere se includerli nell&#39;analisi. </li><li> Una volta che una cellula terminale di interesse è stato identificato, acquisire un&#39;immagine utilizzando l&#39;ingrandimento desiderato, in genere 10X o 20X è meglio (Figura 2A). Nota: a causa di modelli di ramificazione variabile, cerca di catturare le immagini che includono come molti rami e suggerimenti filiali possibile. </li><li> Senza spostare il palco, spegnere la fluorescenza e accendere la luce trasmessa per catturare un&#39;immagine brightfield della stessa cella e il piano focale (Figura 2B). Il lume sarà visualizzato come scuro contrastante all&#39;interno dello spazio cellula terminale. Se la pianificazione di quantificare rami terminali cellulari e lumen, raccogliere più immagini in più piani focali di ogni cellula terminale. </li></ol> 5. Analisi e quantificazione dei Terminal cellulare Morfologia Utilizzando ImageJ <ol><li> Aprire le immagini fluorescenti e campo chiaro utilizzando il ImageJ ( <a href="http://rsb.info.nih.gov/ij/" target="_blank">http://rsb.info.nih.gov/ij/</a> ) plug-in NeuronJ ( <a href="http://www.imagescience.org/meijering/software/neuronj/" target="_blank">http://www.imagescience.org/meijering/software/neuronj/</a> ). </li><li> Utilizzando il &quot;Aggiungi tracciati&quot; strumento, tracciare manualmente i rami e lume l&#39;intera cella terminale. </li><li> Utilizzando il &quot;tracciati Label&quot; strumento, cambia titolo e reColor assegnare ogni riga all&#39;interno della traccia di una denominazione specifica. </li><li> Utilizzando il &quot;Set parametri&quot; strumento, regolare la larghezza della linea 6-10 pixel (512x512 per immagini ottenute dalla fotocamera digitale collegata al microscopio composto. Per le telecamere risoluzione maggiore o minore, la larghezza in pixel deve essere ripartita in modo appropriato), utilizzando tutti altre impostazioni predefinite, e scegliere &quot;OK&quot;. Quindi utilizzare il &quot;Make istantanea&quot; strumento per scattare una foto. Scegliere &quot;Disegna traccia&quot; per ottenere una fotografia istantanea della traccia che possono essere visualizzati fianco a fianco con l&#39;originale. </li><li> Selezionare il &quot;tracciati Measure&quot; strumento e selezionare il tipo di tracciamento (cioè che si dirama a misura in base alle designazioni specifiche assegnate in fase 5.3). Quindi, selezionare &quot;Visualizza misurazioni tracing&quot; e &quot;Cancella misurazioni precedenti&quot; quindi fare clic su &quot;Esegui&quot;. Ciò produrrà un foglio elettronico che contiene il nome, etichetta, lunghezza (in pixel), e altri dati per l&#39;immagine. Questi dati possono poi essere salvati come un foglio di calcolo Excel di Microsoft per ulteriori statisticheanalisi. </li></ol>

