Riconosciamo i membri del laboratorio Mably e Narie Storer per la loro assistenza tecnica, e l&#39;American Heart Association (NCRP Scientist Development Grant 0635363N) e il National Heart, Lung, and Blood Institute (Grant SCCOR RFA HL02-027) per il finanziamento.

Parte 1: Produzione di uova e raccolta <ol><li> La notte prima dell&#39;iniezione, istituito il pesce in vasche di allevamento con divisori in posizione. Per aumentare la produzione totale di uova, il pesce può essere impostato in un rapporto di due femmine per un maschio se lo si desidera. </li><li> La mattina seguente, dopo le luci della stanza si accende, tirare i divisori da più serbatoi e lasciare per circa 20 minuti di tempo di accoppiamento indisturbato. </li><li> Utilizzando un colino, raccogliere le uova dalle gabbie di allevamento e risciacquare con acqua uovo. Versare le uova in una capsula di Petri con acqua uovo e rimuovere le uova non fecondate e detriti con una pipetta di trasferimento. I pesci possono essere raggruppati in grandi vasche per la produzione di turni aggiuntivi di uova per l&#39;iniezione. Regolare i tempi di raccolta delle uova per consentire un numero massimo di uova da produrre senza farli passare alla fase singola cella. </li><li> Posizionare un vetrino da microscopio invertito nel coperchio di un piatto 100 millimetri Petri. Utilizzare una pipetta di trasferimento per allineare le uova contro il lato del vetrino che formano una singola colonna. Eliminare l&#39;acqua in eccesso uovo dalla diapositiva premendo un Kimwipe contro il lato opposto le uova. (Figura 1A) </li></ol> Parte 2: Ago tirare, il caricamento e la preparazione <ol><li> Con un estrattore micropipetta, tirare un bicchiere 1,0 millimetri OD capillare in due aghi e conservare in un piatto da 150 millimetri di Petri che oltre rampe Silly Putty. Aghi può essere tirato in anticipo. </li><li> Ritardare l&#39;ago con 3 ml di materiale di iniezione con una pipetta microloader. Agitare il bolo verso la punta dell&#39;ago finché non ci sono bolle pochi o nessun rimanenti. </li><li> Accendere la fonte di aria e microinjector. Inserire l&#39;ago nel microinjector e assicurare una perfetta tenuta all&#39;interno della custodia. Controllare che il micromanipolatore si trova in una posizione adeguata per consentire una vasta gamma di movimento e di regolazione. Portare la punta dell&#39;ago nel piano di vista del microscopio, alta dal palco, e mettere a fuoco la regione più sottile della punta. Usare un paio di pinze taglienti per pizzicare fuori l&#39;ago in un punto che lascia l&#39;ago sottile abbastanza per bucare il corion e il tuorlo, ma ancora in grado di fornire una dimensione coerente tallone. Una goccia di olio minerale su un micrometro può essere usata per calcolare il volume di ogni iniezione. Quando iniettato nel petrolio, una perlina con un diametro di 0,1 mm contiene 500 pL di materiale di iniezione (figura 1B); volumi di iniezione di 500 PL o 1nL sono tipicamente utilizzati. Premere il pedale e monitorare le dimensioni del cordone, mentre taglio l&#39;ago e la regolazione della pressione di iniezione in base alle esigenze. Volumi di iniezione ideale riempirà circa il 10% del volume dell&#39;uovo. La qualità della punta dell&#39;ago è cruciale sia per la facilità di iniezione e la qualità e la coerenza dei risultati. </li></ol> Parte 3: Iniezione <ol><li> Assicurarsi che gli embrioni non hanno sviluppato oltre la fase quattro celle. Idealmente, gli embrioni dovrebbero essere al unicellulare stadio. </li><li> Abbassare l&#39;ago verso la colonna di uova, tenendo il piatto in posizione con la mano opposta. </li><li> Perforare la superficie del corion e inserire il tuorlo in un colpo solo liscio durante la visione di qualsiasi schiacciamento o lacerazione del sacco vitellino. Iniettare il materiale iniezione nel tuorlo (figura 1C). Evitare di iniettare bolle d&#39;aria o si estende il tuorlo sia come può essere letale per l&#39;embrione. Di lavoro lungo la linea, regolare la pressione necessaria per mantenere