Questo lavoro è stato sostenuto dal National Institute of Health di sovvenzione # 1R01CA120825-01A1, il Collaborative Research Biomedica (CBR) Program presso la University of Massachusetts Amherst, e la borsa di studio per Isenberg Bhushan J. Toley. Noi riconosciamo con gratitudine il prezioso contributo di James Schafer, l&#39;operatore video, narratore, ed editore di questo video.

1. Dispositivo Fabrication Replica di caratteristiche microfluidica in materiali elastomerici si basa sul metodo descritto da Duffy et al. 1 <ol><li> Mix elastomero (polidimetilsilossano, PDMS) e catalizzatore dal Kit elastomero di silicone (Dow Corning, Midland, MI), in un rapporto in peso 9:1 e versare sopra il master in modo da formare uno strato di 4 mm di spessore. Degas per rimuovere le bolle d&#39;aria e polimerizzare la miscela a 60 ° C per 5 ore. Peel curata PDMS dallo stampo per ottenere un timbro di caratteristiche del flusso sul elastomero. </li><li> Fori Punch per ingressi e le uscite con un 1,5 mm biopsia (Miltex, York, PA), montato su un trapano a colonna. Estrarre tutti i detriti. </li><li> Oggetto Il lato le caratteristiche del timbro e un vetrino pulito per plasma di ossigeno per 8 minuti in un incisore plasma di ossigeno. Portare le superfici trattate immediatamente a contatto per formare un legame tra loro. Mantenere il gruppo a 60 ° C su un vetrino più caldo per almeno 5 ores per rafforzare il legame. </li><li> Collegare 0.032 &quot;ID tubi in PTFE (Cole Parmer, Vernon Hills, IL) per le entrate e le uscite utilizzando un&#39;interfaccia di luer lock maschio connettori collegati ai connettori spinato femmina luer lock (Qosina, Edgewood, New York). </li><li> Impostare il gruppo di flusso con valvole di intercettazione e di un connettore a Y (Upchurch scientifico, Oak Harbor, WA; la figura 1). Montare il dispositivo al microscopio. Collegare siringhe di tubi tramite 20G 1.5 &quot;aghi (BD Bioscience, Rockville, MD). </li></ol> 2. Formazione di Spheroids uniformi Sferoidi sono formate attraverso il metodo della goccia pendente 2,3. <ol><li> Tripsinizzare le cellule sotto cappa sterile coltura cellulare. </li><li> Centrifugare cellule tripsinizzate a 2000 rpm per 5 minuti e risospendere in 6 ml di mezzo fresco. Diluire la soluzione madre alla concentrazione finale desiderata (Tabella 1). </li><li> Togliere il coperchio di una piastra da 48 pozzetti e metterlo a testa in giù nella sterilized cappuccio. Zone circolari corrispondenti a ciascun pozzetto sono evidenti sul coperchio. Riempire ogni pozzetto della piastra con 1 ml di acqua sterilizzata per mantenere l&#39;umidità. Mettere a goccia 20 ml di soluzione diluita di cellule in ciascuna regione circolare con una micropipetta. Agitare delicatamente il coperchio e posizionarlo sopra la piastra pozzo, assicurando che le gocce non toccare i bordi dei pozzetti. </li><li> Incubare la piastra a pozzetti a 37 ° C per un determinato numero di giorni (Tabella 1). Uno sferoide si formerà in ogni goccia. </li></ol> 3. Introduzione di Spheroids in Dispositivo Fare riferimento alla Figura 1 e Tabella 2 per questa sezione. <ol><li> Sterilizzare il dispositivo da lavaggio con etanolo 70% introdotto attraverso l&#39;ingresso del flusso. Successivamente, lavare con PBS seguita da HEPES tamponati terreno di coltura cellulare. F lasciare la siringa medio S attaccato al tubo. </li><li> Pareggio 2-3 sferoidi in P siringa S, toccare la siringa per rimuovere le bolle d&#39;aria, ecollegare alla presa di imballaggio del dispositivo. </li><li> Apertura valvola di ingresso V Pin e vicino Fin V. Aprire la valvola di uscita Pout V e vicino Fout V. Tenere la siringa confezionatrice verticale con l&#39;ago rivolto verso il basso; guardare come sferoidi depositano sul fondo della siringa nel connettore luer lock dell&#39;ago. Spingere lo stantuffo sulla siringa di imballaggio e sferoidi orologi inserire il tubo e il flusso nel dispositivo. Poiché solo la valvola di uscita imballaggio è aperta, uno sferoide entrerà nella camera del dispositivo e conservate dal posti sul retro (Fig. 2). </li><li> Chiudere la valvola di ingresso e di uscita V Pin valvola Pout V. Montare la siringa F S su una pompa a siringa. Aprire la valvola V Fin e la valvola V Fout. Flusso medio nel dispositivo al 3 ml / min. </li></ol> 4. Introduzione di Agente Rilevamento Apoptosi (CaspGLOW) Dopo l&#39;imballaggio camere con sferoidi, raggiungere l&#39;equilibrio per up a 24 ore per stabilire gradienti nutrizionali e microambienti, prima di introdurre l&#39;apoptosi o la rilevazione di agenti terapeutici. Perché i tessuti in camere sono in contatto con le pareti impenetrabili dall&#39;alto e dal basso, non vi sono gradienti nutrienti lungo lo spessore (0,15 mm) del tessuto. Dopo 24 ore di incubazione, tutti strati di cellule lungo lo spessore del tessuto sono quindi equivalenti e l&#39;eterogeneità solo in una direzione lontano dal canale di flusso. <ol><li> Spegnere V Fin, fermare la pompa a siringa, rimuovere F S siringa dalla pompa e sostituirlo con una siringa con terreno contenente 0,25 microlitri / ml di CaspGLOW Red attiva caspasi-3 marcatore (Red-DEVD-FMK, Biovision, Mountain View, CA). </li><li> Manualmente irrigare 0,7 ml di questa soluzione attraverso il dispositivo per garantire lo spostamento di vecchi media. Montare la siringa sulla pompa, riavviare il flusso, e aperto Fin V. In un periodo di 5-8 ore, l&#39;apoptosi rilevamento diffonde agente in tegli reagisce in tessuto e brillanti nelle regioni apoptotici. Agente apoptosi rilevamento a questa concentrazione viene mantenuta in tutte le successive soluzioni di flusso nel dispositivo. </li></ol> Nota: <ol class="lroman"><li> Eterogeneità del tessuto può essere confermata mediante l&#39;ottenimento di profili di intensità di fluorescenza lineare come descritto nella Sezione 6. I profili dovrebbero mostrare gradienti spaziali in apoptosi, a conferma che il tessuto è eterogenea rispetto alla vitalità cellulare. </li><li> CaspGLOW verde attivo caspasi-3 marcatore (fluoresceina-DEVD-FMK; Biovision) può anche essere utilizzato per rilevare l&#39;apoptosi. Questo indicatore contiene il fluoroforo verde fluoresceina invece della rodamina fluorocromo rosso. </li></ol> 5. Introduzione di agente terapeutico <ol><li> Seguire la procedura dei passi 4,1-4,2 per introdurre doxorubicina