Questo lavoro è stato sostenuto da una borsa di studio del Howard Hughes Medical Institute e la National Science Foundation per RG, e fondi erogati a SM dal National Institutes of Health (Grant R01-HL98416) e l&#39;American Heart Association (Grant 09BGIA2450014).

1. Coltivazione di un monostrato di cellule in Transwell Inserti <ol><li> In una sterile, livello di biosicurezza 2 cellule cappa cultura, pongono 0,8 millimetri poro PET Transwell inserisce in una piastra a 24 pozzetti (4 pozzi per condizione, per la significatività statistica) con una pinza. Tutti i materiali cofano, devono essere sterilizzati con etanolo. </li></ol> Nota: La dimensione dei pori del filtro deve essere selezionato in accordo alla dimensione media della NC utilizzato, per consentire il trasporto attraverso la membrana. Inoltre, per ottenere risultati statisticamente significativi, ogni condizione sperimentale richiede un minimo di quattro ripetizioni (pozzi) all&#39;interno dello stesso esperimento, e un minimo di tre esperimenti indipendenti. <ol start="2"><li> Preparare terreno di coltura contenente DMEM supplementato con 4,5 g / L di glucosio, siero bovino fetale 15% e 1% Pen Strep, e calore a 37 ° C in un bagno d&#39;acqua. </li><li> Diluire adenocarcinoma colorettale epiteliale umano (Caco-2), le cellule in terreno cellulare e luogo200-400 microlitri della soluzione nella cella superiore (apicale) camera dell&#39;inserto transwell, ad una densità di 1,5 x 10 5 cellule / cm 2. Riempire il più basso (basolaterale) da camera con 700-900 ml di mezzo cellulare. </li><li> Cellule di coltura a 37 ° C, 5% CO 2, e 95% di umidità per 16-21 giorni, sostituendo il mezzo nella camera superiore e inferiore ogni 3-4 giorni, utilizzando i volumi indicati al punto 1.3. Sostituire medio nel seguente ordine di mantenere la pressione sopra (anziché sotto) il monostrato cellulare: aspirare il terreno dalla camera inferiore, aspirare il terreno dalla camera superiore, riempire la camera superiore con mezzo fresco, e riempire la camera inferiore con terreno fresco. </li></ol> 2. Validazione del GI epiteliale permeabilità della barriera Uso transepiteliale resistenza elettrica (TEER) e Immunostaining di giunzioni strette <ol><li> Per la conservazione a breve termine (meno di 2 settimane), immergere gli elettrodi STX100 in una soluzione elettrolitazione (0,1-0,15 M KCl o NaCl). Collegare il cavo dell&#39;elettrodo alla porta elettrodo sul misuratore Evom volt-ohm in modo che il sistema è internamente cortocircuitati e elettrodo simmetria è mantenuta. Per la conservazione a lungo termine, sciacquare con dH 2 O e conservare in un luogo asciutto, condizione di buio. </li><li> Per sterilizzare gli elettrodi, immergere in etanolo per 15 minuti e lasciare asciugare all&#39;aria per 15 sec. In alternativa, gli elettrodi possono essere memorizzati in una cappa UV. Risciacquare gli elettrodi in una soluzione sterile elettrolita (soluzione salina tampone fosfato, PBS) o 0,1-0,15 soluzione M KCl o NaCl, prima di ogni misurazione della resistenza. </li><li> Con il voltmetro ohm impostata alla resistenza, verticalmente posizionare gli elettrodi in un pozzetto contenente l&#39;inserto transwell, con la breve elettrodo nella camera superiore e lungo elettrodo nella camera inferiore toccare il fondo del pozzo. Dopo la lettura Evom stabilizza, registrare il valore di resistenza (dato in ohm, Ω) per ogni bene. </li><li> Calcola resistività (resisce normalizzato a zona; Ω × cm 2) di campioni sottraendo la resistenza di fondo (TEER di inserti transwell senza celle) e moltiplicando per la superficie della membrana. Valori di resistività sono più spesso riportati in letteratura. (Vedi la discussione) </li><li> Ripetere le misurazioni ogni 1-2 giorni fino TEER valori aumentano al massimo e plateau, indicando la formazione di una barriera di permeabilità, che richiede in genere 2-3 settimane dal momento del Platting cella. Valori e il tempo necessario a conseguire integrità della barriera Plateau TEER possono variare in base al numero di cellulare di passaggio. </li><li> Per verificare la presenza di giunzioni strette in monostrati di cellule con alta TEER (uguale o superiore al valore di soglia per la formazione di barriera), fissare le cellule mediante incubazione con freddo 2% paraformaldeide per 15 min. Poi, lavare le cellule con PBS e incubate per 30 minuti a temperatura ambiente con 1 mg / ml di anti-occludina. Lavare le cellule nuovamente con PBS e incubare per 30 min a temperatura ambiente con 7,5 ug / ml fanticorpi secondari luorescently-etichettati. Utilizzare pozzetti con basso TEER come controllo negativo per la formazione barriera. </li></ol> Nota: Come sostituto per anti-occludina, possono essere utilizzati anticorpi contro proteine ​​alternative giunzione stretti. <ol start="7"><li> Asportare con cura la membrana filtrante su cui è collegato il monostrato fisso, e montare su vetrini per l&#39;imaging che utilizzano epifluorescenza o microscopia confocale. </li></ol> 3. Valutare transepiteliale trasporto di portatori di mirate <ol><li> Etichetta la mira anticorpo (anticorpo monoclonale di topo contro ICAM-1, anti-ICAM, in questo esempio) con 125 I, come descritto in precedenza 7. Utilizzare saggio Bradford per stimare la concentrazione di proteine ​​e un contatore gamma per determinare 125 I contenuti di anticorpi, quindi calcolare l&#39;attività specifica in conteggi per minuto (CPM) / mg di anticorpo marcato. </li></ol> Nota: Per controllare per la specificità, riRipetere la procedura con IgG etichettatura mouse, che verrà utilizzato per preparare NC rivestiti non mirati. Per studiare il trasporto di un carico terapeutica, ripetere la procedura di etichettatura del carico, per esempio, alfa-galattosidasi (α-Gal) in questo esempio. Alternative possono essere usate per l&#39;agente targeting, il controllo non specifico, o merci terapeutico. Metodi alternativi possono essere utilizzati anche per etichettare i composti e stimare la concentrazione delle controparti etichettati. <ol start="2"><li> Coppia il marcato di targeting anticorpi (anti-ICAM nel nostro