Lavoro in laboratorio Hammarlund è finanziato da: NS066082 NIH R01-01 e T32GM007223, la Fondazione Beckman, e il Ellison Medical Foundation.

1. Assemblaggio del sistema I componenti specifiche del nostro sistema sono riportate qui di seguito. Se correttamente montato, l&#39;utente dovrebbe essere in grado di concentrarsi al microscopio con una mano, spostare il palco con gli altri (sia con il mouse o il joystick), attivare il laser con il pedale, e avere una visione chiara di on- schermo delle immagini. <ol><li> MicroPoint laser montato sul epi-fluorescenza porta di un microscopio composto. Usiamo una Nikon 80i, ma ogni ricerca-grade portata in posizione verticale o invertita dovrebbe funzionare. Il sistema MicroPoint includerà un dicroico personalizzato, che dovrebbe corrispondere al fluoroforo che le etichette delle celle che si desidera tagliare. Cellule taglio etichettati con fluorofori alternativa richiede dicroici aggiuntivi. Inoltre, un generatore di impulsi e pedale fornite con il sistema MicroPoint. </li><li> 100x, 1,4 NA obiettivo di petrolio per l&#39;esecuzione di interventi chirurgici e valutare la rigenerazione, oltre a obiettivi supplementari, se necessario per localizzare il campione sul vetrino. Usiamo un piano Nikon Apo VC per la chirurgia, e scoprire che un 4x è utile per la messa a fuoco grossolana e trovare il campione. </li><li> Motorizzato palco con joystick. Un palco con estrema precisione e ripetibilità elevate non è necessaria, dal momento che lo stadio viene utilizzato solo per il targeting. Noi utilizziamo un Priore OptiScan II (vedi la discussione). </li><li> Fotocamera. La fotocamera ha bisogno di fornire un frame rate sufficiente mettere a fuoco il bersaglio e neurite etichettati con l&#39;obiettivo 100x, mentre visualizzando l&#39;immagine sul monitor del computer. Noi preferiamo attenuare la luce dell&#39;illuminazione durante la procedura assotomia per evitare possibili effetti confondenti da fotometabolismo o danni (vedi 1.7, di seguito). Così, la fotocamera ha bisogno di essere abbastanza sensibile per ospitare questo livello ridotto di luce. Usiamo un Hamamatsu Orca 05G, e scoprire che l&#39;imaging a 16,3 Hz è sufficiente. Telecamere equivalente potrebbe essere sostituito. </li><li> Computer, monitor, e software di imaging che può guidare la macchina fotografica. Inoltre, si usa il software di imaging per manipolare la scena motorizzata con il mouse (vedi discussione). </li><li> Air tavolo. Questo requisito può variare a seconda della posizione, ma poiché la chirurgia è eseguita con un obiettivo 100x, troviamo isolamento dalle vibrazioni essenziali. </li><li> Fornitura di luce con guida di luce e il meccanismo di scatto per illuminare il fluoroforo. La guida di luce si collega alla MicroPoint. Il meccanismo dell&#39;otturatore è utile per ridurre l&#39;intensità dell&#39;illuminazione indipendentemente dal laser. Noi utilizziamo un Priore Lumen 200 o una Leica EL6000, e attenuare fino al 80% del totale per l&#39;intensità della luce assotomia. </li></ol> 2. Laser di setup Un protocollo dettagliato per allineare inizialmente e mettere a fuoco il laser viene fornito con il sistema laser MicroPoint. Non ci assumiamo tale procedura sia stata seguita con successo al momento della configurazione iniziale. Ciò include l&#39;allineamento del laser con il reticolo nell&#39;oculare. Qui forniamo un protocollo per la manutenzione ordinaria di messa a fuoco del laser e l&#39;intensità. Come notato nel manuale MicroPoint, il laser pulsato di azoto è in grado di danneggiare seriamente l&#39;occhio umano. Si deve prestare attenzione a guardare mai direttamente il raggio laser. Una volta installato, il filtro di sbarramento dovrebbe bloccare la radiazione in modo sicuro attraverso gli oculari. Taglio neuroni in un organismo delle dimensioni di un granello di sabbia può essere impegnativo. Poiché l&#39;area del danno fatto dal laser è molto piccolo, è essenziale conoscere la posizione tridimensionale di messa a fuoco del laser al fine di indirizzare il proprio campione. La messa a fuoco laser è trovato usando la diapositiva mirroring. In primo luogo, verifichiamo che la posizione z del fuoco del laser corrisponde al centro del percorso di imaging. Quindi, la posizione xy del fuoco danno è contrassegnato con croce nel software di imaging. Messa a fuoco nel piano z <ol><li> Spingere il filtro a densità neutra ND16 (Figura 1a). Noi usiamo i filtri a densità neutra nella epi-illuminazione percorso per attenuare il laser mentre ci si concentra. Per ancora più fini di messa a fuoco, spingere in entrambe le ND16 e ND4 filtri fluorescenti. </li><li> Impostare il laser MicroPoint a 1 impulso con l&#39;interruttore girato a &#39;Select&#39; (figura 1b), e quindi spostare la ruota portafiltri alla barriera filtro appropriato lungo-pass (Figura 1c). </li><li> Posizionare la diapositiva speculare sul palco e mettere a fuoco fori all&#39;interno di esso con l&#39;obiettivo 4X a luce trasmessa. </li><li> Aggiungere una goccia di olio di immersione alla diapositiva specchio e concentrarsi sui fori con l&#39;obiettivo 100X. Aperto l&#39;otturatore della fotocamera con il percorso ottico di commutazione leva (Figura 1d) e l&#39;otturatore laser (figura 1e). Se necessario, ridurre l&#39;intensità della luce trasmessa modo che i bordi dei fori per perno sono nitidi: questo sarà di aiuto nella messa a fuoco esattamente. </li><li> Premere il pedale. Questo dovrebbe produrre un piccolo foro nello specchio se il laser è focalizzato in modo corretto. </li><li> Messa a fuoco il microscopio leggermente sopra il piano della diapositiva specchio e sparare con il laser di nuovo. Questo dovrebbe fare un ancora più piccolobuco che il primo colpo, o non lasciano segno. Ripetere concentrandosi sotto la diapositiva mirroring. </li><li> Se il buco non è prodotto in 2,5, o se un buco più grande è prodotto quando concentrando sopra o sotto la superficie dello specchio, rimettere a fuoco il laser con l&#39;anello di messa a fuoco sulla testa ablazione. Verificare che il buco è ancora correttamente allineato con il reticolo nell&#39;oculare. Con l&#39;uso costante, il piano z necessario concentrarsi raramente da regolare. </li></ol> Messa a fuoco nel piano xy <ol start="8"><li> Seguire i passaggi da 2.1 a 2.3 e premere il pedale per fare un piccolo foro nella diapositiva specchio. </li><li> Iniziato &#39;Live&#39; modalità di cattura dal menu &#39;acquisire&#39; Elementi. Nella barra degli strumenti &#39;misura&#39; selezionare &#39;ROI editore&#39;, quindi selezionare lo strumento &#39;doppia croce&#39; e trascinare il mirino per allinearle con il centro del foro nuova. Fare clic su &#39;Salva ROI&#39; e poi &#39;Exit Editor&#39; e riprendere la modalità Live cattura. </li><li> Attivare il &#39;mouse XY&#39; impostazione in Elementi di manipolare il palco con il mouse. </li><li> Tirare il filtro a densità neutra (s) nella posizione originale (s), impostare gli impulsi laser a 10, e rimuovere il vetrino mirroring. </li></ol> Regolazione della potenza del laser <ol start="12"><li> La potenza del laser deve essere aggiustato per la potenza minima necessaria per tagliare il neurone di vostra scelta. Regolare la potenza spostando il piatto attenuatore (Figura 1f) mentre il taglio vermi che vivono (descritta sotto). Se la potenza del laser è troppo alta, può causare danni periferici o blastica un buco nel verme. Se la potenza del laser è troppo bassa, non rompere il neurone. Una volta che il sistema è stato istituito, la posizione attenuatore raramente necessita di essere cambiato. Se il laser diventa debole, e il piatto attenuatore deve essere spostato di continuare a tagliare, potrebbe essere un segno che il colorante nella cellula colorante deve essere sostituita (vedi discussione). </li></ol> 3. Immobilizzare i vermi <ol><li> Preparare una soluzione del 3% agarosio fuso in M9 (KH2PO4 22mm, Na2HPO4 42mm, 85mm NaCl, 1 mM