This work was supported by National Institutes of Health (National Institute of Neurological Disorders and Stroke) Grant 1R01NS060757-01 and by the E.L. Lindseth endowed chair to Dominique M. Durand. We thank Dr. Andrew M. Rollins&#8217; laboratory for the help on the OCT imaging.

NOTA: Animal protocolli sperimentali sono stati esaminati e approvati dalla cura e l&#39;uso degli animali Comitato Istituzionale presso l&#39;università. CD1 topi di entrambi i sessi, all&#39;età di P10 a P20 sono utilizzati in questo studio. 1. Le soluzioni per la chirurgia e la registrazione sperimentale <ol><li> Preparare tampone normale liquido cerebrospinale artificiale (aCSF) contenente (mM): NaCl 124, KCl 3,75, KH 2 PO 4 1,25, MgSO 4 2, NaHCO3 26, destrosio 10, e CaCl 2 2. Utilizzare questo normale aCSF per il recupero dei tessuti dopo la dissezione, così come per il sistema di lavaggio all&#39;inizio dell&#39;esperimento. </li><li> Preparare saccarosio aCSF che viene utilizzata durante la dissezione dell&#39;ippocampo e contiene (mm): 220 saccarosio, KCl 2,95, NaH 2 PO4 1.3, MgSO 4 2, 3 NaHCO 26, destrosio 10, e CaCl 2 2. Per indurre attività epilettiforme nella preparazione del tessuto dell&#39;ippocampo intatta, aggiungere 4-aminopiridina (4-AP) alla normalità aCSF ala concentrazione di 100 mM. </li></ol> 2. Procedura chirurgica per l&#39;Hippocampus preparazione Intact <ol><li> Goccia isoflurano (1 ml) nella camera al fondo di un barattolo di vetro essiccatore (No.1 in materiali specifici e attrezzature) e usare un tovagliolo di carta normale per coprire la superficie della fase inferiore in modo che l&#39;animale non entrare in contatto con il liquido. Quindi, posizionare il mouse CD1 nel barattolo e chiudere il coperchio. Mantenere l&#39;animale nel vaso chiuso per circa 1 min per 2 min. Quando la frequenza respiro è di circa uno al secondo, rimuovere il mouse dal vaso. </li><li> Posizionare il mouse sul palco chirurgia e decapitarlo con un adeguato forbici. Subito dopo decapitazione, posizionare la testa nel ghiacciata (3-4 ° C), saccarosio ossigenato aCSF per circa 30 sec. </li><li> Utilizzare forbici fini (No.5 in materiali specifici e Equipment) per rimuovere la pelle sulla parte superiore del cranio e di tagliare il cranio lungo la linea centrale della testa, nonché a due estremità vicino il tempolobo ral. Utilizzare pinze (# 6 in materiali specifici e attrezzature) per sbucciare cranio tagliata verso ogni lato della testa, al fine di esporre il cervello. </li><li> Inserire un laboratorio spatola micro (No. 8 in materiali specifici e attrezzature) nella fessura tra i lobi parietali del cervello e del cranio a sbucciare con attenzione il cervello dal fondo del cranio e poi rilasciarlo su un preparato ghiacciata (3 -4 ° C) fase chirurgica ricoperta con carta da filtro bagnata (n.2 in materiali specifici e attrezzature). Rimuovere il cervelletto con una lama di ghiaccio-refrigerati e separare i due emisferi tagliando la linea mediana del cervello. Poi, posizionare i due emisferi separati in un bicchiere pieno di saccarosio aCSF ghiacciato bollito con il 95% O 2/5% di CO 2. </li><li> Prendere una metà dell&#39;emisfero e posto sulla scena carta da filtro ghiacciata. Posizionare asciugamani di carta regolari o carta da filtro in tutto il cervello a succhiare la soluzione supplementare. Utilizzare due strumenti pipetta di vetro al fuoco lucido (# 10 in Materiali eEquipment) per separare la corteccia dal resto della parte centrale del cervello. </li><li> Dopo l&#39;ippocampo è esposta all&#39;interno della corteccia e messo in fase gelata, collocare due o tre gocce di ghiacciata saccarosio aCSF sul tessuto e poi rimuovere la soluzione supplementare intorno nell&#39;ippocampo. Tagliare le connessioni con la corteccia a due estremità dell&#39;ippocampo. Poi, sezionare l&#39;ippocampo fuori del cervello con gli strumenti di vetro fuoco lucidato e rimuovere la parte restante del cervello. </li><li> Separare l&#39;intero ippocampo con il lato rivolto verso l&#39;alto e alveus ippocampale solco rivolto verso il basso. Rilasciare rapidamente due o tre gocce di ghiacciata saccarosio aCSF sul tessuto di nuovo e rimuovere la soluzione extra intorno il tessuto utilizzando un foglio di carta assorbente. Utilizzare uno strumento di vetro fuoco lucido per girare su tutto ippocampo per esporre il solco (Figura 1B, C). </li><li> Sotto un microscopio ottico normale, inserire un ago di vetro su misura (No. 11 in specifico Materials e Impianti) in un&#39;estremità del solco e tagliare le connessioni di fibre, di giro dentato (DG) per subiculum o il campo CA1, lungo la direzione del solco (Figura 1C). Applicare una lama ghiacciata per tagliare i setto e temporali estremità dell&#39;ippocampo se necessario. Inserire un anello di filo metallico su misura (n ° 12 in materiali specifici e attrezzature) nel solco di taglio e tirare su il DG di distanza dal tessuto tenendo la fine subiculum / CA1 dell&#39;ippocampo da uno strumento di fuoco in vetro lucido (Figura 1D) . </li><li> Seguendo la procedura sopra dispiegamento, aggiungere altri due o tre gocce di saccarosio aCSF ghiacciata sul tessuto e rimuovere la soluzione supplementare intorno al tessuto. Quindi, tagliare l&#39;ippocampo spiegato con la lama ghiacciata ai bordi (Figura 1E) e posizionare la preparazione da una spatola nella camera di recupero riempita con aCSF normale e gorgogliare con 95% O 2/5% di CO 2 a RT (circa 25 ° C). Lasciareil tessuto ippocampo spiegato di recuperare circa 