<ol>
	<li>Manning, G., Krasnow, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+the+Drosophila+Tracheal+System.">Development of the Drosophila Tracheal System.</a> The Development of Drosophila melanogaster. , 609-685 (1993).</li><li>Jarecki, J., Johnson, E., Krasnow, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxygen+regulation+of+airway+branching+in+Drosophila+is+mediated+by+branchless+FGF.">Oxygen regulation of airway branching in Drosophila is mediated by branchless FGF.</a> Cell. 99 (2), 211-220 (1999).</li><li>Ghabrial, A. S., Krasnow, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Social+interactions+among+epithelial+cells+during+tracheal+branching+morphogenesis.">Social interactions among epithelial cells during tracheal branching morphogenesis.</a> Nature. 441 (7094), 746-749 (2006).</li><li>Ruiz, O. E., Nikolova, L. S., Metzstein, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+Zpr1+(Zinc+Finger+Protein+1)+Is+Required+Downstream+of+Both+EGFR+And+FGFR+Signaling+in+Tracheal+Subcellular+Lumen+Formation.">Drosophila Zpr1 (Zinc Finger Protein 1) Is Required Downstream of Both EGFR And FGFR Signaling in Tracheal Subcellular Lumen Formation.</a> PLoS ONE. 7 (9), e45649 (2012).</li><li>Ghabrial, A. S., Levi, B. P., Krasnow, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+systematic+screen+for+tube+morphogenesis+and+branching+genes+in+the+Drosophila+tracheal+system.">A systematic screen for tube morphogenesis and branching genes in the Drosophila tracheal system.</a> PLoS Genetics. 7 (7), e1002087 (2011).</li><li>Baer, M. M., Bilstein, A., Leptin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+clonal+genetic+screen+for+mutants+causing+defects+in+larval+tracheal+morphogenesis+in+Drosophila.">A clonal genetic screen for mutants causing defects in larval tracheal morphogenesis in Drosophila.</a> Genetics. 176 (4), 2279-2291 (2007).</li><li>Schottenfeld-Roames, J., Ghabrial, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whacked+and+Rab35+polarize+dynein-motor-complex-dependent+seamless+tube+growth.">Whacked and Rab35 polarize dynein-motor-complex-dependent seamless tube growth.</a> Nat. Cell Biol. 14 (4), 386-393 (2012).</li><li>Levi, B. P., Ghabrial, A. S., Krasnow, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+talin+and+integrin+genes+are+required+for+maintenance+of+tracheal+terminal+branches+and+luminal+organization.">Drosophila talin and integrin genes are required for maintenance of tracheal terminal branches and luminal organization.</a> Development. 133 (12), 2383-2393 (2006).</li><li>Jones, T. A., Metzstein, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+function+for+the+PAR+complex+in+subcellular+morphogenesis+of+tracheal+terminal+cells+in+Drosophila+melanogaster.">A novel function for the PAR complex in subcellular morphogenesis of tracheal terminal cells in Drosophila melanogaster.</a> Genetics. 189 (1), 153-164 (2011).</li><li>Gervais, L., Casanova, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+coupling+of+cell+elongation+and+lumen+formation+in+a+single+cell.">In vivo coupling of cell elongation and lumen formation in a single cell.</a> Curr. Biol. 20 (4), 359-366 (2010).</li><li>Lee, T., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mosaic+analysis+with+a+repressible+cell+marker+for+studies+of+gene+function+in+neuronal+morphogenesis.">Mosaic analysis with a repressible cell marker for studies of gene function in neuronal morphogenesis.</a> Neuron. 22 (3), 451-461 (1999).</li><li>Shiga, Y., Tanaka-Matakatsu, M., Hayashi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+nuclear+GFP/&#223;-galactosidase+fusion+protein+as+a+marker+for+morphogenesis+in+living+Drosophila.">A nuclear GFP/&#223;-galactosidase fusion protein as a marker for morphogenesis in living Drosophila.</a> Dev. Growth Differ. 38, 99-106 (1996).</li><li>Meijering, E., Jacob, M., Sarria, J. -. C. F., Steiner, P., Hirling, H., Unser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+and+validation+of+a+tool+for+neurite+tracing+and+analysis+in+fluorescence+microscopy+images.">Design and validation of a tool for neurite tracing and analysis in fluorescence microscopy images.</a> Cytometry. Part A: The Journal of the International Society for Analytical Cytology. 58 (2), 167-176 (2004).</li><li>Centanin, L., Dekanty, A., Romero, N., Irisarri, M., Gorr, T. A., Wappner, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+autonomy+of+HIF+effects+in+Drosophila:+tracheal+cells+sense+hypoxia+and+induce+terminal+branch+sprouting.">Cell autonomy of HIF effects in Drosophila: tracheal cells sense hypoxia and induce terminal branch sprouting.</a> Dev. Cell. 14 (4), 547-558 (2008).</li></ol>

Gli autori dichiarano di non avere alcun interesse finanziario in competizione.

La tecnica di fissazione di calore qui descritto è uno strumento rapido e conveniente per l&#39;imaging Drosophila larvali cellule terminali tracheali. Qui, usiamo questa tecnica per esaminare la ramificazione e lume modello di cellule wild-type. Cellule tracheali esprimono GFP, guidato dal promotore specifico tracheale senza fiato, possono essere facilmente visualizzati attraverso la cuticola larvale dopo la fissazione di calore. Gli specifici modelli di ramificazione di cellule terminali individuali...