MgSO4). Dispensare 5 ml di agarosio fuso in un tubo da 15 ml falco. Riempire un altro tubo con l&#39;acqua. Tubi posto in un elemento modulare di riscaldamento impostato a 55 ° C. Riempire la resistenza con l&#39;acqua per creare bagni di acqua mini per ogni tubo. Nota: agarosio può essere preparato in grandi quantità in anticipo e rifuso per esperimenti successivi. </li><li> Inserire due strati di nastro etichetta su ciascuna delle due diapositive e un vetrino pulito tra queste diapositive. Dispensare una goccia di agarosio utilizzando una pipetta di plastica lampadina al centro del vetrino pulito e un altro luogo perpendicular scivolare al primo in modo che le agarosio pad è lo spessore di due pezzi di nastro (Figura 2). Togliere uno dei due diapositive dal cuscinetto dopo 30 secondi. Sciacquare e memorizzare la pipetta in plastica pieno d&#39;acqua tubo falcon per l&#39;uso con diapositive successive. </li><li> Quindi, posto 3-5 l di 0,10 micron o 0,05 micron perle di polistirene al centro del pad. Aggiungi worm 5-10 esprimono proteine ​​fluorescenti nei neuroni di interesse. Se i neuroni di interesse sono asimmetricamente distribuiti sul lato destro o sinistro del worm, usare un plettro di platino per capovolgere i vermi in modo che il lato corretto è rivolto verso l&#39;alto. Worms devono essere collocati su vetrini entro 10 minuti di preparare il pad agarosio. </li><li> Attentamente luogo uno slittamento copertura sul worm. Dopo aver posizionato la polizza di copertura, non spostarlo rispetto al pad di agarosio come in questo ostacolerà la cuticola e distruggere il worm. Posizionare il vetrino preparato sul palco microscopio. </li></ol> 4. Tagliare i neuroni <ol><li> Luce diretta negli oculari con la leva di commutazione ottica percorso. Focus sulla vite senza fine da tagliare con l&#39;obiettivo 4X, una goccia di olio sul vetrino, e passare l&#39;obiettivo 100X. Restituire il percorso ottico alla fotocamera. </li><li> Usa il mouse per spostare il neurone di vostra scelta sotto il centro del mirino. Premere il pedale per il fuoco del laser e tagliare il processo neuronale. Se necessario, due serie di impulsi possono essere usati per tagliare il neurone. In un primo momento, è utile per tenere traccia con precisione quali neuroni sono state tagliate in vermi individuali al fine di valutare la rigenerazione successive. Quando eseguito correttamente, il laser assotomia produce una piccola pausa nel neurone senza causare danni significativi al tessuto cutaneo circostante o altri neuroni (Figura 3). In alcuni casi, una piccola cicatrice può formarsi intorno al luogo della ferita. </li><li> Recuperare i vermi rimuovendo il vetrino in un movimento diretto verso l&#39;alto, facendo attenzione che i vermi rimangono sulla rampa di agarosio. NON scorrere il copri off. Quindi, tagliare il pad in tutto il worm con punta a spillo pinze e posto la sezione di agarosio su un piatto appena seminato NGM contenente OP50 8. Introdurre 10 ml di sterili M9 sul pad per liberare i vermi dalle perline e rimuovere agarosio. </li></ol> 5. Punteggio per la rigenerazione dei neuroni <ol><li> Preparare agarosio pad come descritto al punto 2.2. </li><li> Worm posto in 3-5 &amp;mu, L di perle di polistirene. Applicare un vetrino coprioggetti. Le diapositive possono essere preparati in sequenza, o in alternativa tutti i vermi possono essere preparati in anticipo e le diapositive tenuti in piatti di cm 10 la cultura, ciascuno contenente un Kimwipe umido per mantenere umido il agarosio. </li><li> Utilizzare l&#39;obiettivo 100X di visualizzare i neuroni reciso. In molti neuroni, un ceppo neuronale distale al sito di taglio rimarrà. Noi usiamo la presenza di questo residuo come un&#39;indicazione che il neurone era effettivamente rotto (Figura 4). La presenza di questo ceppo permette di distinguere un neurone che è stato tagliato e rigenerato da uno che non è stata tagliata. Nota: entrambi i ceppi distali e prossimali inizialmente ritrattare dopo essere stato tagliato. </li><li> Valutare la rigenerazione. Una varietà di parametri possono essere determinati. Un test semplice è se il neurone infortunato ha formato un cono di crescita (Figura 4a) e rigenerati, o no (Figura 4b). In alternativa, la lunghezza dei neuriti possono essere rintracciati e confrontati. </li></ol> 6. Rappresentante risultati Come esempio, si descrive la caratterizzazione di rigenerazione del γ-aminobutirrico (GABA) motoneuroni. Questi neuroni, che risiedono nel cordone nervoso ventrale ed estendere i processi la circonferenza del cordone nervoso dorsale, sono essenziali per la locomozione proprio 9. Neuroni GABA può essere visualizzata esprimendo un fluoroforo geneticamente codificato, come la proteina fluorescente verde (GFP), sotto il controllo del -47 unc unc o -25 promotori (ceppi EG1285 e CZ1200, rispettivamente, disponibile presso il C. elegans Centro Genetico ). Monte L4-stadio worm come descritto, capovolgere i vermi così i neuroni GABA su un fianco destro sono rivolti verso l&#39;alto, e posto il vetrino. Tagliate 1-3 di commessure posteriore in ogni metà strada senza fine, tra le corde dorsale e ventrale. Evitare di tagliare commissure che si incrociano o fasciculate commissure con altri, in quanto questi sono difficili da punteggio più tardi. Recupera worm come descritto. 18 a 24 ore dopo un assotomia successo, i vermi avranno recuperato da un intervento chirurgico ed esporre locomotore normale e la deposizione delle uova comportamenti. Eliminare i vermi che sono morti o malati. Rimontare il resto come descritto, e valutare la rigenerazione. Di solito scopo di valutare almeno 30 neuroni per tagliare condizione sperimentale. In oxIs12 animali, di solito 60-70% dei neuroni GABA mozzata L4 avrà inizio una struttura cono di crescita, evidenziato da un ampliamento della membrana in punta e l&#39;estensione dei neuriti rami diversi, e migrati dal sito di taglio (Figura 4a). In molti casi, i coni di crescita si sono migrati a riconnettersi con il cordone nervoso dorsale, una commessura adiacente neuronale, o il moncone distale. Il restante 30% dei neuroni avranno sia iniziata alcuna crescita, formando un moncone prossimale al sito di assotomia, o che hanno esteso solo piccole filopodia (Fig. 4b). <img src="/files/ftp_upload/2707/2707fig1.jpg" alt="Figura 1"/> Figura 1. L&#39;UV laser pulsato sistema assotomia. Componenti specifici sono: (a) I filtri ND (b) impulso selettore (c) la leva ruota portafiltri (d) di cammino ottico di commutazione leva (e) otturatore laser e (f) piatto attenuatore. <img src="/files/ftp_upload/2707/2707fig2.jpg" alt="Figura 2"/> Figura 2. Preparazione di un pad agarosio. Per preparare un pad agarosio dello spessore desiderato, due strati di nastro (verde) sono disposti su due colonne. Una diapositiva è posta tra le prime due, e una goccia di agarosio viene quindi aggiunto il vetrino pulito. Infine, una diapositiva quarto è posizionato perpendicolarmente alle prime tre, risultando in un pad che è lo spessore di due pezzi di nastro. <img src="/files/ftp_upload/2707/2707fig3.jpg" alt="Figura 3"/> Figura 3. Rappresentante dei neuroni GABA axotomies. In un tipico esperimento, GABA commissure neurone sono tagliato al centro della faccia laterale del worm. Una commessura mozzata è mostrata immediatamente prima (pannello di sinistra) e dopo (pannello di destra) assotomia. Tutte le immagini sono state scattate con un obiettivo 100X olio. <img src="/files/ftp_upload/2707/2707fig4.jpg" alt="Figura 4"/> Figura 4. Risultati rappresentativi di GABA axotomies neurone. 24 ore post-assotomia assoni reciso sono segnati per la rigenerazione. Un assone rigenerante con un cono di crescita (freccia) è mostrato in (a), mentre un non-rigenerazione dell&#39;assone è visto come un moncone prossimale (freccia) a (b). Il moncone distale di ciascun assone taglio viene mostrato in ogni pannello (punta di freccia) ed è un&#39;indicazione che l&#39;assone è stata interrotta.

