Vorremmo ringraziare la signora Christine A. Winters per l&#39;eccellente assistenza tecnica. Questo lavoro è stato supportato dal Programma Neuroscienze di base del Intramurale Programma di Ricerca NINDS, NIH (Z01 NS002610).

L&#39;approccio qui descritto è stato sviluppato utilizzando strumenti specifici, strumenti e software. Dato che i laboratori non utilizzano lo stesso setup sperimentale l&#39;approccio è generalizzata, ove possibile. 1. Congelamento rapido Il metodo analitico descritto è assolutamente dipendente approcci criogenici per: 1) il &quot;cryofixation&quot; di cellule o tessuti in modo da preservare quantitativamente la distribuzione dei componenti del tessuto diffusibili e degli elementi chimici come erano in cellule vive nell&#39;istante di congelamento e 2) la preparazione degli ultraleggeri criosezioni adatto per l&#39;imaging e analisi in un TEM. Queste tecniche sono brevemente descritti, ma i dettagli necessari a riprodurre tali procedure in altri laboratori sono oltre la portata di questo articolo. I lettori interessati sono indicati eccellenti articoli recenti 9,14. Attenzione: Questa sezione descrive l&#39;uso di sapone liquidetano efied, che è altamente infiammabile ed esplosiva, devono essere prese le opportune precauzioni. L&#39;operatore deve anche avere familiarità con azoto liquido (LN 2) precauzioni di sicurezza, tra cui protezione da laboratorio camice, occhiali e guanti cryoresistant. Nota: Qui e in tutto, tutti gli strumenti (pinze, ecc) utilizzati per gestire i campioni congelati devono essere pre-raffreddata in LN 2 prima dell&#39;uso per evitare lo scongelamento accidentale. Cellule coltivate su vetrini <ol><li> Preparare un dispositivo congelamento tuffo condensando etano gassoso a -160 ° C in LN 2-raffreddato pozzetto centrale. Riempire fino al segno e coprire il pozzo con il coperchio di alluminio basculante quando non in uso. </li><li> Utilizzando cunei di carta da filtro, macchia lamelle di plastica di cellule coltivate in sperimentalmente condizioni adeguate per un film acquoso sottile. Tamponare dal bordo in modo da non toccare il tessuto, la pellicola residua ideale, determinato per tentativi ed errori, è il più sottile possibile, ma non così thcome evaporare e permettere l&#39;essiccazione della superficie del tessuto. </li><li> Tenendo il vetrino per il bordo con una pinza di serraggio, immergere subito in etano liquido, manualmente o utilizzando lo stantuffo-gravità alimentati. </li><li> Posizionare il vetrino congelato in una ciotola polistirolo nelle vicinanze di LN 2, grande abbastanza per manipolare il numero desiderato di vetrini in contenitori di stoccaggio a lungo termine. Barattoli con tappo a vite di alluminio che non colgono sotto LN 2 sono raccomandati. </li></ol> Congelamento rapido di fette di cervello in coltura <ol start="5"><li> Sotto un microscopio da dissezione, vista e orientare una fetta dell&#39;ippocampo organotipica, indisturbato e ancora attaccato alla membrana inserto cultura. Posizionare punti di riferimento sulla membrana vicino al bordo della fetta con una penna Sharpie tipo nero e fotografia. </li><li> Sempre sotto il microscopio, tagliare ca. 5 x 5 millimetri quadrati di membrana con le singole sezioni incentrate sulle piazze. Evitare di toccare la fetta o piegare il membrane. </li><li> Montare una fetta membrana sostenuta, ammortizzato da un ¼ in rilievo diametro agar, su un disco in alluminio progettata su misura per adattarsi a una cryoultramicrotome (descritto di seguito). Rapidamente congelare la fetta da pneumaticamente propulsione contro un blocco di zaffiro LN 2-raffreddato per mezzo di un dispositivo personalizzato &quot;sbattere di congelamento&quot;. </li><li> Sposta in memoria come descritto per cellule in coltura. </li></ol> 2. Criosezionamento CAVEAT: produrre con successo nastri secco taglio di sezioni ultrasottili, mentre la semplice e logica, richiede una formazione, pazienza e una notevole pratica. <ol><li> Cuocere un cryoultramicrotome dotato di cryoattachment e raffreddare a -135 ° C. </li><li> Tagliare coprioggetto congelati in ca. 3 x 3 millimetri quadrati con un forte, bisturi preraffreddato. Incorporare pezzi con culture rivolta verso l&#39;alto in un liquido viscoso &quot;cryoglue&quot; (a 1:06 miscela di etanolo e 2-propanolo 11), sullo standard 3mm perni in alluminio di diametro progettato per adattarsi mandrino provino microtomo. Evitare perdite cryoglue sulla superficie cultura. Solidificare cryoglue abbassando la temperatura cryobox a ≤ -160 ° C. <ul class="lalpha"><li> Per sezioni di cervello congelati, fissare saldamente dischi direttamente ad un esemplare mandrino su misura per mezzo di una ghiera filettata. </li></ul></li><li> Trim aree selezionate dei campioni congelati - ad esempio, spazi ricchi di cellule di pezzi coprioggetto o aree individuate di fette - un ca. Blocco 250 x 250 micron viso e ~ 100 micron di profondità utilizzando un utensile diamantato taglio. </li><li> Nastri secco taglio di sezioni sottili a ca. -160 ° C utilizzando un diamante cryoknife 35 °, essenzialmente come descritto nel referencs 4, 9. Velocità di taglio e coltello angolo di spoglia sono determinati empiricamente, un buon punto di partenza è 0,4-0,6 mm / sec a 9 °. Lo spessore nominale, cioè esemplare anticipo, di sezioni idratati is tipicamente 80 nm, sebbene sezioni sono in realtà 1.5-2.0x spessa, principalmente a causa della compressione. Per sezionamento soddisfacenti, un dispositivo antistatico è essenziale. Posizionare la punta ionizzante dei dispositivi di 0,5-1 cm dal bordo coltello e regolare la potenza di uscita fino a quando si producono nastri soddisfacenti sezioni. </li><li> Preparare le sonde ciglia per incollaggio (con resina epossidica) ciglia legno stick applicatori. Utilizzando tale sonda, pick up e trasferimento sezioni dal retro del coltello Onto, film di sostegno pioloform carbonio rivestite glow-scarica espressi oltre 100 maglie griglie di rame piegatura e di riposo su un indio busta mezzo foglio ripiegato su una mensola di lavoro alle spalle il coltello. Ripiegare la metà superiore della griglia e busta, stampa con uno strumento di spremitura a freddo. </li><li> Trasferimento griglie avvolto ad una casella della griglia comoda e conservare in un alluminio possono come descritto al punto 1.4. </li></ol> 3. Cryotransfer dei campioni al microscopio elettronico Lo strumento di base per EPMAin questo laboratorio è un microscopio elettronico analitica operati a 120 kV e attrezzato per cryomicroscopy, cioè, progettato con un aspirapolvere, campione-zona anticontaminator, una fotocamera digitale 2k x 2k alta sensibilità e titolare cryotransfer campione. Controllare in anticipo l&#39;allineamento microscopio e condizioni di funzionamento in entrambe le modalità a basso e ad alto ingrandimento e confermare una colonna sotto vuoto soddisfacente, idealmente ≤ 10 -7 Torr. Tune up, se necessario. <ol><li> Verificare che l&#39;isolamento sotto vuoto del componente Dewar del cryoholder è soddisfacente. Pompa, se necessario. </li><li> Raffreddare il cryoholder alla sua temperatura minima, almeno -160 ° C, mentre sotto alto vuoto all&#39;interno del portaoggetti, scollegare il cavo di collegamento al detentore di sua scatola di controllo. Inclinare il goniometro di 45 ° in senso orario prima di rimuovere il supporto per ridurre al minimo LN 2 spargimento sulle superfici dell&#39;operatore e del microscopio. </li><li> Preparare la cryoworkstation banco raffreddando il insulate integraled coppa a ≤ 160 ° C. </li><li> Transfer (quickly!) il cryoholder raffreddato da microscopio per crio workstation. Ritrarre scudo gelo del titolare. </li><li> Recupera sotto LN 2, un panino griglia di stoccaggio e posto sul tavolo