1 ora prima di metterlo nella camera di registrazione. </li><li> Prendere l&#39;altro emisfero del cervello e usarlo per passare attraverso passaggi 2,5-2,9. Di solito, prendere circa 1 a 2 minuti per completare l&#39;intera procedura di dispiegare un solo ippocampo e drop ghiacciata saccarosio aCSF continuamente per mantenere il tessuto ossigenato e idratata. </li></ol> Setup 3. sistema sperimentale <ol><li> Colla un PMEA fabbricato personalizzato su un Pin Grid Array (PGA) pacchetto e utilizzare micro bonding cavo per collegare ogni pad da un singolo microelettrodo al pad di un perno sulla confezione (Figura 3B). Quindi, inserire il pacchetto nella presa su un circuito su misura 13. </li><li> Collegare individualmente ogni microelettrodi per i suoi filtri con banda passante frequenza di taglio da 1 Hz a 4 KHz e amplificatori con guadagno del 100 sul circuito misura 13. Digitalizzare l&#39;uscita analogica del circuito da un A / D convSistema erting, e acquisire e memorizzare i dati su un computer. </li><li> Colla un camera di registrazione di plastica su misura intorno l&#39;array con aspirazione e tubo di uscita per il flusso della soluzione (Figura 4A). Utilizzare almeno due bottiglie di mantenere diverse soluzioni nel sistema, e unire e controllare il tubo di uscita delle bottiglie da un tri-valvola. Collegare l&#39;uscita del tri-valvola per un sistema di tubi con una camera di gocciolamento IV, che guida la soluzione nella camera di registrazione. </li><li> Tra il tri-valvola e l&#39;ingresso della camera di registrazione, aggiungere un riscaldatore elettrico per riscaldare la soluzione a temperatura controllata (35 ° C) prima che la soluzione è guidato alla camera di registrazione. Attaccare l&#39;uscita della camera di registrazione di un tubo a vuoto per raccogliere la soluzione in un pallone collegato valvolare. Non riciclare alcuna soluzione in ogni esperimento in questo studio. </li></ol> 4. Posizionamento del Hippocampus piegato sul PMEA per registrare l&#39;attività neurale </p&gt; <ol><li> Per preparare il setup sperimentale, riempire una bottiglia con aCSF normale e una bottiglia con 4-AP aCSF. In entrambe le bottiglie, la bolla del 95% O 2/5% di CO 2 fin dall&#39;inizio di ogni esperimento. Utilizzare un connettore a tre valvole per controllare che la soluzione sarà selezionato durante un esperimento. Collegare un tubo a vuoto all&#39;uscita della camera per pompare la soluzione in un contenitore di polvere. Riscaldare il gasdotto prima consegna nella camera di registrazione e mantenere la soluzione ad un livello di temperatura controllata (35 ° C). </li><li> Quando l&#39;ingresso e l&#39;uscita della camera di registrazione sono chiusi, utilizzare una misura contagocce pipetta di vetro per trasferire e posizionare l&#39;ippocampo spiegato nella camera di registrazione. Sotto il microscopio, posizionare l&#39;ippocampo spiegato utilizzando un normale piccolo pennello, mentre il tessuto è fluttuante nella soluzione. Posizionare l&#39;ippocampo spiegato con il lato rivolto verso il basso alveus, zona CA3 che punta lontano, e il campo CA1 punta verso il ricercatore. </li&gt; <li> Succhiare attenzione via la soluzione nella camera con una pipetta di aspirazione dal bordo della camera di registrazione per abbassare il livello della soluzione fino a quando la camera viene essiccato e il tessuto viene abbassato sulla matrice. Poi, posizionare accuratamente un ancoraggio tessuto misura (Figura 4) (No. 14 in specifici materiali e attrezzature) sulla parte superiore del tessuto per contenere l&#39;ippocampo spiegato sulla matrice. Mettere alcune gocce di soluzione nella camera di registrazione a riempirlo, e gradualmente aprire l&#39;ingresso e l&#39;uscita per regolare la portata di circa due gocce al secondo nella camera di gocciolamento IV. </li><li> Incubare il tessuto nella camera di registrazione con normale aCSF per circa 1 min a recuperare, quindi passare il rifornimento della soluzione di 4-AP aCSF sciolto e regolare la portata correttamente. Incubare il tessuto in 4-AP sciolti aCSF per circa 5 a 10 minuti e poi il ricercatore potrebbe iniziare il software per registrare il segnale quando appare attività spontanea. </li></ol> 5. RimozioneTessuto dalla PMEA Dopo un esperimento <ol><li> Controllare l&#39;ancoraggio del tessuto da un micromanipolatore e gradualmente sollevare il tessuto dalla camera di registrazione. Spegnere sia ingresso e uscita per arrestare il flusso nella camera di registrazione. La camera di registrazione dovrebbe essere pieno di soluzione o aggiungere qualche goccia di soluzione per riempire la camera se la camera di registrazione non è pieno. </li><li> Utilizzare un piccolo pennello per sollevare ogni angolo del tessuto. Se il tessuto non è fluttuante nella soluzione, poi impiegare il tubo vuoto per asciugare la camera accuratamente con il tessuto ancora seduto sulla matrice. Quindi aprire accuratamente l&#39;ingresso per riempire progressivamente la camera e chiudere l&#39;ingresso per arrestare il flusso quando la camera di registrazione è pieno. Applicare il piccolo pennello per sollevare di nuovo ogni angolo del tessuto. </li><li> Ripetere passaggio 5.2 finché il tessuto viene staccato dalla matrice e galleggianti nella soluzione. Se il tessuto è fluttuante nella soluzione, quindi utilizzare il tubo a vuoto per aspirare il tessuto di distanza. Aprire tegli flusso in ingresso e aprire il vuoto nella presa. Lavare il sistema con acqua distillata e asciugarlo. </li></ol>