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	<li>Hammarlund, M., Nix, P., Hauth, L., Jorgensen, E. M., Bastiani, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axon+regeneration+requires+a+conserved+MAP+kinase+pathway.">Axon regeneration requires a conserved MAP kinase pathway.</a> Science. 323, 802-806 (2009).</li><li>Ghosh-Roy, A., Wu, Z., Goncharov, A., Jin, Y., Chisholm, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+and+Cyclic+AMP+Promote+Axonal+Regeneration+in+Caenorhabditis+elegans+and+Require+DLK-1+Kinase.">Calcium and Cyclic AMP Promote Axonal Regeneration in Caenorhabditis elegans and Require DLK-1 Kinase.</a> Journal of Neuroscience. 30, 3175-3183 (2010).</li><li>Wu, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caenorhabditis+elegans+neuronal+regeneration+is+influenced+by+life+stage,+ephrin+signaling,+and+synaptic+branchi+ng.">Caenorhabditis elegans neuronal regeneration is influenced by life stage, ephrin signaling, and synaptic branchi ng.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 104, 15132-15137 (2007).</li><li>Yan, D., Wu, Z., Chisholm, A. D., Jin, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+DLK-1+Kinase+Promotes+mRNA+Stability+and+Local+Translation+in+C.+elegans+Synapses+and+Axon+Regeneration.">The DLK-1 Kinase Promotes mRNA Stability and Local Translation in C. elegans Synapses and Axon Regeneration.</a> Cell. 138, 1005-1018 (2009).</li><li>Yanik, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurosurgery:+Functional+regeneration+after+laser+axotomy.">Neurosurgery: Functional regeneration after laser axotomy.</a> Nature. 432, 822-822 (2004).</li><li>Gabel, C. V., Antoine, F., Chuang, C., Samuel, A. D. T., Chang, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+nanosecond+laser+axotomy:+cavitation+dynamics+and+vesicle+transport.">In vivo nanosecond laser axotomy: cavitation dynamics and vesicle transport.</a> Optics Express. 16, 9884-9894 (2008).</li><li>Rao, G. N., Kulkarni, S. S., Koushika, S. P., Rau, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+nanosecond+laser+axotomy:+cavitation+dynamics+and+vesicle+transport.">In vivo nanosecond laser axotomy: cavitation dynamics and vesicle transport.</a> Optics Express. 16, 9884-9894 (2008).</li><li>Wood, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Nematode+Caenorhabditis+Elegans.">The Nematode Caenorhabditis Elegans.</a> , (1988).</li><li>McLntire, S. L., Jorgensen, E., Kaplan, J., Horvitz, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+GABAergic+nervous+system+of+Caenorhabditis+elegans.">The GABAergic nervous system of Caenorhabditis elegans.</a> Nature. 364, 337-341 (1993).</li><li>Bourgeois, F., Ben-Yakar, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Femtosecond+laser+nanoaxotomy+properties+and+their+effect+on+axonal+recovery+in.">Femtosecond laser nanoaxotomy properties and their effect on axonal recovery in.</a> C. elegans. Optics Express. 15, 8521-8531 (2007).</li><li>Chung, S., Mazur, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Femtosecond+laser+ablation+of+neurons+in+C.+elegans+for+behavioral+studies.">Femtosecond laser ablation of neurons in C. elegans for behavioral studies.</a> Applied Physics A: Materials Science &#38; Processing. 96, 335-341 (2009).</li><li>Steinmeyer, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Construction+of+a+femtosecond+laser+microsurgery+system.">Construction of a femtosecond laser microsurgery system.</a> Nature Protocols. 5, 395-407 (2010).</li><li>Wang, Z., Jin, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+dissection+of+axon+regeneration.+Current+Opinion+in+Neurobiology.">Genetic dissection of axon regeneration. Current Opinion in Neurobiology.</a> , (2010).</li><li>Huang, X., Cheng, H. -. J., Tessier-Lavigne, M., Jin, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MAX-1,+a+Novel+PH/MyTH4/FERM+Domain+Cytoplasmic+Protein+Implicated+in+Netrin-Mediated+Axon+Repulsion.">MAX-1, a Novel PH/MyTH4/FERM Domain Cytoplasmic Protein Implicated in Netrin-Mediated Axon Repulsion.</a> Neuron. 34, 563-576 (2002).</li><li>McIntire, S. L., Reimer, R. J., Schuske, K., Edwards, R. H., Jorgensen, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+characterization+of+the+vesicular+GABA+transporter.">Identification and characterization of the vesicular GABA transporter.</a> Nature. 389, 870-876 (1997).</li><li>Fang-Yen, C., Gabel, C. V., Samuel, A. D. T., Bargmann, C. I., Avery, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Laser microsurgery in C. elegans in Methods in Cell Biology: Caenorhabditis elegans: Modern Biological Analysis of an Organism. , .</li><li>Guo, S. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Femtosecond+laser+nanoaxotomy+lab-on-a-chip+for+in+vivo+nerve+regeneration+studies.">Femtosecond laser nanoaxotomy lab-on-a-chip for in vivo nerve regeneration studies.</a> Nature Methods. 5, 531-533 (2008).</li><li>Zeng, F., Rohde, C. B., Yanik, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sub-cellular+precision+on-chip+small-animal+immobilization,+multi-photon+imaging+and+femtosecond-laser+manipulation.">Sub-cellular precision on-chip small-animal immobilization, multi-photon imaging and femtosecond-laser manipulation.</a> Lab on a Chip. 8, 653-656 (2008).</li><li>Rohde, C. B., Zeng, F., Gonzalez-Rubio, R., Angel, M., Yanik, M. F., F, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+system+for+on-chip+high-throughput+whole-animal+sorting+and+screening+at+subcellular+resolution.">Microfluidic system for on-chip high-throughput whole-animal sorting and screening at subcellular resolution.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 104, 13891-13895 (2007).</li><li>Hulme, S. E., Shevkoplyas, S. S., Apfeld, J., Fontana, W., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+microfabricated+array+of+clamps+for+immobilizing+and+imaging+C.+elegans.">A microfabricated array of clamps for immobilizing and imaging C. elegans.</a> Lab on a Chip. 7, 1515-1523 (2007).</li><li>Ben-Yakar, A., Chronis, N., Lu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidics+for+the+analysis+of+behavior,+nerve+regeneration,+and+neural+cell+biology+in+C.+elegans.">Microfluidics for the analysis of behavior, nerve regeneration, and neural cell biology in C. elegans.</a> Current Opinion in Neurobiology. 19, 561-567 (2009).</li><li>Samara, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-scale+in+vivo+femtosecond+laser+neurosurgery+screen+reveals+small-molecule+enhancer+of+regeneration.">Large-scale in vivo femtosecond laser neurosurgery screen reveals small-molecule enhancer of regeneration.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. , (2010).</li><li>Nelson, F. K., Riddle, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+study+of+the+Caenorhabditis+elegans+secretory-excretory+system+using+laser+microsurgery.">Functional study of the Caenorhabditis elegans secretory-excretory system using laser microsurgery.</a> Journal of Experimental Zoology. 231, 45-56 (1984).</li><li>Sulston, J. E., White, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+and+cell+autonomy+during+postembryonic+development+of+Caenorhabditis+elegans.">Regulation and cell autonomy during postembryonic development of Caenorhabditis elegans.</a> Developmental Biology. 78, 577-597 (1980).</li><li>Kimble, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alterations+in+cell+lineage+following+laser+ablation+of+cells+in+the+somatic+gonad+of+Caenorhabditis+elegans.">Alterations in cell lineage following laser ablation of cells in the somatic gonad of Caenorhabditis elegans.</a> Developmental Biology. 87, 286-300 (1981).</li><li>Allen, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-synapse+ablation+and+long-term+imaging+in+live+C.+elegans.">Single-synapse ablation and long-term imaging in live C. elegans.</a> Journal of Neuroscience Methods. 173, 20-26 (2008).</li><li>Pujol, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+Innate+Immune+Responses+to+Infection+and+Wounding+in+the+C.+elegans+Epidermis.">Distinct Innate Immune Responses to Infection and Wounding in the C. elegans Epidermis.</a> Current biology. CB 18, 481-489 (2008).</li></ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Una varietà di sistemi laser sono stati utilizzati per tagliare neuriti in C. elegans, e diversi studi hanno esaminato le loro prestazioni in dettaglio 3,7,10,11. Il laser MicroPoint utilizzati nel nostro protocollo è un sistema chiavi in ​​mano che è facile da installare e mantenere, ed è disponibile a basso costo per i ricercatori rispetto a un Ti-zaffiro sistema laser. Rispetto ad un sistema Ti-zaffiro, comunque, il laser MicroPoint si prevede di causare danni ad un&#39;area più ampia, che può essere svantaggioso per alcune applicazioni. Se un Ti-zaffiro sistema si desidera, un protocollo eccellente sulla costruzione di tale sistema è disponibile 12. L&#39;attuale protocollo può essere eseguito su una varietà di neuroni in C. elegans, tuttavia, si nota che le differenze di capacità rigenerative tra diversi tipi di neuroni sono attesi 13. Inoltre, diversi background transgenici possono influenzare il successo rigenerativa. Anche se la percentuale di rigenerare i neuroni GABA è abbastanza coerente tra diversi ceppi marcatore transgenici, abbiamo notato un aumento complessivo lieve recupero in juIs76 14 vs 15 oxIs12 vermi. Le differenze tra i marker dei neuroni contatto sono stati anche descritti 2. Noi preferiamo immobilizzare il worm con microsfere piuttosto che anestetici come le perline risultato più veloce e immobilizzazione più coerente 16. Questo è anche vantaggioso come siamo in grado di osservare la rigenerazione privi di possibili effetti di confusione a causa di anestesia 17. Un&#39;alternativa anestetico senza metodo di immobilizzazione è l&#39;uso di dispositivi microfluidici. L&#39;uso di microfluidica per assotomia è stato ampiamente descritto 17-22. Troviamo che con l&#39;uso costante, le funzioni laser meglio quando la cumarina 440 nella cella colorante viene cambiata una volta ogni settimana seguendo la procedura descritta nel manuale MicroPoint. Se necessario, il dispositivo di scorrimento attenuazione può essere utilizzato per aumentare la potenza, ma questo può essere un&#39;indicazione di colorante vecchi o disallineamento laser. Inoltre, la cellula colorante ha una durata limitata e alla fine devono essere ricostruiti o sostituiti (Vedere Risoluzione dei problemi). Può essere difficile da manovrare i neuriti bersaglio sotto il mirino che segnano il fuoco del laser, in particolare se l&#39;animale è completamente paralizzato. Troviamo che una fase manuale non è ottimale per questo scopo, anche se è certamente utilizzabile. Un joystick controllato stadio motorizzato è più precisa, e troviamo che l&#39;uso di software che supporta l&#39;immagine trascinando con il mouse per spostare lo stadio motorizzato è il migliore. Elementi Nikon offre questa caratteristica ed è descritto in questo protocollo, ma il pacchetto Micromanager libero, così come altri software di imaging, può avere funzionalità simili. Un modo diverso di targeting multa è di spostare il fuoco del laser, piuttosto che l&#39;animale. Un fascio-direzione meccanismo galvanometro è disponibile come add-on per il laser MicroPoint, se questo approccio è preferito. Oltre alla sua applicazione allo studio della rigenerazione neuronale, il laser può essere usata per l&#39;ablazione altri tipi di cellule, come la pelle, muscolo, o di cellule specializzate, o di distruggere specifiche sinapsi neuronali 23-27. Inoltre, i percorsi che regolano la degenerazione dei neuroni che accompagna infortunio o malattia potrebbe essere indagata con questo sistema. Come tale, l&#39;uso di laser pulsati continuerà a far luce su entrambi i fattori genetici ed i cambiamenti delle cellule biologiche che favoriscono la rigenerazione neuronale e altri processi pertinenti. Risoluzione dei problemi: Qui descritte sono alcuni problemi comuni e le loro soluzioni associate. <ol type="a"><li> Il laser non è il taglio in modo corretto. Ciò è probabilmente perché o il laser è fuori fuoco (vedi sezione 2), o il colorante nella cellula colorante deve essere sostituita (vedi MicroPoint manuale). In alternativa, la cellula colorante può essere necessario sostituire o ricostruire. </li><li> I vermi si muovono su agarosio pad. Questo è generalmente un segno che il pad agarosio è troppo umida. Troviamo che pattini devono essere lasciati per circa 30 secondi prima che i vermi sono posti su di loro per aggirare questo problema. Potete anche provare a utilizzare più piccole dimensioni (0,05 micron) microsfere. </li><li> Il recupero di worm è difficile e inefficiente. Ciò può essere causato dalla rimozione coprioggetto non corretto o da un tampone a secco agarosio. Se il pad è troppo secca, si può notare che gli assoni sviluppare un aspetto in rilievo. In alcuni casi, questo avviene perché i vermi non sono stati immessi sul pad abbastanza presto dopo che è stato fatto. In alternativa, un vecchio magazzino della soluzione di agarosio possono presentare una concentrazione superiore al 3% dopo la fusione ripetuti. </li></ol>