esempio) alla superficie di NC. In questo esempio, incubare nanobeads polistirolo (diametro di 100 nm) per 1 ora a temperatura ambiente con 125 I-anti-ICAM per consentire adsorbimento superficie, come descritto 7. </li></ol> Nota: Per il controllo non specifico uso 125 I-IgG. Per tracciare il trasporto di un carico, utilizzare una combinazione di anticorpi rivolti e 125 I-marcato carico (α-Gal nel nostro esempio). <ol start="3"><li> Centrifugare a 13.000 xg per 3 min e rimuovere le controparti non-rivestiti nel surnatante tramite aspirazione. Risospendere il pellet contenente NC rivestiti con 1% di albumina sierica bovina (BSA) in PBS pipettando, e sonicare a bassa potenza per distruggere potenziali aggregati di particelle (20-30 brevi impulsi). </li><li> Per la caratterizzazione NC, misurare le dimensioni, polidispersità, e ζ-potenziale di particelle rivestite utilizzando light scattering dinamico (seguendo le istruzioni del fornitore), e quantificare il numero di 125 I-marcato targeting molecole anticorpali (ad esempio anti-ICAM) sulla superficie delle particelle utilizzando un contatore gamma. </li></ol> Nota: Questi metodi possono essere ripetute per controparti non specifici e terapeutiche. La dimensione delle particelle rivestite varia circa 200 nm. <ol start="5"><li> Aggiungere 125 NC I-anticorpo, (ad esempio 125 I-anti-ICAM NCs; 56 nCi / ml) alla camera superiore sopra confluenti Caco-2 monostrati con TEER &amp;# 8805; 350 Ω × cm 2 (vedi discussione) su sfondo (16-21 giorni dopo la semina). Incubare a 37 ° C per una o più di tempo desiderato intervalli. Misurare TEER (Sezione 2.3) prima e dopo incubazione per valutare gli effetti della NC sulla barriera di permeabilità. </li></ol> Nota: Questa procedura può essere ripetuta per controparti non specifici e terapeutiche. <ol start="6"><li> Raccogliere medio dalle camere superiori e inferiori e lavare una volta con 0,5 ml di DMEM a 37 ° C (camera superiore) o 1 ml dH 2 O (camera inferiore). Raccogliere i lavaggi per la misurazione del contenuto totale radioisotopo in un contatore gamma. </li><li> Per la misura della frazione di cellule, asportare il filtro permeabile, per esempio usando una lama di rasoio per tagliare lungo i bordi, e incubare in un tubo contatore gamma con 1% Triton X-100 per 10 minuti (per rilasciare il contenuto delle celle), prima cella di misura associata radioattività totale. </li><li> Per misurare 125 ho riaffittati da NC durante il trasporto oa causa di potenziale degrado, primo mix 300 ml di campione (provenienti dalle frazioni superiori, inferiori o cellulari) con 700 ml di 3% BSA in PBS e 200 ml di acido tricloroacetico (TCA). Incubare a temperatura ambiente per 15 min. Nel frattempo questa volta, misurare la radioattività totale di questo campione in un contatore gamma. </li><li> Centrifugare i campioni TCA a 3.000 xg per 5 minuti per separare proteina intatta (pellet) dalla proteina degradata o 125 I frazione (surnatante). Quantificare la radioattività della libera 125 frazione I e sottrarre questo valore dal radioattività totale misurato prima della centrifugazione. Ciò fornirà la quantità della proteina marcata che non viene degradato. </li></ol> 4. Meccanismo di trasporto transepiteliale di nanovettori mirate <ol><li> Etichetta albumina con 125 I, come descritto nella Sezione 3.1 e riportato in precedenza 7. </li></ol> Nota: L&#39;albumina è un 66.5kDa e, quindi, una relativamente grande sostanza. Anche se un controllo valido per il trasporto passivo di oggetti di grandi dimensioni (ad esempio, 200 CN nm utilizzati qui), dovrebbe essere sostituito con molecole traccianti inerti più piccoli quando si studia il trasporto di portatori di farmaci più piccoli (vedi discussione). <ol start="2"><li> Per valutare trasporto paracellulare utilizzando albumina perdite paracellulare, cultura Caco-2 monolayers su transwell inserti come descritto sopra. </li><li> Per il mezzo camera superiore sopra il monostrato cellulare, aggiungere o 125 solo I-albumina (controllo negativo che mostra il livello basale di perdite), o 125 NC anticorpi mirati I-albumina e non radioattivi (come descritto nella Sezione 3.5). Incubare a 37 ° C per l&#39;intervallo di tempo selezionato (s), che dovrebbe corrispondere a quelli esaminati durante le prove del trasporto NC. Misurare TEER (Sezione 2.3) prima, durante e dopo l&#39;incubazione, quindi raccogliere tutte le frazioni per un totale di 125 mi e libero 125 I misure come indicato. nella sezione 3 Nota: concomitante aggiunta di 125 controllo I-albumina e non radiomarcato NC IgG può essere utilizzato come controllo. </li><li> Come controllo positivo per l&#39;apertura di giunzioni intercellulari, aggiungere media cella contenente 5 mM H 2 O 2 alle camere superiore ed inferiore dell&#39;inserto transwell, e incubare a 37 ° C per 30 min. Quindi, misurare TEER (Sezione 2.3) e aggiungere 125 I-albumina alla camera superiore per gli intervalli di tempo selezionati. Misurare TEER in vari momenti durante l&#39;incubazione per identificare TEER decadimento valore causata da H 2 O 2 indotta apertura delle giunzioni cellulari. </li><li> In esperimenti paralleli, valutare i trasporti transcellulare, chiamato anche transcitosi, di 125 NC I-mirati da parte di incubazione confluenti Caco-2 monostrati sia con 50 pm monodansylcadaverine (MDC; inibitore di endocitosi clatrina-mediata), 1 mg / ml filipin (inibitore della caveolari endocitosi mediata), 0,5 micron Wortmannin (inibitore della fosfatidilinositolo 3 chinasi [PI3K], coinvolto in macropinocitosi), o 20 micron [5 - (N-etil-N-isopropile) amiloride] (EIPA, inibitore della macropinocitosi e CAM-mediata endocitosi 15). </li></ol> Nota: 125 I-IgG NC e 125 I-albumina possono essere utilizzati come controlli negativi per l&#39;effetto di questi inibitori, e altri metodi (ad esempio tecniche di siRNA) possono fornire inibizione più selettiva. <ol start="6"><li> Misurare TEER (Sezione 2.3) prima, durante, e dopo incubazione delle cellule con inibitori e materiali radiomarcati, quale ulteriore controllo per l&#39;effetto degli inibitori sulla permeabilità monostrato. </li></ol>