cloridrato 10 mM (Dox, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) contenente l&#39;apoptosi rilevazione agente. </li><li> Continua il flusso del therapeagente soluzione UTIC per un determinato periodo di tempo. Valvola di intercettazione Fin V e spegnere la pompa a siringa. Sostituire la siringa trattamento con una siringa contenente mezzo fresco apoptosi rilevamento agente. Permettono il flusso di mezzo fresco per 24 -36 ore mentre monitorando continuamente il tessuto al microscopio. </li></ol> 6. Time-lapse microscopia e la stima dei coefficienti diffusività droga Per ottenere puliti dati di fluorescenza, acquisire tutte le immagini al microscopio, concentrandosi sugli strati inferiori dei tessuti. Perché non ci sono gradienti di nutrienti in direzione verticale (vedi sezione 4), gli strati inferiori di cellule sono buoni rappresentanti di tutti gli altri livelli di cui sopra. <ol><li> Il processo di acquisizione è stato automatizzato tramite uno script personalizzato in IPLab (BD Bioscience, Rockville, MD). Acquisire le immagini trasmesse luce e fluorescenza della sferoide imballato con ingrandimento 10x ogni 30 minuti (Fig. 3A). All&#39;acquisie l&#39;immagine di fluorescenza di fondo prima dell&#39;introduzione Dox. Per ospitare per le grandi dimensioni della camera (1000 micron x 300 micron), acquisisce due immagini adiacenti e piastrelle insieme 4. </li><li> Per la stima dei coefficienti di diffusività matematica droga, il primo passo è di generare profili di intensità medi lineari di Dox fluorescenza usando ImageJ. Selezionare una regione rettangolare di interesse (ROI) comprendente il tessuto nella camera. Utilizzare il comando Plot profilo per generare un profilo di intensità media in funzione della distanza dal canale di flusso. Ripetere l&#39;operazione per un massimo di 3 punti temporali diversi. </li><li> Ottenere un&#39;immagine di fluorescenza di fondo prima di introdurre Dox misurare autofluorescenza dal tessuto. Sottrarre la media intensità di fluorescenza di fondo dai profili di intensità ottenuti e normalizzare ogni profilo corrispondente per l&#39;intensità massima per ottenere <img src="/files/ftp_upload/2425/2425eq0.jpg" alt="c" /> (X, t) (Fig. 3B). </li><li> Il passo successivo è quello di valutare l&#39;efficacia del coefficiente di diffusione D Dox nel tessuto tumorale. Dox diffusione può essere rappresentata dalla seguente equazione 5 <img src="/files/ftp_upload/2425/2425eq1.jpg" alt="Equazione 1"/> dove FUNZ.ERRORE.COMP è la funzione errore complementare, x è la distanza nel tessuto dal canale, et è il tempo dopo l&#39;introduzione di Dox (vedi fig. 3). Utilizzare il seguente schema iterativo in ogni tempo considerato: <ul><li> Indovinate un valore per D </li><li> Calcolare lato destro dell&#39;equazione in ogni posizione x </li><li> Calcolare la somma dei quadrati degli errori (residuo) tra i due lati </li><li> Modificare D per minimizzare il residuo </li></ul></li><li> Media dei valori ottimali di D ottenuta ad ogni tempo per stimare il coefficiente medio di diffusione efficace Dox nel tessuto. </li></ol> 7. Rappresentante dei risultati: &lt;class = p &quot;jove_content&quot;&gt; I dispositivi microfluidici disponibile 1mm x 0,3 millimetri x 0,15 millimetri otticamente accessibili camere di coltura per la crescita di tridimensionale tessuto tumorale. Sferoidi tumorali multicellulari sono stati portati in queste camere e sono stati accolti da due posti di filtro sul retro. Il metodo della goccia pendente permesso rapida formazione di sferoidi di dimensioni consistenti e forma da linee cellulari diverse. Sferoidi sono stati coltivati ​​con successo sul dispositivo per un massimo di 3 giorni. Crescita nelle camere era associata con una modifica riproducibile di microambienti all&#39;interno sferoidi. Apoptosi in cellule verificato meno in prossimità del canale di flusso superiore e più in profondità nel tessuto. Il dispositivo è stato usato per stimare il coefficiente di diffusione della doxorubicina nel tessuto tumorale. Il valore ottenuto di 8,75 x 10 -7 cm 2 s -1 concorda con il valore di 9,1 x 10 -7 cm 2 s -1 riportato precedentemente 6 nel carcinoma mammario umano. <table border="1"><tbody><tr><td> Linea cellulare </td><td> Cella concentrazione richiesta </td><td> Tempo di incubazione </td></tr><tr><td> LS174T </td><td> 300 cellule / mL </td><td> 2-3 giorni </td></tr><tr><td> T47D </td><td> 750 cellule / mcl </td><td> 3-4 giorni </td></tr><tr><td> MDA-MB-231 </td><td> 150 cellule / mL </td><td> 5-6 giorni </td></tr></tbody></table> Parametri Tabella 1. Spheroids per goccia <table border="1"><tbody><tr><td> Parte </td><td> Descrizione </td></tr><tr><td> S F </td><td> Flusso Siringa </td></tr><tr><td> S P </td><td> Imballaggio Siringa </td></tr><tr><td> V Fin </td><td> Flusso in entrata della valvola </td></tr><tr><td> V Pin </td><td> Imballaggio valvola di aspirazione </td></tr><tr><td> V Fout </td><td> Portata in uscita della valvola </td></tr><tr><td> V Pout </td><td> Imballaggio valvola di scarico </td></tr></tbody></table> Siringhe Tabella 2. E valvole in configurazione di flusso <img src="/files/ftp_upload/2425/2425fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1 Schema della configurazione del flusso V e V Fin Fout:. Aspirazione di flusso e valvole di scarico, V Pin e Pout V: ingresso Imballaggio e valvole di scarico, S F e S P: flusso e siringhe di imballaggio. La siringa imballaggio e confezionamento valvole di aspirazione e scarico sono utilizzati quando uno sferoide è volato nella camera. La siringa flusso e flusso di aspirazione e valvole di scarico vengono utilizzati per scorrere medio successivamente. <img src="/files/ftp_upload/2425/2425fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2. Schematica di uno sferoide intrappolato in una camera sul dispositivo. Uno sferoide è fluito nella camera del dispositivo ed è bloccato da due pos filtrots sul retro della camera. <img src="/files/ftp_upload/2425/2425fig3.jpg" alt="Figura 3" /> Figura 3. Doxorubicina diffusione nel tessuto tumorale sul dispositivo. A. Fusione trasmessa immagine luce e rosso fluorescente del tessuto, mostra la località e la concentrazione di doxorubicina (in rosso). Barra della scala rappresenta 250 micron. B. profilo normalizzato intensità di fluorescenza lineare da doxorubicina.