una dimensione coerente tallone e, utilizzando un puntale, togliere le uova non fecondate che si affacciano o sono stati distrutti durante il processo di iniezione. </li><li> Dopo aver completato una colonna di uova, usare un getto di acqua dolce uovo di spostare le uova iniettato in una scatola di Petri pulita. Ripetere se necessario. Tenere diversi embrioni uninjected come controllo. Alla fine del primo giorno, rimuovere gli embrioni morti e registrare il numero di embrioni iniettati. Sostituire l&#39;acqua uovo nel piatto periodicamente per ridurre la probabilità di infezione. </li></ol> Parte 4: I risultati rappresentativi A seconda di cosa viene iniettato, gli embrioni possono sopravvivere a un tasso inferiore rispetto ai loro fratelli uninjected. Fortunatamente, è facile per iniettare un gran numero di loro, quindi questo è raramente un problema. È normale che morphants di esporre sviluppo leggermente ritardata. Per illustrare i risultati della microiniezione, abbiamo usato questo protocollo per manipolare i livelli della proteina Cuore di vetro (Heg). HEG è una proteina transmembrana necessario per lo sviluppo cuore normale. In sua assenza, gli embrioni sviluppano cuori con tratti afflusso gigantesco e camere 1. Abbiamo iniettato due Morpholinos non descritte in precedenza contro HEG, heg_e3i3_egfr1 e heg_e4i4_egfr2, ad una concentrazione di 500 micron. A 2 giorni dopo la fecondazione, i controlli fratello uninjected appaiono normali, come previsto (figura 2A e B). Embrioni iniettati con heg_e3i3_egfr1 hanno edema cerebrale (figura 2C). Anche se i cuori della maggior parte di questi morphants hanno modificato la morfologia, le loro camere sono normalmente di dimensioni (figura 2D). Gli embrioni iniettatiheg_e4i4_egfr2 con difetti cardiaci mostra variabile. Alcuni appaiono normali, mentre altri hanno tratti afflusso di grandi dimensioni e atri moderatamente allargata (2E figura e F). Il mutante HEG, come riportato in precedenza 1, ha un tratto d&#39;afflusso enormemente ampliato e atrio (figura 2G e H). Abbiamo anche iniettato embrioni tipo selvatico con 400 mRNA ng / mL trascritto da full-length HEG cDNA. Mentre i controlli uninjected svilupparsi normalmente (figura 3A e B), gli embrioni iniettati con mRNA HEG mostra uno spettro di fenotipi che vanno dalla comparsa di tipo selvatico ciclopia grave, accorciamento dell&#39;asse corpo principale, necrosi della testa e del corpo, e difetti della linea mediana (figura 3C e D). <img src="/files/ftp_upload/1115/Figure%201%20FINAL.png" alt="" /> Embrioni Figura 1. Da iniettare sono allineati contro un vetrino da microscopio in una capsula di Petri (A). Volume di iniezione è determinata iniettando in olio minerale collocato su un micrometro. Un volume di iniezione di 500 PL, che è comunemente usato, ha un diametro di 0,1 mm (B). Immediatamente dopo l&#39;iniezione, il morfolino o mRNA è visibile come una macchia punteggiano nel tuorlo (C). <img src="/files/ftp_upload/1115/Figure%202%20FINAL.png" alt="" /> Figura 2. A 2 giorni dopo la fecondazione, gli embrioni uninjected non hanno difetti lordo (A) o fenotipo cuore (B). Embrioni iniettati con il heg_e3i3_egfr1 morfolino hanno edema cerebrale (C, freccia) ma camere cardiache di solito di dimensioni (D). Alcuni embrioni iniettati con il heg_e4i4_egfr2 morfolino hanno tratti afflusso ampliato e atri (E, F). mutanti HEG sono tratti afflusso gravemente ampliato e atri (G, H). (A), (C), (E), e (G) sono 4x immagini DIC, (B), (D), (F) e (H) sono 20x immagini DIC. un atrio = it = tratto d&#39;afflusso. <img src="/files/ftp_upload/1115/Figure%203%20FINAL.png" alt="" /> Figura 3. A distanza di 24 ore dopo la fecondazione, uninjected embrioni hanno un corpo lungo e dritto, senza difetti o necrosi della linea mediana (A) e due occhi ben definita con un tubo neurale tra di loro (B). Alcuni embrioni iniettati con mRNA HEG, al contrario, mostrano un asse del corpo ridotto, necrosi, somiti deformi (C), e ciclopia (D). (A) e (C) sono 4x immagini DIC, (B) e (D) sono 20x immagini DIC.