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Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari in competizione.

Usando i metodi discussi sopra, un modello cellulare per studiare il trasporto di NC mirati attraverso le barriere cellulari può essere stabilita, come l&#39;esempio fornito per Caco-2 cellule epiteliali, che è rilevante per valutare trasporto dal lume GI nel sangue nel caso dei sistemi di drug delivery per via orale. Coltura di monostrati di cellule epiteliali GI in inserti transwell ha permesso la misurazione di TEER e fluorescenza immunoistochimica di giunzioni strette per confermare la formazione di una barriera d...

Barriere cellulari nell&#39;atto corpo come gateway tra l&#39;ambiente esterno e scomparti interni. Questo è il caso per il rivestimento epiteliale separa la superficie esterna esposta del tratto gastrointestinale (GI) e il flusso sanguigno 1-3. Barriere cellulari rappresentano anche l&#39;interfaccia tra il sangue e il parenchima e componenti cellulari di tessuti e organi. Questo è il caso per il rivestimento endoteliale interno in vasi sanguigni, come la barriera emato-polmonare, la barriera emato-encefalica, ecc 1 La capacità di attraversare le barriere cellulari nel corpo è cruciale per la consegna efficiente di agenti terapeutici e diagnostici in circolo e tessuti / organi in cui è necessario l&#39;intervento. Per migliorare l&#39;erogazione di agenti terapeutici o diagnostici, questi composti possono essere caricati in nanocarriers sub-micrometriche (NC). Questi veicoli di somministrazione di farmaci possono essere formulati con una varietà dichimiche e strutture per ottimizzare la solubilità della droga, la protezione, la farmacocinetica, il rilascio, e il metabolismo 4,5. NC può essere funzionalizzato con affinità o rivolti frazioni (ad esempio anticorpi, peptidi, aptameri zuccheri, ecc) per facilitare l&#39;adesione alle zone del corpo in cui è richiesta l&#39;azione terapeutica 2,6. Targeting di NC determinanti espresse sulla superficie delle barriere cellulari può facilitare il successivo trasporto in e / o di tutti questi rivestimenti 2,6. Il ruolo di trasportare selettivamente sostanze tra due ambienti richiede alcune caratteristiche uniche tra strati di cellule. Una tale funzionalità è polarità cellulare, per cui la membrana apicale rivolta verso il lume della cavità varia dalla membrana basolaterale orientata verso l&#39;interstizio tessuto, rispetto alla membrana morfologia e composizione dei lipidi, trasportatori e recettori 2. Un&#39;altra caratteristica comporta junctio intercellularens collegamento celle adiacenti. Regolazione delle proteine ​​che formano giunzioni strette, molecole di adesione particolarmente giunzionali (inceppamento), occludins e claudine, modulare la funzione di barriera per permettere selettivamente o non trasporto di sostanze tra cellule, note come trasporto paracellular, permettendo il passaggio di materiali dal lume a lo spazio basolaterale 3. Il legame di molti elementi naturali e sintetiche (leucociti, molecole, particelle e sistemi di drug delivery) alle barriere cellulari nel corpo può indurre apertura cella giunzione, che può essere transitoria e relativamente innocuo o più prolungato e, quindi, non sicuro con accesso di sostanze indesiderate attraverso la barriera 2,5,7-9. Di conseguenza, questa via può essere valutata misurando la resistenza elettrica transepiteliale (TEER) e diffusione paracellular passiva di molecole (qui chiamato dispersione paracellular), per cui diminuita resistenza in corrente elettrica o maggiore dispersione paracellular di un inert composto nello spazio basolaterale indicare l&#39;apertura di giunzioni cellulari, rispettivamente 5,10,11. A complemento di questi metodi, una delle proteine ​​di giunzione stretti sopra elencati possono essere macchiati di valutare la loro integrità, dove la colorazione dovrebbe apparire concentrata ai confini cellula-cellula in tutto il periferia cellulare 5,10,12. In alternativa, sistemi di somministrazione di farmaci che hanno come target specifici determinanti della superficie cellulare, come quelli associati a fosse rivestite di clatrina o invaginazioni di membrana a fiasco chiamati caveole, possono innescare captazione vescicolare nelle cellule per endocitosi, fornendo una via per la somministrazione di farmaci a compartimenti intracellulari 5, 13. Inoltre, endocitosi può portare al traffico di vescicole in tutto il corpo cellulare per il rilascio sul lato basolaterale, un fenomeno noto come transyctosis, o il trasporto transcellulare 14. Pertanto, la conoscenza della cinetica e meccanismo di endocitosi può essere utilizzata per sfruttare intracellulare unand drug delivery transcellulare, che offre un modo relativamente sicuro e controllato di consegna rispetto alla via paracellular. (Endocitosi come nel caso della molecola di adesione cellulare (CAM)-mediata) Il meccanismo di endocitosi può essere valutata con modulatori dei percorsi classici (clatrina-e endocitosi caveolina-mediata, e macropinocitosi) o rotte non-classici 5,13,15 . Considerando traffico intracellulare è spesso studiato in pozzetti standard o coprioggetti, l&#39;assenza di un compartimento basolaterale osta polarizzazione cellulare e la capacità di studiare il trasporto attraverso strati di cellule. Per superare questo ostacolo, il trasporto attraverso monostrati cellulari sono stati a lungo studiati utilizzando transwell inserti 10,11,16,17, che consistono in un (apicale) camera superiore, una membrana permeabile poroso in cui le cellule si attaccano e formano un monostrato stretto, ed una inferiore (basolaterale) camera (Figura 1). In questa configurazione, il trasporto può essere misurata nelapicale a basolaterale direzione somministrando un trattamento nella camera superiore, segue un percorso attraverso il monostrato cellulare e la membrana porosa sottostante, e finalmente raccogliendo il mezzo nella camera inferiore per la quantificazione del materiale trasportato. Trasporto in direzione basolaterale-to-apicale può anche essere misurata mediante somministrazione iniziale alla camera inferiore e successiva raccolta dalla camera superiore 5,10,12,16. Esistono varie tecniche per verificare la formazione di permeabilità barriera su transwells, compresi TEER e saggi trasporto paracellular, come descritto sopra. Inoltre, il filtro permeabile in cui le cellule sono coltivate può essere rimosso per l&#39;analisi delle immagini (ad esempio mediante fluorescenza, confocale, microscopia elettronica), come ulteriormente validazione del modello monostrato cellulare così