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	<li>Duffy, D. C., McDonald, J. C., Schueller, O. J., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+Prototyping+of+Microfluidic+Systems+in+Poly(dimethylsiloxane).">Rapid Prototyping of Microfluidic Systems in Poly(dimethylsiloxane).</a> Anal. Chem. 70, 4974-4984 (1998).</li><li>Kelm, J. M., Timmins, N. E., Brown, C. J., Fussenegger, M., Nielsen, L. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Method+for+generation+of+homogeneous+multicellular+tumor+spheroids+applicable+to+a+wide+variety+of+cell+types.">Method for generation of homogeneous multicellular tumor spheroids applicable to a wide variety of cell types.</a> Biotechnol. Bioeng. 83, 173-180 (2003).</li><li>Timmins, N. E., Nielsen, L. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+multicellular+tumor+spheroids+by+the+hanging-drop+method.">Generation of multicellular tumor spheroids by the hanging-drop method.</a> Methods. Mol. Med. 140, 141-151 (2007).</li><li>Kasinskas, R. W., Forbes, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Salmonella+typhimurium+specifically+chemotax+and+proliferate+in+heterogeneous+tumor+tissue+in+vitro.">Salmonella typhimurium specifically chemotax and proliferate in heterogeneous tumor tissue in vitro.</a> Biotechnol. Bioeng. 94, 710-721 (2006).</li><li>Walsh, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+multipurpose+microfluidic+device+designed+to+mimic+microenvironment+gradients+and+develop+targeted+cancer+therapeutics.">A multipurpose microfluidic device designed to mimic microenvironment gradients and develop targeted cancer therapeutics.</a> Lab. Chip. 9, 545-554 (2009).</li><li>Lankelma, J., Fernandez Luque, R., Dekker, H., Schinkel, W., Pinedo, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mathematical+model+of+drug+transport+in+human+breast+cancer.">A mathematical model of drug transport in human breast cancer.</a> Microvasc. Res. 59, 149-161 (2000).</li><li>Less, J. R., Skalak, T. C., Sevick, E. M., Jain, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microvascular+architecture+in+a+mammary+carcinoma:+branching+patterns+and+vessel+dimensions.">Microvascular architecture in a mammary carcinoma: branching patterns and vessel dimensions.</a> Cancer. Res. 51, 265-273 (1991).</li><li>Brown, J. M., Giaccia, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+unique+physiology+of+solid+tumors:+opportunities+(and+problems)+for+cancer+therapy.">The unique physiology of solid tumors: opportunities (and problems) for cancer therapy.</a> Cancer. Res. 58, 1408-1416 (1998).</li><li>Thomlinson, R. H., Gray, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+histological+structure+of+some+human+lung+cancers+and+the+possible+implications+for+radiotherapy.">The histological structure of some human lung cancers and the possible implications for radiotherapy.</a> Br. J. Cancer. 9, 539-549 (1955).</li><li>Minchinton, A. I., Tannock, I. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drug+penetration+in+solid+tumours.">Drug penetration in solid tumours.</a> Nat. Rev. Cancer. 6, 583-592 (2006).</li></ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Il sistema vascolare nei tumori è scarsa e mal sviluppati 7,8. Ci sono regioni lontane (&gt; 100 micron) dai vasi sanguigni che sono inaccessibili ai nutrienti e farmaci forniti anche se il sistema vascolare 9. Il microambiente eterogenea risultante contribuisce alla limitata efficacia di molti chemioterapici 10. Il dispositivo microfluidico qui sviluppato ricrea un microambiente tumorale eterogenea caratterizzata da proliferazione, le cellule quiescenti e apoptotiche o necrotiche, in v...