<ol>
	<li>Mably, J. D., Mohideen, M. P. K., Burns, C. G., Chen, J., Fishman, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=heart+of+glass+regulates+the+concentric+growth+of+the+heart+in+zebrafish.">heart of glass regulates the concentric growth of the heart in zebrafish.</a> Curr. Biol. 13, 2138-2147 (2003).</li></ol>

Uno dei punti di forza del sistema modello Danio rerio è la facilità con cui i prodotti gene specifico può essere aggiunto o eliminato dal embrione di microiniezione. Per ubiquitariamente iperespressione di una proteina particolare, la codifica mRNA che viene iniettato nel tuorlo alla 1-cella di scena. Durante il successivo sviluppo dell&#39;embrione, l&#39;RNA è distribuito in tutto l&#39;organismo e tradotto. Viceversa, per eliminare una particolare proteina, Morpholinos vengono utilizzati. Morpholinos sono oligonucleotidi sintetici progettati con la complementarietà di RNA antisenso specifici. Come mRNA, Morpholinos vengono iniettati nel tuorlo alla 1-cella di scena. All&#39;interno l&#39;embrione si legano il loro RNA bersaglio, evitando di traduzione. La modifica principale che deve essere effettuata per ogni morfolino o mRNA è la concentrazione del materiale iniettato. Troppo alta la concentrazione di uno o morfolino mRNA possono causare tossicità non specifici, mentre ogni morfolino devono essere testati empiricamente per determinare la concentrazione ottimale, generalmente le concentrazioni di morfolino tra i 200 micron e 500 micron abbattere l&#39;attività dei geni in modo efficace, senza causare non specifici difetti. La dimensione esatta dell&#39;apertura ago non è cruciale. All&#39;interno di una gamma di dimensioni dell&#39;ago, la pressione d&#39;iniezione e il tempo di iniezione possono essere regolati per produrre un bolo del volume corretta. Morpholinos hanno molte applicazioni, tra cui la dissezione funzionale di domini all&#39;interno di una proteina. Quando progettati per target specifici giunzioni esone-introne, Morpholinos impedirà il verificarsi di splicing lì. Abbiamo esaminato gli effetti di due Morpholinos che legano esone-introne giunzioni nel pre-mRNA di HEG. Il heg_e3i3_egfr1 morfolino lega la giunzione tra esone 3 e introne 3, impedendo il meccanismo di splicing nell&#39;esone 3 che incorpora in trascrizioni maturi. Il heg_e4i4_egfr2 morfolino rimuove in modo simile esone 4. Sia esoni 3 e 4 codificano domini contenenti EGF-come ripete. Alcuni embrioni iniettati con heg_e4i4_egfr2 moderatamente fenocopia il mutante; ulteriori esperimenti saranno tenuti a comprendere il ruolo del Heg esone 4 in sviluppo cuore. Sorprendentemente, gli embrioni iniettati con heg_e3i3_egfr1 hanno edema cerebrale, una caratteristica che non si vedono in mutanti HEG. Ciò può essere dovuto alla capacità di Morpholinos di legare trascrizioni materno che lascia impregiudicata in mutanti zigotico.