<ol>
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The authors have nothing to disclose.

Lo sviluppo della preparazione dell&#39;ippocampo spiegato, dove gli assi longitudinali e trasversali dell&#39;ippocampo sono conservati in combinazione con una matrice microelettrodo penetrante, fornisce un potente strumento per studiare le connessioni anatomia o propagazione neurale nell&#39;ippocampo 7. Questa procedura dispiegarsi è applicabile per lo studio ippocampo in topi adulti anche. Recenti studi con questa preparazione hanno mostrato che l&#39;attività epilettiforme 4-AP-indotta potrebbe propaga...

Informazioni conduzione neurale o propagazione dei segnali neurali è cruciale per determinare il meccanismo di comunicazione neurale sia nel normale funzionamento e condizioni patologiche nel cervello 1-3. L&#39;ippocampo è una delle strutture più studiati nel cervello in quanto svolge ruolo fondamentale in molte funzioni cerebrali come la memoria, e il monitoraggio del territorio ed è coinvolto in diverse alterazioni patologiche che influenzano notevolmente il comportamento e 1,6. Sebbene, l&#39;ippocampo presenta una struttura complessa, i vari elementi della struttura possono essere facilmente identificate ed accessibili nella preparazione fetta 4-6. Nella direzione trasversale dell&#39;ippocampo, attività neurale è noto per propagare attraverso la via tri-sinaptica che compongono il giro dentato (DG), CA3, CA1 andsubiculum 4,5. Si ritiene che la trasmissione sinaptica e conduzione assonale svolgono un ruolo importante per communicatiin questo circuito trasversale 4,6. Tuttavia, la propagazione del segnale neurale avviene sia trasversale e longitudinale 4,6. Questo implica che l&#39;ippocampo non può essere completamente studiato utilizzando preparazioni fetta che limitano l&#39;osservazione ad una particolare direzione di propagazione 4. La fetta longitudinale è stato sviluppato per studiare le vie assonale lungo l&#39;asse longitudinale 5. I ricercatori hanno osservato gamma e theta oscillazioni specifici comportamenti prevalentemente lungo la trasversale e assi longitudinali rispettivamente 6. Questi comportamenti sono stati studiati separatamente, ma l&#39;accesso simultaneo a due direzioni è cruciale per capire questi comportamenti. Anche con lo sviluppo della preparazione dell&#39;ippocampo intatta, è difficile controllare la propagazione tutto il tessuto a causa della struttura ripiegata-dell&#39;ippocampo 4. L&#39;ippocampo spiegato fornisce l&#39;accesso ai neuroni imballatoin una forma di un piano bidimensionale strato di cellule 7,8. Con dispiegarsi giro dentato (DG) (Figura 1), l&#39;ippocampo adotta una forma appiattita con una configurazione rettangolare, in cui entrambe le connessioni longitudinali e trasversali rimangono intatti con lo strato di cellule piramidali disposti in un foglio bidimensionale contenente sia CA3 e CA1, lasciando un pezzo di tessuto neurale che può essere usato per studiare la propagazione neurale (Figura 2) 8. L&#39;attività neurale può essere monitorato con i singoli pipette di vetro, matrici di microelettrodi, elettrodi stimolanti, così come coloranti sensibili tensione (VSD) 3,7,8. Inoltre, geneticamente codificato indicatore di tensione da topi transgenici possono essere utilizzati per monitorare lo schema di propagazione 9. La configurazione piatta della rete dell&#39;ippocampo spiegato è adatto per la registrazione metodo ottico, ma anche per una matrice microelettrodo. Most degli array disponibili in commercio sono fabbricati con elettrodi profilo piatto o basso e in grado di registrare l&#39;attività neurale in entrambe le fette di tessuto e colture di neuroni 10-12. Tuttavia, il rapporto segnale-rumore (SNR) diminuisce quando i segnali sono ottenuti da un tessuto intatto dal soma dei neuroni si trovano più in profondità nel tessuto. Schiere di elettrodi microelettrodi con elevati rapporti di aspetto sono necessari per migliorare il SNR. A tal fine, una matrice microelettrodo penetrante (PMEA) è stato sviluppato nel nostro laboratorio, e fornisce la capacità di sondare direttamente nel tessuto inserendo 64 picchi con un diametro di 20 micron e 200 micron altezza nell&#39;ippocampo unfolded 7,13 . Questa matrice microelettrodo ha una maggiore SNR rispetto sensibili di imaging colorante tensione e il SNR rimane stabile durante un esperimento 7,13. La combinazione della preparazione dell&#39;ippocampo dispiegata e PMEA fornisce un nuovo modo di investireiGate propagazione neurale su un piano bidimensionale. Gli esperimenti con questa tecnica hanno già dato risultati significativi sui meccanismi di propagazione del segnale neurale nell&#39;ippocampo cui attività neurale in grado di propagarsi autonomamente di sinapsi sinaptici o elettrici 7.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>desiccator jar</td>
			<td>LABRECYCLERS Inc.</td>
			<td>5410</td>
			<td>Place regular paper towels at the bottome of the jar for animal anesthesia use.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A blade and Custome made surgical stage for unfolding hippocampus</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>A petri dish is place upside down (in the center) in the ice with a wet filter paper place on top of it.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Custom made tissue recovery chamber</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Plastic tubes were glued with plastic mesh at the bottom and bubbled with 95% O2/ 5% CO2 in the aCSF.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Straight Operating&#160;Scissors</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S17336B&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; Medco Instruments No.:81995&#160;</td>