<table border="1"><tbody><tr><th> Nome del reagente </th><th> Azienda </th><th> Numero di catalogo </th><th> Commenti </th></tr><tr><td> Silicone elastomero kit </td><td> Adesivi Ellsworth </td><td> 184 Sil Elast Kit </td><td></td></tr><tr><td> Miltex biopsia </td><td> MedexSupply </td><td> MTX-33-31AA </td><td> 1,5 millimetri </td></tr><tr><td> Tubi in PTFE </td><td> Cole Parmer </td><td> EW-06417-31 </td><td> 0,032 &quot;ID </td></tr><tr><td> Maschio luer lock </td><td> Qosina </td><td> 65111 </td><td></td></tr><tr><td> Spinato raccordo luer lock femmina </td><td> Qosina </td><td> 11556 </td><td></td></tr><tr><td> Valvola di intercettazione </td><td> Idex Health and Science </td><td> P-721 </td><td></td></tr><tr><td> Connettore a Y </td><td> Idex Health and Science </td><td> P-513 </td><td></td></tr><tr><td> 20G 1.5 &quot;aghi </td><td> BD Bioscience </td><td> 305176 </td><td></td></tr><tr><td> Tripsina-EDTA </td><td> Invitrogen </td><td> 25300-054 </td><td></td></tr><tr><td> HEPES </td><td> Sigma </td><td> H-4034 </td><td></td></tr><tr><td> CaspGLOW fluoresceina </td><td> Biovision </td><td> K183-25 </td><td></td></tr><tr><td> CaspGLOW Red </td><td> Biovision </td><td> K193-25 </td><td></td></tr><tr><td> Doxorubicina cloridrato </td><td> Sigma </td><td> 44583 </td><td></td></tr><tr><td> LS174T </td><td> ATCC </td><td> CCL-188 </td><td> Carcinoma del colon umano linea di cellule </td></tr><tr><td> T47D </td><td> ATCC </td><td> HTB-133 </td><td> Umano carcinoma duttale linea cellulare </td></tr><tr><td> MDA-MB-231 </td><td> ATCC </td><td> HTB-26 </td><td> Adenocarcinoma mammario umano linea di cellule </td></tr></tbody></table>