di lavoro del cryoworkstation. Un anello di arresto per pozzetto del titolare è anche posto sul tavolo. </li><li> Aprire la busta indio e spostare la griglia pieghevole allegato al pozzo esemplare di cryoholder. Fissare la griglia con anello di sicurezza utilizzando lo strumento chiave in dotazione e chiudere lo scudo gelo. </li><li> Rimuovere rapidamente il cryoholder dal cryoworkstation e inserire nella camera d&#39;equilibrio del microscopio e passare attraverso la sequenza di pompaggio più rapidamente possibile. Sull&#39;inserimento, ci dovrebbe essere il minimo disturbo del vuoto colonna. </li><li> Goniometro Ritorna a 0 ° di inclinazione. Riconnettersi e ricaricarsi la scatola di controllo e verificare che la temperatura del campione è ≤ 150 ° C. </li><li> Riempire il Dewar deldel campione titolare e permettono vuoto e temperatura a recuperare pienamente. </li></ol> 4. Indagine visiva delle sezioni <ol><li> Ritrarre lo scudo gelo del titolare di esporre campioni e accendere il fascio di elettroni. </li><li> Visivamente valutare il campione a basso ingrandimento, tipicamente 250X, e scarsa illuminazione. Come illustrato nella Figura 1, sezioni devono essere sottile e liscia, non piegata o sovrapposte, piana e ben attaccato alla pellicola di supporto, e generalmente non oscurata da sbarre di griglia. </li><li> Facoltativamente fotografare sezioni selezionate. (NOTA: Ridurre al minimo l&#39;esposizione del fascio, in quanto sezioni congelate-idrato sono molto sensibili ai danni fascio-indotta.) Utilizzare il palco goniometro digitale automatizzati atti a memorizzare le coordinate delle sezioni selezionate. </li></ol> 5. Liofilizzazione delle sezioni <ol><li> Liofilizzare sezioni aumentando la temperatura detentore di ca. -100 ° C per ~ 30 min. </li><li> Recool detentore di -160 ° C o al di sotto. </li><li&gt; Prima di imaging, spegnere centralina cryoholder e cavo del controller fisicamente disconnessione per evitare la deriva immagine a causa di cicli termici e / o pick-up vibrazione. </li></ol> 6. Imaging di cellule e gli organelli Immagini strutturali delle sezioni liofilizzati sono ottenuti a ca. -160 ° C a basso dosaggio, immagini di zero-perdita registrata digitalmente utilizzando una camera CCD slow-scan 2k x 2k controllato dal software appropriato. <ol><li> Attivare la EM in modalità hi-mag. </li><li> Scegli e immagini a ~ 2.000 X (come TIFF, vedi figura 2) celle selezionate e le aree subcellulare di interesse nelle sezioni di alta qualità, le cui riprese sono stati precedentemente registrato e memorizzato. (NOTA: Le sezioni secche sono ora sostanzialmente meno fragile e meno suscettibile ai danni di elettroni fascio. </li><li> Valutare le immagini al fine di selezionare le regioni di interesse (ROI) per l&#39;analisi a raggi X. Questo passaggio può facoltativamente essere effettuata fuori linea, nel qual caso l&#39;EM può essere attivataoff e il campione lasciata riscaldare a temperatura ambiente. </li></ol> 7. Acquisizione di raggi X Spectra Spettri a raggi X può essere registrato utilizzando uno dei vari commerciali o progettati su misura a raggi X sistemi di analisi minimamente costituiti da un raggi X (EDX) rilevatore di energia dispersiva, associate elettronica pulse-processore e l&#39;acquisizione e la visualizzazione software compatibile. (Il sistema utilizzato in questo laboratorio è descritto nella Tabella 1.) <ol><li> Configurare EM per l&#39;acquisizione radiografica inserendo il rilevatore EDX nella colonna (se necessario), ritirando l&#39;apertura dell&#39;obiettivo, e l&#39;inserimento di centraggio e le aperture radiazione diffusa. Regolare il cryoholder alla temperatura più bassa alla quale si evita la contaminazione gelo del campione, ma almeno sotto -100 ° C. </li><li> Inclinare il supporto 20 ° verso il rivelatore. </li><li> In condizioni di imaging a grande campo, e supponendo si intende analizzare la matrice di un individual mitocondri, scegliere un mitocondrio per l&#39;analisi, si sposta al centro del campo e concentrarsi. </li><li> Passare alla modalità spot (su alcuni microscopi appena convergere il fascio utilizzando secondo fuoco condensatore) e aumentare la corrente di fascio di ca. 3 nA (come misurato con una tazza Faraday o simili) in un punto 100 nm. </li><li> Avviare il software di acquisizione dello spettro e iniziare a 100 acquisizioni sec, che possono essere visualizzati volta in diretta sul monitor. Salvare spettro registrato (Figura 2). Il formato EMSA standard del settore è preferito. </li><li> Arrestare il EM e trasferire il file di più spettri (s) a una (offline) workstation analisi. </li></ol> 8. Analisi di raggi X Spectra Analisi qualitativa Uno spettro EDX (Figura 2, nel riquadro) è essenzialmente un grafico xy dell&#39;intensità dei raggi X vs energia. Spectra contengono informazioni qualitative e quantitative sulla composizione elementare di tanalizzava il volume, in quanto l&#39;energia &quot;caratteristica&quot; di un picco identifica l&#39;elemento generatore che picco mentre l&#39;intensità riflette la quantità di tale elemento. I picchi caratteristici corsa su di uno sfondo lentamente variabile, &quot;continuo&quot;. (La legenda alla Figura 2 illustra ulteriori dettagli salienti di spettri EDX.) L&#39;energia dei collettori di picco per l&#39;intera tabella periodica sono definiti dalla nota struttura elettronica di elementi, quindi tutti i collegamenti software EDX a un database che identifica automaticamente i componenti di un analita. In un contesto fisiologico, elementi di interesse generale che ben si adattano ad analisi EDX includono Na (K α a 1.04 keV), P (2.01 keV), K (3.31 keV) e Ca (3,69 keV). <ol><li> Approfittate del database del software disponibile e le routine di picco corrispondente a individuare i principali elementi spettri. In un campione biologico si aspetterebbe di trovare i picchi di Na, Mg, P, S, Cl, K e Ca. (ATTENZIONE:Gli ultimi due elementi si sovrappongono!) </li></ol> Analisi quantitativa L&#39;analisi quantitativa degli spettri EDX consiste nell&#39;estrarre l&#39;area integrata di picchi identificati e convertire questo valore per una concentrazione. Per l&#39;analisi biologica, l&#39;approccio determinato rappresenta il metodo picco / continuo Sala 4,7,10, che sfrutta il fatto che l&#39;intensità del continuum (sopra definito e in Figura 2) è proporzionale alla massa secca del volume analizzato . Così, il rapporto di picco zona zona / continuo, rispetto allo stesso rapporto in spettri di standard di composizione nota, specifica la concentrazione nel compartimento cellulare mirato. Si noti che questo approccio fornisce concentrazioni in moli per unità di peso, tipicamente espressi come mmol / kg di peso secco. Questa unità è inusuale e di interpretazione può richiedere ulteriore conversione, ad esempio, mmol / L peso umido o mmol / mg di proteina, come descritto ELsewhere 4,10. <ol start="2"><li> Estrarre aree dei picchi (e le stime di errore) di elementi biologici tra Z = 10-20 (0,5-4,0 keV), cioè Na, Mg, P, S, Cl, K e Ca, utilizzando una delle routine di montaggio integrato nel software di analisi (vedi Tabella 1, in particolare nota 4). Questo laboratorio utilizza Simplex o multiple-minimi quadrati. Si noti che questo raccordo richiede particolare attenzione per risolvere la sovrapposizione tra K e Ca picchi (vedi figura 2). </li><li> Integrare il continuum tra 1,45-1,61 keV. Regioni libere da interferenze alternativi possono essere utilizzati. </li><li> Calcola rapporti picco / continui e poi concentrazioni rispetto agli standard. Propagare errori durante l&#39;analisi. </li><li> Utilizzare il software statistico standard e le formule per stimare le medie che riflettono la variabilità biologica. </li></ol>

