Questa ricerca è stata sostenuta da sovvenzioni NIH (PN2EY016525 e P41GM103832). SHS è stato sostenuto da una borsa di studio dal Nanobiologia Interdisciplinare Graduate Program Formazione del WM Keck Center for Interdisciplinary Bioscience formazione della Costa del Golfo Consorzi (NIH di Grant No. T32EB009379). SHS sezionato, crebbe e vetrificati DRG e cellule dell&#39;ippocampo, raccolte crio-ET dati di DRG e assoni ippocampo Cryo-EM e, ricostruito e colore-annotato la serie tilt. MRG sezionato e fornito cellule dell&#39;ippocampo nel laboratorio di MNR. SC assistito in serie tilt annotazione. SHS è stato addestrato da CW su come sezionare e crescere neuroni. SHS, WCM e WC concepito gli esperimenti. SHS preparato il manoscritto con il contributo di altri autori. Questo video è stato girato presso il Centro di Imaging Cellulare e NanoAnalytics (C-CINA), del Biozentrum di tegli Università di Basilea. C-CINA è integrato nel Dipartimento per Biosystems Science and Engineering (D-BSSE) del Politecnico federale di Zurigo, che si trova a Basilea, in Svizzera.

1. Preparazione di piatti con EM griglie per la placcatura neuroni primari <ol><li> Esaminare l&#39;integrità di carbonio bucata sulle griglie oro EM utilizzando un microscopio ottico a ingrandimento di almeno 25X. Assicurarsi che i fori di carbonio sono&gt; 98% intatto. </li><li> Per placcatura neuroni primari, utilizzare un becco Bunsen a fiamma sterilizzare le griglie EM e contemporaneamente renderli idrofilo. Utilizzare le pinzette per raccogliere la griglia di EM per il bordo, non è la zona reticolata centrale. ATTENZIONE: Non lasciare mai un becco Bunsen acceso incustodito, e non utilizzare guanti o pinze con componenti in plastica durante l&#39;esecuzione di questi passaggi: <ol><li> Prima di accendere il bruciatore Bunsen, impostare le regolazioni aria e gas in una posizione minimamente aperta. </li><li> Accendere il becco Bunsen con una selce attaccante o butano. </li><li> Modificare le regolazioni aria e gas per ottenere un piccolo, fiamma interiore blu all&#39;interno di un più alto, più leggera fiamma blu / violetto. La punta della fiamma interiore è la parte più calda della fiamma. La manopola sottoneath il bruciatore regola la quantità di gas di penetrare nel tubo del bruciatore, mentre la canna del bruciatore può essere ruotata per regolare la quantità di aria che entra nel bruciatore. Ruotando la regolazione dell&#39;aria in senso orario diminuisce l&#39;aria (risultante in una fiamma viola) e in senso antiorario, l&#39;aria (risultante in una fiamma gialla). </li><li> Con una pinzetta in metallo (senza parti in plastica) per tenere la griglia di EM, passare rapidamente attraverso la fiamma per due volte, di fronte carbonio-side up. Il lato carbonio apparirà più opaco (meno lucida) e con più di una tinta grigio rispetto al lato opposto. </li><li> Trasferire immediatamente la griglia (carbonio-lato alto) nel centro del piatto fondo di vetro collocato entro 10 cm dal becco Bunsen. Utilizzare una griglia di EM per ogni piatto (Figura 1). Utilizzare solo piatti con fondo di vetro che sono presterilized, vale a dire tramite raggi gamma. </li></ol></li><li> Utilizzare un microscopio ottico per controllare l&#39;integrità della rete (buchi di carbonio intatto) pur mantenendo la griglia EM all&#39;interno del vetro-bottpiatto om (per evitare contaminazioni). Quando si applica qualsiasi sostanza sulla griglia o qualsiasi cosa che verrà in contatto con i neuroni, utilizzare procedura sterile e puntali sterili. </li><li> In una cappa di coltura utilizzando la procedura sterile, applicare 250 microlitri della sostanza di rivestimento appropriato lentamente e accuratamente la superficie vetrata centrale della piastra di Petri. Assicurarsi che l&#39;appropriato sostanza di rivestimento copre l&#39;intera griglia EM. <ol><li> Per neuroni ippocampali, utilizzare poli-L-lisina (PLL, 1 mg / ml) come sostanza di rivestimento, preparato come descritto in precedenza 19. Si noti che 250 microlitri sono necessari per griglia EM, per ogni piatto, in modo da scalare il lotto di conseguenza. Per i gangli spinali (DRG) neuroni, utilizzare una miscela proteica gelatinosa secreta dal Engelbreth-Holm-Swarm (EHS), le cellule del sarcoma del mouse (vedi Tabella dei Materiali e reagenti) come sostanza di rivestimento, preparare quanto segue. Si noti che 250 microlitri sono necessari per griglia EM, per ogni piatto, in modo da scalare il lotto di conseguenza. <ol><li> Scongelare una bottiglia stockdella miscela proteica gelatinosa secreta dal Engelbreth-Holm-Swarm (EHS), le cellule del mouse sarcoma notte a 4 ° C. </li><li> Mantenere freddo miscela proteica gelatinosa secreta dal Engelbreth-Holm-Swarm (EHS), le cellule del sarcoma topo, e tutti i componenti utilizzati per rendere la soluzione, ossia del loro mantenimento sul ghiaccio. </li><li> Mentre su ghiaccio, diluire questa miscela proteica gelatinosa Neurobasal mezzo per ottenere una diluizione 1:20 (cioè attenuare 500 microlitri della miscela proteica gelatinosa in 10 ml di Neurobasal). </li><li> Dividere diluito miscela proteica gelatinosa in aliquote da 1 ml, e memorizzare immediatamente eventuali aliquote supplementari a -20 ° C. </li><li> Applicare 250 microlitri per griglia EM, per ogni piatto, come descritto nella Sezione 1.4. </li></ol></li></ol></li><li> Coprire il piatto Petri con la sua parte superiore e incubare (sia con PLL per campioni ippocampali, OR con miscela proteica gelatinosa per campioni DRG) per 1 ora a temperatura ambiente nella cappa coltura tissutale. </li><li> Aspiclassificare tutti PLL (per campioni di ippocampo) o miscela proteica gelatinosa (per campioni DRG) dai piatti. Per effettuare questa operazione, utilizzare il sistema di aspirazione della cappa coltura tissutale. Utilizzare un puntale sterile attaccato al tubo a vuoto. Evitare il contatto diretto con la rete EM. </li><li> Utilizzare una pipetta a spostamento d&#39;aria regolabile attentamente applicare 250 microlitri di PBS sterile (PBS) alla griglia EM nella zona centrale in vetro di ogni piatto Petri, tale che la griglia EM è completamente coperto da PBS. Poi, aspirare il PBS da ogni piatto. Ripetere 3x. </li><li> Lasciare i piatti con griglie EM ad asciugare sotto il cofano coltura di tessuti per 15 min. Assicurarsi che siano completamente asciutti controllando al microscopio luce nella stanza coltura di tessuti. Assicurarsi che non vi siano bolle di umidità nella griglia. Se è così, attenzione aspirare accanto alla griglia EM per eliminare questa umidità supplementare. La griglia rivestita deve essere usato immediatamente per la placcatura di neuroni. </li></ol> 2. Preparazione e Plrativo Primaria neuroni su EM griglie <ol><li> Per piastra neuroni primari, prima sezionare, trypsinize (con 2,5% tripsina) e triturare dissociare il dell&#39;ippocampo (o dorsale radice gangli di 18 giorni di età embrioni di ratto) nelle singole celle, come descritto in precedenza 19. <ol><li> Triturare è un termine comunemente usato dai neurobiologi per descrivere dissociazione grumi di cellule in singole celle, in particolare mediante l&#39;utilizzo di una pipetta di vetro con una punta sterilizzata. Il risultato si ottiene con attenzione e lentamente disegno e rilasciando le cellule, su e giù, più volte (~ 30) tramite la pipetta. </li></ol></li><li> Seguire le procedure descritte in precedenza per DRG dissezione e isolamento delle cellule 24, prendendo atto di usare 0,25% tripsina (in HBSS) per isolare i neuroni DRG di ratto, invece di utilizzare gli enzimi suggeriti (papaina, collagenasi / dispasi) che sono più adatti per il mouse neuroni DRG. </li><li> Calcolare il numero di neuroni isolati (ad esempio con un emocitometro)e utilizzare questo valore per calcolare il volume appropriato di cellule da applicare a ogni piatto per ottenere una concentrazione di 50.000 cellule / ml al piatto. Il volume massimo da applicare è di 250 microlitri. Si noti che questo riempie solo la zona centrale in vetro, non l&#39;intera piastra. </li><li> Incubare i piatti per 30 minuti in un incubatore CO 2 a 37 ° C. Consentono alle cellule di recuperare e di aderire. </li><li> Aggiungere lentamente 1,5 ml di mezzi riscaldati ad ogni piatto, facendo attenzione a non disturbare la griglia EM. Il tipo di supporto dipende dal tipo di cellula (dell&#39;ippocampo o DRG). <ol><li> Preparare il supporto appropriato per entrambi neuroni ippocampali 19 o dorsali radice gangliari neuroni 24, che viene riscaldato in un bagno d&#39;acqua a 37 ° C prima dell&#39;uso. Incubare i piatti pernottamento in CO 2 incubatore. </li><li> Per i neuroni dell&#39;ippocampo, cambiare i media il giorno successivo. Cambiare la metà dei media ogni due giorni in poi per 14 giorni. Riscaldare il supporto in un bagno d&#39;acqua a 37 ° prima dell&#39;uso. </li&gt; <li> Per neuroni DRG, il giorno dopo dissezione / placcatura, preparare un nuovo ceppo di media con un agente anti-mitotico (Uridine e 5&#39;-Fluoro-2&#39;-deossiuridina) ottenere una soluzione stock 10 mM di ciascuno, separatamente, utilizzare una finale concentrazione di 10 mM per ciascuno. Rimuovere la metà dei mezzi di DRG (875 ml) e aggiungere 875 ml di mezzi freschi con l&#39;agente anti-mitotico. <ol><li> Per neuroni DRG, ogni due giorni per la prima settimana, si alternano a cambiare i media tra i media anti-mitotico e media DRG standard. Per la seconda settimana, cambiare i media DRG standard, ogni due giorni. </li></ol></li></ol></li></ol> 3. Vitrifying Neuroni su EM griglie <ol><li> Preparare attrezzature e tutto il materiale per il congelamento e la conservazione delle reti oro EM a temperatura criogenica: un dispositivo di vetrificazione con una camera di umidità 17, fine-point pinzette specializzati per la macchina vetrificazione, pinzette point lungo piatta, Dewar (s) di azoto liquido (LN 2), cContenitore oolant, contenitore griglia EM, carta da filtro priva di calcio. </li><li> Avviare il dispositivo di vetrificazione. Impostare l&#39;umidità al 100% e temperatura di 32 ° C. Nella sezione &quot;Console&quot;, impostare il tempo macchia di zero secondi. Questo permette manuale assorbente attraverso il lato-finestra della camera umida della macchina vetrificazione. </li><li> Maneggiare la carta da filtro priva di calcio con i guanti, stratificazione loro tale che tre carte sono impilate. Tagliare la pila a 0,5 centimetri strisce larghe che sono ~ 2 cm di lunghezza. Piegarle a 90 ° in modo tale che un lato della carta ha di 0,5 cm x 0,5 centimetri faccia (Figura 2). Usando le pinzette, rimuovere la carta centrale e metterlo su un altro filtro di carta senza calcio fino al momento dell&#39;uso. </li><li> Mettere il pulsante di memorizzazione griglia nel supporto bottone all&#39;interno della camera di vetrificazione. Riempire la camera interna del contenitore refrigerante con azoto liquido e attendere fino a completa evaporazione. Riempire la camera esterna del secoloe contenitore refrigerante con azoto liquido finché non raggiunge una temperatura stabile per procedere al passo successivo. Riempire la camera interna con elevata purezza etano gassoso che condensano allo stato liquido all&#39;interno della camera raffreddata. </li><li> Spostare il piatto (es) dal termostato a un grande piatto polistirolo 100 mm per il trasporto alla camera vetrificazione, se non nelle immediate vicinanze. Utilizzare le pinzette vetrificazione specializzati per scegliere con cura la griglia EM dal piatto. Si noti che parte i neuroni crescono sulla griglia EM; posizione avrà importanza per il passaggio successivo. Utilizzare il blocco scorrimento nera sulle pinzette per bloccare saldamente le pinzette sulla griglia EM. </li><li> Inserire le pinzette nella macchina vetrificazione tale lato della griglia EM in cui i neuroni sono rispettati volti a fianco, lontano dal foro della macchina vetrificazione apertura laterale. Ritrarre le pinzette specializzati nella macchina vetrificazione. </li><li> Posizionare il contenitore refrigerante nel supporto appropriatodella macchina vetrificazione. Deve essere riempita con un adeguato LN 2 ed etano liquido. Utilizzo del comando schermata appropriata della macchina vetrificazione, sollevare la camera refrigerante verso l&#39;alto fino a quando è lavata con il fondo della camera umida. </li><li> Con le pinzette punta piatta, afferrare un bordo della carta da filtro in modo tale che il lato minore (di 0,5 cm x 0,5 centimetri faccia) è perpendicolare alle pinzette. Questa faccia entrerà in contatto diretto con la griglia EM per blotting (Figura 2B). Inserire delicatamente la carta da filtro nel lato foro della camera di umidità della macchina vetrificazione (Figura 2A). Stabilmente tenere la carta contro la griglia EM (il lato opposto a campione) per 10 sec. Eliminare la carta dopo e subito sprofondare-congelare i campioni in etano liquido utilizzando l&#39;automazione della macchina vetrificazione. </li><li> Trasferire accuratamente la griglia EM frozen-idrato ad uno degli slot in uno deipulsanti di storage di rete. Ripetere la procedura per ulteriori griglie EM nei piatti. I pulsanti di storage di rete EM utilizzati in questi esperimenti possono memorizzare più griglie EM congelati-idratata. </li></ol> 4. Immagine raccolta, elaborazione, e annotazione <ol><li> Procedere per raccogliere microscopio elettronico 2-D e / o 3-D serie tilt 5 dei neuriti utilizzando un microscopio crio-elettroni in condizioni di basse dosi. Le immagini 2-D sono stati destinati a valutare la qualità della rete in termini di spessore del ghiaccio e le possibili aree utili per serie tilt 3-D. <ol><li> In questo caso, tutte le immagini sono stati raccolti usando una camera CCD 4k x 4k attaccato ad un microscopio elettronico a 200 kV equipaggiata con un solo conduttore inclinazione azoto liquido trasferimento criogenico, a 20k microscopio ingrandimento ad un bersaglio underfocus di 7 micron e campionamento di 4,4 Å / pixel. </li><li> Per ottenere una tomografia 3D del campione, prendere una serie di immagini di proiezione, mentre incrementale inclinando il campione along un asse del microscopio elettronico a trasmissione (TEM). Date le inclinazioni e le altre impostazioni sperimentali, ci sono diversi software differenti disponibili per raccogliere automaticamente le serie tilt 5. La serie tilt 3-D mostrato qui sono stati raccolti sulla stessa microscopio usando semiautomatico software di acquisizione serie inclinazione 26 in un intervallo di -60 ° a 60 ° a 5 ° incrementi con una dose cumulativa di ~ 60 e / a 2. </li></ol></li><li> Ricostruire la serie inclinazione dei neuriti utilizzando un software di elaborazione delle immagini 21 come precedentemente descritto per altri campioni 5,29. </li><li> Colore-annotare le caratteristiche 3-D del neuriti dal primo segmentando il tomogramma e creando un modello di superficie utilizzando una 3-D software di elaborazione di immagini come descritto in precedenza 5. </li></ol>