microfluidic device for recreating a tumor microenvironment in vitro

Abbiamo sviluppato un dispositivo a microfluidi che imita la consegna e la clearance sistemica di farmaci per eterogenei tessuti tumorali tridimensionali in vitro. I nutrienti forniti da vascolarizzazione non riescono a raggiungere tutte le parti di tumori, dando luogo a microambienti eterogenei costituiti da tipi di cellule vitali, quiescenti e necrotico. Farmaci contro il cancro Molti non riescono a penetrare in modo efficace e trattare tutti i tipi di cellule a causa di questa eterogeneità. Monostrati di cellule tumorali non imitare questa eterogeneità, rendendo difficile per testare farmaci antitumorali di un idoneo modello in vitro. I nostri dispositivi microfluidici sono stati realizzati su PDMS utilizzando la litografia soffice. Sferoidi multicellulari tumorali, formate con il metodo della goccia pendente, sono stati inseriti e vincolati in camere rettangolari sul dispositivo e mantenuto con perfusione mezzo continuo su un lato. La forma rettangolare delle camere sul dispositivo creato gradienti lineari all&#39;interno del tessuto. Macchie fluorescenti sono stati utilizzati per quantificare °variabilità e in apoptosi all&#39;interno del tessuto. Tumori sul dispositivo sono stati trattati con la doxorubicina farmaco chemioterapico fluorescente, time-lapse microscopia è stata utilizzata per monitorare la diffusione nel tessuto, e il coefficiente di diffusione efficace è stato stimato. Il metodo della goccia pendente permesso rapida formazione di sferoidi uniformi dalle diverse linee cellulari tumorali. Il dispositivo è attivata crescita di sferoidi fino a 3 giorni. Cellule in prossimità del flusso mezzo erano minimamente apoptotica e lontani dal canale erano più apoptotico, così accuratamente mimando regioni tumori adiacenti ai vasi sanguigni. Il valore stimato del coefficiente di diffusione doxorubicina concordato con un valore precedentemente riportato nel carcinoma mammario umano. Poiché la penetrazione e ritenzione dei farmaci nei tumori solidi influenza la loro efficacia, noi crediamo che questo dispositivo è uno strumento importante per comprendere il comportamento dei farmaci, e lo sviluppo di nuove terapie contro il cancro.

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Microfluidic Device for Recreating a Tumor Microenvironment in Vitro

Vi presentiamo la procedura per la fabbricazione e il funzionamento di un dispositivo a microfluidi che ricrea eterogenei microambienti tumorali<em&gt; In vitro</em&gt;. La variabilità in apoptosi nel tessuto tumorale è stata quantificata mediante macchie fluorescenti e il coefficiente di diffusione efficace del farmaco chemioterapico doxorubicina nel tessuto tumorale è stata valutata.

Dispositivo Microfluidic per ricreare un microambiente tumorale<em&gt; In Vitro</em

We have developed a microfluidic device that mimics the delivery and systemic clearance of drugs to heterogeneous three-dimensional tumor tissues in ...

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

Microfluidic Device for Recreating a Tumor Microenvironment in Vitro

11.5K Views.  University Of Massachusetts Amherst. Vi presentiamo la procedura per la fabbricazione e il funzionamento di un dispositivo a microfluidi che ricrea eterogenei microambienti tumorali In vitro. La variabilità in apoptosi nel tessuto tumorale è stata quantificata mediante macchie fluorescenti e il coefficiente di diffusione efficace del farmaco chemioterapico doxorubicina nel tessuto tumorale è stata valutata.

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A Microfluidic Device for Studying Multiple Distinct Strains

The study of cell responses to environmental changes poses many experimental challenges: cells need to be imaged under changing conditions, often in a comparative manner. Multiwell plates are routinely used to compare many different strains or cell lines, but allow limited control over the environment dynamics. Microfluidic devices, on the other hand, allow exquisite dynamic control over the surrounding conditions, but it is challenging to image and distinguish more than a few strains in them. Here we describe a method to easily and rapidly manufacture a microfluidic device capable of applying dynamically changing conditions to multiple distinct yeast strains in one channel. The device is designed and manufactured by simple means without the need for soft lithography. It is composed of a Y-shaped flow channel attached to a second layer harboring microwells. The strains are placed in separate microwells, and imaged under the exact same dynamic conditions. We demonstrate the use of the device for measuring protein localization responses to pulses of nutrient changes in different yeast strains.

We present a simple method to produce microfluidic devices capable of applying similar dynamic conditions to multiple distinct strains, without the need for a clean room or soft lithography.