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		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Microinjector</td>
<td>Tool</td>
<td>Harvard Apparatus</td>
<td>PLI 100</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Micromanipulator</td>
<td>Tool</td>
<td>Narishige</td>
<td>MN 153</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Needle Puller</td>
<td>Tool</td>
<td>Sutter Instruments</td>
<td>P 97</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Glass Capillaries</td>
<td>Tool</td>
<td>World Precision Instruments</td>
<td>TW100 F6</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Microloader Pipettes</td>
<td>Tool</td>
<td>Eppendorf</td>
<td>5242956.003</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Needle Holder</td>
<td>Tool</td>
<td>World Precision Instruments</td>
<td>MPH310</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function

Uno dei vantaggi di zebrafish studio è la facilità e la velocità di manipolare i livelli di proteina nell&#39;embrione. Morpholinos, che sono oligonucleotidi sintetici con la complementarità antisenso di RNA bersaglio, può essere aggiunto l&#39;embrione di ridurre l&#39;espressione di un prodotto particolare gene. Al contrario, mRNA elaborati possono essere aggiunti per l&#39;embrione per aumentare i livelli di un prodotto genico. Il veicolo per l&#39;aggiunta di mRNA o morfolino di un embrione è microiniezione. Microiniezione è efficiente e rapida, che consente per l&#39;iniezione di centinaia di embrioni per ora. Questo video mostra tutte le fasi del processo di microiniezione. In breve, le uova vengono raccolte subito dopo la posa e allineati contro un vetrino da microscopio in una capsula di Petri. Poi, un bel punta l&#39;ago caricato con materiale di iniezione è collegato ad un microinjector e una fonte d&#39;aria, ed i controlli microinjector sono regolati per produrre un volume di iniezione desiderabile. Infine, l&#39;ago è immerso nel tuorlo dell&#39;embrione e la morfolino o mRNA viene espulso.

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Microinjection of Zebrafish Embryos to Analyze Gene Function

Questo video mostra come morfolino o mRNA possono essere iniettati in embrioni di pesce zebra alla unicellulare stadio per diminuire o aumentare il livello di prodotti specifico gene durante lo sviluppo successivo.

Microiniezione di embrioni di zebrafish per analizzare la funzione del gene

One of the advantages of studying zebrafish is the ease and speed of manipulating protein levels in the embryo.  Morpholinos, which are synthetic ...

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Research

JoVE Journal

Biology

77.2K Views.  Harvard Medical School. Questo video mostra come morfolino o mRNA possono essere iniettati in embrioni di pesce zebra alla unicellulare stadio per diminuire o aumentare il livello di prodotti specifico gene durante lo sviluppo successivo.

Video: Microinjection of Zebrafish Embryos to Analyze Gene Function

Microinjection of A. aegypti Embryos to Obtain Transgenic Mosquitoes

In this video, Nijole Jasinskiene demonstrates the methodology employed to generate transgenic Aedes aegypti mosquitoes, which are vectors for dengue fever.  The techniques for correctly preparing microinjection needles, dessicating embryos, and performing microinjection are demonstrated.

In this video, Nijole Jasinskiene demonstrates the methodology employed to generate transgenic Aedes aegypti mosquitoes, which are vectors for dengue fever. The techniques for correctly preparing microinjection needles, dessicating embryos, and performing microinjection are demonstrated.

Microiniezione di A. aegypti embrioni per ottenere zanzare transgeniche

In this video, Nijole Jasinskiene demonstrates the methodology employed to generate transgenic Aedes aegypti mosquitoes, which are vectors for dengue ...

Ricerca

Biologia

Microinjection of mRNA and Morpholino Antisense Oligonucleotides in Zebrafish Embryos.

An essential tool for investigating the role of a gene during development is the ability to perform gene knockdown, overexpression, and misexpression studies. In zebrafish (Danio rerio), microinjection of RNA, DNA, proteins, antisense oligonucleotides and other small molecules into the developing embryo provides researchers a quick and robust assay for exploring gene function in vivo. In this video-article, we will demonstrate how to prepare and microinject in vitro synthesized EGFP mRNA and a translational-blocking morpholino oligo against pkd2, a gene associated with autosomal dominant polycystic kidney disease (ADPKD), into 1-cell stage zebrafish embryos. We will then analyze the success of the mRNA and morpholino microinjections by verifying GFP expression and phenotype analysis. Broad applications of this technique include generating transgenic animals and germ-line chimeras, cell-fate mapping and gene screening. Herein we describe a protocol for overexpression of EGFP and knockdown of pkd2 by mRNA and morpholino oligonucleotide injection.