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Biol. 20, 95-111 (1964).</li><li>Raza, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aging+is+associated+with+elevated+intracellular+calcium+levels+and+altered+calcium+homeostatic+mechanisms+in+hippocampal+neurons.">Aging is associated with elevated intracellular calcium levels and altered calcium homeostatic mechanisms in hippocampal neurons.</a> Neurosci. Lett. 418, 77-81 (2007).</li><li>Scroggs, R. S., Fox, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+current+variation+between+acutely+isolated+adult+rat+dorsal+root+ganglion+neurons+of+different+size.">Calcium current variation between acutely isolated adult rat dorsal root ganglion neurons of different size.</a> J. Physiol. 445, 639-658 (1992).</li><li>Squire, L. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Fundamental neuroscience. , (2003).</li><li>Sulzer, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+hit+hypotheses+for+dopamine+neuron+loss+in+Parkinson's+disease.">Multiple hit hypotheses for dopamine neuron loss in Parkinson's disease.</a> Trends Neurosci. 30, 244-250 (2007).</li><li>Tapia, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+expression+of+glycine+and+GABA(A)+receptors+in+developing+spinal+cord+neurons.+Effects+on+neurite+outgrowth.">Early expression of glycine and GABA(A) receptors in developing spinal cord neurons. Effects on neurite outgrowth.</a> Neuroscience. 108, 493-506 (2001).</li></ol>

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari in competizione.

Abbiamo dimostrato che i neuroni di ratto embrionali (ganglio della radice dorsale e ippocampo) possono essere coltivate su oro microscopia elettronica (EM) griglie e congelati in ghiaccio vitreo abbastanza sottile per i loro neuriti essere ripreso con 2-D Cryo-EM e 3-D crio- ET. Mentre neuriti dell&#39;ippocampo sono stati precedentemente fotografato con crio-ET 8,10,18,23, un protocollo abbastanza dettagliato per la replica di successo utilizzando dispositivi disponibili in commercio è stata carente. Inolt...