Un dispositivo a microfluidi per lo studio più ceppi distinti

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Ricerca

Bioingegneria

Tissue Engineering of Tumor Stromal Microenvironment with Application to Cancer Cell Invasion

3D organotypic cultures of epithelial cells on a matrix embedded with mesenchymal cells are widely used to study epithelial cell differentiation and invasion. Rat tail type I collagen and/or matrix derived from Engelbreth-Holm-Swarm mouse sarcoma cells have been traditionally employed as the substrates to model the matrix or stromal microenvironment into which mesenchymal cells (usually fibroblasts) are populated. Although experiments using such matrices are very informative, it can be argued that due to an overriding presence of a single protein (such as in type I Collagen) or a high content of basement membrane components and growth factors (such as in matrix derived from mouse sarcoma cells), these substrates do not best reflect the contribution to matrix composition made by the stromal cells themselves. To study native matrices produced by primary dermal fibroblasts isolated from patients with a tumor prone, genetic blistering disorder (recessive dystrophic epidermolysis bullosa), we have adapted an existing native matrix protocol to study tumor cell invasion. Fibroblasts are induced to produce their own matrix over a prolonged period in culture. This native matrix is then detached from the culture dish and epithelial cells are seeded onto it before the entire coculture is raised to the air-liquid interface. Cellular differentiation and/or invasion can then be assessed over time. This technique provides the ability to assess epithelial-mesenchymal cell interactions in a 3D setting without the need for a synthetic or foreign matrix with the only disadvantage being the prolonged period of time required to produce the native matrix. Here we describe the application of this technique to assess the ability of a single molecule expressed by fibroblasts, type VII collagen, to inhibit tumor cell invasion.

Tissue engineered fibroblast-derived native matrix is an emerging tool to generate a stromal substrate which supports epithelial cell proliferation and differentiation. Here a protocol applying this methodology to assess the impact of different stromal cell types on tumor cell biology is presented.

Ingegneria dei tessuti del tumore stromale Microenvironment con l&#39;applicazione di Invasion Cancer Cell

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Protocol for Biofilm Streamer Formation in a Microfluidic Device with Micro-pillars

Several bacterial species possess the ability to attach to surfaces and colonize them in the form of thin films called biofilms. Biofilms that grow in porous media are relevant to several industrial and environmental processes such as wastewater treatment and CO2 sequestration. We used Pseudomonas fluorescens, a Gram-negative aerobic bacterium, to investigate biofilm formation in a microfluidic device that mimics porous media. The microfluidic device consists of an array of micro-posts, which were fabricated using soft-lithography. Subsequently, biofilm formation in these devices with flow was investigated and we demonstrate the formation of filamentous biofilms known as streamers in our device. The detailed protocols for fabrication and assembly of microfluidic device are provided here along with the bacterial culture protocols. Detailed procedures for experimentation with the microfluidic device are also presented along with representative results.

Protocols for the study of biofilm formation in a microfluidic device that mimics porous media are discussed. The microfluidic device consists of an array of micro-pillars and biofilm formation by Pseudomonas fluorescens in this device is investigated.

Protocollo per il Biofilm Streamer formazione in un dispositivo a microfluidi con Micro-pilastri

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Analyzing Mixing Inhomogeneity in a Microfluidic Device by Microscale Schlieren Technique

In this paper, we introduce the use of microscale schlieren technique to measure mixing inhomogeneity in a microfluidic device. The microscale schlieren system is constructed from a Hoffman modulation contrast microscope, which provides easy access to the rear focal plane of the objective lens, by removing the slit plate and replacing the modulator with a knife-edge. The working principle of microscale schlieren technique relies on detecting light deflection caused by variation of refractive index1-3. The deflected light either escapes or is obstructed by the knife-edge to produce a bright or a dark band, respectively. If the refractive index of the mixture varies linearly with its composition, the local change in light intensity in the image plane is proportional to the concentration gradient normal to the optical axis. The micro-schlieren image gives a two-dimensional projection of the disturbed light produced by three-dimensional inhomogeneity.
To accomplish quantitative analysis, we describe a calibration procedure that mixes two fluids in a T-microchannel. We carry out a numerical simulation to obtain the concentration gradient in the T-microchannel that correlates closely with the corresponding micro-schlieren image. By comparison, a relationship between the grayscale readouts of the micro-schlieren image and the concentration gradients presented in a microfluidic device is established. Using this relationship, we are able to analyze the mixing inhomogeneity from associate micro-schlieren image and demonstrate the capability of microscale schlieren technique with measurements in a microfluidic oscillator4. For optically transparent fluids, microscale schlieren technique is an attractive diagnostic tool to provide instantaneous full-field information that retains the three-dimensional features of the mixing process.

Herein, we describe a procedure that employs microscale schlieren technique to measure mixing inhomogeneity in a microfluidic device. Through calibration, distribution of concentration gradient can be derived from the micro-schlieren image.

Analizzando disomogeneità Mescolando in un dispositivo a microfluidi da Tecnica microscala Schlieren

In this paper, we introduce the use of microscale schlieren technique to measure mixing inhomogeneity in a microfluidic device. The microscale schlieren ...