La forma delle cellule è critico per la funzione delle singole celle all&#39;interno di un organismo, così come cellule che funzionano come parte di un tessuto o organo. Usiamo Drosophila cellule terminali tracheali, un componente del sistema respiratorio degli insetti, per indagare i meccanismi molecolari che partecipano al controllo di due tipi conservate della morfologia cellulare: ramificazione e di formazione del tubo (lumenogenesis). Cellule terminali sono situati alle estremità di una rete di tubi ramificati che funziona per fornire ossigeno ai tessuti interni 1 e hanno una morfologia ramificato elaborato che dipende da un FGF via di segnalazione che è controllato da livelli di ossigeno locale all&#39;interno tessuti bersaglio 2. Rami di cellule terminali sono tubi sottili, con piene di gas lume subcellulari che attraversa ogni ramo. Le architetture cellulari distinti di cellule terminali, insieme con la facilità con cui l&#39;analisi genetica può essere eseguita in Drosophila, rendono queste cellule un modello eccellente fo meccanismi di escrescenza cellulare investigare, ramificazione, e formazione del tubo intracellulare. Cellule terminali hanno dimostrato un modello utile per comprendere alcune delle vie di segnalazione che portano alla differenziazione delle cellule ramificate, escrescenza, e la maturazione 2-4. Utilizzando questo sistema imparziale, schermi avanti genetici per mutanti morfogenesi delle cellule sono stati eseguiti, cedendo intuizioni in meccanismi che controllano la forma delle cellule 5,6. Per esempio, questi schermi hanno rivelato che una RabGAP specifica è richiesta per la polarità del citoscheletro e il traffico delle vescicole in formazione di lumen e di posizionamento 7; che l&#39;adesione integrine-mediata è necessario per la stabilità ramo 8, e che le proteine ​​PAR-polarità epiteliali regolare il traffico di membrana polarizzata richiesto sia per ramificazione e formazione lumen 9. Altri studi in cellule terminali hanno dimostrato che è necessaria l&#39;accumulo di actina asimmetrico e organizzazione dei microtubuli per l&#39;allungamento delle cellule e lumenogenesis <sup&gt; 10. Così, diversi meccanismi biologici, conservati cellule contribuiscono alla morfogenesi cellulare terminale. Qui, descriviamo un metodo per risolvere rapidamente intatto terzo instar larve di Drosophila per l&#39;analisi del terminale cellulare ramificazione e la formazione di lumen. Questo protocollo può anche essere eseguita su entrambi i primi e secondi animali instar. Chiave di questa tecnica è la capacità di visualizzare cellule terminali che sono geneticamente etichettati mediante espressione proteina fluorescente direttamente attraverso la cuticola larvale degli animali intatti. Dal momento che questa procedura non richiede manipolazioni post-fissazione, come colorazione degli anticorpi, di osservare le cellule, che ben si adatta ad analisi ad alta velocità, tra cui lo screening genetico o di droga. Espressione della proteina fluorescente rivela la struttura dei rami cytoplasmically-riempite. Formazione del tubo può essere monitorato in parallelo utilizzando microscopia brightfield per identificare il lume pieno di gas, che contrasta con il fluido circostante-fillndr tessuti. Incluso in questo protocollo è il metodo per la generazione di mosaici genetici basati sul sistema MARCM 11, per la produzione di cellule terminali mutanti omozigoti marcati con proteine ​​fluorescenti in animali altrimenti non etichettati. Ciò è necessario, poiché cellule terminali elaborano solo le loro strutture complesse relativamente tardi nello sviluppo; mosaici genetici consentono di bypass delle esigenze del gene in altri tessuti precedenti in sviluppo. . Per generare cloni marcm, trachea sono etichettati con il driver tracheale specifico fiato (btl) 12 qui descritto è il protocollo per il cromosoma X di Drosophila, per altri cromosomi, una procedura simile può essere utilizzato, con i reagenti genetica appropriata al cromosoma essere esaminato. Qui, trachea sono etichettati da espressione di una GFP cytoplasmically localizzata, ma la procedura funziona ugualmente bene con espressione di altre proteine ​​fluorescenti, quali DsRed. Inoltre, abbiamo incluso un metodo per quantificare modelli di ramificazione e la formazione di lumen in cellule terminali, sulla base di metodi sviluppati per la caratterizzazione di modelli neuronali 13 filiali. Questo tipo di dati quantitativi può essere critica nel discernere il ruolo preciso dei geni nel processo di ramificazione o lumenogenesis, oltre a permettere un confronto diretto tra diversi mutanti 9.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of Reagent/Material</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Student Dumont #5 forceps</td>
			<td>Fine Scientific Tools</td>
			<td>91150-20</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica MZ16 Dissecting microscope (or equivalent)</td>
			<td>Leica</td>
			<td>MZ16</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AxioImager M1 compound microscope (or equivalent)</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Equiped with AxioCam MRm, A-PLAN 10X/0.25, EC PLAN-NEOFLUAR20X/0.5, Filter Set 38HE</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100% Glycerol</td>
			<td>BioExpress</td>
			<td>M152-4L</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fly stock</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Genotype: w FRT19A tub:GAL80 FLP122; Btl-GAL4, UAS-GFP y w FRT19A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fly stock</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Genotype: y w FRT19A</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