			<td>This scissors is used to&#160;&#160; decapitate the mice.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Integra Miltex Goldman-Fox&#160;Scissors</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-460-517&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; MILTEX INC&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; No.:5-SC-320</td>
			<td>This scissors is used to cut the skull of the mice.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Miltex 
			Hysterectomy Forceps</td>
			<td>Claflin Medical equipment</td>
			<td>CESS-722033-00001</td>
			<td>This Forceps is used to peel the cut skull to expose the brain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Spatula</td>
			<td>Cardinal Health</td>
			<td></td>
			<td>This micro spatula is used to tranfer the whole brain of a semisphere into the recorering chamber.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Frey Scientific Stainless Steel Semi-Micro Spatula</td>
			<td>Cardinal Health</td>
			<td></td>
			<td>this semi micro spatula is used to tranfer the unfolded hippocampus into the glucose aCSF in the recovering chamber.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>small paint brush</td>
			<td>Lowe&#39;s</td>
			<td>tem #:&#160;105657&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; Model #:&#160;90219</td>
			<td>The one with the smallest size in a normal paint brush package</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fire polished glass help tool</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>This tool was fire polished and made from the regular Pasteur glass pipettes.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Custom made glass needle</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>This tool was fire polished and made from the regular Pasteur glass pipettes.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Custom made glass tool with a metal wire loop</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>This tool was fire polished and made from the regular Pasteur glass pipettes with a reshaped metal wire loop.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Custom made glass solution dropper</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>This tool was&#160; made from the regular Pasteur glass pipettes with its tips cut and a rubber head attached with the cut end.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Custom made tissue anchor</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Nylon fiber mesh was glued on a insulated copper wire ring. The tissue anchor was hold by an micromanipulator.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Custom fabricated microelectrode array</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>More detail about the array please refer to&#160; Kibler, et al, 2011.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Custom made filter and amplifiers circuits for the array</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>More detail about the array please refer to&#160; Kibler, et al, 2011.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Data acquisition processor 3400a</td>
			<td>Microstar Laboratories</td>
			<td>N/A</td>
			<td>This is a complete data acquisition system with A/D converter.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

neural activity propagation in an unfolded hippocampal preparation with a penetrating micro-electrode array

Questo protocollo descrive un metodo per preparare una nuova preparazione in vitro nell&#39;ippocampo piatta combinata con una matrice di micro-lavorato per mappare l&#39;attività neuronale nell&#39;ippocampo. La trasversale preparato fetta ippocampo è la preparazione dei tessuti più comuni per studiare ippocampo elettrofisiologia. Una fetta longitudinale ippocampo è stato sviluppato anche per indagare le connessioni longitudinali nell&#39;ippocampo. L&#39;ippocampo intatti mouse possono anche essere mantenute in vitro perché il suo spessore consenta un&#39;adeguata diffusione dell&#39;ossigeno. Tuttavia, questi tre preparazioni non forniscono un accesso diretto alla propagazione neurale dal momento che alcuni dei tessuti è mancante o piegato. L&#39;ippocampo intatta unfolded fornisce sia connessioni longitudinali in una configurazione piatta per l&#39;accesso diretto al tessuto di analizzare la piena portata di propagazione del segnale nell&#39;ippocampo in vitro e trasversale. Al fine di monitorare efficacemente l&#39;attività neurale da tegli strato di cellule, un fatto del penetrante gamma di micro-elettrodi (PMEA) è stato fabbricato e applicato l&#39;ippocampo spiegato. Il PMEA con 64 elettrodi di 200 micron di altezza potrebbe registrare l&#39;attività neurale in profondità all&#39;interno dell&#39;ippocampo di topo. La combinazione unica di un preparato hippocampal dispiegata e PMEA fornisce un nuovo strumento in vitro per studiare la velocità e la direzione di propagazione dell&#39;attività neurale nei bidimensionali regioni CA1-CA3 dell&#39;ippocampo con un alto rapporto segnale-rumore.