<table border="1"><tbody><tr><th> Nome del reagente </th><th> Azienda </th><th> Numero di catalogo </th><th> Commenti </th></tr><tr><td> Perle di polistirene 0,05 micron </td><td> Polysciences, Inc. </td><td> 08691 </td><td></td></tr><tr><td> Perle di polistirene 0,10 micron </td><td> Polysciences, Inc. </td><td> 00876 </td><td></td></tr><tr><td> Agarosio GPG / LE </td><td> Americano Bioanalytical </td><td> 00972 </td><td> Ultra pura </td></tr><tr><td> Falcon 14 polistirolo ml a fondo rotondo Tubo </td><td> BD Biosciences </td><td> 352057 </td><td> 17 x 100 stile mm, apirogeno </td></tr><tr><td> Thermo Scientific Pianura vetrini da microscopio predepurata </td><td> Erie Scientifica Azienda </td><td> 420-004T </td><td> 3 &quot;x 1&quot; x 1 mm </td></tr><tr><td> Copertura Slips </td><td> VWR </td><td> 48366 205 </td><td> 18 millimetri x 18 mm n ° 1 1 / 2 </td></tr><tr><td> KIMTECH Scienza Kimwipes </td><td> Kimberly-Clark </td><td> 34155 </td><td></td></tr><tr><td> BD Falcon 100 x 15mm Piatto Stile Petri </td><td> BD Biosciences </td><td> 351029 </td><td></td></tr><tr><td> Nastro vuoto 3/4w x 500L </td><td> TimeMed </td><td> T-512 </td><td></td></tr><tr><td> Olio di immersione </td><td> Nikon </td><td></td><td> Tipo A, nd = 1,515 </td></tr><tr><td> EG1285 o CZ1200 </td><td> C. elegans Centro Genetico </td><td> http://www.cbs.umn.edu/CGC/strains/ </td><td></td></tr><tr><td> OptiScan II </td><td> PRIMA scientifico </td><td></td><td></td></tr><tr><td> NIS-Elements Ar o Br </td><td> Nikon </td><td></td><td></td></tr><tr><td> MicroPoint Ablazione Laser System </td><td> Fotonici scientifico </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Microscopio composto </td><td> Nikon </td><td> Eclipse 80i </td><td></td></tr><tr><td> Hamamatsu Camera </td><td> Hamamatsu Photonics </td><td> Modello C8484-05G01 </td><td></td></tr><tr><td> Dell Precision T3400 PC con processore Intel Core 2 Duo </td><td> Conca </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Windows XP Professional </td><td></td><td> Microsoft </td><td> Versione 2002, Serie Pack 3 </td></tr><tr><td> Doppio bagno secco Incubator </td><td> Fisher Scientific </td><td></td><td> Controlli analogici </td></tr><tr><td> 4X Plan Fluor obiettivo </td><td> Nikon </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 100X Apo Piano obiettivo olio VC </td><td> Nikon </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Dumont # 5 / 45 forcipe </td><td> Dumont </td><td> 11251-35 </td><td> Dumoxel punte standard, può anche usare # 7 </td></tr><tr><td> Microscopio da dissezione </td><td> Nikon </td><td> SMZ800 </td><td> Con NI-150 Illuminatore ad alta intensità </td></tr></tbody></table>