come il meccanismo di trasporto. Selezione del tipo a membrana, che è disponibile in diverse dimensioni dei pori, materiali e superfici, in funzione di varie factors come la dimensione di sostanze o oggetti da trasportare, tipo cellulare, e metodo di imaging 16,18-20. Transwell inserti anche facilitare quantificazione controllato e preciso di trasporto rispetto ai sistemi complessi di mammifero, come volumi delle camere e della superficie cellulare sono costanti note. Mentre molti fattori coinvolti nella consegna in vivo sono eliminati, tra cui la presenza di muco intestinale, shear stress, enzimi digestivi, le cellule immunitarie, ecc, questa piccola scala modello in vitro fornisce informazioni preliminari utili in materia di trasporti. Come esempio per illustrare l&#39;adattamento di questi metodi per studiare il trasporto NC attraverso le barriere cellulari 10,11,16,17, descriviamo qui un caso in cui il rischio di propagazione NC attraverso l&#39;epitelio GI stato modellato valutando passaggio di un drug delivery modello sistema attraverso un monostrato di adenocarcinoma colorettale epiteliale umano (Caco-2) cellule. A tal fine, cells stati coltivati ​​in inserti transwell, su un 0,8 micron pori polietilene tereftalato (PET) filtro (diametro 6,4 mm), che è trasparente e può essere utilizzato per l&#39;imaging microscopia. Lo stato della barriera di permeabilità è convalidata misurando TEER, trasporto apicale a basolaterale di una sostanza di riferimento, albumina, e visualizzazione microscopia a fluorescenza di un elemento delle giunzioni strette, proteine ​​occludina. Un modello di polimero mirata NC viene utilizzato, costituito da 100 nm, nanoparticelle polistirene non biodegradabile. NC sono rivestiti mediante adsorbimento superficie con un anticorpo rivolti solo o una combinazione di un anticorpo targeting e un carico terapeutico, in cui o componente può essere marcato con 125 I per radioisotopo tracciamento. Nell&#39;esempio selezionata, l&#39;anticorpo riconosce molecola di adesione intercellulare-1 (ICAM-1), una proteina espressa sulla superficie di GI epiteliale (e altre cellule), che è stato dimostrato per facilitare il trasporto intracellulare e transcellulare o<html> trasportatori di farmaci f e del loro carico 21. Il carico è l&#39;alfa-galattosidasi (α-Gal), un enzima terapeutico usato per il trattamento della malattia di Fabry, una malattia da accumulo lisosomiale genetica 22. NCS rivestiti, di circa 200 nm dimensioni, vengono aggiunti alla camera apicale sopra il monostrato cellulare e incubate a 37 ° C per vari periodi di tempo, dopo che 125 I sulla NC può essere rilevato associata al monostrato di cellule e / o trasportato alla camera basolaterale sotto le celle. Ulteriori determinazione del libero 125 mi permette di sottrazione della frazione degradato e la stima dei trasporti rivestito NC. Il meccanismo di trasporto è ulteriormente valutata esaminando cambiamenti nella permeabilità della barriera di pertinenza del percorso paracellulare, attraverso i parametri sopra descritti, mentre il trasporto transcellulare è determinata esaminando cambiamenti nel trasporto modulando vie di endocitosi e transcitosi. ONTENUTO &quot;&gt; Questi metodi forniscono informazioni preziose riguardo modelli barriera cellulare, il grado e la velocità di trasporto di un sistema di somministrazione di farmaci, e il meccanismo di tale trasporto, consentendo complessivamente valutazione del potenziale per la somministrazione di farmaci attraverso le barriere cellulari.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Transwell inserts</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>353095</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s Medium (DMEM), 1x</td>
			<td>Cellgro</td>
			<td>10-013-CM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Cellgro</td>
			<td>35-015-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen Strep</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human epithelial colorectal adenocarcinoma (Caco-2) cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>HTB-37TM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>125Iodine</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>NEZ033H002MC</td>
			<td>Radioactive hazard</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffer Saline (PBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190-235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Equitech Bio</td>
			<td>BAH-66</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde (16%)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Immunoglobulin G (IgG)</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>015-000-003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse monoclonal antibodies to human ICAM-1 (anti-ICAM)</td>
			<td>Marlin 1987</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#945;-Galactosidase, from green coffee beans</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G8507-25UN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC latex beads, 100 nm</td>
			<td>Polysciences, Inc.</td>
			<td>17150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>234729-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trichloroacetic acid (TCA)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>SA433-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Occludin antibody (Y-12), goat polyclonal anti-human</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>Sc-27151</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monodansylcadaverine (MDC)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D4008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filipin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F9765</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5-(N-ethyl-N-isopropyl) amiloride (EIPA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A3085</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wortmannin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>W1628</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gamma counter</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>Wizard2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Volt-ohm meter</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>EVOM2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEER electrodes</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>STX100</td>
			<td>Electrodes available for different well-plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dynamic Light Scattering (DLS)</td>
			<td>Malvern</td>
			<td>Nano-ZS90</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