<ol>
	<li>Aronova, M. A., Kim, Y. C., Pivovarova, N. B., Andrews, S. B., Leapman, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+EFTEM+mapping+of+near+physiological+calcium+concentrations+in+biological+specimens.">Quantitative EFTEM mapping of near physiological calcium concentrations in biological specimens.</a> Ultramicroscopy. 109, 201-212 (2009).</li><li>Aronova, M. A., Leapman, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elemental+mapping+by+electron+energy+loss+spectroscopy+in+biology.">Elemental mapping by electron energy loss spectroscopy in biology.</a> Methods Mol. 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Neurobiol. 14, 591-598 (2004).</li><li>LeFurgey, A., Bond, M., Ingram, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Frontiers+in+electron+probe+microanalysis:+application+to+cell+physiology.">Frontiers in electron probe microanalysis: application to cell physiology.</a> Ultramicroscopy. 24, 185-219 (1988).</li><li>Newbury, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+new+X-ray+mapping:+X-ray+spectrum+imaging+above+100+kHz+output+count+rate+with+the+silicon+drift+detector.">The new X-ray mapping: X-ray spectrum imaging above 100 kHz output count rate with the silicon drift detector.</a> Microsc. Microanal. 12, 26-35 (2006).</li><li>Pierson, J., Vos, M., McIntosh, J. R., Peters, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perspectives+on+electron+cryotomography+of+vitreous+cryo-sections.">Perspectives on electron cryotomography of vitreous cryo-sections.</a> J. Electron Microsc. 60, S93-S100 (2011).</li><li>Pivovarova, N. B., Hongpaisan, J., Andrews, S. B., Friel, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Depolarization-induced+mitochondrial+Ca+accumulation+in+sympathetic+neurons:+spatial+and+temporal+characteristics.">Depolarization-induced mitochondrial Ca accumulation in sympathetic neurons: spatial and temporal characteristics.</a> J. Neurosci. 19, 6372-6384 (1999).</li><li>Pivovarova, N. B., Nguyen, H. V., Winters, C. A., Brantner, C. A., Smith, C. L., Andrews, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Excitotoxic+calcium+overload+in+a+subpopulation+of+mitochondria+triggers+delayed+death+in+hippocampal+neurons.">Excitotoxic calcium overload in a subpopulation of mitochondria triggers delayed death in hippocampal neurons.</a> J. Neurosci. 24, 5611-5622 (2004).</li><li>Ritchie, N. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spectrum+simulation+in+DTSA-II.">Spectrum simulation in DTSA-II.</a> Microsc. Microanal. 15, 454-468 (2009).</li><li>Stanika, R. I., Winters, C. A., Pivovarova, N. B., Andrews, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+NMDA+receptor-dependent+calcium+loading+and+mitochondrial+dysfunction+in+CA1+vs.+CA3+hippocampal+neurons.">Differential NMDA receptor-dependent calcium loading and mitochondrial dysfunction in CA1 vs. CA3 hippocampal neurons.</a> Neurobiol. Dis. 37, 403-411 (2010).</li><li>Zhang, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+visualization+of+receptor+arrays+in+frozen-hydrated+sections+and+plunge-frozen+specimens+of+E.+coli+engineered+to+overproduce+the+hemotaxis+receptor+Tsr.">Direct visualization of receptor arrays in frozen-hydrated sections and plunge-frozen specimens of E. coli engineered to overproduce the hemotaxis receptor Tsr.</a> J. Microsc. 216, 76-83 (2004).</li></ol>