I neuroni stabiliscono il complesso essenziale circuiteria per la funzione del sistema nervoso centrale e periferico elaborando dendriti ricevere informazioni e assoni, spesso molto lunghe, per comunicare con i neuroni a valle. Crescita dei neuriti gioca un ruolo fondamentale durante lo sviluppo embrionale e la differenziazione e la manutenzione di neuriti neuronale supporta criticamente la funzione del sistema nervoso. Processi neuritic dispongono inoltre criticamente in danno neuronale e rigenerazione, così come disturbi del sistema nervoso. Lo studio di architettura neuronale è fondamentale per capire sia il cervello normale e malato. Fortunatamente, fisiologicamente rilevanti sistemi di coltura di cellule neuronali esistono che possono ricapitolare strutture cellulari complesse ed eterogenee. Sulla base della spiegazione di piattaforme sperimentali solide strategie di visualizzazione efficaci che consentano analisi qualitative e quantitative di morfologia neuronale sono necessari. Particolarmente utile sarebbeuna metodologia dettagliata che fornisce una piattaforma coerente per la visualizzazione neuriti, sia assoni e dendriti in scala nanometrica. Microscopia elettronica tradizionale richiede l&#39;uso di solventi organici durante la disidratazione e l&#39;incorporamento resina, che può indurre distorsioni nei campioni dal loro vero stato. Ad oggi, la maggior parte delle caratterizzazioni strutturali a scala nanometrica sono basati su cellule o tessuti più grandi che sono sottoposti a tali sostanze chimiche aggressive - limitando così l&#39;interpretazione dei risultati 4,9,25. Inoltre, per la penetrazione fascio di elettroni, sezionamento è necessaria per gli organismi o sporgenze cellulari che presentano uno spessore maggiore di 1 micron 12. Infine, sezionato o lavorato risultati tessuto in collezione di insiemi di dati discreti specifico slice, rendendo ingombrante la definizione della funzione allungata di neuriti. Anche per crio-EM, in cui sezionando un campione congelato-idratato è possibile, il metodo introduce artif compressioneatti 1. Negli ultimi anni, i ricercatori hanno imparato a coltivare i neuroni dell&#39;ippocampo direttamente su griglie EM e-flash congelamento loro in etano liquido per visualizzare successivamente neuriti con crio-ET 8,10,18,23. Tuttavia, tali studi né usano un dispositivo su misura 10,23, oppure dettagli mancanza sul gradino assorbente per la generazione di ghiaccio vitreo abbastanza sottile per la visualizzazione di routine 8,18. Per esempio, uno studio raccomanda l&#39;uso di 30-40 sec per blotting griglia EM 10, tuttavia, questo valore non è ottimizzata per uso generale, ma è specifico per il dispositivo-tuffo congelamento misura. Utilizzando un dispositivo su misura, piuttosto che un disponibile in commercio un 17 per mantenere l&#39;umidità prima di immergersi congelamento del campione potrebbe rappresentare un ostacolo per la diffusa riproducibilità. Anche se questi studi sono stati Innovativo nel visualizzare neuriti da crio-ET, abbiamo compiuto un ulteriore passo avanti per esplorare l&#39;applicability di crio-ET ad una varietà di esemplari neuronali (ippocampo e gangli delle radici dorsali neuroni). Inoltre, si discute sia i risultati ottimali e non ottimali, così come i potenziali artefatti che si potrebbe riscontrare utilizzando crio-ET per tali esemplari. Definizione di una tecnica dettagliata per la conservazione e la visualizzazione di neuriti interi su scala nanometrica in uno stato quasi native aumenterebbe la possibilità per i più ricercatori di effettuare studi ultrastrutturali. A tal fine, si descrive un protocollo efficace e dettagliato utilizzando apparecchiature disponibili in commercio per la preparazione non fissati, i neuroni non colorati per visualizzare neuriti. Questo è un primo importante passo verso dettagliare l&#39;ultrastruttura dei neuriti sani e di gettare le basi per capire quali sono presenti in modelli di malattia del sistema nervoso differenze strutturali. Poiché crio-ET in grado di risolvere non fissate, le caratteristiche dei neuriti non colorati in 3-D su scala nanometrica, il metodo renderà possibile, come mai esserepertanto definire architettura neuritic 12.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="970">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Dumont #7 Tweezers</td>
			<td style="width:196px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:309px;">72803-01</td>
			<td style="width:171px;">For handling EM grids</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glass bottom dishes</td>
			<td>MatTek Corp.</td>
			<td>P35G-1.5-10C</td>
			<td>For growing sample</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Electron microscopy grids</td>
			<td>Quantifoil</td>
			<td>Holey Carbon, Au 200, R 2/2</td>
			<td>For growing sample</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Calcium-free filter paper</td>
			<td>Whatman</td>
			<td>1541-055</td>
			<td>For blotting sample</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Large flat point long tweezers</td>
			<td>Excelta Corporation</td>
			<td>E003-000590, 25-SA</td>
			<td>For blotting sample </td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Vitrification device and tweezers</td>
			<td>FEI</td>
			<td>Vitrobot Mark III</td>
			<td>For freezing sample</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mini grid storage boxes</td>
			<td>Ted Pella, Inc.</td>
			<td>160-40</td>
			<td>For storing EM grids</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cryo transfer holder</td>
			<td>Gatan</td>
			<td>626 Single Tilt Liquid Nitrogen Cryo Transfer Holder</td>
			<td>For imaging samples</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Semi-automated tilt series acquisition software</td>
			<td>SerialEM</td>
			<td>http://bio3d.colorado.edu/SerialEM/</td>
			<td>For imaging samples</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Image processing software</td>
			<td>IMOD eTomo</td>
			<td>http://bio3d.colorado.edu/imod/</td>
			<td>For image processing</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">Transmission electron microscope for cryoEM</td>
			<td>JEOL, Tokyo</td>
			<td>200-kV JEM2100 LaB6 electron microscope</td>
			<td>For imaging samples</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">4k x 4k CCD camera</td>
			<td>Gatan</td>
			<td>N/A</td>
			<td>For imaging samples</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">3-D annotation software</td>
			<td>Visage Imaging GmbH</td>
			<td>Amira/Avizo</td>
			<td>For processing 3-D data</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Software for digitally stitching 2-D images</td>
			<td>Adobe</td>
			<td>Adobe Photoshop</td>
			<td>For processing 2-D data</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DMEM, High Glucose</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11965-118</td>
			<td>For hippocampal culture</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Boric acid</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>B-0252</td>
			<td>For hippocampal culture</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium tetraborate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>B-9876</td>
			<td>For hippocampal culture</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Poly-L-lysine </td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P2636-500MG</td>
			<td>For hippocampal culture</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Filter system</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430758</td>
			<td>For hippocampal culture</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Neurobasal medium</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>21103-049</td>
			<td>For DRG culture</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">B-27 supplement</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>17504-044</td>
			<td>For DRG culture</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>For DRG culture</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glutamax</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>35050-061</td>
			<td>For DRG culture</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Recombinant rat b-NGF</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>556-NG</td>
			<td>For DRG culture</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Uridine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>U3003-5G</td>
			<td>For DRG culture</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">5&#39;-Fluoro-2&#39;-deoxyuridine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F0503-100MG</td>
			<td>For DRG culture</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Matrigel</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>356234</td>
			<td>For DRG culture</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation of primary neurons for visualizing neurites in a frozen-hydrated state using cryo-electron tomography