examination of drosophila larval tracheal terminal cells by light microscopy

La forma delle cellule è fondamentale per la funzione delle cellule. Tuttavia, nonostante l&#39;importanza della morfologia cellulare, poco si sa su come le singole cellule generano forme specifiche. Cellule terminali tracheali Drosophila sono diventati un potente modello genetico per individuare e chiarire i ruoli dei geni necessari per la generazione di morfologie cellulari. Cellule terminali sono una componente di una rete tubolare ramificata, il sistema tracheale che funziona per fornire ossigeno ai tessuti interni. Cellule terminali sono un ottimo modello per studiare questioni di forma delle cellule in quanto in possesso due architetture cellulari distinti. In primo luogo, cellule terminali hanno una morfologia ramificata elaborata, simile ai neuroni complessi, in secondo luogo, i rami terminali cellulari sono formate da tubi sottili e contengono un lume intracellulare di membrana. Analisi quantitativa di terminale numero ramo cella, organizzazione ramo e forma singola branca, può essere utilizzato per fornire informazioni sul ruolo di specifici meccanismi geneticocanismi nella realizzazione di una cella ramificata. Analisi di formazione del tubo in queste cellule può rivelare meccanismi conservate della tubulogenesi comuni ad altre reti tubolari, quali la vascolarizzazione vertebrato. Qui si descrivono le tecniche che possono essere utilizzate per risolvere rapidamente, immagine e analizzare sia i modelli di ramificazione e la formazione del tubo in cellule terminali all&#39;interno di larve di Drosophila. Queste tecniche possono essere utilizzate per analizzare cellule terminali in animali wild-type e mutanti, o mosaici genetici. A causa della elevata efficienza di questo protocollo, è anche adatto per la genetica, la base di RNAi, o schermi di droga nel sistema tracheale Drosophila.

Risultati sono mostrati in Figura 2. Un singolo gruppo laterale (LG) cellula terminale indica vasta subcellulare ramificazione (visualizzata da GFP, A) e un gas piene lume subcellulari che attraversa ciascuno dei rami (visualizzato mediante microscopia brightfield; B). Queste immagini sono state raccolte da un mosaico L3 larva, generato usando il sistema MARCM descritto nelle sezioni 1 e 2, e di calore fisse e ripreso, come descritti ai punti 3 e 4. Pannelli C e D mostrano una traccia NeuronJ generato, ...

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Examination of Drosophila Larval Tracheal Terminal Cells by Light Microscopy

Qui, presentiamo un metodo per l&#39;analisi al microscopio ottico di cellule terminali in tracheali<em&gt; Drosophila</em&gt; Larve. Questo metodo permette di rapido esame di ramo e lume morfologia in animali interi e sarebbe utile per l&#39;analisi dei singoli mutanti o schermi per mutazioni che interessano lo sviluppo delle cellule del terminale.