Gli autori riportano conflitti di interesse.

La base microscopio-analitiche elettrone qui presentato permette l&#39;individuazione, l&#39;identificazione e la quantificazione di diversi elementi di interesse biologico, compresi Na, K, P, e soprattutto Ca. Queste analisi possono essere effettuate a subcellulare, cioè, intra-organello, risoluzione a causa della capacità di localizzare e identificare le strutture di interesse in immagini di alta qualità di criosezioni preparati da campioni congelati rapidamente. Si noti che nessuna colorazione è tenuto a...

Gli ioni calcio sono senza dubbio l&#39;entità segnalazione cellulare più importante e versatile in biologia, gioca un ruolo fondamentale nei processi normali diversi come trasmissione sinaptica e l&#39;espressione genica. D&#39;altra parte, il calcio è ugualmente importante nella morte cellulare. In particolare, la deregolamentazione calcio è un fattore chiave nel danno neuronale in ictus, Parkinson, Alzheimer e altre malattie neurodegenerative 3,5. Pertanto, è estremamente importante capire quantitativamente come calcio è distribuito all&#39;interno delle cellule, e come questo cambia seguente stimoli fisiologici o patofisiologici. Questo obiettivo è complicato dal fatto che il calcio è distribuita dinamicamente tra due stati fisici - liberi in soluzione o legato ad un substrato - e che le concentrazioni di calcio cellulare commutati diversi ordini di grandezza a seguito di stimolazione. Mentre ci sono diverse metodologie avanzate disponibili per l&#39;analisi di free calcio intracellulare, la determinazione delle concentrazioni di calcio totale in compartimenti intracellulari definiti è realisticamente limitata ad un approccio, cioè, elettrone sonda microanalisi (EPMA). EPMA è una tecnica che le coppie uno spettrometro a raggi X di un microscopio elettronico a trasmissione (TEM). La pistola TEM elettronico si concentra una sonda elettronica submicronico fermo su una regione subcellulare di interesse e raggi X specifici degli elementi emessi a seguito del bombardamento di elettroni sono raccolti e analizzati (vedi riferimenti 7, 4 per dettagliate recensioni tecnici). I vantaggi di EPMA sono sola risoluzione a livello di organelli e sensibilità submillimolar. In pratica, tuttavia, richiede EPMA cryotechniques specializzati e strumentazione per la preparazione dei campioni e analisi. Qui sono descritti gli strumenti, le tecniche e gli strumenti adeguati per misure di calcio intracellulare mediante EPMA. Calcio intramitocondriale è di i particolarinterest sul conto del ruolo fondamentale che gioca mitocondriali sovraccarico di calcio nelle malattie neurodegenerative.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>REAGENTS/MATERIALS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermanox plastic coverslips</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>72280</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture inserts</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>353090</td>
			<td>For 6-well plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryopins</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>16701952</td>
			<td>Grooved</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wood applicators</td>
			<td>EM Sciences</td>
			<td>72300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Folding EM grids</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>4GC100/100</td>
			<td>100 mesh</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Indium foil</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>13982</td>
			<td>0.25 mm thick</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>EQUIPMENT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plunge freezing device</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>KF-80</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slam freezing device</td>
			<td>LifeCell</td>
			<td>CF-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultramicrotome</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>UC6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryoattachment for microtome</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>FC6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diamond cryotrimming tool</td>
			<td>Diatome</td>
			<td>Cryotrim 45</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diamond cryoknife</td>
			<td>Diatome</td>
			<td>Cryo 35</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antistatic device</td>
			<td>Diatome</td>
			<td>Hauf Static Line</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryo electron microscope</td>
			<td>Carl Zeiss Microscopy</td>
			<td>EM912 Omega</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EM cryo specimen holder</td>
			<td>Gatan</td>
			<td>CT3500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slow-scan CCD camera, 2k x 2k</td>
			<td>Troendle (TRS)</td>
			<td>Sharpeye</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image acquisition software</td>
			<td>Olympus SIS</td>
			<td>iTEM suite</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ED x-ray detector</td>
			<td>Oxford Instruments</td>
			<td>Linksystem Pentafet</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pulse Processor</td>
			<td>Oxford Instruments</td>
			<td>XP-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCI backplane card</td>
			<td>4pi Systems</td>
			<td>Spectral Engine II</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Desktop computer</td>
			<td>Apple</td>
			<td>Any OS9-compatible model</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-ray analysis software</td>
			<td>NIST</td>
			<td>DTSA, DTSA II</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spreadsheet software</td>
			<td>Microsoft</td>
			<td>Excel</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>
			<ol>
				<li>The CF100 is no longer sold commercially, although the machine is available at many academic facilities, and complete machines or parts can be found on-line.</li>
				<li>A video tutorial for the CT3500 cryotransfer holder is available at <a href="http://www.gatan.com/files/Movies/CT3500_Cryo_transfer_holder.mp4" target="_blank">http://www.gatan.com/files/Movies/CT3500_Cryo_transfer_holder.mp4</a>.</li>
				<li>The SEII is obsolete; the Universal Spectral Engine Is a later, PC-compatible product with comparable functionality. 4pi has ceased manufacturing and sales but still provides technical customer support. Used systems are often found online.</li>
				<li>The original DTSA is now obsolete. NIST offers in the public domain an updated successor, DTSA II 12 (<a href="http://www.nist.gov/mml/mmsd/software.cfm" target="_blank">http://www.nist.gov/mml/mmsd/software.cfm</a>)</li>
			</ol>
			</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measurement of total calcium in neurons by electron probe x-ray microanalysis