in vivo laser axotomy in c. elegans

I neuroni di comunicare con altre cellule tramite assoni e dendriti, le estensioni della membrana sottile che contengono specializzazioni pre-o post-sinaptica. Se un neurone è danneggiato da lesioni o malattie, può rigenerare. Fattori Cell-intrinseci ed estrinseci influenzare la capacità di un neurone per rigenerare e ripristinare la funzione. Recentemente, il nematode C. elegans è emerso come un organismo modello eccellente per identificare i geni e le vie di segnalazione che influenzano la rigenerazione dei neuroni 1-6. Il modo principale per avviare la rigenerazione neuronale in C. elegans è mediata da taglio laser, o assotomia. Durante assotomia, un processo di fluorescenza marcata neuronale viene reciso con impulsi ad alta energia. Inizialmente, la rigenerazione neuronale in C. elegans è stata esaminata utilizzando un laser a femtosecondi amplificato 5. Tuttavia, gli studi rigenerazione successivi hanno dimostrato che un laser a impulsi convenzionale può essere usato per tagliare con precisione i neuroni in vivo e di suscitare una risposta simile rigenerativa 1,3,7. Vi presentiamo un protocollo per l&#39;esecuzione in vivo laser in assotomia il worm utilizzando un MicroPoint laser pulsato, un sistema chiavi in mano che è prontamente disponibile e che è stato ampiamente utilizzato per l&#39;ablazione delle cellule bersaglio. Descriviamo allineando il laser, il montaggio del worm, il taglio neuroni specifici, e valutare la rigenerazione successive. Il sistema fornisce la possibilità di tagliare un gran numero di neuroni in più vermi durante un esperimento. Così, laser assotomia come descritto nel presente documento è un sistema efficiente per l&#39;avvio e analisi del processo di rigenerazione.