Esame della<em&gt; Drosophila</em&gt; Larvali tracheali Terminal cellule al microscopio ottico

Cell shape is critical for cell function. However, despite the importance of cell morphology, little is known about how individual cells generate specific ...

examination-drosophila-larval-tracheal-terminal-cells-light

Research

JoVE Journal

Biology

Examination of Drosophila Larval Tracheal Terminal Cells by Light Microscopy

10.2K Views.  University of Utah. Qui, presentiamo un metodo per l'analisi al microscopio ottico di cellule terminali in tracheali Drosophila Larve. Questo metodo permette di rapido esame di ramo e lume morfologia in animali interi e sarebbe utile per l'analisi dei singoli mutanti o schermi per mutazioni che interessano lo sviluppo delle cellule del terminale.

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Dissection of Larval CNS in Drosophila Melanogaster

The central nervous system (CNS) of Drosophila larvae is complex and poorly understood.  One way to investigate the CNS is to use immunohistochemistry to examine the expression of various novel and marker proteins.  Staining of whole larvae is impractical because the tough cuticle prevents antibodies from penetrating inside the body cavity.  In order to stain these tissues it is necessary to dissect the animal prior to fixing and staining.  In this article we demonstrate how to dissect Drosophila larvae without damaging the CNS.  Begin by tearing the larva in half with a pair of fine forceps, and then turn the cuticle "inside-out" to expose the CNS.  If the dissection is performed carefully the CNS will remain attached to the cuticle.  We usually keep the CNS attached to the cuticle throughout the fixation and staining steps, and only completely remove the CNS from the cuticle just prior to mounting the samples on glass slides.  We also show some representative images of a larval CNS stained with Eve, a transcription factor expressed in a subset of neurons in the CNS.  The article concludes with a discussion of some of the practical uses of this technique and the potential difficulties that may arise.

In this article we demonstrate how to dissect the central nervous system from third instar Drosophila larvae.

Dissezione del sistema nervoso centrale larvali in Drosophila melanogaster

The central nervous system (CNS) of Drosophila larvae is complex and poorly understood.  One way to investigate the CNS is to use immunohistochemistry to ...

Ricerca

Biologia

Drosophila Larval NMJ Dissection

The Drosophila neuromuscular junction (NMJ) is an established model system used for the study of synaptic development and plasticity. The widespread use of the Drosophila motor system is due to its high accessibility. It can be analyzed with single-cell resolution. There are 30 muscles per hemisegment whose arrangement within the peripheral body wall are known. A total of 35 motor neurons attach to these muscles in a pattern that has high fidelity. Using molecular biology and genetics, one can create transgenic animals or mutants. Then, one can study the developmental consequences on the morphology and function of the NMJ. In order to access the NMJ for study, it is necessary to carefully dissect each larva. In this article we demonstrate how to properly dissect Drosophila larvae for study of the NMJ by removing all internal organs while leaving the body wall intact. This technique is suitable to prepare larvae for imaging, immunohistochemistry, or electrophysiology.

This protocol demonstrates how to dissect Drosophila larvae in preparation for immunohistochemistry and/or imaging of the neuromuscular junction.

Drosophila larvali NMJ Dissection

The Drosophila neuromuscular junction (NMJ) is an established model system used for the study of synaptic development and plasticity. The widespread use ...

Drosophila Larval NMJ Immunohistochemistry

The Drosophila neuromuscular junction (NMJ) is an established model system used for the study of synaptic development and plasticity. The widespread use of the Drosophila motor system is due to its high accessibility. It can be analyzed with single-cell resolution. There are 30 muscles per hemisegment whose arrangement within the peripheral body wall are known. A total of 31 motor neurons attach to these muscles in a pattern that has high fidelity. Using molecular biology and genetics, one can create transgenic animals or mutants. Then, one can study the developmental consequences on the morphology and function of the NMJ. Immunohistochemistry can be used to clearly image the components of the NMJ. In this article, we demonstrate how to use antibody staining to visualize the Drosophila larval NMJ.

Drosophila Larval NMJ Immunohistochemistry

This protocol demonstrates how to perform immunohistochemistry on dissected Drosophila larva.