Microinjection is a well-established and effective method for introducing foreign substances into fertilized zebrafish embryos. Here, we demonstrate a robust microinjection technique for performing mRNA overexpression, and morpholino oligonucleotide gene knockdown studies in zebrafish.

Microiniezione di mRNA e oligonucleotidi antisenso Morpholino in embrioni di zebrafish.

An essential tool for investigating the role of a gene during development is the ability to perform gene knockdown, overexpression, and misexpression ...

Generating Chimeric Zebrafish Embryos by Transplantation

One of the most powerful tools used to gain insight into complex developmental processes is the analysis of chimeric embryos. A chimera is defined as an organism that contains cells from more than one animal; mosaics are one type of chimera in which cells from more than one genotype are mixed, usually wild-type and mutant. In the zebrafish, chimeras can be readily made by transplantation of cells from a donor embryo into a host embryo at the appropriate embryonic stage. Labeled donor cells are generated by injection of a lineage marker, such as a fluorescent dye, into the one-cell stage embryo. Labeled donor cells are removed from donor embryos and introduced into unlabeled host embryos using an oil-controlled glass pipette mounted on either a compound or dissecting microscope. Donor cells can in some cases be targeted to a specific region or tissue of the developing blastula or gastrula stage host embryo by choosing a transplantation site in the host embryo based on well-established fate maps.

A step-by-step guide to generating targeted chimeric zebrafish embryos by transplantation at the blastula or gastrula stage.

Generare embrioni di zebrafish Chimerico da trapianto

One of the most powerful tools used to gain insight into complex developmental processes is the analysis of chimeric embryos. A chimera is defined as an ...

Using the optokinetic response to study visual function of zebrafish

Optokinetic response (OKR) is a behavior that an animal vibrates its eyes to follow a rotating grating around it. It has been widely used to assess the visual functions of larval zebrafish1-5. Nevertheless, the standard protocol for larval fish is not yet readily applicable in adult zabrafish. Here, we introduce how to measure the OKR of adult zebrafish with our simple custom-built apparatus using a new protocol which is established in our lab. Both our apparatus and step-by-step procedure of OKR in adult zebrafish are illustrated in this video. In addition, the measurements of the larval OKR, as well as the optomotor response (OMR) test of adult zebrafish, are also demonstrated in this video. This OKR assay of adult zebrafish in our experiment may last for up to 4 hours. Such OKR test applied in adult fish will benefit to visual function investigation more efficiently when the adult fish vision system is manipulated.
Su-Qi Zou and Wu Yin contributed equally to this paper.

Optokinetic response has been widely used to assess the visual functions of larval zebrafish. Nevertheless, the standard protocol for larval fish is not yet readily applicable in adults1-5. Here, we introduce how to measure the OKR of adult zebrafish using a new protocol which is established in our lab.

Utilizzando la risposta optocinetico per studiare la funzione visiva del pesce zebra

Optokinetic response (OKR) is a behavior that an animal vibrates its eyes to follow a rotating grating around it. It has been widely used to assess the ...

Two-Photon-Based Photoactivation in Live Zebrafish Embryos

Photoactivation of target compounds in a living organism has proven a valuable approach to investigate various biological processes such as embryonic development, cellular signaling and adult physiology. In this respect, the use of multi-photon microscopy enables quantitative photoactivation of a given light responsive agent in deep tissues at a single cell resolution. As zebrafish embryos are optically transparent, their development can be monitored in vivo. These traits make the zebrafish a perfect model organism for controlling the activity of a variety of chemical agents and proteins by focused light. Here we describe the use of two-photon microscopy to induce the activation of chemically caged fluorescein, which in turn allows us to follow cell's destiny in live zebrafish embryos. We use embryos expressing a live genetic landmark (GFP) to locate and precisely target any cells of interest. This procedure can be similarly used for precise light induced activation of proteins, hormones, small molecules and other caged compounds.

Multiphoton microscopy allows control of low energy photons with deep optical penetration and reduced phototoxicity. We describe the use of this technology for live cell labeling in zebrafish embryos. This protocol can be readily adapted for photo-induction of various light-responsive molecules.