In questo articolo vengono descritti gli strumenti, le tecniche e gli strumenti adeguati per misure quantitative di contenuti elementale intracellulare utilizzando la tecnica conosciuta come sonda di elettroni microanalisi (EPMA). Calcio intramitocondriale è una particolare attenzione per il ruolo fondamentale che il sovraccarico di calcio mitocondriale svolge nelle malattie neurodegenerative. Il metodo si basa sull&#39;analisi dei raggi X generato in un microscopio elettronico (EM) per interazione di un fascio di elettroni con il campione. Al fine di mantenere la distribuzione nativo di elementi diffusibili in campioni di microscopia elettronica, EPMA richiede &quot;cryofixation&quot; del tessuto seguita dalla preparazione di criosezioni ultrasottili. Rapido congelamento delle cellule in coltura o colture fetta organotipica viene effettuata da tuffo congelamento in etano liquido o sbattere congelamento contro un blocco metallico freddo, rispettivamente. Criosezioni nominalmente spessore 80 nm sono tagliati a secco con un coltello di diamante a ca. -16076, C, montato su carbonio / griglie di rame pioloform rivestite, e cryotransferred in un Cryo-EM utilizzando un supporto cryospecimen specializzato. Dopo l&#39;indagine visiva e mappatura posizione a ≤ -160 ° C e bassa dose di elettroni, criosezioni congelati-idrato sono liofilizzati a -100 ° C per ~ 30 min. Immagini a livello organello di criosezioni secchi sono registrati, anche a basse dosi, per mezzo di una telecamera CCD a lenta scansione e regioni subcellulari di interesse selezionato per l&#39;analisi. Raggi X emessi da ROI da una, concentrata, sonda di elettroni ad alta intensità stazionaria vengono raccolti da un raggi X a dispersione di energia (EDX) spettrometro, elaborato da elettronica associata, e presentata come spettro ai raggi X, cioè un appezzamento di intensità dei raggi X vs energia. Software aggiuntivo facilita: 1) l&#39;identificazione di componenti elementari dai loro &quot;caratteristici&quot; energie di picco e di impronte digitali, e 2) analisi quantitativa per estrazione delle aree dei picchi / sfondo. Questo documento si conclude con due esempi che illustrano tipiciApplicazioni EPMA, uno in cui l&#39;analisi di calcio mitocondriale disponibile una visione critica dei meccanismi di danno excitotoxic e un altro che rivelavano la base della resistenza ischemia.

Le cellule cerebrali tipicamente lesioni alle eccitotossico a seguito del rilascio di neurotrasmettitore patologica che si verifica in condizioni ischemiche. EPMA è stato fondamentale per scoprire come la capacità dei mitocondri neuronali di sequestrare enormi quantità di calcio è alla base del meccanismo di lesione. Il microscopio elettronico in Figura 3 illustra l&#39;aspetto di mitocondri in criosezioni liofilizzati di neuroni ippocampali rapidamente congelati dopo 30 minuti di esposizione ad uno...

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Measurement of Total Calcium in Neurons by Electron Probe X-ray Microanalysis

Questo documento descrive l&#39;applicazione della microscopia elettronica cryoanalytical per la misurazione quantitativa del contenuto di calcio totale e la distribuzione a risoluzione subcellulare in campioni biologici fisiologicamente definiti.

Misurazione del calcio totale in neuroni da Electron Probe microanalisi a raggi X

In this article the tools, techniques, and instruments appropriate for quantitative measurements of intracellular elemental content using the technique ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

11.9K Views.  National Institutes of Health.  Questo documento descrive l'applicazione della microscopia elettronica cryoanalytical per la misurazione quantitativa del contenuto di calcio totale e la distribuzione a risoluzione subcellulare in campioni biologici fisiologicamente definiti. 