Drosophila larvali NMJ Immunoistochimica

Presynaptically Silent Synapses Studied with Light Microscopy

Synaptic plasticity likely underlies the nervous system's ability to learn and remember and may also represent an adaptability that prevents otherwise damaging insults from becoming neurotoxic.  We have been studying a form of presynaptic plasticity that is interesting in part because it is expressed as a digital switching on and off of a presynaptic terminal s ability to release vesicles containing the neurotransmitter glutamate.  Here we demonstrate a protocol for visualizing the activity status of presynaptic terminals in dissociated cell cultures prepared from the rodent hippocampus.  The method relies on detecting active synapses using staining with a fixable form of the styryl dye FM1-43, commonly used to label synaptic vesicles.  This staining profile is compared with immunostaining of the same terminals with an antibody directed against the vesicular glutamate transporter 1 (vGluT-1), a stain designed to label all glutamate synapses regardless of activation status.   We find that depolarizing stimuli induce presynaptic silencing.  The population of synapses that is silent under baseline conditions can be activated by prolonged electrical silencing or by activation of cAMP signaling pathways.

Glutamatergic synapses can switch from an active mode to a silent mode. We demonstrate that presynaptic activity status in dissociated culture of rodent neurons is visualized using a fixable form of the FM1-43 dye to visualize active synapses and immunostaining with vGluT-1 antibody to visualize all glutamate synapses.

Sinapsi Presynaptically silenzioso studiato con microscopia ottica

Synaptic plasticity likely underlies the nervous system's ability to learn and remember and may also represent an adaptability that prevents otherwise ...

Preparation of Drosophila S2 cells for Light Microscopy

The ideal experimental system would be cheap and easy to maintain, amenable to a variety of techniques, and would be supported by an extensive literature and genome sequence database. Cultured Drosophila S2 cells, the product of disassociated 20-24 hour old embryos1, possess all these properties. Consequently, S2 cells are extremely well-suited for the analysis of cellular processes, including the discovery of the genes encoding the molecular components of the process or mechanism of interest. The features of S2 cells that are most responsible for their utility are the ease with which they are maintained, their exquisite sensitivity to double-stranded (ds)RNA-mediated interference (RNAi), and their tractability to fluorescence microscopy as either live or fixed cells.
S2 cells can be grown in a variety of media, including a number of inexpensive, commercially-available, fully-defined, serum-free media2. In addition, they grow optimally and quickly at 21-24&deg;C and can be cultured in a variety of containers. Unlike mammalian cells, S2 cells do not require a regulated atmosphere, but instead do well with normal air and can even be maintained in sealed flasks.
Complementing the ease of RNAi in S2 cells is the ability to readily analyze experimentally-induced phenotypes by phase or fluorescence microscopy of fixed or live cells. S2 cells grow in culture as a single monolayer but do not display contact inhibition. Instead, cells tend to grow in colonies in dense cultures. At low density, S2 cultures grown on glass or tissue culture-treated plastic are round and loosely-attached. However, the cytology of S2 cells can be greatly improved by inducing them to flatten extensively by briefly culturing them on a surface coated with the lectin, concanavalin A (ConA)3. S2 cells can also be stably transfected with fluorescently-tagged markers to label structures or organelles of interest in live or fixed cells. Therefore, the usual scenario for the microscopic analysis of cells is this: first, S2 cells (which can possess transgenes to express tagged markers) are treated by RNAi to eliminate a target protein(s). RNAi treatment time can be adjusted to allow for differences in protein turn-over kinetics and to minimize cell trauma/death if the target protein is important for viability. Next, the treated cells are transferred to a dish containing a coverslip pre-coated with conA to induce cells to spread and tightly adhere to the glass. Finally, cells are imaged with the researcher's choice of microscopy modes. S2 cells are particularly good for studies requiring extended visualization of live cells since these cells stay healthy at room temperature and normal atmosphere.

Preparation of Drosophila S2 cells for Light Microscopy

Drosophila Schneider (S2) cells are an increasingly popular system for the discovery and functional analysis of genes. Our goal is to describe some of the microscopic techniques that make S2 cells such an increasingly important experimental system.

Preparazione del Drosophila Cellule S2 per la microscopia ottica

The ideal experimental system would be cheap and easy to maintain, amenable to a variety of techniques, and would be supported by an extensive literature ...