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In vivo Laser Axotomy in C. elegans

Un protocollo per ridurre i neuroni in<em&gt; C. elegans</em&gt; Con un laser pulsato MicroPoint è presentato. Ci descrivono la configurazione del sistema, immobilizzare worm e recidendo i neuroni etichettati. I vantaggi includono un sistema relativamente a basso costo e la possibilità di tagliare i processi neuronali o cellule ablazione<em&gt; In vivo</em&gt;.

In vivo Laser assotomia in C. elegans

Neurons communicate with other cells via axons and dendrites, slender membrane extensions that contain pre- or post-synaptic specializations. If a neuron ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

In vivo Laser Axotomy in C. elegans

18.1K Views.  Yale University School of Medicine. Un protocollo per ridurre i neuroni in C. elegans Con un laser pulsato MicroPoint è presentato. Ci descrivono la configurazione del sistema, immobilizzare worm e recidendo i neuroni etichettati. I vantaggi includono un sistema relativamente a basso costo e la possibilità di tagliare i processi neuronali o cellule ablazione In vivo.

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Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

The targeting and refinement of RGC projections to the midbrain is a popular and powerful model system for studying how precise patterns of neural connectivity form during development. In mice, retinofugal projections are arranged in a topographic manner and form eye-specific layers in the Lateral Geniculate Nucleus (dLGN) of the thalamus and the Superior Colliculus (SC). The development of these precise patterns of retinofugal projections has typically been studied by labeling populations of RGCs with fluorescent dyes and tracers, such as horseradish peroxidase1-4. However, these methods are too coarse to provide insight into developmental changes in individual RGC axonal arbor morphology that are the basis of retinotopic map formation. They also do not allow for the genetic manipulation of RGCs.
Recently, electroporation has become an effective method for providing precise spatial and temporal control for delivery of charged molecules into the retina5-11. Current retinal electroporation protocols do not allow for genetic manipulation and tracing of retinofugal projections of a single or small cluster of RGCs in postnatal mice. It has been argued that postnatal in vivo electroporation is not a viable method for transfecting RGCs since the labeling efficiency is extremely low and hence requires targeting at embryonic ages when RGC progenitors are undergoing differentiation and proliferation6. 
In this video we describe an in vivo electroporation protocol for targeted delivery of genes, shRNA, and fluorescent dextrans to murine RGCs postnatally. This technique provides a cost effective, fast and relatively easy platform for efficient screening of candidate genes involved in several aspects of neural development including axon retraction, branching, lamination, regeneration and synapse formation at various stages of circuit development. In summary we describe here a valuable tool which will provide further insights into the molecular mechanisms underlying sensory map development.

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

We demonstrate an in vivo electroporation protocol for transfecting single or small clusters of retinal ganglion cells (RGCs) and other retinal cell types in postnatal mice over a wide range of ages. The ability to label and genetically manipulate postnatal RGCs in vivo is a powerful tool for developmental studies.

Trasfezione delle cellule gangliari della retina di topo In vivo Elettroporazione

The targeting and refinement of RGC projections to the midbrain is a popular and powerful model system for studying how precise patterns of neural ...

Ricerca

Neuroscienze

Functional Neuroimaging Using Ultrasonic Blood-brain Barrier Disruption and Manganese-enhanced MRI

Although mice are the dominant model system for studying the genetic and molecular underpinnings of neuroscience, functional neuroimaging in mice remains technically challenging. One approach, Activation-Induced Manganese-enhanced MRI (AIM MRI), has been used successfully to map neuronal activity in rodents 1-5. In AIM MRI, Mn2+ acts a calcium analog and accumulates in depolarized neurons 6,7. Because Mn2+ shortens the T1 tissue property, regions of elevated neuronal activity will enhance in MRI. Furthermore, Mn2+ clears slowly from the activated regions; therefore, stimulation can be performed outside the magnet prior to imaging, enabling greater experimental flexibility. However, because Mn2+ does not readily cross the blood-brain barrier (BBB), the need to open the BBB has limited the use of AIM MRI, especially in mice.
One tool for opening the BBB is ultrasound. Though potentially damaging, if ultrasound is administered in combination with gas-filled microbubbles (i.e., ultrasound contrast agents), the acoustic pressure required for BBB opening is considerably lower. This combination of ultrasound and microbubbles can be used to reliably open the BBB without causing tissue damage 8-11.
Here, a method is presented for performing AIM MRI by using microbubbles and ultrasound to open the BBB. After an intravenous injection of perflutren microbubbles, an unfocused pulsed ultrasound beam is applied to the shaved mouse head for 3 minutes. For simplicity, we refer to this technique of BBB Opening with Microbubbles and UltraSound as BOMUS 12. Using BOMUS to open the BBB throughout both cerebral hemispheres, manganese is administered to the whole mouse brain. After experimental stimulation of the lightly sedated mice, AIM MRI is used to map the neuronal response.
To demonstrate this approach, herein BOMUS and AIM MRI are used to map unilateral mechanical stimulation of the vibrissae in lightly sedated mice 13. Because BOMUS can open the BBB throughout both hemispheres, the unstimulated side of the brain is used to control for nonspecific background stimulation. The resultant 3D activation map agrees well with published representations of the vibrissae regions of the barrel field cortex 14. The ultrasonic opening of the BBB is fast, noninvasive, and reversible; and thus this approach is suitable for high-throughput and/or longitudinal studies in awake mice.

A technique is described for broadly opening the blood-brain barrier in the mouse using microbubbles and ultrasound. Using this technique, manganese can be administered to the mouse brain. Because manganese is an MRI contrast agent that accumulates in depolarized neurons, this approach enables imaging of neuronal activity.

Neuroimaging funzionale con l&#39;impiego dell&#39;ecografia emato-encefalica e la barriera di Turbativa del Manganese-enhanced MRI

Although mice are the dominant model system for studying the genetic and molecular underpinnings of neuroscience, functional neuroimaging in mice remains ...

Automated Quantification of Synaptic Fluorescence in C. elegans

Synapse strength refers to the amplitude of postsynaptic responses to presynaptic neurotransmitter release events, and has a major impact on overall neural circuit function. Synapse strength critically depends on the abundance of neurotransmitter receptors clustered at synaptic sites on the postsynaptic membrane. Receptor levels are established developmentally, and can be altered by receptor trafficking between surface-localized, subsynaptic, and intracellular pools, representing important mechanisms of synaptic plasticity and neuromodulation. Rigorous methods to quantify synaptically-localized neurotransmitter receptor abundance are essential to study synaptic development and plasticity. Fluorescence microscopy is an optimal approach because it preserves spatial information, distinguishing synaptic from non-synaptic pools, and discriminating among receptor populations localized to different types of synapses. The genetic model organism Caenorhabditis elegans is particularly well suited for these studies due to the small size and relative simplicity of its nervous system, its transparency, and the availability of powerful genetic techniques, allowing examination of native synapses in intact animals.
Here we present a method for quantifying fluorescently-labeled synaptic neurotransmitter receptors in C. elegans. Its key feature is the automated identification and analysis of individual synapses in three dimensions in multi-plane confocal microscope output files, tabulating position, volume, fluorescence intensity, and total fluorescence for each synapse. This approach has two principal advantages over manual analysis of z-plane projections of confocal data. First, because every plane of the confocal data set is included, no data are lost through z-plane projection, typically based on pixel intensity averages or maxima. Second, identification of synapses is automated, but can be inspected by the experimenter as the data analysis proceeds, allowing fast and accurate extraction of data from large numbers of synapses. Hundreds to thousands of synapses per sample can easily be obtained, producing large data sets to maximize statistical power. Considerations for preparing C. elegans for analysis, and performing confocal imaging to minimize variability between animals within treatment groups are also discussed. Although developed to analyze C. elegans postsynaptic receptors, this method is generally useful for any type of synaptically-localized protein, or indeed, any fluorescence signal that is localized to discrete clusters, puncta, or organelles.
The procedure is performed in three steps: 1) preparation of samples, 2) confocal imaging, and 3) image analysis. Steps 1 and 2 are specific to C. elegans, while step 3 is generally applicable to any punctate fluorescence signal in confocal micrographs.