models and methods to evaluate transport of drug delivery systems across cellular barriers

Vettori sub-micrometriche (nanovettori; NC) migliorare l&#39;efficacia dei farmaci, migliorando la solubilità, stabilità, tempo di circolazione, il targeting e il rilascio. Inoltre, attraversando le barriere cellulari nel corpo è fondamentale sia per la somministrazione orale di NC terapeutici nella circolazione e il trasporto dal sangue nei tessuti, dove è necessario un intervento. NC trasporto attraverso le barriere cellulari si ottiene: (i) il percorso paracellulare, via transitoria interruzione delle giunzioni che si incastrano celle adiacenti, o (ii) il percorso transcellulare, in cui i materiali vengono internalizzati per endocitosi, trasportato attraverso il corpo cellulare, e secreta sulla superficie cellulare opposta (transyctosis). Consegna attraverso le barriere cellulari può essere facilitata con l&#39;accoppiamento di terapie o loro vettori con agenti di targeting che si legano specificamente a marcatori di superficie cellulare coinvolti nel trasporto. Qui, forniamo i metodi per misurare l&#39;entità e il meccanismo di trasporto NC attraverso una barriera cellulare modello, which è costituito da un monostrato di gastrointestinale (GI), le cellule epiteliali coltivate su una membrana porosa situato in un inserto transwell. Formazione di una barriera di permeabilità è confermata dalla misurazione resistenza elettrica transepiteliale (TEER), trasporto transepiteliale di una sostanza di riferimento, e immunocolorazione delle giunzioni strette. Come esempio, si usano ~ 200 nm NC polimeriche, che portano un carico terapeutica e rivestite con un anticorpo che si rivolge a un determinante superficie cellulare. L&#39;anticorpo o un carico terapeutica è etichettato con 125 I per radioisotopo rintracciamento e NC etichettati vengono aggiunti alla camera superiore sopra il monostrato cellulare per diversi periodi di tempo. NC associati alle cellule e / o trasportati alla camera sottostante può essere rilevato. Misurazione della libera 125 I consente la sottrazione della frazione degradato. Il percorso paracellulare è valutata determinando potenziali variazioni causate dal trasporto NC barriera ai parametri sopra descritti. Transcellulare i trasportis determinata affrontando l&#39;effetto di modulare endocitosi e transcitosi percorsi.

Come validazione del nostro modello cellulare per lo studio trasporto transepiteliale di CN mirati, la figura 2 mostra che Caco-2 monostrati di cellule piastrate ad una densità di 1,5 x 10 5 cellule / cm 2 raggiunto confluenza ~ 12 ° giorno e mantenuti integrità monostrato fino al giorno 18, indicato con TEER (Figura 2A). Questo è stato convalidato dalla presenza di giunzioni strette occludina-positivi (Figura 2B) in monostrati con elevata TEER...

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Models and Methods to Evaluate Transport of Drug Delivery Systems Across Cellular Barriers

Molte applicazioni terapeutiche richiedono un trasporto sicuro ed efficiente dei vettori della droga e dei loro carichi attraverso le barriere cellulari nel corpo. Questo articolo descrive un adattamento di metodi consolidati per valutare il tasso e il meccanismo di trasporto di nanocarriers droga (NCS) attraverso le barriere cellulari, come il tratto gastrointestinale (GI) epitelio.

Modelli e metodi per valutare il trasporto di Drug Delivery Systems attraverso le barriere cellulari

Sub-micrometer carriers (nanocarriers; NCs) enhance efficacy of drugs by improving solubility, stability, circulation time, targeting, and release. ...

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46.0K Views.  University of Maryland.  Molte applicazioni terapeutiche richiedono un trasporto sicuro ed efficiente dei vettori della droga e dei loro carichi attraverso le barriere cellulari nel corpo. Questo articolo descrive un adattamento di metodi consolidati per valutare il tasso e il meccanismo di trasporto di nanocarriers droga (NCS) attraverso le barriere cellulari, come il tratto gastrointestinale (GI) epitelio. 

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Determination of the Transport Rate of Xenobiotics and Nanomaterials Across the Placenta using the ex vivo Human Placental Perfusion Model

Decades ago the human placenta was thought to be an impenetrable barrier between mother and unborn child. However, the discovery of thalidomide-induced birth defects and many later studies afterwards proved the opposite. Today several harmful xenobiotics like nicotine, heroin, methadone or drugs as well as environmental pollutants were described to overcome this barrier. With the growing use of nanotechnology, the placenta is likely to come into contact with novel nanoparticles either accidentally through exposure or intentionally in the case of potential nanomedical applications. Data from animal experiments cannot be extrapolated to humans because the placenta is the most species-specific mammalian organ 1. Therefore, the ex vivo dual recirculating human placental perfusion, developed by Panigel et al. in 1967 2 and continuously modified by Schneider et al. in 1972 3, can serve as an excellent model to study the transfer of xenobiotics or particles.
Here, we focus on the ex vivo dual recirculating human placental perfusion protocol and its further development to acquire reproducible results.
The placentae were obtained after informed consent of the mothers from uncomplicated term pregnancies undergoing caesarean delivery. The fetal and maternal vessels of an intact cotyledon were cannulated and perfused at least for five hours. As a model particle fluorescently labelled polystyrene particles with sizes of 80 and 500 nm in diameter were added to the maternal circuit. The 80 nm particles were able to cross the placental barrier and provide a perfect example for a substance which is transferred across the placenta to the fetus while the 500 nm particles were retained in the placental tissue or maternal circuit. The ex vivo human placental perfusion model is one of few models providing reliable information about the transport behavior of xenobiotics at an important tissue barrier which delivers predictive and clinical relevant data.