Dissection and Staining of Drosophila Larval Ovaries

Many organs depend on stem cells for their development during embryogenesis and for maintenance or repair during adult life. Understanding how stem cells form, and how they interact with their environment is therefore crucial for understanding development, homeostasis and disease. The ovary of the fruit fly Drosophila melanogaster has served as an influential model for the interaction of germ line stem cells (GSCs) with their somatic support cells (niche) 1, 2. The known location of the niche and the GSCs, coupled to the ability to genetically manipulate them, has allowed researchers to elucidate a variety of interactions between stem cells and their niches 3-12.
Despite the wealth of information about mechanisms controlling GSC maintenance and differentiation, relatively little is known about how GSCs and their somatic niches form during development. About 18 somatic niches, whose cellular components include terminal filament and cap cells (Figure 1), form during the third larval instar 13-17. GSCs originate from primordial germ cells (PGCs). PGCs proliferate at early larval stages, but following the formation of the niche a subgroup of PGCs becomes GSCs 7, 16, 18, 19. Together, the somatic niche cells and the GSCs make a functional unit that produces eggs throughout the lifetime of the organism.
Many questions regarding the formation of the GSC unit remain unanswered. Processes such as coordination between precursor cells for niches and stem cell precursors, or the generation of asymmetry within PGCs as they become GSCs, can best be studied in the larva. However, a methodical study of larval ovary development is physically challenging. First, larval ovaries are small. Even at late larval stages they are only 100&mu;m across. In addition, the ovaries are transparent and are embedded in a white fat body. Here we describe a step-by-step protocol for isolating ovaries from late third instar (LL3) Drosophila larvae, followed by staining with fluorescent antibodies. We offer some technical solutions to problems such as locating the ovaries, staining and washing tissues that do not sink, and making sure that antibodies penetrate into the tissue. This protocol can be applied to earlier larval stages and to larval testes as well.

Dissection and Staining of Drosophila Larval Ovaries

How niches and stem cells form during development is an important question with practical implications. In the Drosophila ovary, germ line stem cells and their somatic niches form during larval development. This video demonstrates how to dissect, stain and mount female gonads from late third instar (LL3) Drosophila larvae.

Dissezione e colorazione di Drosophila Larvali ovaie

Many organs depend on stem cells for their development during embryogenesis and for maintenance or repair during adult life. Understanding how stem cells ...

In vivo Clonal Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Marked by Five Fluorescent Proteins using Confocal and Multiphoton Microscopy

We developed and validated a fluorescent marking methodology for clonal tracking of hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) with high spatial and temporal resolution to study in vivo hematopoiesis using the murine bone marrow transplant experimental model. Genetic combinatorial marking using lentiviral vectors encoding fluorescent proteins (FPs) enabled cell fate mapping through advanced microscopy imaging. Vectors encoding five different FPs: Cerulean, EGFP, Venus, tdTomato, and mCherry were used to concurrently transduce HSPCs, creating a diverse palette of color marked cells. Imaging using confocal/two-photon hybrid microscopy enables simultaneous high resolution assessment of uniquely marked cells and their progeny in conjunction with structural components of the tissues. Volumetric analyses over large areas reveal that spectrally coded HSPC-derived cells can be detected non-invasively in various intact tissues, including the bone marrow (BM), for extensive periods of time following transplantation. Live studies combining video-rate multiphoton and confocal time-lapse imaging in 4D demonstrate the possibility of dynamic cellular and clonal tracking in a quantitative manner.

In vivo Clonal Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Marked by Five Fluorescent Proteins using Confocal and Multiphoton Microscopy

Combinatorial 5 fluorescent proteins marking of hematopoietic stem and progenitor cells allows in vivo clonal tracking via confocal and two-photon microscopy, providing insights into bone marrow hematopoietic architecture during regeneration. This method allows non-invasive fate mapping of spectrally-coded HSPCs-derived cells in intact tissues for extensive periods of time following transplantation.

In vivo clonale Monitoraggio di staminali ematopoietiche e cellule progenitrici Contrassegnato da cinque proteine ​​fluorescenti che utilizzano confocale e microscopia Multiphoton

We developed and validated a fluorescent marking methodology for clonal tracking of hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) with high spatial and ...