I dati riportati nelle figure qui sono stati registrati nella preparazione nell&#39;ippocampo spiegato con 4-AP (100 mM) aCSF aggiunto durante l&#39;incubazione del tessuto nella camera di registrazione a RT (25 ° C). Normalmente l&#39;attività inizia entro 5 minuti, ma in alcuni tessuti ippocampali dagli animali più anziani potrebbe richiedere più tempo. La cottura neuronale 4 AP-indotta osservato con il PMEA è lo stesso come precedentemente riportato 14,15. Poiché gli elettrodi hanno un&#39;altezza di...

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Neural Activity Propagation in an Unfolded Hippocampal Preparation with a Penetrating Micro-electrode Array

Abbiamo sviluppato un ippocampo spiegato in vitro che conserva CA1-CA3 array di neuroni. In combinazione con la matrice di micro-penetrante elettrodi, attività neurale può essere monitorato in entrambi gli orientamenti longitudinali e trasversali. Questo metodo fornisce vantaggi rispetto fettine ippocampali come la propagazione in tutta nell&#39;ippocampo possibile registrare contemporaneamente.

Neural Activity Propagazione in ippocampale preparazione piegato con un penetrante Micro-elettrodo Array

This protocol describes a method for preparing a new in vitro flat hippocampus preparation combined with a micro-machined array to map neural activity in ...

neural-activity-propagation-an-unfolded-hippocampal-preparation-with

Research

JoVE Journal

Neuroscience

8.3K Views.  Case Western Reserve University.  Abbiamo sviluppato un ippocampo spiegato in vitro che conserva CA1-CA3 array di neuroni. In combinazione con la matrice di micro-penetrante elettrodi, attività neurale può essere monitorato in entrambi gli orientamenti longitudinali e trasversali. Questo metodo fornisce vantaggi rispetto fettine ippocampali come la propagazione in tutta nell'ippocampo possibile registrare contemporaneamente. 

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Growth and Differentiation of Adult Hippocampal Arctic Ground Squirrel Neural Stem Cells

Arctic ground squirrels (Urocitellus parryii, AGS) are unique in their ability to hibernate with a core body temperature near or below freezing 1. These animals also resist ischemic injury to the brain in vivo 2,3 and oxygen-glucose deprivation in vitro 4,5. These unique qualities provided the impetus to isolate AGS neurons to examine inherent neuronal characteristics that could account for the capacity of AGS neurons to resist injury and cell death caused by ischemia and extremely cold temperatures. Identifying proteins or gene targets that allow for the distinctive properties of these cells could aid in the discovery of effective therapies for a number of ischemic indications and for the study of cold tolerance. Adult AGS hippocampus contains neural stem cells that continue to proliferate, allowing for easy expansion of these stem cells in culture. We describe here methods by which researchers can utilize these stem cells and differentiated neurons for any number of purposes. By closely following these steps the AGS neural stem cells can be expanded through two passages or more and then differentiated to a culture high in TUJ1-positive neurons (~50%) without utilizing toxic chemicals to minimize the number of dividing cells. Ischemia induces neurogenesis 6 and neurogenesis which proceeds via MEK/ERK and PI3K/Akt survival signaling pathways contributes to ischemia resistance in vivo7 and in vitro 8 (Kelleher-Anderson, Drew et al., in preparation). Further characterization of these unique neural cells can advance on many fronts, using some or all of these methods.

Neural stem cells were prepared from the hippocampus of adult non-hibernating yearling Arctic ground squirrels (AGS). These neural stem cells can be expanded through numerous passages, differentiated and maintained as a nearly 50:50 neuron to glial culture.

Crescita e la differenziazione degli adulti ippocampale suolo artico Cellule Staminali neurali Squirrel

Arctic ground squirrels (Urocitellus parryii, AGS) are unique in their ability to hibernate with a core body temperature near or below freezing 1. These ...

Ricerca

Neuroscienze

Neural-Colony Forming Cell Assay: An Assay To Discriminate Bona Fide Neural Stem Cells from Neural Progenitor Cells

The neurosphere assay (NSA) is one of the most frequently used methods to isolate, expand and also calculate the frequency of neural stem cells (NSCs). Furthermore, this serum-free culture system has also been employed to expand stem cells and determine their frequency from a variety of tumors and normal tissues. It has been shown recently that a one-to-one relationship does not exist between neurosphere formation and NSCs. This suggests that the NSA as currently applied, overestimates the frequency of NSCs in a mixed population of neural precursor cells isolated from both the embryonic and adult mammalian brain. This video practically demonstrates a novel collagen based semi- solid assay, the neural-colony forming cell assay (N-CFCA), which has the ability to discriminate stem from progenitor cells based on their long-term proliferative potential, and thus provides a method to enumerate NSC frequency. In the N-CFCA, colonies &ge;2 mm in diameter are derived from cells that meet all the functional criteria of a NSC, while colonies &lt; 2mm are derived from progenitors. The N-CFCA procedure can be used for cells prepared from different sources including primary and cultured adult or embryonic mouse CNS cells. Here we use cells prepared from passage one neurospheres generated from embryonic day 14 mice brain to perform N-CFCA. The cultures are replenished with proliferation medium every seven days for three weeks to allow the plated cells to exhibit their full proliferative potential and then the frequency of neural progenitor and bona fide neural stem cells is calculated respectively by counting the number of colonies that are &lt; 2mm and the ones that are &ge;2mm in reference to the number of cells that were initially plated.