Determination of the Transport Rate of Xenobiotics and Nanomaterials Across the Placenta using the ex vivo Human Placental Perfusion Model

The ex vivo dual recirculating human placental perfusion model can be used to investigate the transfer of xenobiotics and nanoparticles across the human placenta. In this video protocol we describe the equipment and techniques required for a successful execution of a placenta perfusion.

Determinazione del tasso di trasporto di xenobiotici e nanomateriali attraverso la placenta con il<em&gt; Ex vivo</em&gt; Umano Modello perfusione placentare

Decades ago the human placenta was thought to be an impenetrable barrier between mother and unborn child. However, the discovery of thalidomide-induced ...

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Self-reporting Scaffolds for 3-Dimensional Cell Culture

Culturing cells in 3D on appropriate scaffolds is thought to better mimic the in vivo microenvironment and increase cell-cell interactions. The resulting 3D cellular construct can often be more relevant to studying the molecular events and cell-cell interactions than similar experiments studied in 2D. To create effective 3D cultures with high cell viability throughout the scaffold the culture conditions such as oxygen and pH need to be carefully controlled as gradients in analyte concentration can exist throughout the 3D construct. Here we describe the methods of preparing biocompatible pH responsive sol-gel nanosensors and their incorporation into poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) electrospun scaffolds along with their subsequent preparation for the culture of mammalian cells. The pH responsive scaffolds can be used as tools to determine microenvironmental pH within a 3D cellular construct. Furthermore, we detail the delivery of pH responsive nanosensors to the intracellular environment of mammalian cells whose growth was supported by electrospun PLGA scaffolds. The cytoplasmic location of the pH responsive nanosensors can be utilized to monitor intracellular pH (pHi) during ongoing experimentation.

Biocompatible pH responsive sol-gel nanosensors can be incorporated into poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) electrospun scaffolds. The produced self-reporting scaffolds can be used for in&#160;situ monitoring of microenvironmental conditions whilst culturing cells upon the scaffold. This is beneficial as the 3D cellular construct can be monitored in real-time without disturbing the experiment.

Ponteggi self-reporting per coltura cellulare 3-Dimensional

Culturing cells in 3D on appropriate scaffolds is thought to better mimic the in vivo microenvironment and increase cell-cell interactions. The resulting ...

In Vitro Permeation of FITC-loaded Ferritins Across a Rat Blood-brain Barrier: a Model to Study the Delivery of Nanoformulated Molecules

Brain microvascular endothelial cells, supported by pericytes and astrocytes endfeet, are responsible for the low permeation of large hydrosoluble drugs through the blood-brain barrier (BBB), causing difficulties for effective pharmacological therapies. In recent years, different strategies for promoting brain targeting have aimed to improve drug delivery and activity at this site, including innovative nanosystems for drug delivery across the BBB. In this context, an in vitro approach based on a simplified cellular model of the BBB provides a useful tool to investigate the effect of nanoformulations on the trans-BBB permeation of molecules. This study describes the development of a double-layer BBB, consisting of co-cultured commercially available primary rat brain microvascular endothelial cells and astrocytes. A multiparametric approach for the validation of the model, based on the measurement of the transendothelial electrical resistance and the apparent permeability of a high molecular weight dextran, is also described. As proof of concept for the employment of this BBB model to study the effect of different nanoformulations on the translocation of fluorescent molecules across the barrier, we describe the use of fluorescein isothiocyanate (FITC), loaded into ferritin nanoparticles. The ability of ferritins to improve the trans-BBB permeation of FITC was demonstrated by flux measurements and confocal microscopy analyses. The results suggest this is a useful system for validating nanosystems for delivery of drugs across the BBB.

In Vitro Permeation of FITC-loaded Ferritins Across a Rat Blood-brain Barrier: a Model to Study the Delivery of Nanoformulated Molecules

A method to establish an in vitro model of blood-brain barrier based on a co-culture of rat brain microvascular endothelial cells and astrocytes is described and validated. This system proved to be a valid tool to study the effect of nanoformulation on the trans-barrier permeation of fluorescent molecules.

In Vitro permeazione di ferritine FITC-caricati attraverso un Rat barriera emato-encefalica: un modello per studiare la consegna di Nanoformulated Molecole

Brain microvascular endothelial cells, supported by pericytes and astrocytes endfeet, are responsible for the low permeation of large hydrosoluble drugs ...

Manufacture and Drug Delivery Applications of Silk Nanoparticles

Silk is a promising biopolymer for biomedical and pharmaceutical applications due to its outstanding mechanical properties, biocompatibility and biodegradability, as well its ability to protect and subsequently release its payload in response to a trigger. While silk can be formulated into various material formats, silk nanoparticles are emerging as promising drug delivery systems. Therefore, this article covers the procedures for reverse engineering silk cocoons to yield a regenerated silk solution that can be used to generate stable silk nanoparticles. These nanoparticles are subsequently characterized, drug loaded and explored as a potential anticancer drug delivery system. Briefly, silk cocoons are reverse engineered first by degumming the cocoons, followed by silk dissolution and clean up, to yield an aqueous silk solution. Next, the regenerated silk solution is subjected to nanoprecipitation to yield silk nanoparticles &#8211; a simple but powerful method that generates uniform nanoparticles. The silk nanoparticles are characterized according to their size, zeta potential, morphology and stability in aqueous media, as well as their ability to entrap a chemotherapeutic payload and kill human breast cancer cells. Overall, the described methodology yields uniform silk nanoparticles that can be readily explored for a myriad of applications, including their use as a potential nanomedicine.