Video: Measurement of Total Calcium in Neurons by Electron Probe X-ray Microanalysis

Dissection and Culture of Commissural Neurons from Embryonic Spinal Cord

Commissural neurons have been widely used to investigate the mechanisms underlying axon guidance during embryonic spinal cord development. The cell bodies of these neurons are located in the dorsal spinal cord and their axons follow stereotyped trajectories during embryonic development. Commissural axons initially project ventrally towards the floorplate. After crossing the midline, these axons turn anteriorly and project towards the brain. Each of these steps is regulated by the action of several guidance cues. Cultures highly enriched in commissural neurons are ideally suited for many experiments addressing the mechanisms of axon pathfinding, including turning assays, immunochemistry and biochemistry. Here, we describe a method to dissect and culture commissural neurons from E13 rat dorsal spinal cord. First, the spinal cord is isolated and dorsal strips are dissected out. The dorsal tissue is then dissociated into a cell suspension by trypsinization and mechanical disruption. Neurons are plated onto poly-L-lysine-coated glass coverslips or tissue-culture dishes. After 30 hours in vitro, most neurons have extended an axon. The purity of the culture (Yam et al. 2009), typically over 90%, can be assessed by immunolabeling with the commissural neuron markers DCC, LH2 and TAG1 (Helms and Johnson, 1998). This neuronal preparation is a useful tool for in vitro studies of the cellular and molecular mechanisms of commissural axon growth and guidance during spinal cord development.

This video demonstrates a method to dissect and culture commissural neurons from E13 rat dorsal spinal cord. Dissociated commissural neurons are useful to study the cellular and molecular mechanisms of axon growth and guidance.

Dissezione e la cultura di neuroni embrionali commissurali da midollo spinale

Commissural neurons have been widely used to investigate the mechanisms underlying axon guidance during embryonic spinal cord development. The cell bodies ...

Ricerca

Neuroscienze

Large-scale Recording of Neurons by Movable Silicon Probes in Behaving Rodents

A major challenge in neuroscience is linking behavior to the collective activity of neural assemblies. Understanding of input-output relationships of neurons and circuits requires methods with the spatial selectivity and temporal resolution appropriate for mechanistic analysis of neural ensembles in the behaving animal, i.e. recording of representatively large samples of isolated single neurons. Ensemble monitoring of neuronal activity has progressed remarkably in the past decade in both small and large-brained animals, including human subjects1-11. Multiple-site recording with silicon-based devices are particularly effective because of their scalability, small volume and geometric design.
Here, we describe methods for recording multiple single neurons and local field potential in behaving rodents, using commercially available micro-machined silicon probes with custom-made accessory components. There are two basic options for interfacing silicon probes to preamplifiers: printed circuit boards and flexible cables. Probe supplying companies (<a href="http://www.neuronexustech.com/" >http://www.neuronexustech.com/</a>; <a href="http://www.sbmicrosystems.com/">http://www.sbmicrosystems.com/</a>; <a href="http://www.acreo.se/">http://www.acreo.se/</a>) usually provide the bonding service and deliver probes bonded to printed circuit boards or flexible cables. Here, we describe the implantation of a 4-shank, 32-site probe attached to flexible polyimide cable, and mounted on a movable microdrive. Each step of the probe preparation, microdrive construction and surgery is illustrated so that the end user can easily replicate the process.

We describe methods for large-scale recording of multiple single units and local field potential in behaving rodents with silicon probes. Drive fabrication, probe attachment to the drive and probe implantation processes are illustrated in sufficient details for easy replication.

Su larga scala di registrazione dei neuroni da sonde mobili in silicio Comportarsi Roditori

A major challenge in neuroscience is linking behavior to the collective activity of neural assemblies. Understanding of input-output relationships of ...

Simultaneous Recording of Calcium Signals from Identified Neurons and Feeding Behavior of Drosophila melanogaster

To study neuronal networks in terms of their function in behavior, we must analyze how neurons operate when each behavioral pattern is generated. Thus, simultaneous recordings of neuronal activity and behavior are essential to correlate brain activity to behavior. For such behavioral analyses, the fruit fly, Drosophila melanogaster, allows us to incorporate genetically encoded calcium indicators such as GCaMP1, to monitor neuronal activity, and to use sophisticated genetic manipulations for optogenetic or thermogenetic techniques to specifically activate identified neurons2-5. Use of a thermogenetic technique has led us to find critical neurons for feeding behavior (Flood et al., under revision). As a main part of feeding behavior, a Drosophila adult extends its proboscis for feeding6 (proboscis extension response; PER), responding to a sweet stimulus from sensory cells on its proboscis or tarsi. Combining the protocol for PER7 with a calcium imaging technique8 using GCaMP3.01, 9, I have established an experimental system, where we can monitor activity of neurons in the feeding center &#x2013; the suboesophageal ganglion (SOG), simultaneously with behavioral observation of the proboscis. I have designed an apparatus ("Fly brain Live Imaging and Electrophysiology Stage": "FLIES") to accommodate a Drosophila adult, allowing its proboscis to freely move while its brain is exposed to the bath for Ca2+ imaging through a water immersion lens. The FLIES is also appropriate for many types of live experiments on fly brains such as electrophysiological recording or time lapse imaging of synaptic morphology. Because the results from live imaging can be directly correlated with the simultaneous PER behavior, this methodology can provide an excellent experimental system to study information processing of neuronal networks, and how this cellular activity is coupled to plastic processes and memory.

Simultaneous Recording of Calcium Signals from Identified Neurons and Feeding Behavior of Drosophila melanogaster

The fruit fly, Drosophila melanogaster, extends its proboscis for feeding, responding to a sugar stimulus from its proboscis or tarsus. I have combined observations of the proboscis extension response (PER) with a calcium imaging technique, allowing us to monitor the activity of neurons in the brain, simultaneously with behavioral observation.