This video protocol demonstrates how to discriminate and enumerate bona fide neural stem cells in a mixed population of neural precursor cells using the neural colony-forming cell assay.

Neural-formanti colonia saggio Cell: un test per discriminare Bona Fide cellule staminali neurali da cellule progenitrici neurali

The neurosphere assay (NSA) is one of the most frequently used methods to isolate, expand and also calculate the frequency of neural stem cells (NSCs). ...

Preparation of an Awake Mouse for Recording Neural Responses and Injecting Tracers

It is well known that anesthesia alters neural response properties in various regions of the brain.13. In the auditory system, fundamental response properties of brainstem neurons including threshold, frequency specificity, and inhibitory sidebands are altered in significant ways under anesthesia1-2. These observations prompted physiologists to seek ways to record from single neurons without the contaminating effects of anesthesia. One result was a decerebrate preparation, where the brainstem was completely transected at the level of the midbrain4. The drawbacks of this preparation are a formidable surgery, the elimination of descending projections from the forebrain, and an inability to use sensory stimulation to examine structures above the midbrain. A different strategy has been to implant electrode arrays chronically to record from single neurons and multiunit clusters while the animal is awake and/or behaving5,6. These techniques however are not compatible with injecting tracer dyes after first electrophysiologically characterizing a brain structure. To avoid altering neural response properties with anesthetics while recording electrophysiological response properties from single neurons, we have adapted a head restraint technique long used in bats7-9 to mouse10-12. Using this method, we are able to conduct electrophysiological recordings over several days in the unanesthetized mouse. At the end of the recording sessions, we can then inject a dye to reconstruct electrode positions and recording sites or inject a tracer so that pathways to and from the recording loci can be determined. This method allows for well isolated single neuron recordings over multiple days without the use anesthetics.

Electrophysiological characterization of neuronal responses is important for understanding brain function and for guiding the placement of dyes for pathway tracing. However, many studies are performed in anesthetized animals. To understand brain function without anesthetics, we developed a method to record neuronal response properties and inject dyes in awake mouse.

Preparazione di un mouse Awake per la registrazione di risposte neurali e iniezione Tracers

It is well known that anesthesia alters neural response properties in various regions of the brain.13.  In the auditory system, fundamental response ...

Optical Recording of Suprathreshold Neural Activity with Single-cell and Single-spike Resolution

Signaling of information in the vertebrate central nervous system is often carried by populations of neurons rather than individual neurons. Also propagation of suprathreshold spiking activity involves populations of neurons. Empirical studies addressing cortical function directly thus require recordings from populations of neurons with high resolution. Here we describe an optical method and a deconvolution algorithm to record neural activity from up to 100 neurons with single-cell and single-spike resolution. This method relies on detection of the transient increases in intracellular somatic calcium concentration associated with suprathreshold electrical spikes (action potentials) in cortical neurons. High temporal resolution of the optical recordings is achieved by a fast random-access scanning technique using acousto-optical deflectors (AODs)1. Two-photon excitation of the calcium-sensitive dye results in high spatial resolution in opaque brain tissue2. Reconstruction of spikes from the fluorescence calcium recordings is achieved by a maximum-likelihood method. Simultaneous electrophysiological and optical recordings indicate that our method reliably detects spikes (&gt;97% spike detection efficiency), has a low rate of false positive spike detection (&lt; 0.003 spikes/sec), and a high temporal precision (about 3 msec) 3. This optical method of spike detection can be used to record neural activity in vitro and in anesthetized animals in vivo3,4.

Understanding the function of the vertebrate central nervous system requires recordings from many neurons because cortical function arises on the level of populations of neurons. Here we describe an optical method to record suprathreshold neural activity with single-cell and single-spike resolution, dithered random-access scanning. This method records somatic fluorescence calcium signals from up to 100 neurons with high temporal resolution. A maximum-likelihood algorithm deconvolves the underlying suprathreshold neural activity from the somatic fluorescence calcium signals. This method reliably detects spikes with high detection efficiency and a low rate of false positives and can be used to study neural populations in vitro and in vivo.

Registrazione ottica di attività neurale suprathreshold con risoluzione singola cellula e single-picco

Signaling of information in the vertebrate central nervous system is often carried by populations of neurons rather than individual neurons. Also ...

Multi-unit Recording Methods to Characterize Neural Activity in the Locust (Schistocerca Americana) Olfactory Circuits

Detection and interpretation of olfactory cues are critical for the survival of many organisms. Remarkably, species across phyla have strikingly similar olfactory systems suggesting that the biological approach to chemical sensing has been optimized over evolutionary time1. In the insect olfactory system, odorants are transduced by olfactory receptor neurons (ORN) in the antenna, which convert chemical stimuli into trains of action potentials. Sensory input from the ORNs is then relayed to the antennal lobe (AL; a structure analogous to the vertebrate olfactory bulb). In the AL, neural representations for odors take the form of spatiotemporal firing patterns distributed across ensembles of principal neurons (PNs; also referred to as projection neurons)2,3. The AL output is subsequently processed by Kenyon cells (KCs) in the downstream mushroom body (MB), a structure associated with olfactory memory and learning4,5. Here, we present electrophysiological recording techniques to monitor odor-evoked neural responses in these olfactory circuits.
First, we present a single sensillum recording method to study odor-evoked responses at the level of populations of ORNs6,7. We discuss the use of saline filled sharpened glass pipettes as electrodes to extracellularly monitor ORN responses. Next, we present a method to extracellularly monitor PN responses using a commercial 16-channel electrode3. A similar approach using a custom-made 8-channel twisted wire tetrode is demonstrated for Kenyon cell recordings8. We provide details of our experimental setup and present representative recording traces for each of these techniques.