Nanoparticles are emerging as promising drug delivery systems for a broad range of indications. Here, we describe a simple yet powerful method to manufacture silk nanoparticles using reverse engineered Bombyx mori silk. These silk nanoparticles can be readily loaded with a therapeutic payload and subsequently explored for drug delivery applications.

Fabbricazione e consegna della droga Applicazioni di seta nanoparticelle

Silk is a promising biopolymer for biomedical and pharmaceutical applications due to its outstanding mechanical properties, biocompatibility and ...

An Experimental and Finite Element Protocol to Investigate the Transport of Neutral and Charged Solutes across Articular Cartilage

Osteoarthritis (OA) is a debilitating disease that is associated with degeneration of articular cartilage and subchondral bone. Degeneration of articular cartilage impairs its load-bearing function substantially as it experiences tremendous chemical degradation, i.e. proteoglycan loss and collagen fibril disruption. One promising way to investigate chemical damage mechanisms during OA is to expose the cartilage specimens to an external solute and monitor the diffusion of the molecules. The degree of cartilage damage (i.e. concentration and configuration of essential macromolecules) is associated with collisional energy loss of external solutes while moving across articular cartilage creates different diffusion characteristics compared to healthy cartilage. In this study, we introduce a protocol, which consists of several steps and is based on previously developed experimental micro-Computed Tomography (micro-CT) and finite element modeling. The transport of charged and uncharged iodinated molecules is first recorded using micro-CT, which is followed by applying biphasic-solute and multiphasic finite element models to obtain diffusion coefficients and fixed charge densities across cartilage zones.

We propose a protocol to investigate the transport of charged and uncharged molecules across articular cartilage with the aid of recently developed experimental and numerical methods.

Uno Sperimentale e Finite Element protocollo per indagare il trasporto di soluti neutri e carichi attraverso cartilagine articolare

Osteoarthritis (OA) is a debilitating disease that is associated with degeneration of articular cartilage and subchondral bone. Degeneration of articular ...

Creating a Structurally Realistic Finite Element Geometric Model of a Cardiomyocyte to Study the Role of Cellular Architecture in Cardiomyocyte Systems Biology

With the advent of three-dimensional (3D) imaging technologies such as electron tomography, serial-block-face scanning electron microscopy and confocal microscopy, the scientific community has unprecedented access to large datasets at sub-micrometer resolution that characterize the architectural remodeling that accompanies changes in cardiomyocyte function in health and disease. However, these datasets have been under-utilized for&#160;investigating the role of cellular architecture remodeling in cardiomyocyte function. The purpose of this protocol is to outline how to create an accurate finite element model of a cardiomyocyte using high resolution electron microscopy and confocal microscopy images. A detailed and accurate model of cellular architecture has significant potential to provide new insights into cardiomyocyte biology, more than experiments alone can garner. The power of this method lies in its ability to computationally fuse information from two disparate imaging modalities of cardiomyocyte ultrastructure to develop one unified and detailed model of the cardiomyocyte. This protocol outlines steps to integrate electron tomography and confocal microscopy images of adult male Wistar (name for a specific breed of albino rat) rat cardiomyocytes to develop a half-sarcomere finite element model of the cardiomyocyte. The procedure generates a 3D finite element model that contains an accurate, high-resolution depiction (on the order of ~35 nm) of the distribution of mitochondria, myofibrils and ryanodine receptor clusters that release the necessary calcium for cardiomyocyte contraction from the sarcoplasmic reticular network (SR) into the myofibril and cytosolic compartment. The model generated here as an illustration does not incorporate details of the transverse-tubule architecture or the sarcoplasmic reticular network and is therefore a minimal model of the cardiomyocyte. Nevertheless, the model can already be applied in simulation-based investigations into the role of cell structure in calcium signaling and mitochondrial bioenergetics, which is illustrated and discussed using two case studies that are presented following the detailed protocol.

This protocol outlines a novel method to create a spatially detailed finite element model of the intracellular architecture of cardiomyocytes from electron microscopy and confocal microscopy images. The power of this spatially detailed model is demonstrated using case studies in calcium signaling and bioenergetics.

Creazione di un modello geometrico strutturalmente realistico agli elementi finiti di un Cardiomyocyte per studiare il ruolo dell'architettura cellulare in biologia dei sistemi del Cardiomyocyte

With the advent of three-dimensional (3D) imaging technologies such as electron tomography, serial-block-face scanning electron microscopy and confocal ...

Surface Functionalization of Hepatitis E Virus Nanoparticles Using Chemical Conjugation Methods

Virus-like particles (VLPs) have been used as nanocarriers to display foreign epitopes and/or deliver small molecules in the detection and treatment of various diseases. This application relies on genetic modification, self-assembly, and cysteine conjugation to fulfill the tumor-targeting application of recombinant VLPs. Compared with genetic modification alone, chemical conjugation of foreign peptides to VLPs offers a significant advantage because it allows a variety of entities, such as synthetic peptides or oligosaccharides, to be conjugated to the surface of VLPs in a modulated and flexible manner without alteration of the VLP assembly.
Here, we demonstrate how to use the hepatitis E virus nanoparticle (HEVNP), a modularized theranostic capsule, as a multifunctional delivery carrier. Functions of HEVNPs include tissue-targeting, imaging, and therapeutic delivery. Based on the well-established structural research of HEVNP, the structurally independent and surface-exposed residues were selected for cysteine replacement as conjugation sites for maleimide-linked chemical groups via thiol-selective linkages. One particular cysteine-modified HEVNP (a Cys replacement of the asparagine at 573 aa (HEVNP-573C)) was conjugated to a breast cancer cell-specific ligand, LXY30 and labeled with near-infrared (NIR) fluorescence dye (Cy5.5), rendering the tumor-targeted HEVNPs as effective diagnostic capsules (LXY30-HEVNP-Cy5.5). Similar engineering strategies can be employed with other macromolecular complexes with well-known atomic structures to explore potential applications in theranostic delivery.