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) maintain the turnover of all mature blood cell lineages. The coordination of the complex signals leading to specific HSC fates relies upon the interaction between HSCs and the intricate bone marrow microenvironment, which is still poorly understood[1-2].
We describe how by combining a newly developed specimen holder for stable animal positioning with multi-step confocal and two-photon in vivo imaging techniques, it is possible to obtain high-resolution 3D stacks containing HSPCs and their surrounding niches and to monitor them over time through multi-point time-lapse imaging. High definition imaging allows detecting ex vivo labeled hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) residing within the bone marrow. Moreover, multi-point time-lapse 3D imaging, obtained with faster acquisition settings, provides accurate information about HSPC movement and the reciprocal interactions between HSPCs and stroma cells.
Tracking of HSPCs in relation to GFP positive osteoblastic cells is shown as an exemplary application of this method. This technique can be utilized to track any appropriately labeled hematopoietic or stromal cell of interest within the mouse calvarium bone marrow space.

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

The nature of the interactions between hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) and bone marrow niches is poorly understood. Custom hardware modifications and a multi-step acquisition protocol allow the use of two-photon and confocal microscopy to image ex vivo labeled HSPCs homed within bone marrow areas, tracking interactions and movement.

In Vivo inseguimento 4-dimensionale di emopoietiche staminali e progenitrici celle di topo adulto cranica di Midollo Osseo

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

Measurement of Larval Activity in the Drosophila Activity Monitor

Drosophila larvae are used in many behavioral studies, yet a simple device for measuring basic parameters of larval activity has not been available. This protocol repurposes an instrument often used to measure adult activity, the TriKinetics Drosophila activity monitor (MB5 Multi-Beam Activity Monitor) to study larval activity. The instrument can monitor the movements of animals in 16 individual 8 cm glass assay tubes, using 17 infrared detection beams per tube. Logging software automatically saves data to a computer, recording parameters such as number of moves, times sensors were triggered, and animals&#8217; positions within the tubes. The data can then be analyzed to represent overall locomotion and/or position preference as well as other measurements. All data are easily accessible and compatible with basic graphing and data manipulation software. This protocol will discuss how to use the apparatus, how to operate the software and how to run a larval activity assay from start to finish.

Measurement of Larval Activity in the Drosophila Activity Monitor

This report describes a method for measuring Drosophila larval activity using the TriKinetics Drosophila Activity Monitor. The device employs infrared beams to detect movements of up to 16 individual animals. Data can be analyzed to represent motion parameters including rates and the positions of the animals within the assay chambers.

Misura della larvali attività nel<em&gt; Drosophila</em&gt; Activity Monitor

Drosophila larvae are used in many behavioral studies, yet a simple device for measuring basic parameters of larval activity has not been available. This ...

Examination of Mitotic and Meiotic Fission Yeast Nuclear Dynamics by Fluorescence Live-cell Microscopy

Live-cell imaging is a microscopy technique used to examine cell and protein dynamics in living cells. This imaging method is not toxic, generally does not interfere with cell physiology, and requires minimal experimental handling. The low levels of technical interference enable researchers to study cells across multiple cycles of mitosis and to observe meiosis from beginning to end. Using fluorescent tags such as Green Fluorescent Protein (GFP) and Red Fluorescent Protein (RFP), researchers can analyze different factors whose functions are important for processes like transcription, DNA replication, cohesion, and segregation. Coupled with data analysis using Fiji (a free, optimized ImageJ version), live-cell imaging offers various ways of assessing protein movement, localization, stability, and timing, as well as nuclear dynamics and chromosome segregation. However, as is the case with other microscopy methods, live-cell imaging is limited by the intrinsic properties of light, which put a limit to the resolution power at high magnifications, and is also sensitive to photobleaching or phototoxicity at high wavelength frequencies. However, with some care, investigators can bypass these physical limitations by carefully choosing the right conditions, strains, and fluorescent markers to allow for the appropriate visualization of mitotic and meiotic events.

Here, we present live-cell imaging which is a non-toxic microscopy method that allows researchers to study protein behavior and nuclear dynamics in living fission yeast cells during mitosis and meiosis.

Esame della dinamica nucleare del lievito di fissione mitotico e meiotico da fluorescenza microscopia a celle vive

Live-cell imaging is a microscopy technique used to examine cell and protein dynamics in living cells. This imaging method is not toxic, generally does ...