Eye Irritation Test (EIT) for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial (RhCE) Tissue Model

To comply with the Seventh Amendment to the EU Cosmetics Directive and EU REACH legislation, validated non-animal alternative methods for reliable and accurate assessment of ocular toxicity in man are needed. To address this need, we have developed an eye irritation test (EIT) which utilizes a three dimensional reconstructed human cornea-like epithelial (RhCE) tissue model that is based on normal human cells. The EIT is able to separate ocular&#160;irritants and corrosives (GHS Categories 1 and 2 combined) and those that do not require labeling (GHS No Category). The test utilizes two separate protocols, one designed for liquid chemicals and a second, similar protocol for solid test articles. The EIT prediction model uses a single exposure period (30 min for liquids, 6 hr for solids) and a single tissue viability cut-off (60.0% as determined by the MTT assay). Based on the results for 83 chemicals (44 liquids and 39 solids) EIT achieved 95.5/68.2/ and 81.8% sensitivity/specificity and accuracy (SS&#38;A) for liquids, 100.0/68.4/ and 84.6% SS&#38;A for solids, and 97.6/68.3/ and 83.1% for overall SS&#38;A. The EIT will contribute significantly to classifying the ocular irritation potential of a wide range of liquid and solid chemicals without the use of animals to meet regulatory testing requirements. The EpiOcular EIT method was implemented in 2015 into the OECD Test Guidelines as TG 492.

Eye Irritation Test EIT for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial RhCE Tissue Model

We have developed an eye irritation test which utilizes a three dimensional reconstructed human cornea-like epithelial (RhCE) tissue model. The test is able to discriminate between ocular irritant and corrosive materials (GHS Categories 1 and 2 combined) and those that do not require labeling (GHS No Category).

Oculare Test (EIT) per identificazione del pericolo di sostanze chimiche irritanti oculari utilizzando Ricostruito umana Cornea come epiteliale (RHCE) Tessuto Modello

To comply with the Seventh Amendment to the EU Cosmetics Directive and EU REACH legislation, validated non-animal alternative methods for reliable and ...

Co-culture of Living Microbiome with Microengineered Human Intestinal Villi in a Gut-on-a-Chip Microfluidic Device

Here, we describe a protocol to perform long-term co-culture of multi-species human gut microbiome with microengineered intestinal villi in a human gut-on-a-chip microphysiological device. We recapitulate the intestinal lumen-capillary tissue interface in a microfluidic device, where physiological mechanical deformations and fluid shear flow are constantly applied to mimic peristalsis. In the lumen microchannel, human intestinal epithelial Caco-2 cells are cultured to form a &#39;germ-free&#39; villus epithelium and regenerate small intestinal villi. Pre-cultured microbial cells are inoculated into the lumen side to establish a host-microbe ecosystem. After microbial cells adhere to the apical surface of the villi, fluid flow and mechanical deformations are resumed to produce a steady-state microenvironment in which fresh culture medium is constantly supplied and unbound bacteria (as well as bacterial wastes) are continuously removed. After extended co-culture from days to weeks, multiple microcolonies are found to be randomly located between the villi, and both microbial and epithelial cells remain viable and functional for at least one week in culture. Our co-culture protocol can be adapted to provide a versatile platform for other host-microbiome ecosystems that can be found in various human organs, which may facilitate in vitro study of the role of human microbiome in orchestrating health and disease.

We describe an in vitro protocol to co-culture gut microbiome and intestinal villi for an extended period using a human gut-on-a-chip microphysiological system.

Co-cultura del vivere Microbiome con Microengineered umana intestinale Villi in un Gut-on-a-chip microfluidico dispositivo

Here, we describe a protocol to perform long-term co-culture of multi-species human gut microbiome with microengineered intestinal villi in a human ...

Perfusable Vascular Network with a Tissue Model in a Microfluidic Device

A spheroid (a multicellular aggregate) is regarded as a good model of living tissues in the human body. Despite the significant advancement in the spheroid cultures, a perfusable vascular network in the spheroids remains a critical challenge for long-term culture required to maintain and develop their functions, such as protein expressions and morphogenesis. The protocol presents a novel method to integrate a perfusable vascular network within the spheroid in a microfluidic device. To induce a perfusable vascular network in the spheroid, angiogenic sprouts connected to microchannels were guided to the spheroid by utilizing angiogenic factors from human lung fibroblasts cultured in the spheroid. The angiogenic sprouts reached the spheroid, merged with the endothelial cells co-cultured in the spheroid, and formed a continuous vascular network. The vascular network could perfuse the interior of the spheroid without any leakage. The constructed vascular network may be further used as a route for supply of nutrients and removal of waste products, mimicking blood circulation in vivo. The method provides a new platform in spheroid culture toward better recapitulation of living tissues.

The protocol describes how to engineer a perfusable vascular network in a spheroid. The spheroid's surrounding microenvironment is devised to induce angiogenesis and connect the spheroid to the microchannels in a microfluidic device. The method allows the perfusion of the spheroid, which is a long-awaited technique in three-dimensional cultures.

Perfusable rete vascolare con un modello di tessuto in un dispositivo microfluidico

A spheroid (a multicellular aggregate) is regarded as a good model of living tissues in the human body. Despite the significant advancement in the ...