Due-Photon-Based fotoattivazione in Live embrioni di zebrafish

Photoactivation of target compounds in a living organism has proven a valuable approach to investigate various biological processes such as embryonic ...

Microinjection of Medaka Embryos for use as a Model Genetic Organism

In this video, we demonstrate the technique of microinjection into one-cell stage medaka embryos. Medaka is a small egg-laying freshwater fish that allows both genetic and embryological analyses and is one of the vertebrate model organisms in which genome-wide phenotype-driven mutant screens were carried out 1, as in zebrafish and the mouse. Divergence of functional overlap of related genes between medaka and zebrafish allows identification of novel phenotypes that are unidentifiable in a single species 2, thus medaka and zebrafish are complementary for genetic dissection of vertebrate genome functions.
To take advantage of medaka fish whose embryos are transparent and develop externally, microinjection is an essential technique to inject cell-tracers for labeling cells, mRNAs or anti-sense oligonucleotides for over-expressing and knocking-down genes of interest, and DNAs for making transgenic lines.

Medaka and zebrafish are complementary for genetic dissection of vertebrate genome functions. This protocol highlights the key points for successful microinjection into medaka embryos, an important technique for embryological and genetic analysis using medaka and zebrafish in a laboratory.

Microiniezione di embrioni Medaka per essere utilizzato come organismo modello genetico

In this video, we demonstrate the technique of microinjection into one-cell stage medaka embryos. Medaka is a small egg-laying freshwater fish that allows ...

Metabolic Profile Analysis of Zebrafish Embryos

A growing goal in the field of metabolism is to determine the impact of genetics on different aspects of mitochondrial function. Understanding these relationships will help to understand the underlying etiology for a range of diseases linked with mitochondrial dysfunction, such as diabetes and obesity. Recent advances in instrumentation, has enabled the monitoring of distinct parameters of mitochondrial function in cell lines or tissue explants. Here we present a method for a rapid and sensitive analysis of mitochondrial function parameters in vivo during zebrafish embryonic development using the Seahorse bioscience XF 24 extracellular flux analyser. This protocol utilizes the Islet Capture microplates where a single embryo is placed in each well, allowing measurement of bioenergetics, including: (i) basal respiration; (ii) basal mitochondrial respiration (iii) mitochondrial respiration due to ATP turnover; (iv) mitochondrial uncoupled respiration or proton leak and (iv) maximum respiration. Using this approach embryonic zebrafish respiration parameters can be compared between wild type and genetically altered embryos (mutant, gene over-expression or gene knockdown) or those manipulated pharmacologically. It is anticipated that dissemination of this protocol will provide researchers with new tools to analyse the genetic basis of metabolic disorders in vivo in this relevant vertebrate animal model.

Zebrafish represent a powerful vertebrate model that has been under-utilised for metabolic studies. Here we describe a rapid way to measure the in vivo metabolic profile of developing zebrafish that allows the comparison of different mitochondrial function parameters between genetically or pharmacologically manipulated embryos, thereby increasing the applicability of this organism.

Analisi Profilo metabolico di embrioni di zebrafish

A growing goal in the field of metabolism is to determine the impact of genetics on different aspects of mitochondrial function. Understanding these ...

Gene Trapping Using Gal4 in Zebrafish

Large clutch size and external development of optically transparent embryos make zebrafish an exceptional vertebrate model system for in vivo insertional mutagenesis using fluorescent reporters to tag expression of mutated genes. Several laboratories have constructed and tested enhancer- and gene-trap vectors in zebrafish, using fluorescent proteins, Gal4- and lexA- based transcriptional activators as reporters 1-7. These vectors had two potential drawbacks: suboptimal stringency (e.g. lack of ability to differentiate between enhancer- and gene-trap events) and low mutagenicity (e.g. integrations into genes rarely produced null alleles). Gene Breaking Transposon (GBTs) were developed to address these drawbacks 8-10. We have modified one of the first GBT vectors, GBT-R15, for use with Gal4-VP16 as the primary gene trap reporter and added UAS:eGFP as the secondary reporter for direct detection of gene trap events. Application of Gal4-VP16 as the primary gene trap reporter provides two main advantages. First, it increases sensitivity for genes expressed at low expression levels. Second, it enables researchers to use gene trap lines as Gal4 drivers to direct expression of other transgenes in very specific tissues. This is especially pertinent for genes with non-essential or redundant functions, where gene trap integration may not result in overt phenotypes. The disadvantage of using Gal4-VP16 as the primary gene trap reporter is that genes coding for proteins with N-terminal signal sequences are not amenable to trapping, as the resulting Gal4-VP16 fusion proteins are unlikely to be able to enter the nucleus and activate transcription. Importantly, the use of Gal4-VP16 does not pre-select for nuclear proteins: we recovered gene trap mutations in genes encoding proteins which function in the nucleus, the cytoplasm and the plasma membrane.