Neuriti, entrambi i dendriti e degli assoni, sono processi cellulari neuronali che consentono la conduzione degli impulsi elettrici tra i neuroni. Definire la struttura dei neuriti è fondamentale per capire come questi processi si muovono materiali e segnali che supportano la comunicazione sinaptica. La microscopia elettronica (EM) è stato tradizionalmente usato per valutare le caratteristiche ultrastrutturali all&#39;interno neuriti, tuttavia, l&#39;esposizione a solventi organici durante la disidratazione e resina embedding può distorcere strutture. Un importante obiettivo insoddisfatto è la formulazione di procedure che consentano alle valutazioni strutturali non interessate da tali artefatti. Qui, abbiamo stabilito un protocollo dettagliato e riproducibile per la coltivazione e il flash congelamento neuriti interi di diversi neuroni primari di elettroni griglie di microscopia seguita dalla loro esame con crio-elettroni tomografia (crio-ET). Questa tecnica permette di visualizzazione 3-D di surgelati, neuriti idratati a risoluzione nanometrica, facilitando assessment delle loro differenze morfologiche. Il nostro protocollo produce una visione senza precedenti della radice dorsale ganglio (DRG) neuriti, e una visualizzazione dei neuriti dell&#39;ippocampo nel loro stato quasi native. Come tali, questi metodi creano una base per gli studi futuri su neuriti di entrambi i neuroni normali e quelle colpito da disturbi neurologici.

Prima di congelamento e di imaging via crio-ET, immagini al microscopio di luce dovrebbero essere prese della rete EM in cui i neuroni sono in crescita. Neuriti dovrebbero essere chiaramente visibile senza sovrapposizione significativa tra loro. Una casella colorata in Figura 3A rappresenta una zona che è ingrandita per mostrare un ingrandimento maggiore nella Figura 3B, in cui neuriti estendono attraverso la struttura a reticolo della griglia. Ciascuna griglia quadrati è composto da ...

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Preparation of Primary Neurons for Visualizing Neurites in a Frozen-hydrated State Using Cryo-Electron Tomography

Per conservare processi neuronali per l&#39;analisi ultrastrutturale, si descrive un protocollo per la placcatura di neuroni primari su Electron griglie microscopia seguite da congelamento flash, ottenendo campioni sospesi in uno strato di ghiaccio vitreo. Questi campioni possono essere esaminate con un microscopio crio-elettroni per visualizzare le strutture in scala nanometrica.

Preparazione di primaria neuroni per visualizzare neuriti in uno Stato Frozen-idratata Utilizzo Cryo-Electron Positron

Neurites, both dendrites and axons, are neuronal cellular processes that enable the conduction of electrical impulses between neurons. Defining the ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

79.0K Views.  Baylor College of Medicine.  Per conservare processi neuronali per l'analisi ultrastrutturale, si descrive un protocollo per la placcatura di neuroni primari su Electron griglie microscopia seguite da congelamento flash, ottenendo campioni sospesi in uno strato di ghiaccio vitreo. Questi campioni possono essere esaminate con un microscopio crio-elettroni per visualizzare le strutture in scala nanometrica. 

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Quantitative Analysis of Synaptic Vesicle Pool Replenishment in Cultured Cerebellar Granule Neurons using FM Dyes

After neurotransmitter release in central nerve terminals, SVs are rapidly retrieved by endocytosis. Retrieved SVs are then refilled with neurotransmitter and rejoin the recycling pool, defined as SVs that are available for exocytosis1,2. The recycling pool can generally be subdivided into two distinct pools - the readily releasable pool (RRP) and the reserve pool (RP). As their names imply, the RRP consists of SVs that are immediately available for fusion while RP SVs are released only during intense stimulation1,2. It is important to have a reliable assay that reports the differential replenishment of these SV pools in order to understand 1) how SVs traffic after different modes of endocytosis (such as clathrin-dependent endocytosis and activity-dependent bulk endocytosis) and 2) the mechanisms controlling the mobilisation of both the RRP and RP in response to different stimuli.
FM dyes are routinely employed to quantitatively report SV turnover in central nerve terminals3-8. They have a hydrophobic hydrocarbon tail that allows reversible partitioning in the lipid bilayer, and a hydrophilic head group that blocks passage across membranes. The dyes have little fluorescence in aqueous solution, but their quantum yield increases dramatically when partitioned in membrane9. Thus FM dyes are ideal fluorescent probes for tracking actively recycling SVs. The standard protocol for use of FM dye is as follows. First they are applied to neurons and are taken up during endocytosis (Figure 1). After non-internalised dye is washed away from the plasma membrane, recycled SVs redistribute within the recycling pool. These SVs are then depleted using unloading stimuli (Figure 1). Since FM dye labelling of SVs is quantal10, the resulting fluorescence drop is proportional to the amount of vesicles released. Thus, the recycling and fusion of SVs generated from the previous round of endocytosis can be reliably quantified.
Here, we present a protocol that has been modified to obtain two additional elements of information. Firstly, sequential unloading stimuli are used to differentially unload the RRP and the RP, to allow quantification of the replenishment of specific SV pools. Secondly, each nerve terminal undergoes the protocol twice. Thus, the response of the same nerve terminal at S1 can be compared against the presence of a test substance at phase S2 (Figure 2), providing an internal control. This is important, since the extent of SV recycling across different nerve terminals is highly variable11.
Any adherent primary neuronal cultures may be used for this protocol, however the plating density, solutions and stimulation conditions are optimised for cerebellar granule neurons (CGNs)12,13.