Multi-unit Recording Methods to Characterize Neural Activity in the Locust Schistocerca Americana Olfactory Circuits

We demonstrate variations of the extracellular multi-unit recording technique to characterize odor-evoked responses in the first three stages of the invertebrate olfactory pathway. These techniques can easily be adapted to examine ensemble activity in other neural systems as well.

Multi-unit Metodi di registrazione per caratterizzare l&#39;attività neurale nel Locust (<em&gt; Schistocerca Americana</em&gt;) Circuiti olfattive

Detection and interpretation of olfactory cues are critical for the survival  of many organisms. Remarkably, species across phyla have strikingly similar ...

Optogenetic Perturbation of Neural Activity with Laser Illumination in Semi-intact Drosophila Larvae in Motion

Drosophila larval locomotion is a splendid model system in developmental and physiological neuroscience, by virtue of the genetic accessibility of the underlying neuronal components in the circuits1-6. Application of optogenetics7,8 in the larval neural circuit allows us to manipulate neuronal activity in spatially and temporally patterned ways9-13. Typically, specimens are broadly illuminated with a mercury lamp or LED, so specificity of the target neurons is controlled by binary gene expression systems such as the Gal4-UAS system14,15. In this work, to improve the spatial resolution to "sub-genetic resolution", we locally illuminated a subset of neurons in the ventral nerve cord using lasers implemented in a conventional confocal microscope. While monitoring the motion of the body wall of the semi-intact larvae, we interactively activated or inhibited neural activity with channelrhodopsin16,17 or halorhodopsin18-20, respectively. By spatially and temporally restricted illumination of the neural tissue, we can manipulate the activity of specific neurons in the circuit at a specific phase of behavior. This method is useful for studying the relationship between the activities of a local neural assembly in the ventral nerve cord and the spatiotemporal pattern of motor output.

Optogenetic Perturbation of Neural Activity with Laser Illumination in Semi-intact Drosophila Larvae in Motion

Here we describe a protocol for optogenetic manipulation of motoneuronal activity while monitoring changes in motor output (muscle contraction) in semi-intact Drosophila larvae using lasers within a conventional confocal microscope. This technique enables researchers to achieve local perturbation of neural activity in a few neuromeres to elucidate the dynamics of motor circuits.

Optogenetic Perturbazione di attività neurale con illuminazione laser in semi-intatte<em&gt; Drosophila</em&gt; Larve in Motion

Drosophila larval locomotion is a splendid model system in developmental and physiological neuroscience, by virtue of the genetic accessibility of the ...

Immunohistochemical Visualization of Hippocampal Neuron Activity After Spatial Learning in a Mouse Model of Neurodevelopmental Disorders

Induction of phosphorylated extracellular-regulated kinase (pERK) is a reliable molecular readout of learning-dependent neuronal activation. Here, we describe a pERK immunohistochemistry protocol to study the profile of hippocampal neuron activation following exposure to a spatial learning task in a mouse model characterized by cognitive deficits of neurodevelopmental origin. Specifically, we used pERK immunostaining to study neuronal activation following Morris water maze (MWM, a classical hippocampal-dependent learning task) in Engrailed-2 knockout (En2-/-) mice, a model of autism spectrum disorders (ASD). As compared to wild-type (WT) controls, En2-/- mice showed significant spatial learning deficits in the MWM. After MWM, significant differences in the number of pERK-positive neurons were detected in specific hippocampal subfields of En2-/- mice, as compared to WT animals. Thus, our protocol can robustly detect differences in pERK-positive neurons associated to hippocampal-dependent learning impairment in a mouse model of ASD. More generally, our protocol can be applied to investigate the profile of hippocampal neuron activation in both genetic or pharmacological mouse models characterized by cognitive deficits.

We describe an immunohistochemistry protocol to study the profile of hippocampal neuron activation following exposure to a spatial learning task in a mouse model characterized by cognitive deficits of neurodevelopmental origin. This protocol can be applied to both genetic or pharmacological mouse models characterized by cognitive deficits.

Visualizzazione immunoistochimica di ippocampale Neuron attività dopo Spatial apprendimento in un modello murino di disturbi dello sviluppo neurologico

Induction of phosphorylated extracellular-regulated kinase (pERK) is a reliable molecular readout of learning-dependent neuronal activation. Here, we ...

