Questo protocollo è la porta d'accesso alla matrice extracellulare. È la complessità e la sua struttura fino alla scala sub micron. Quindi il vantaggio principale di questo metodo è che consente di ottenere una matrice extracellulare che mantiene la sua integrità strutturale aprendo così la strada all'analisi biochimica e anatomica.
A dimostrare la procedura saranno, Alejandro Mayorca Gilani, Raphael Reuten e Maria Rafaeva, attualmente nel mio laboratorio e Chris Madsen e che era nel mio laboratorio e ha continuato il lavoro all'Università di Lund. Inizia radendo il torace, l'addome e la parte posteriore del topo eutanasizzato con un tagliacapelli. Disinfettare l'area con il 70% di etanolo.
Quindi appuntare il mouse su un vassoio di polistirolo, estendendo i suoi quattro arti posteriori terminali, così come la testa e la coda. Mettilo sotto il microscopio microchirurgico. Usando una forbice a modello dritto Mayo, fai un'incisione cutanea che va dalla regione sottondibolare all'addome inferiore e seziona per via sottocutanea per esporre la parete toracica e il peritoneo.
Quindi utilizzare forbici microchirurgiche per tagliare i muscoli pettorali maggiori e pettorali minori lungo il sesto spazio intercostale su entrambi i lati della parete toracica. Tagliare lo sterno lungo le incisioni precedenti con forbici dritte. Quindi completare una sternotomia tagliando lo sterno lungo il suo asse lungo.
Elevare e fissare, entrambi i lati della parete toracica per esporre il complesso cardiopolmonare. Utilizzare micro pinze a punta rotonda per asportare il timo e il tessuto adiposo circostante estraendoli delicatamente dai loro attacchi. E tagliare l'esofago con micro forbici.
Separare le vene brachiocefaliche e l'arteria brachiocefalica con micro pinze affilate. Quindi separare le arterie carotidi comuni sinistre e succlavia sinistra dal tessuto sottostante per facilitare la legatura e la cauterizzazione. Utilizzare un portaaghi e micro pinze affilate e una sutura a nove oh per posizionare punti sopra l'emergere delle arterie carotidi comuni brachiocefaliche e succlavia sinistra, cauterizzare le vene brachiocefaliche.
Usando micro forbici, apri un ingresso sezionando il legamento. Introdurre un catetere calibro 27 nella trachea e spingere delicatamente fino a quando la trachea si ramifica nei bronchi, facendo attenzione a non disturbare i bronchi. Usando una sutura a sei O, posizionare tre punti attorno alla trachea per fissare il catetere.
Sezione il topo all'altezza della 12a vertebra toracica, l'aorta discendente corre anteriormente alla colonna vertebrale e dovrebbe essere sezionata qui insieme alla colonna vertebrale. Cateterizzare retrogradamente l'aorta e spingere il catetere fino a raggiungere l'arco aortico. Usando una sutura, posizionare quattro punti intorno all'Aorta, iniziando cinque millimetri sotto la punta del catetere.
Collegare il mouse a un sistema di pompe utilizzando tubi in silicone e connettori inferiori. Perfondere con acqua deionizzata a 200 microlitri al minuto per 15 minuti. Quindi cambiare l'agente di perfusione allo 0,5% DOC, diluito in acqua deionizzata e perfondere durante la notte.
Il giorno successivo, cambiare l'agente di perfusione allo 0,1% di SDS diluito in acqua deionizzata e perfondere per otto ore. Quindi perfondere con acqua deionizzata per 24 ore per lavare via la SDS e la DOC. Resecare il cuore e i polmoni decellularizzati sezionando i suoi attaccamenti al torace.
Conservare il tessuto in un tubo crio sterile in acqua deionizzata con l'1% di penicillina streptomicina e 0,3 micromolare di sodio azide a quattro gradi Celsius. Per eseguire la colorazione immunologica, bloccare il campione incubandolo in una criotuba contenente il 6% di siero d'asino e il 3% di BSA durante la notte. Quindi incubare con anticorpo primario in siero d'asino al 3% in PBS per 24 ore.