A live fluorescence imaging technique to quantify the replenishment and mobilisation of specific synaptic vesicle (SV) pools in central nerve terminals is described. Two rounds of SV recycling are monitored in the same nerve terminals providing an internal control.

Analisi quantitativa di Replenishment pool delle vescicole sinaptiche in colture di neuroni granuli cerebellari utilizzando coloranti FM

After neurotransmitter release in central nerve terminals, SVs are rapidly retrieved by endocytosis.  Retrieved SVs are then refilled with ...

Ricerca

Neuroscienze

Preparation of Drosophila Central Neurons for in situ Patch Clamping

Short generation times and facile genetic techniques make the fruit fly Drosophila melanogaster an excellent genetic model in fundamental neuroscience research. Ion channels are the basis of all behavior since they mediate neuronal excitability. The first voltage gated ion channel cloned was the Drosophila voltage gated potassium channel Shaker1,2. Toward understanding the role of ion channels and membrane excitability for nervous system function it is useful to combine powerful genetic tools available in Drosophila with in situ patch clamp recordings. For many years such recordings have been hampered by the small size of the Drosophila CNS. Furthermore, a robust sheath made of glia and collagen constituted obstacles for patch pipette access to central neurons. Removal of this sheath is a necessary precondition for patch clamp recordings from any neuron in the adult Drosophila CNS. In recent years scientists have been able to conduct in situ patch clamp recordings from neurons in the adult brain3,4 and ventral nerve cord of embryonic5,6, larval7,8,9,10, and adult Drosophila11,12,13,14. A stable giga-seal is the main precondition for a good patch and depends on clean contact of the patch pipette with the cell membrane to avoid leak currents. Therefore, for whole cell in situ patch clamp recordings from adult Drosophila neurons must be cleaned thoroughly. In the first step, the ganglionic sheath has to be treated enzymatically and mechanically removed to make the target cells accessible. In the second step, the cell membrane has to be polished so that no layer of glia, collagen or other material may disturb giga-seal formation. This article describes how to prepare an identified central neuron in the Drosophila ventral nerve cord, the flight motoneuron 5 (MN515), for somatic whole cell patch clamp recordings. Identification and visibility of the neuron is achieved by targeted expression of GFP in MN5. We do not aim to explain the patch clamp technique itself.

Preparation of Drosophila Central Neurons for in situ Patch Clamping

In situ patch clamp recordings are used for electrophysiological characterization of neurons in intact circuitry. In the Drosophila genetic model patch clamping is difficult because the CNS is small and surrounded by a robust sheath. This article describes the procedure to remove the sheath and clean neurons for subsequent patch clamp recordings.

Preparazione di<em&gt; Drosophila</em&gt; Neuroni centrali per<em&gt; In situ</em&gt; Patch di serraggio

Short generation times and facile genetic techniques make the fruit fly Drosophila melanogaster an excellent genetic model in fundamental neuroscience ...

Imaging Dendritic Spines of Rat Primary Hippocampal Neurons using Structured Illumination Microscopy

Dendritic spines are protrusions emerging from the dendrite of a neuron and represent the primary postsynaptic targets of excitatory inputs in the brain. Technological advances have identified these structures as key elements in neuron connectivity and synaptic plasticity. The quantitative analysis of spine morphology using light microscopy remains an essential problem due to technical limitations associated with light's intrinsic refraction limit. Dendritic spines can be readily identified by confocal laser-scanning fluorescence microscopy. However, measuring subtle changes in the shape and size of spines is difficult because spine dimensions other than length are usually smaller than conventional optical resolution fixed by light microscopy's theoretical resolution limit of 200 nm.
Several recently developed super resolution techniques have been used to image cellular structures smaller than the 200 nm, including dendritic spines. These techniques are based on classical far-field operations and therefore allow the use of existing sample preparation methods and to image beyond the surface of a specimen. Described here is a working protocol to apply super resolution structured illumination microscopy (SIM) to the imaging of dendritic spines in primary hippocampal neuron cultures. Possible applications of SIM overlap with those of confocal microscopy. However, the two techniques present different applicability. SIM offers higher effective lateral resolution, while confocal microscopy, due to the usage of a physical pinhole, achieves resolution improvement at the expense of removal of out of focus light. In this protocol, primary neurons are cultured on glass coverslips using a standard protocol, transfected with DNA plasmids encoding fluorescent proteins and imaged using SIM. The whole protocol described herein takes approximately 2 weeks, because dendritic spines are imaged after 16-17 days in vitro, when dendritic development is optimal. After completion of the protocol, dendritic spines can be reconstructed in 3D from series of SIM image stacks using specialized software.

This article describes a working protocol to image dendritic spines from hippocampal neurons in vitro using Structured Illumination Microscopy (SIM). Super-resolution microscopy using SIM provides image resolution significantly beyond the light diffraction limit in all three spatial dimensions, allowing the imaging of individual dendritic spines with improved detail.

Imaging spine dendritiche di Rat Primaria neuroni dell&#39;ippocampo utilizzando Structured Illumination Microscopy

Dendritic spines are protrusions emerging from the dendrite of a neuron and represent the primary postsynaptic targets of excitatory inputs in the brain. ...