We have engineered the capsid protein of hepatitis E virus as a theranostic nanoparticle (HEVNP). HEVNP self-assembles into a stable icosahedral cage in mucosal delivery. Here, we describe the modification of HEVNPs for tumor targeting by mutating surface-exposed residues to cysteines, which conjugate synthetic ligands that specifically bind tumor cells.

Funzionalizzazione superficiale delle nanoparticelle di Virus di epatite E utilizzando metodi di coniugazione chimica

Virus-like particles (VLPs) have been used as nanocarriers to display foreign epitopes and/or deliver small molecules in the detection and treatment of ...

Comprehensive Evaluation of the Effectiveness and Safety of Placenta-Targeted Drug Delivery Using Three Complementary Methods

No effective treatments currently exist for placenta-associated pregnancy complications, and developing strategies for the targeted delivery of drugs to the placenta while minimizing fetal and maternal side effects remains challenging. Targeted nanoparticle carriers provide new opportunities to treat placental disorders. We recently demonstrated that a synthetic placental chondroitin sulfate A binding peptide (plCSA-BP) could be used to guide nanoparticles to deliver drugs to the placenta. In this protocol, we describe in detail a system for assessing the efficiency of drug delivery to the placenta by plCSA-BP that employs three separate methods used in combination: in vivo imaging, high-frequency ultrasound (HFUS), and high-performance liquid chromatography (HPLC). Using in vivo imaging, plCSA-BP-guided nanoparticles were visualized in the placentas of live animals, while HFUS and HPLC demonstrated that plCSA-BP-conjugated nanoparticles efficiently and specifically delivered methotrexate to the placenta. Thus, a combination of these methods can be used as an effective tool for the targeted delivery of drugs to the placenta and development of new treatment strategies for several pregnancy complications.

We describe a system that utilizes three methods to evaluate the safety and effectiveness of placenta-targeted drug delivery: in vivo imaging to monitor nanoparticle accumulation, high-frequency ultrasound to monitor placental and fetal development, and HPLC to quantify drug delivery to tissue.

Valutazione globale dell'efficacia e della sicurezza di Placenta-Targeted Drug Delivery utilizzando tre metodi complementari

No effective treatments currently exist for placenta-associated pregnancy complications, and developing strategies for the targeted delivery of drugs to ...

Repressing Gene Transcription by Redirecting Cellular Machinery with Chemical Epigenetic Modifiers

Regulation of chromatin compaction is an important process that governs gene expression in higher eukaryotes. Although chromatin compaction and gene expression regulation are commonly disrupted in many diseases, a locus-specific, endogenous, and reversible method to study and control these mechanisms of action has been lacking. To address this issue, we have developed and characterized novel gene-regulating bifunctional molecules. One component of the bifunctional molecule binds to a DNA-protein anchor so that it will be recruited to an allele-specific locus. The other component engages endogenous cellular chromatin-modifying machinery, recruiting these proteins to a gene of interest. These small molecules, called chemical epigenetic modifiers (CEMs), are capable of controlling gene expression and the chromatin environment in a dose-dependent and reversible manner. Here, we detail a CEM approach and its application to decrease gene expression and histone tail acetylation at a Green Fluorescent Protein (GFP) reporter located at the Oct4 locus in mouse embryonic stem cells (mESCs). We characterize the lead CEM (CEM23) using fluorescent microscopy, flow cytometry, and chromatin immunoprecipitation (ChIP), followed by a quantitative polymerase chain reaction (qPCR). While the power of this system is demonstrated at the Oct4 locus, conceptually, the CEM technology is modular and can be applied in other cell types and at other genomic loci.

Regulation of the chromatin environment is an essential process required for proper gene expression. Here, we describe a method for controlling gene expression through the recruitment of chromatin-modifying machinery in a gene-specific and reversible manner.

Reprimere la trascrizione genica reindirizzando macchinario cellulare con modificatori epigenetici chimici

Regulation of chromatin compaction is an important process that governs gene expression in higher eukaryotes. Although chromatin compaction and gene ...

3D Analysis of Multi-cellular Responses to Chemoattractant Gradients

Various limitations of 2D cell culture systems have sparked interest in 3D cell culture and analysis platforms, which would better mimic the spatial and chemical complexity of living tissues and mimic in vivo tissue functions. Recent advances in microfabrication technologies have facilitated the development of 3D in vitro environments in which cells can be integrated into a well-defined extracellular matrix (ECM) and a defined set of soluble or matrix associated biomolecules. However, technological barriers have limited their widespread use in research laboratories. Here, we describe a method to construct simple devices for 3D culture and experimentation with cells and multicellular organoids in 3D microenvironments with a defined chemoattractant gradient. We illustrate the use of this platform for analysis of the response of epithelial cells and organoids to gradients of growth factors, such as epidermal growth factor (EGF). EGF gradients were stable in the devices for several days leading to directed branch formation in breast organoids. This analysis allowed us to conclude that collective gradient sensing by groups of cells is more sensitive vs. single cells. We also describe the fabrication method, which does not require photolithography facilities nor advanced soft lithography techniques. This method will be helpful to study 3D cellular behaviors in the context of the analysis of development and pathological states, including cancer.

We describe a method to construct devices for 3D culture and experimentation with cells and multicellular organoids. This device allows analysis of cellular responses to soluble signals in 3D microenvironments with defined chemoattractant gradients. Organoids are better than single cells at detection of weak noisy inputs.

Analisi 3D delle risposte multi-cellulari ai gradienti chemoattractant

Various limitations of 2D cell culture systems have sparked interest in 3D cell culture and analysis platforms, which would better mimic the spatial and ...