Dopo l'incubazione lavare il campione cinque volte in PBST per un'ora per lavaggio. Incubare il campione con anticorpi secondari coniugati fluorescenti in siero d'asino al 3% in PBS per 24 ore. Quindi ripetere i lavaggi in PBST.
Aggiungere l'acqua ionizzata e conservare il campione a quattro gradi Celsius lontano dalla luce diretta. Per visualizzare il campione, metterlo in un piatto con fondo di vetro e umidificarlo con due goccioline di soluzione di conservazione. Impostare l'obiettivo e ispezionare il campione utilizzando la luce a fluorescenza.
Passa al controllo del computer, accendi i laser e regola l'intensità del laser, l'apertura stenopeica, la lunghezza d'onda dei rilevatori, il guadagno, la risoluzione e lo zoom. Imposta il numero e la dimensione del passo per lo stack Z, quindi inizia l'acquisizione. Asportare un lobo polmonare da un topo eutanasizzato e metterlo in uno stampo criometrico da 10 per 10 per cinque millimetri.
Coprilo con circa 500 miglia di microlitri di composto OCT e congelalo su ghiaccio secco. Mantenere il campione a quella temperatura. Asportare un lobo polmonare decellularizzato da un topo lavorato, posizionarlo in uno stampo criometrico con la superficie più ampia verso il basso e coprirlo con composto OCT.
Congelare il campione su ghiaccio secco e mantenerlo a quella temperatura fino a quando non sarà altrimenti richiesto. Il campione può essere conservato per almeno 12 settimane. Utilizzare un criostato per sezionare blocchi di tessuto congelato in cinque sezioni di micrometri a meno 20 gradi Celsius.
E posiziona le sezioni su vetrini adesivi. Trasferire le diapositive a temperatura ambiente fino a quando non si asciugano all'aria. Immergere brevemente le diapositive in PBS, seguito da 4% paraformaldeide in PBS per 15 minuti.
Lavare una volta in PBS, poi due volte in acqua distillata per cinque minuti per lavaggio. Immergere i vetrini nella soluzione di ematossilina di Myer per 10 minuti. Quindi, lavare i vetrini in un barattolo Copeland sotto acqua distillata corrente per 10 minuti e immergere in soluzione di eosina per sette minuti.
Immergere nello xilene più volte. Applicare alcune gocce di supporto di montaggio DPX e posizionare un coperchio di vetro. Lasciare asciugare i vetrini durante la notte sotto un cappuccio chimico, quindi scansionarli in uno scanner a vetrini.
Dopo aver completato con successo il protocollo, il cuore e i polmoni e il tessuto NX saranno privi di cellule. La decellularizzazione può essere convalidata mediante colorazione dell'ematossilina eosina degli scaffold ECM. Le impalcature mantengono le dimensioni degli organi freschi e la sua struttura ECM insoliable è intatta.
Gli scaffold ECM hanno mostrato una maggiore permeabilità e penetrabilità della luce. L'utilizzo di questo protocollo con uno stadio di microscopio motorizzato consente l'imaging tridimensionale piastrellato di campioni a montaggio intero con risoluzione inferiore al micron. È essenziale evitare il flusso verso gli organi di interesse per ottenere una decellurizzazione uniforme completa.
La dissezione microchirurgica e la legatura dei vasi devono essere efficaci. E allo stesso tempo rispettare i tessuti bersaglio per mantenere la struttura VCM nativa. Seguendo questa procedura, gli scaffold saranno arricchiti per proteine ECM strutturali e potranno essere utilizzati per la spettrometria di massa o l'ingegneria tissutale.
Questa tecnica apre la strada alla mappatura ad alta risoluzione della matrice extracellulare.