Primary Culture of Mouse Dopaminergic Neurons

Dopaminergic neurons represent less than 1% of the total number of neurons in the brain. This low amount of neurons regulates important brain functions such as motor control, motivation, and working memory. Nigrostriatal dopaminergic neurons selectively degenerate in Parkinson&#39;s disease (PD). This progressive neuronal loss is unequivocally associated with the motors symptoms of the pathology (bradykinesia, resting tremor, and muscular rigidity). The main agent responsible of dopaminergic neuron degeneration is still unknown. However, these neurons appear to be extremely vulnerable in diverse conditions. Primary cultures constitute one of the most relevant models to investigate properties and characteristics of dopaminergic neurons. These cultures can be submitted to various stress agents that mimic PD pathology and to neuroprotective compounds in order to stop or slow down neuronal degeneration. The numerous transgenic mouse models of PD that have been generated during the last decade further increased the interest of researchers for dopaminergic neuron cultures. Here, the video protocol focuses on the delicate dissection of embryonic mouse brains. Precise excision of ventral mesencephalon is crucial to obtain neuronal cultures sufficiently rich in dopaminergic cells to allow subsequent studies. This protocol can be realized with embryonic transgenic mice and is suitable for immunofluorescence staining, quantitative PCR, second messenger quantification, or neuronal death/survival assessment.

Dopaminergic neurons play a vital regulatory role in the brain. Their loss is associated with Parkinson's disease. In this video, we show how to generate primary cultures of central dopaminergic neurons from embryonic mouse mesencephalon. Such cultures are useful to study the extreme vulnerability of these neurons to various stresses.

Cultura primario di topo neuroni dopaminergici

Dopaminergic neurons represent less than 1% of the total number of neurons in the brain. This low amount of neurons regulates important brain functions ...

Modeling Neuronal Death and Degeneration in Mouse Primary Cerebellar Granule Neurons

Cerebellar granule neurons (CGNs) are a commonly used neuronal model, forming an abundant homogeneous population in the cerebellum. In light of their post-natal development, abundance, and accessibility, CGNs are an ideal model to study neuronal processes, including neuronal development, neuronal migration, and physiological neuronal activity stimulation. In addition, CGN cultures provide an excellent model for studying different modes of cell death including excitotoxicity and apoptosis. Within a week in culture, CGNs express N-methyl-D-aspartate (NMDA) receptors, a specific ionotropic glutamate receptor with many critical functions in neuronal health and disease. The addition of low concentrations of NMDA in conjunction with membrane depolarization to rodent primary CGN cultures has been used to model physiological neuronal activity stimulation while the addition of high concentrations of NMDA can be employed to model excitotoxic neuronal injury. Here, a method of isolation and culturing of CGNs from 6 day old pups as well as genetic manipulation of CGNs by adenoviruses and lentiviruses are described. We also present optimized protocols on how to stimulate NMDA-induced excitotoxicity, low-potassium-induced apoptosis, oxidative stress and DNA damage following transduction of these neurons.

This protocol describes a simple method for isolating and culturing primary mouse cerebral granule neurons (CGNs) from 6-7 day old pups, efficient transduction of CGNs for loss and gain of function studies, and modelling NMDA-induced neuronal excitotoxicity, low-potassium-induced cell death, DNA-damage, and oxidative stress using the same culture model.

Modellazione di morte neuronale e degenerazione in neuroni cerebellari del granello primario del Mouse

Cerebellar granule neurons (CGNs) are a commonly used neuronal model, forming an abundant homogeneous population in the cerebellum. In light of their ...

Live Images of GLUT4 Protein Trafficking in Mouse Primary Hypothalamic Neurons Using Deconvolution Microscopy

Type 2 diabetes mellitus (T2DM) is a global health crisis which is characterized by insulin signaling impairment and chronic inflammation in peripheral tissues. The hypothalamus in the central nervous system (CNS) is the control center for energy and insulin signal response regulation. Chronic inflammation in peripheral tissues and imbalances of certain chemokines (such as CCL5, TNF&#945;, and IL-6) contribute to diabetes and obesity. However, the functional mechanism(s) connecting chemokines and hypothalamic insulin signal regulation still remain unclear.
In vitro primary neuron culture models are convenient and simple models which can be used to investigate insulin signal regulation in hypothalamic neurons. In this study, we introduced exogeneous GLUT4 protein conjugated with GFP (GFP-GLUT4) into primary hypothalamic neurons to track GLUT4 membrane translocation upon insulin stimulation. Time-lapse images of GFP-GLUT4 protein trafficking were recorded by deconvolution microscopy, which allowed users to generate high-speed, high-resolution images without damaging the neurons significantly while conducting the experiment. The contribution of CCR5 in insulin regulated GLUT4 translocation was observed in CCR5 deficient hypothalamic neurons, which were isolated and cultured from CCR5 knockout mice. Our results demonstrated that the GLUT4 membrane translocation efficiency was reduced in CCR5 deficient hypothalamic neurons after insulin stimulation.

This protocol describes a technique for observation of real-time Green Fluorescence Protein (GFP) tagged Glucose Transporter 4 (GLUT4) protein trafficking upon insulin stimulation and characterization of the biological role of CCR5 in the insulin&#8211;GLUT4 signaling pathway with Deconvolution Microscopy.

Immagini in diretta della proteina GLUT4 tratta di neuroni ipotalamici primario del Mouse usando la microscopia di Deconvolution

Type 2 diabetes mellitus (T2DM) is a global health crisis which is characterized by insulin signaling impairment and chronic inflammation in peripheral ...

Use of Pre-Assembled Plastic Microfluidic Chips for Compartmentalizing Primary Murine Neurons

Microfabricated methods to compartmentalize neurons have become essential tools for many neuroscientists. This protocol describes the use of a commercially available pre-assembled plastic chip for compartmentalizing cultured primary rat hippocampal neurons. These plastic chips, contained within the footprint of a standard microscope slide, are compatible with high-resolution, live, and fluorescence imaging. This protocol demonstrates how to retrograde label neurons via isolated axons using a modified rabies virus encoding a fluorescent protein, create isolated microenvironments within one compartment, and perform axotomy and immunocytochemistry on-chip. Neurons are cultured for &gt;3 weeks within the plastic chips, illustrating the compatibility of these chips for long-term neuronal cultures.