Interfacing 3D Engineered Neuronal Cultures to Micro-Electrode Arrays: An Innovative In Vitro Experimental Model

Currently, large-scale networks derived from dissociated neurons growing and developing in vitro on extracellular micro-transducer devices are the gold-standard experimental model to study basic neurophysiological mechanisms involved in the formation and maintenance of neuronal cell assemblies. However, in vitro studies have been limited to the recording of the electrophysiological activity generated by bi-dimensional (2D) neural networks. Nonetheless, given the intricate relationship between structure and dynamics, a significant improvement is necessary to investigate the formation and the developing dynamics of three-dimensional (3D) networks. In this work, a novel experimental platform in which 3D hippocampal or cortical networks are coupled to planar Micro-Electrode Arrays (MEAs) is presented. 3D networks are realized by seeding neurons in a scaffold constituted of glass microbeads (30-40 &#181;m in diameter) on which neurons are able to grow and form complex interconnected 3D assemblies. In this way, it is possible to design engineered 3D networks made up of 5-8 layers with an expected final cell density. The increasing complexity in the morphological organization of the 3D assembly induces an enhancement of the electrophysiological patterns displayed by this type of networks. Compared with the standard 2D networks, where highly stereotyped bursting activity emerges, the 3D structure alters the bursting activity in terms of duration and frequency, as well as it allows observation of more random spiking activity. In this sense, the developed 3D model more closely resembles in vivo neural networks.

Interfacing 3D Engineered Neuronal Cultures to Micro-Electrode Arrays: An Innovative In Vitro Experimental Model

In this work, a novel experimental model in which 3D neuronal cultures are coupled to planar Micro-Electrode Arrays (MEAs) is presented. 3D networks are built by seeding neurons in a scaffold made up of glass microbeads on which neurons grow and form interconnected 3D structures.

Interfacciamento 3D Engineered neuronali Culture a Micro-Electrode Array: Un innovativo<em&gt; In Vitro</em&gt; Modello sperimentale

Currently, large-scale networks derived from dissociated neurons growing and developing in vitro on extracellular micro-transducer devices are the ...

Direct-current Stimulation and Multi-electrode Array Recording of Seizure-like Activity in Mice Brain Slice Preparation

Cathodal transcranial direct-current stimulation (tDCS) induces suppressive effects on drug-resistant seizures. To perform effective actions, the stimulation parameters (e.g., orientation, field strength, and stimulation duration) need to be examined in mice brain slice preparations. Testing and arranging the orientation of the electrode relative to the position of the mice brain slice are feasible. The present method preserves the thalamocingulate pathway to evaluate the effect of DCS on anterior cingulate cortex seizure-like activities. The results of the multichannel array recordings indicated that cathodal DCS significantly decreased the amplitude of the stimulation-evoked responses and duration of 4-aminopyridine and bicuculline-induced seizure-like activity. This study also found that cathodal DCS applications at 15 min caused long-term depression in the thalamocingulate pathway. The present study investigates the effects of DCS on thalamocingulate synaptic plasticity and acute seizure-like activities. The current procedure can test the optimal stimulation parameters including orientation, field strength, and stimulation duration in an in vitro mouse model. Also, the method can evaluate the effects of DCS on cortical seizure-like activities at both the cellular and network levels.

Studies have shown that cathodal transcranial direct-current stimulation can produce suppressive effects on drug-resistant seizures. In this study, an in vitro experimental setup was devised in which the direct-current stimulation and multielectrode array recording of seizure-like activity were evaluated in mice brain slice preparation. The direct-current stimulation parameters were evaluated.

Stimolazione diretta correnti e multi-elettrodo Array registrazione di sequestro simile attività nei topi cervello fetta di preparazione

Cathodal transcranial direct-current stimulation (tDCS) induces suppressive effects on drug-resistant seizures. To perform effective actions, the ...

Extracellular Recording of Neuronal Activity Combined with Microiontophoretic Application of Neuroactive Substances in Awake Mice

Differences in the activity of neurotransmitters and neuromodulators, and consequently different neural responses, can be found between anesthetized and awake animals. Therefore, methods allowing the manipulation of synaptic systems in awake animals are required in order to determine the contribution of synaptic inputs to neuronal processing unaffected by anesthetics. Here, we present methodology for the construction of electrodes to simultaneously record extracellular neural activity and release multiple neuroactive substances at the vicinity of the recording sites in awake mice. By combining these procedures, we performed microiontophoretic injections of gabazine to selectively block GABAA receptors in neurons of the inferior colliculus of head-restrained mice. Gabazine successfully modified neural response properties such as the frequency response area and stimulus-specific adaptation. Thus, we demonstrate that our methods are suitable for recording single-unit activity and for dissecting the role of specific neurotransmitter receptors in auditory processing.
The main limitation of the described procedure is the relatively short recording time (~3 hr), which is determined by the level of habituation of the animal to the recording sessions. On the other hand, multiple recording sessions can be performed in the same animal. The advantage of this technique over other experimental procedures used to manipulate the level of neurotransmission or neuromodulation (such as systemic injections or the use of optogenetic models), is that the drug effect is confined to the local synaptic inputs to the target neuron. In addition, the custom-manufacture of electrodes allows adjustment of specific parameters according to the neural structure and type of neuron of interest (such as the tip resistance for improving the signal-to-noise ratio of the recordings).

We present methods for the construction of electrodes to simultaneously record extracellular neural activity and release multiple neuroactive substances at the vicinity of the recording sites in awake mice. This technique allows the detailed analysis of putative local synaptic inputs to the neuron of interest.

Extracellulare La registrazione di un neurone attività combinata con Microiontophoretic applicazione di sostanze neuroattivi nei topi Awake

Differences in the activity of neurotransmitters and neuromodulators, and consequently different neural responses, can be found between anesthetized and ...