Automated Quantification of Synaptic Fluorescence in C. elegans

The abundance of neurotransmitter receptors clustered at synapses strongly influences synaptic strength. This method quantifies fluorescently-labeled neurotransmitter receptors in three dimensions with single-synapse resolution in C. elegans, allowing hundreds of synapses to be rapidly characterized within a single sample without distortions introduced by z-plane projection.

Quantificazione automatica di fluorescenza in Synaptic<em&gt; C. elegans</em

Synapse strength refers to the amplitude of postsynaptic responses to presynaptic neurotransmitter release events, and has a major impact on overall ...

C. elegans Tracking and Behavioral Measurement

We have developed instrumentation, image processing, and data analysis techniques to quantify the locomotory behavior of C. elegans as it crawls on the surface of an agar plate. For the study of the genetic, biochemical, and neuronal basis of behavior, C. elegans is an ideal organism because it is genetically tractable, amenable to microscopy, and shows a number of complex behaviors, including taxis, learning, and social interaction1,2. Behavioral analysis based on tracking the movements of worms as they crawl on agar plates have been particularly useful in the study of sensory behavior3, locomotion4, and general mutational phenotyping5. Our system works by moving the camera and illumination system as the worms crawls on a stationary agar plate, which ensures no mechanical stimulus is transmitted to the worm. Our tracking system is easy to use and includes a semi-automatic calibration feature. A challenge of all video tracking systems is that it generates an enormous amount of data that is intrinsically high dimensional. Our image processing and data analysis programs deal with this challenge by reducing the worms shape into a set of independent components, which comprehensively reconstruct the worms behavior as a function of only 3-4 dimensions6,7. As an example of the process we show that the worm enters and exits its reversal state in a phase specific manner.

C. elegans Tracking and Behavioral Measurement

We have developed a video-rate tracking microscope system that can record and quantify C. elegans behavior at high resolution and high speeds. We have also developed computational methods to reduce the dimensionality of the worm images to a fundamental set of measurements that completely describe the shape of the worm.

C. elegans Monitoraggio e valutazione del comportamento

We have developed instrumentation, image processing, and data analysis techniques to quantify the locomotory behavior of C. elegans as it crawls on the ...

A Molecular Readout of Long-term Olfactory Adaptation in C. elegans

During sustained stimulation most sensory neurons will adapt their response by decreasing their sensitivity to the signal. The adaptation response helps shape attention and also protects cells from over-stimulation. Adaptation within the olfactory circuit of C. elegans was first described by Colbert and Bargmann1,2. Here, the authors defined parameters of the olfactory adaptation paradigm, which they used to design a genetic screen to isolate mutants defective in their ability to adapt to volatile odors sensed by the Amphid Wing cells type C (AWC) sensory neurons. When wildtype C. elegans animals are exposed to an attractive AWC-sensed odor3 for 30 min they will adapt their responsiveness to the odor and will then ignore the adapting odor in a chemotaxis behavioral assay for ~1 hr. When wildtype C. elegans animals are exposed to an attractive AWC-sensed odor for ~1 hr they will then ignore the adapting odor in a chemotaxis behavioral assay for ~3 hr. These two phases of olfactory adaptation in C. elegans were described as short-term olfactory adaptation (induced after 30 min odor exposure), and long-term olfactory adaptation (induced after 60 min odor exposure). Later work from L'Etoile et al.,4 uncovered a Protein Kinase G (PKG) called EGL-4 that is required for both the short-term and long-term olfactory adaptation in AWC neurons. The EGL-4 protein contains a nuclear localization sequence that is necessary for long-term olfactory adaptation responses but dispensable for short-term olfactory adaptation responses in the AWC4. By tagging EGL-4 with a green fluorescent protein, it was possible to visualize the localization of EGL-4 in the AWC during prolonged odor exposure. Using this fully functional GFP-tagged EGL-4 (GFP::EGL-4) molecule we have been able to develop a molecular readout of long-term olfactory adaptation in the AWC5. Using this molecular readout of olfactory adaptation we have been able to perform both forward and reverse genetic screens to identify mutant animals that exhibit defective subcellular localization patterns of GFP::EGL-4 in the AWC6,7. Here we describe: 1) the construction of GFP::EGL-4 expressing animals; 2) the protocol for cultivation of animals for long-term odor-induced nuclear translocation assays; and 3) the scoring of the long-term odor-induced nuclear translocation event and recovery (re-sensitization) from the nuclear GFP::EGL-4 state.

A Molecular Readout of Long-term Olfactory Adaptation in C. elegans

Here we describe a molecular readout of long-term olfactory adaptation in Caenorhabditis elegans. The Protein Kinase G, EGL-4, is necessary for stable adaptation responses in the primary sensory neuron pair called AWC. During prolonged odor exposure EGL-4 translocates from the cytosol to nucleus of the AWC.

Una lettura molecolare di lungo termine adattamento olfattivo nel<em&gt; C. elegans</em

During sustained stimulation most sensory neurons will adapt their response by decreasing their sensitivity to the signal. The adaptation response helps ...

In vivo Neuronal Calcium Imaging in C. elegans

The nematode worm C. elegans is an ideal model organism for relatively simple, low cost neuronal imaging in vivo. Its small transparent body and simple, well-characterized nervous system allows identification and fluorescence imaging of any neuron within the intact animal. Simple immobilization techniques with minimal impact on the animal's physiology allow extended time-lapse imaging. The development of genetically-encoded calcium sensitive fluorophores such as cameleon 1 and GCaMP 2 allow in vivo imaging of neuronal calcium relating both cell physiology and neuronal activity. Numerous transgenic strains expressing these fluorophores in specific neurons are readily available or can be constructed using well-established techniques. Here, we describe detailed procedures for measuring calcium dynamics within a single neuron in vivo using both GCaMP and cameleon. We discuss advantages and disadvantages of both as well as various methods of sample preparation (animal immobilization) and image analysis. Finally, we present results from two experiments: 1) Using GCaMP to measure the sensory response of a specific neuron to an external electrical field and 2) Using cameleon to measure the physiological calcium response of a neuron to traumatic laser damage. Calcium imaging techniques such as these are used extensively in C. elegans and have been extended to measurements in freely moving animals, multiple neurons simultaneously and comparison across genetic backgrounds. C. elegans presents a robust and flexible system for in vivo neuronal imaging with advantages over other model systems in technical simplicity and cost.