This protocol describes the use of plastic chips to culture and compartmentalize primary murine neurons. These chips are preassembled, user-friendly, and compatible with high-resolution, live, and fluorescence imaging. This protocol describes how to plate rat hippocampal neurons within these chips and perform fluidic isolation, axotomy and immunostaining.

Uso di chip microfluidici plastica pre-assemblato per divisione in compartimenti neuroni primari murini

Microfabricated methods to compartmentalize neurons have become essential tools for many neuroscientists. This protocol describes the use of a ...

Ballistic Labeling of Pyramidal Neurons in Brain Slices and in Primary Cell Culture

It has been reported that the size and shape of dendritic spines is related to their structural plasticity. To identify the morphological structure of pyramidal neurons and dendritic spines, a ballistic labeling technique can be utilized. In the present protocol, pyramidal neurons are labeled with DilC18(3) dye and analyzed using neuronal reconstruction software to assess neuronal morphology and dendritic spines. To investigate neuronal structure, dendritic branching analysis and Sholl analysis are performed, allowing researchers to draw inferences about dendritic branching complexity and neuronal arbor complexity, respectively. The evaluation of dendritic spines is conducted using an automatic assisted classification algorithm integral to the reconstruction software, which classifies spines into four categories (i.e., thin, mushroom, stubby, filopodia). Furthermore, an additional three parameters (i.e., length, head diameter, and volume) are also chosen to assess alterations in dendritic spine morphology. To validate the potential of wide application of the ballistic labeling technique, pyramidal neurons from in vitro cell culture were successfully labeled. Overall, the ballistic labeling method is unique and useful for visualizing neurons in different brain regions in rats, which in combination with sophisticated reconstruction software, allows researchers to elucidate the possible mechanisms underlying neurocognitive dysfunction.

We present a protocol to label and analyze pyramidal neurons, which is critical for evaluating potential morphological alterations in neurons and dendritic spines that may underlie neurochemical and behavioral abnormalities.

Etichettatura balistica dei neuroni piramidali nelle sezioni cerebrali e nella cultura cellulare primaria

It has been reported that the size and shape of dendritic spines is related to their structural plasticity. To identify the morphological structure of ...

Quantifying Spontaneous Ca2+ Fluxes and their Downstream Effects in Primary Mouse Midbrain Neurons

Parkinson&#8217;s disease (PD) is a devastating neurodegenerative disorder caused by the degeneration of dopaminergic (DA) neurons. Excessive Ca2+ influx due to the abnormal activation of glutamate receptors results in DA excitotoxicity and has been identified as an important mechanism for DA neuron loss. In this study, we isolate, dissociate, and culture midbrain neurons from the mouse ventral mesencephalon (VM) of ED14 mouse embryos. We then infect the long-term primary mouse midbrain cultures with an adeno-associated virus (AAV) expressing a genetically encoded calcium indicator, GCaMP6f under control of the human neuron-specific synapsin promoter, hSyn. Using live confocal imaging, we show that cultured mouse midbrain neurons display spontaneous Ca2+ fluxes detected by AAV-hSyn-GCaMP6f. Bath application of glutamate to midbrain cultures causes abnormal elevations in intracellular Ca2+ within neurons and this is accompanied by caspase-3 activation in DA neurons, as demonstrated by immunostaining. The techniques to identify glutamate-mediated apoptosis in primary mouse DA neurons have important applications for the high content screening of drugs that preserve DA neuron health.

Quantifying Spontaneous Ca2+ Fluxes and their Downstream Effects in Primary Mouse Midbrain Neurons

Here we present a protocol to measure in vitro Ca2+ fluxes in midbrain neurons and their downstream effects on caspase-3 using primary mouse midbrain cultures. This model can be employed to study pathophysiologic changes related to abnormal Ca2+ activity in midbrain neurons, and to screen novel therapeutics for anti-apoptotic properties.

Quantificare i flussispontanei di Ca 2 e i loro effetti a valle nei neuroni Midbrain del topo primario

Parkinson&#8217;s disease (PD) is a devastating neurodegenerative disorder caused by the degeneration of dopaminergic (DA) neurons. Excessive Ca2+ influx ...

Live Imaging of the Mitochondrial Glutathione Redox State in Primary Neurons using a Ratiometric Indicator

Mitochondrial redox homeostasis is important for neuronal viability and function. Although mitochondria contain several redox systems, the highly abundant thiol-disulfide redox buffer glutathione is considered a central player in antioxidant defenses. Therefore, measuring the mitochondrial glutathione redox potential provides useful information about mitochondrial redox status and oxidative stress. Glutaredoxin1-roGFP2 (Grx1-roGFP2) is a genetically encoded, green fluorescent protein (GFP)-based ratiometric indicator of the glutathione redox potential that has two redox-state-sensitive excitation peaks at 400 nm and 490 nm with a single emission peak at 510 nm. This article describes how to perform confocal live microscopy of mitochondria-targeted Grx1-roGFP2 in primary hippocampal and cortical neurons. It describes how to assess steady-state mitochondrial glutathione redox potential (e.g., to compare disease states or long-term treatments) and how to measure redox changes upon acute treatments (using the excitotoxic drug N-methyl-D-aspartate (NMDA) as an example). In addition, the article presents co-imaging of Grx1-roGFP2 and the mitochondrial membrane potential indicator, tetramethylrhodamine, ethyl ester (TMRE), to demonstrate how Grx1-roGPF2 can be multiplexed with additional indicators for multiparametric analyses. This protocol provides a detailed description of how to (i) optimize confocal laser scanning microscope settings, (ii) apply drugs for stimulation followed by sensor calibration with diamide and dithiothreitol, and (iii) analyze data with ImageJ/FIJI.

This article describes a protocol to determine differences in basal redox state and redox responses to acute perturbations in primary hippocampal and cortical neurons using confocal live microscopy. The protocol can be applied to other cell types and microscopes with minimal modifications.

Imaging dal vivo dello stato redox del glutatione mitocondriale nei neuroni primari utilizzando un indicatore raziometrico

Mitochondrial redox homeostasis is important for neuronal viability and function. Although mitochondria contain several redox systems, the highly abundant ...