La registrazione simultanea dei segnali di calcio da parte dei neuroni identificati e comportamento alimentare di Drosophila melanogaster</em

To study neuronal networks in terms of their function in behavior, we must analyze how neurons operate when each behavioral pattern is generated.  Thus, ...

Imaging Calcium Responses in GFP-tagged Neurons of Hypothalamic Mouse Brain Slices

Despite an enormous increase in our knowledge about the mechanisms underlying the encoding of information in the brain, a central question concerning the precise molecular steps as well as the activity of specific neurons in multi-functional nuclei of brain areas such as the hypothalamus remain. This problem includes identification of the molecular components involved in the regulation of various neurohormone signal transduction cascades. Elevations of intracellular Ca2+ play an important role in regulating the sensitivity of neurons, both at the level of signal transduction and at synaptic sites.
New tools have emerged to help identify neurons in the myriad of brain neurons by expressing green fluorescent protein (GFP) under the control of a particular promoter. To monitor both spatially and temporally stimulus-induced Ca2+ responses in GFP-tagged neurons, a non-green fluorescent Ca2+ indicator dye needs to be used. In addition, confocal microscopy is a favorite method of imaging individual neurons in tissue slices due to its ability to visualize neurons in distinct planes of depth within the tissue and to limit out-of-focus fluorescence. The ratiometric Ca2+ indicator fura-2 has been used in combination with GFP-tagged neurons1. However, the dye is excited by ultraviolet (UV) light. The cost of the laser and the limited optical penetration depth of UV light hindered its use in many laboratories. Moreover, GFP fluorescence may interfere with the fura-2 signals2. Therefore, we decided to use a red fluorescent Ca2+ indicator dye. The huge Stokes shift of fura-red permits multicolor analysis of the red fluorescence in combination with GFP using a single excitation wavelength. We had previously good results using fura-red in combination with GFP-tagged olfactory neurons3. The protocols for olfactory tissue slices seemed to work equally well in hypothalamic neurons4. Fura-red based Ca2+ imaging was also successfully combined with GFP-tagged pancreatic &beta;-cells and GFP-tagged receptors expressed in HEK cells5,6. A little quirk of fura-red is that its fluorescence intensity at 650 nm decreases once the indicator binds calcium7. Therefore, the fluorescence of resting neurons with low Ca2+ concentration has relatively high intensity. It should be noted, that other red Ca2+-indicator dyes exist or are currently being developed, that might give better or improved results in different neurons and brain areas.

In this protocol, we update recent progress in imaging Ca2+ signals of GFP-tagged neurons in brain tissue slices using a red fluorescent Ca2+ indicator dye.

Calcio Risposte imaging in neuroni GFP-tagged fette di cervello di topo ipotalamici

Despite an enormous increase in our knowledge about the mechanisms underlying the encoding of information in the brain, a central question concerning the ...

Preparation of Primary Neurons for Visualizing Neurites in a Frozen-hydrated State Using Cryo-Electron Tomography

Neurites, both dendrites and axons, are neuronal cellular processes that enable the conduction of electrical impulses between neurons. Defining the structure of neurites is critical to understanding how these processes move materials and signals that support synaptic communication. Electron microscopy (EM) has been traditionally used to assess the ultrastructural features within neurites; however, the exposure to organic solvent during dehydration and resin embedding can distort structures. An important unmet goal is the formulation of procedures that allow for structural evaluations not impacted by such artifacts.
Here, we have established a detailed and reproducible protocol for growing and flash-freezing whole neurites of different primary neurons on electron microscopy grids followed by their examination with cryo-electron tomography (cryo-ET). This technique allows for 3-D visualization of frozen, hydrated neurites at nanometer resolution, facilitating assessment of their morphological differences. Our protocol yields an unprecedented view of dorsal root ganglion (DRG) neurites, and a visualization of hippocampal neurites in their near-native state. As such, these methods create a foundation for future studies on neurites of both normal neurons and those impacted by neurological disorders.

To preserve neuronal processes for ultrastructural analysis, we describe a protocol for plating of primary neurons on electron microscopy grids followed by flash freezing, yielding samples suspended in a layer of vitreous ice. These samples can be examined with a cryo-electron microscope to visualize structures at the nanometer scale.

Preparazione di primaria neuroni per visualizzare neuriti in uno Stato Frozen-idratata Utilizzo Cryo-Electron Positron

Neurites, both dendrites and axons, are neuronal cellular processes that enable the conduction of electrical impulses between neurons. Defining the ...

Simultaneous Electrophysiological Recording and Calcium Imaging of Suprachiasmatic Nucleus Neurons

Simultaneous electrophysiological and fluorescent imaging recording methods were used to study the role of changes of membrane potential or current in regulating the intracellular calcium concentration. Changing environmental conditions, such as the light-dark cycle, can modify neuronal and neural network activity and the expression of a family of circadian clock genes within the suprachiasmatic nucleus (SCN), the location of the master circadian clock in the mammalian brain. Excitatory synaptic transmission leads to an increase in the postsynaptic Ca2+ concentration that is believed to activate the signaling pathways that shifts the rhythmic expression of circadian clock genes. Hypothalamic slices containing the SCN were patch clamped using microelectrodes filled with an internal solution containing the calcium indicator bis-fura-2. After a seal was formed between the microelectrode and the SCN neuronal membrane, the membrane was ruptured using gentle suction and the calcium probe diffused into the neuron filling both the soma and dendrites. Quantitative ratiometric measurements of the intracellular calcium concentration were recorded simultaneously with membrane potential or current. Using these methods it is possible to study the role of changes of the intracellular calcium concentration produced by synaptic activity and action potential firing of individual neurons. In this presentation we demonstrate the methods to simultaneously record electrophysiological activity along with intracellular calcium from individual SCN neurons maintained in brain slices.