In vivo Neuronal Calcium Imaging in C. elegans

With its small transparent body, well-documented neuroanatomy and a host of amenable genetic techniques and reagents, C. elegans makes an ideal model organism for in vivo neuronal imaging using relatively simple, low-cost techniques. Here we describe single neuron imaging within intact adult animals using genetically encoded fluorescent calcium indicators.

In vivo imaging di calcio neuronale in C. elegans

The nematode worm C. elegans is an ideal model organism  for relatively simple, low cost neuronal imaging in vivo. Its small transparent body and simple, ...

Visualizing Neuroblast Cytokinesis During C. elegans Embryogenesis

This protocol describes the use of fluorescence microscopy to image dividing cells within developing Caenorhabditis elegans embryos. In particular, this protocol focuses on how to image dividing neuroblasts, which are found underneath the epidermal cells and may be important for epidermal morphogenesis. Tissue formation is crucial for metazoan development&#160;and relies on external cues from neighboring tissues. C. elegans is an excellent model organism to study tissue morphogenesis in vivo due to its transparency and simple organization, making its tissues easy to study via microscopy. Ventral enclosure is the process where the ventral surface of the embryo is covered by a single layer of epithelial cells. This event is thought to be facilitated by the underlying neuroblasts, which provide chemical guidance cues to mediate migration of the overlying epithelial cells. However, the neuroblasts are highly proliferative and also may act as a mechanical substrate for the ventral epidermal cells. Studies using this experimental protocol could uncover the importance of intercellular communication during tissue formation, and could be used to reveal the roles of genes involved in cell division within developing tissues.

Visualizing Neuroblast Cytokinesis During C. elegans Embryogenesis

This protocol describes how to image dividing cells within a tissue in Caenorhabditis elegans embryos. While several protocols describe how to image cell division in the early embryo, this protocol describes how to image cell division within a developing tissue during mid late embryogenesis.

Visualizzazione neuroblasti Citocinesi Durante<em&gt; C. elegans</em&gt; Embriogenesi

This protocol describes the use of fluorescence microscopy to image dividing cells within developing Caenorhabditis elegans embryos. In particular, this ...

Laser Nanosurgery of Cerebellar Axons In Vivo

Only a few neuronal populations in the central nervous system (CNS) of adult mammals show local regrowth upon dissection of their axon. In order to understand the mechanism that promotes neuronal regeneration, an in-depth analysis of the neuronal types that can remodel after injury is needed. Several studies showed that damaged climbing fibers are capable of regrowing also in adult animals1,2. The investigation of the time-lapse dynamics of degeneration and regeneration of these axons within their complex environment can be performed by time-lapse two-photon fluorescence (TPF) imaging in vivo3,4. This technique is here combined with laser surgery, which proved to be a highly selective tool to disrupt fluorescent structures in the intact mouse cortex5-9.
This protocol describes how to perform TPF time-lapse imaging and laser nanosurgery of single axonal branches in the cerebellum in vivo. Olivocerebellar neurons are labeled by anterograde tracing with a dextran-conjugated dye and then monitored by TPF imaging through a cranial window. The terminal portion of their axons are then dissected by irradiation with a Ti:Sapphire laser at high power. The degeneration and potential regrowth of the damaged neuron are monitored by TPF in vivo imaging during the days following the injury.

Laser Nanosurgery of Cerebellar Axons In Vivo

Two-photon imaging, coupled to laser nanodissection, are useful tools to study degenerative and regenerative processes in the central nervous system with subcellular resolution. This protocol shows how to label, image, and dissect single climbing fibers in the cerebellar cortex in vivo.

Laser nanochirurgia di cerebellari Assoni<em&gt; In Vivo</em

Only a few neuronal populations in the central nervous system (CNS) of adult mammals show local regrowth upon dissection of their axon. In order to ...

In Vivo Imaging of Dauer-specific Neuronal Remodeling in C. elegans

The mechanisms controlling stress-induced phenotypic plasticity in animals are frequently complex and difficult to study in vivo. A classic example of stress-induced plasticity is the dauer stage of C. elegans. Dauers are an alternative developmental larval stage formed under conditions of low concentrations of bacterial food and high concentrations of a dauer pheromone. Dauers display extensive developmental and behavioral plasticity. For example, a set of four inner-labial quadrant (IL2Q) neurons undergo extensive reversible remodeling during dauer formation. Utilizing the well-known environmental pathways regulating dauer entry, a previously established method for the production of crude dauer pheromone from large-scale liquid nematode cultures is demonstrated. With this method, a concentration of 50,000 - 75,000 nematodes/ml of liquid culture is sufficient to produce a highly potent crude dauer pheromone. The crude pheromone potency is determined by a dose-response bioassay. Finally, the methods used for in vivo time-lapse imaging of the IL2Qs during dauer formation are described.

In Vivo Imaging of Dauer-specific Neuronal Remodeling in C. elegans

Following exposure to specific environmental stressors, the nematode Caenorhabditis elegans undergoes extensive phenotypic plasticity to enter into a stress-resistant &#8216;dauer&#8217; juvenile stage. We present methods for the controlled induction and imaging of neuroplasticity during dauer.

In Vivo Imaging di Dauer-specifica neuronale ritocca in C. elegans

The mechanisms controlling stress-induced phenotypic plasticity in animals are frequently complex and difficult to study in vivo. A classic example of ...

Simultaneous ex vivo Functional Testing of Two Retinas by in vivo Electroretinogram System

An In vivo electroretinogram (ERG) signal is composed of several overlapping components originating from different retinal cell types, as well as noise from extra-retinal sources. Ex vivo ERG provides an efficient method to dissect the function of retinal cells directly from an intact isolated retina of animals or donor eyes. In addition, ex vivo ERG can be used to test the efficacy and safety of potential therapeutic agents on retina tissue from animals or humans. We show here how commercially available in vivo ERG systems can be used to conduct ex vivo ERG recordings from isolated mouse retinas. We combine the light stimulation, electronic and heating units of a standard in vivo system with custom-designed specimen holder, gravity-controlled perfusion system and electromagnetic noise shielding to record low-noise ex vivo ERG signals simultaneously from two retinas with the acquisition software included in commercial in vivo systems. Further, we demonstrate how to use this method in combination with pharmacological treatments that remove specific ERG components in order to dissect the function of certain retinal cell types.

Simultaneous ex vivo Functional Testing of Two Retinas by in vivo Electroretinogram System

Ex vivo ERG can be used to record electrical activity of retinal cells directly from isolated intact retinas of animals or humans. We demonstrate here how common in vivo ERG systems can be adapted for ex vivo ERG recordings in order to dissect the electrical activity of retinal cells.

Simultaneo<em&gt; Ex vivo</em&gt; Test funzionale di due retine per<em&gt; In vivo</em&gt; Sistema Elettroretinogramma

An In vivo electroretinogram (ERG) signal is composed of several overlapping components originating from different retinal cell types, as well as noise ...