This protocol describes the method of gene trap insertional mutagenesis using Gal4-VP16 as the primary reporter and GFP/RFP as secondary reporters in zebrafish. Approximately one in ten high-expressing F0 fish yield gene trap progeny co-expressing GFP and RFP. The screening procedure can be readily scaled to adapt to the size of the laboratory performing the insertional mutagenesis screen.

Gene Trapping Utilizzo Gal4 in Zebrafish

Large clutch size and external development of optically transparent embryos make zebrafish an exceptional vertebrate model system for in vivo insertional ...

Force Measurement During Contraction to Assess Muscle Function in Zebrafish Larvae

Zebrafish larvae provide models of muscle development, muscle disease and muscle-related chemical toxicity, but related studies often lack functional measures of muscle health. In this video article, we demonstrate a method to measure force generation during contraction of zebrafish larval trunk muscle. Force measurements are accomplished by placing an anesthetized larva into a chamber filled with a salt solution. The anterior end of the larva is tied to a force transducer and the posterior end of the larva is tied to a length controller. An isometric twitch contraction is elicited by electric field stimulation and the force response is recorded for analysis. Force generation during contraction provides a measure of overall muscle health and specifically provides a measure of muscle function. Although we describe this technique for use with wild-type larvae, this method can be used with genetically modified larvae or with larvae treated with drugs or toxicants, to characterize muscle disease models and evaluate treatments, or to study muscle development, injury, or chemical toxicity.

Force measurements can be used to demonstrate changes in muscle function due to development, injury, disease, treatment or chemical toxicity. In this video, we demonstrate a method to measure force during a maximal contraction of zebrafish larval trunk muscle.

Misura della forza durante la contrazione per valutare la funzione muscolare in larve Zebrafish

Zebrafish larvae provide models of muscle development, muscle disease and muscle-related chemical toxicity, but related studies often lack functional ...

High Resolution Whole Mount In Situ Hybridization within Zebrafish Embryos to Study Gene Expression and Function

This article focuses on whole-mount in situ hybridization (WISH) of zebrafish embryos. The WISH technology facilitates the assessment of gene expression both in terms of tissue distribution and developmental stage. Protocols are described for the use of WISH of zebrafish embryos using antisense RNA probes labeled with digoxigenin. Probes are generated by incorporating digoxigenin-linked nucleotides through in vitro transcription of gene templates that have been cloned and linearized. The chorions of embryos harvested at defined developmental stages are removed before incubation with specific probes. Following a washing procedure to remove excess probe, embryos are incubated with anti-digoxigenin antibody conjugated with alkaline phosphatase. By employing a chromogenic substrate for alkaline phosphatase, specific gene expression can be assessed. Depending on the level of gene expression the entire procedure can be completed within 2-3 days.

High Resolution Whole Mount In Situ Hybridization within Zebrafish Embryos to Study Gene Expression and Function

The zebrafish, a small tropical fish, has become a popular model for studying gene function during vertebrate development and disease. The temporal and spatial expression of target genes can be determined by in situ hybridization. Our improved protocol allows for the detection of low abundant transcripts with low non-specific background signal.

Alta Risoluzione intero monte<em&gt; In Situ</em&gt; Ibridazione in embrioni di zebrafish per studiare l&#39;espressione genica e la funzione

This article focuses on whole-mount in situ hybridization (WISH) of zebrafish embryos. The WISH technology facilitates the assessment of gene expression ...