Procedures are described to perform simultaneous recordings of membrane potential or current and changes of intracellular calcium concentration. Suprachiasmatic nucleus neurons are filled with the calcium indicator bis-fura-2 using a patch clamp electrode in the whole cell patch clamp configuration.

Simultaneous electrophysiological and fluorescent imaging recording methods were used to study the role of changes of membrane potential or current in ...

Calcium Phosphate Transfection of Primary Hippocampal Neurons

Calcium phosphate precipitation is a convenient and economical method for transfection of cultured cells. With optimization, it is possible to use this method on hard-to-transfect cells like primary neurons. Here we describe our detailed protocol for calcium phosphate transfection of hippocampal neurons cocultured with astroglial cells.

Fosfato di calcio trasfezione di primaria neuroni dell&#39;ippocampo

Calcium phosphate precipitation is a convenient and economical method for transfection of cultured cells. With optimization, it is possible to use this ...

Ratiometric Calcium Imaging of Individual Neurons in Behaving Caenorhabditis Elegans

It has become increasingly clear that neural circuit activity in behaving animals differs substantially from that seen in anesthetized or immobilized animals. Highly sensitive, genetically encoded fluorescent reporters of Ca2+ have revolutionized the recording of cell and synaptic activity using non-invasive optical approaches in behaving animals. When combined with genetic and optogenetic techniques, the molecular mechanisms that modulate cell and circuit activity during different behavior states can be identified.
Here we describe methods for ratiometric Ca2+ imaging of single neurons in freely behaving Caenorhabditis elegans worms. We demonstrate a simple mounting technique that gently overlays worms growing on a standard Nematode Growth Media (NGM) agar block with a glass coverslip, permitting animals to be recorded at high-resolution during unrestricted movement and behavior. With this technique, we use the sensitive Ca2+ reporter GCaMP5 to record changes in intracellular Ca2+ in the serotonergic Hermaphrodite Specific Neurons (HSNs) as they drive egg-laying behavior. By co-expressing mCherry, a Ca2+-insensitive fluorescent protein, we can track the position of the HSN within ~ 1 &#181;m and correct for fluctuations in fluorescence caused by changes in focus or movement. Simultaneous, infrared brightfield imaging allows for behavior recording and animal tracking using a motorized stage. By integrating these microscopic techniques and data streams, we can record Ca2+ activity in the C. elegans egg-laying circuit as it progresses between inactive and active behavior states over tens of minutes.

Ratiometric Calcium Imaging of Individual Neurons in Behaving Caenorhabditis Elegans

This protocol describes the use of genetically encoded Ca2+ reporters to record changes in neural activity in behaving Caenorhabditis elegans worms. &#8195;

Raziometrici calcio Imaging di singoli neuroni nel comportarsi Caenorhabditis Elegans

It has become increasingly clear that neural circuit activity in behaving animals differs substantially from that seen in anesthetized or immobilized ...

Localization of the Locus Coeruleus in the Mouse Brain

The locus coeruleus (LC) is a major hub of norepinephrine producing neurons that modulate a number of physiological functions. Structural or functional abnormalities of LC impact several brain regions including cortex, hippocampus, and cerebellum and may contribute to depression, bipolar disorder, anxiety, as well as Parkinson disease and Alzheimer disease. These disorders are often associated with metal misbalance, but the role of metals in LC is only partially understood. Morphologic and functional studies of LC are needed to better understand the human pathologies and contribution of metals. Mice are a widely used experimental model, but the mouse LC is small (~0.3 mm diameter) and hard to identify for a non-expert. Here, we describe a step-by-step immunohistochemistry-based protocol to localize the LC in the mouse brain. Dopamine-&#946;-hydroxylase (DBH), and alternatively, tyrosine hydroxylase (TH), both enzymes highly expressed in the LC, are used as immunohistochemical markers in brain slices. Sections adjacent to LC-containing sections can be used for further analysis, including histology for morphological studies, metabolic testing, as well as metal imaging by X-ray fluorescence microscopy (XFM).

The locus coeruleus is a small cluster of neurons involved in a variety of physiological processes. Here, we describe a protocol to prepare mouse brain sections for studies of proteins and metals in this nucleus.

Localizzazione del Locus Coeruleus nel cervello del topo

The locus coeruleus (LC) is a major hub of norepinephrine producing neurons that modulate a number of physiological functions. Structural or functional ...

In vivo Calcium Imaging in Mouse Inferior Olive

Inferior olive (IO), a nucleus in the ventral medulla, is the only source of climbing fibers that form one of the two input pathways entering the cerebellum. IO has long been proposed to be crucial for motor control and its activity is currently considered to be at the center of many hypotheses of both motor and cognitive functions of the cerebellum. While its physiology and function have been relatively well studied on single-cell level in vitro, presently there are no reports on the organization of the IO network activity in living animals. This is largely due to the extremely challenging anatomical location of the IO, making it difficult to subject to conventional fluorescent imaging methods, where an optic path must be created through the entire brain located dorsally to the region of interest.
Here we describe an alternative method for obtaining state-of-the-art -level calcium imaging data from the IO network. The method takes advantage of the extreme ventral location of the IO and involves a surgical procedure for inserting a gradient-refractive index (GRIN) lens through the neck viscera to come into contact with the ventral surface of the calcium sensor GCaMP6s-expressing IO in anesthetized mice. A representative calcium imaging recording is shown to demonstrate the feasibility to record IO neuron activity after the surgery. While this is a non-survival surgery and the recordings must be conducted under anesthesia, it avoids damage to life-critical brainstem nuclei and allows conducting large variety of experiments investigating spatiotemporal activity patterns and input integration in the IO. This procedure with modifications could be used for recordings in other, adjacent regions of the ventral brainstem.

In vivo Calcium Imaging in Mouse Inferior Olive

We present a protocol to expose the brainstem of adult mouse from the ventral side. By using a gradient-refractive index lens with a miniature microscope, calcium imaging can be used to examine the activity of inferior olive neural somata in vivo.