Advanced 3D Liver Models for In vitro Genotoxicity Testing Following Long-Term Nanomaterial Exposure

Due to the rapid development and implementation of a diverse array of engineered nanomaterials (ENM), exposure to ENM is inevitable and the development of robust, predictive in vitro test systems is essential. Hepatic toxicology is key when considering ENM exposure, as the liver serves a vital role in metabolic homeostasis and detoxification as well as being a major site of ENM accumulation post exposure. Based upon this and the accepted understanding that 2D hepatocyte models do not accurately mimic the complexities of intricate multi-cellular interactions and metabolic activity observed in vivo, there is a greater focus on the development of physiologically relevant 3D liver models tailored for ENM hazard assessment purposes in vitro. In line with the principles of the 3Rs to replace, reduce and refine animal experimentation, a 3D HepG2 cell-line based liver model has been developed, which is a user friendly, cost effective system that can support both extended and repeated ENM exposure regimes (&#8804;14 days). These spheroid models (&#8805;500 &#181;m in diameter) retain their proliferative capacity (i.e., dividing cell models) allowing them to be coupled with the &#8216;gold standard&#8217; micronucleus assay to effectively assess genotoxicity in vitro. Their ability to report on a range of toxicological endpoints (e.g., liver function, (pro-)inflammatory response, cytotoxicity and genotoxicity) has been characterized using several ENMs across both acute (24 h) and long-term (120 h) exposure regimes. This 3D in vitro hepatic model has the capacity to be utilized for evaluating more realistic ENM exposures, thereby providing a future in vitro approach to better support ENM hazard assessment in a routine and easily accessible manner.

This procedure was established to be used for developing advanced 3D hepatic cultures in vitro, which can provide a more physiologically relevant assessment of the genotoxic hazards associated with nanomaterial exposures over both an acute or long-term, repeated dose regimes.

Modelli avanzati di fegato 3D per test di genotossicità in vitro a seguito dell'esposizione a lungo termine ai nanomateriali

Due to the rapid development and implementation of a diverse array of engineered nanomaterials (ENM), exposure to ENM is inevitable and the development of ...

Generation of Dynamical Environmental Conditions using a High-Throughput Microfluidic Device

Mimicking in vivo environmental conditions is crucial for in vitro studies on complex life machinery. However, current techniques targeting live cells and organs are either highly expensive, like robotics, or lack nanoliter volume and millisecond time accuracy in liquid manipulation. We herein present the design and fabrication of a microfluidic system, which consists of 1,500 culture units, an array of enhanced peristaltic pumps and an on-site mixing modulus. To demonstrate the capacities of the microfluidic device, neural stem cell (NSC) spheres are maintained in the proposed system. We observed that when the NSC sphere is exposed to CXCL in day 1 and EGF in day 2, the round-shaped conformation is well maintained. Variation in the input order of 6 drugs causes morphological changes to the NSC sphere and the expression level representative marker for NSC stemness (i.e., Hes5 and Dcx). These results indicate that dynamic and complex environmental conditions have great effects on NSC differentiation and self-renewal, and the proposed microfluidic device is a suitable platform for high throughput studies on the complex life machinery.

We present a microfluidic system for high throughput studies on complex life machinery, which consists of 1500 culture units, an array of enhanced peristaltic pumps and an on-site mixing modulus. The microfluidic chip allows for the analysis of the highly complex and dynamic micro-environmental conditions in vivo.

Generazione di condizioni ambientali dinamiche utilizzando un dispositivo microfluidico ad alta produttività

Mimicking in vivo environmental conditions is crucial for in vitro studies on complex life machinery. However, current techniques targeting live cells and ...

Configurazione di un dispositivo microfluidico per la produzione di tappi combinatoriali

Bilayer Microfluidic Device for Combinatorial Plug Production

Droplet microfluidics is a versatile tool that allows the execution of a large number of reactions in chemically distinct nanoliter compartments. Such systems have been used to encapsulate a variety of biochemical reactions - from incubation of single cells to implementation of PCR reactions, from genomics to chemical synthesis. Coupling the microfluidic channels with regulatory valves allows control over their opening and closing, thereby enabling the rapid production of large-scale combinatorial libraries consisting of a population of droplets with unique compositions. In this paper, protocols for the fabrication and operation of a pressure-driven, PDMS-based bilayer microfluidic device that can be utilized to generate combinatorial libraries of water-in-oil emulsions called plugs are presented. By incorporating software programs and microfluidic hardware, the flow of desired fluids in the device can be controlled and manipulated to generate combinatorial plug libraries and to control the composition and quantity of constituent plug populations. These protocols will expedite the process of generating combinatorial screens, particularly to study drug response in cells from cancer patient biopsies.

Autore in primo piano: Integrazione di approcci computazionali e sperimentali nell'oncologia di precisione

The fabrication of a polydimethylsiloxane (PDMS)-based bilayer device for the production of combinatorial libraries in water-in-oil emulsions (plugs) is presented here. The necessary hardware and software required to automate plug production are detailed in the protocol, and the production of a quantitative library of fluorescent plugs is also demonstrated.

Dispositivo microfluidico a doppio strato per la produzione di tappi combinatori

Droplet microfluidics is a versatile tool that allows the execution of a large number of reactions in chemically distinct nanoliter compartments. Such ...