Gli autori desiderano ringraziare Bob Freeman per la formazione e il laboratorio Kirschner per l&#39;utilizzo della struttura rana, ed i membri del laboratorio di Víctor Van per il supporto. Ringraziamo la Nikon Imaging Center della Harvard Medical School per l&#39;assistenza con microscopio ottico per le immagini in Figura 1. Questo lavoro è stato finanziato dal seguente: NRSA NIH comunione e NIH K99 borsa di studio per LAL, Basic Science Partnership finanziamento ( <a href="https://bsp.med.harvard.edu/" target="_blank">https://bsp.med.harvard.edu/</a> ) a AEF, e NIH RO1 NS035909 al DVV

Nota: descrivere la procedura descritta nelle prime due sezioni solo in breve, come protocolli eccellenti con le informazioni dettagliate sono state pubblicate altrove, che si concentrano in particolare su questi passaggi (ad esempio, 8-12). Inoltre, il protocollo generale di lavorare con i neuroni spinali di Xenopus in colture cellulari in tempo reale è stato precedentemente pubblicato in un articolo dettagliato metodi 8. Consigliamo vivamente di rivedere tale articolo come un complemento a questo video, anche se qui ci vengono fornite informazioni sufficienti per eseguire correttamente e risolvere i problemi la dissezione del tubo neurale e il protocollo placcatura al punto 3. 1. Fecondazione in vitro di uova di Xenopus <ol><li> Ottenere le uova di rane femmine che sono stati iniettati con gonadotropina corionica (400 unità / rana) 12-18 ore prima della raccolta delle uova. Raccogliere le uova in una soluzione di Ringer modificato 1X Marc (MMR) (0,1 M di NaCl, 2.0 mM KCl, 1,0 mM MgSO4, 2.0 mM CaCl 2, 5,0 mM di HEPES, pH 7,4) 9. </li><li> Fecondare le uova in vitro con testicoli tritate, come descritto in precedenza 9. </li><li> Dopo almeno 20 minuti, rimuovere embrione coat gelatina incubando embrioni in 2% di cisteina in 1X MMR (portata a pH 7,8 con NaOH) per 3-5 min. Lavare con 0,1 X. MMR (o 0.1X MBS (Modified Saline Barth, 1X ricetta: 88 mM NaCl, 1 mM KCl, 0,7 mM CaCl 2, 1 mM MgSO4, 2.5 mM NaHCO 3, 5 mM HEPES, pH 7,8)) 3 -5 ore e mantengono embrioni a temperatura ambiente fino iniezioni, o se desiderato, embrioni posti a 14-18 ° C per rallentare lo sviluppo. </li></ol> 2. Microiniezione di RNA Nota: mentre si utilizza iniezione di RNA qui, queste tecniche non sono limitati a RNA e DNA, proteine, acidi nucleici o modificati per la manipolazione genetica può essere utilizzata e sono stati descritti in precedenza 12. <ol><li> Prima di sperimentare, RNA per l&#39;etichettatura delle strutture del citoscheletro o altre are trascritto da modelli di DNA linearizzato utilizzando la mMessage mmachine kit (Ambion). mRNA richiedono un 5 &#39;cappello e una 3&#39; di coda di poliadenilazione sulla promozione della traduzione e prevenire il degrado negli embrioni. pCS2 + è un vettore comunemente utilizzato per questo scopo, e il kit di trascrizione comprende un analogo tappo durante la reazione di sintesi. Abbiamo risospendere mRNA trascritto in nucleasi-free DDH 2 0, in concentrazione magazzino tra 500 e 2.000 ng / pl, seguita dalla conservazione pronta a -80 ° C. Prima dell&#39;iniezione, diluire RNA in DDH 2 0 alla concentrazione appropriata per l&#39;iniezione. Come solo un piccolo volume verrà iniettato in embrioni, risospendere in tampone non è necessario. La concentrazione di iniezione finale è tipicamente 50-200 pg / nl, a seconda del costrutto, e di solito si iniettare fino a 4 nl per embrione, sebbene molti laboratori tradizionalmente iniettare fino a 10 nl, che è circa 1% del volume totale di un embrione. RNA può essere tossico a dosi elevate, e la dose per generi embrionilly varia da 10 pg a 1 ng, anche fino a 5 ng può essere tollerata a seconda del particolare gene e purezza. Tuttavia, per la localizzazione di imaging proteine, il livello più basso possibile, deve essere iniettato per evitare sovra-espressione artefatti. RNA per EB1-GFP in questo protocollo viene utilizzato in quantità finale di 250 pg per embrione. </li><li> Preparare aghi da iniezione tirando capillare con un estrattore ago 9, ad un diametro di punta di ~ 0,2 micron. Con un P-87 Sutter estrattore, utilizziamo le seguenti impostazioni: calore 644, tiro 125, velocità 70, ora 250, ma questi parametri variano a seconda della macchina e deve essere regolato dopo aver cambiato il filamento (attualmente si sta adoperando da 2,5 mm filamento casella quadrata che è di 2,5 mm di larghezza). Sotto un microscopio, rompere la punta dell&#39;ago con una pinza ad un angolo di generare una penna, come forma. Esistono altri metodi per rompere e riempimento aghi per iniezione (per esempio 11,12), ma riempire l&#39;ago con RNA ponendo una piccola goccia (0,5 - 1 pl) all&#39;estremità posteriore delago. Per microinjecting in embrioni, ci sono una serie di sistemi di iniezione disponibili in commercio, due dei più comuni è il Pico-iniettore (Medical Systems), e il Nanoject (Drummond scientifico) (vedi 11 per ulteriori informazioni). Usiamo il Medical Systems PLI-100 Pico-iniettore, che utilizza gas compresso digitalmente per un periodo di tempo stabilito per fornire volumi nanolitri coerenti. Volume di iniezione deve essere calibrato per ogni micropipetta nuovo utilizzando un micrometro, e tempo di iniezione deve essere regolata per ottenere quantità desiderata di RNA iniettati. </li><li> Luogo embrioni fecondati in 1 - a 4 cellule in un piatto di plastica contenente il 5% Ficoll in MMR 0,1 X.. Tenendo l&#39;embrione in posizione con le pinze, o l&#39;immissione in possesso di una piattaforma (una maglia di plastica, con una griglia di 1 mm ~, ha aderito al fondo del piatto con la plastilina o cera dentale), iniettare volume desiderato in blastomeri animali (vedi passo 2.1 per i dettagli relativi volumi di iniezione). Distribuire in diversi loczioni tutta embrione, almeno una iniezione in ciascuno dei blastomeri animali, per ottenere una distribuzione più uniforme (per esempio, per un 4-cellula embrionale fase, si iniettano tipicamente 1-2 volte in ogni blastomero, mentre in una cella 2-stadio embrione, si iniettano 2-4 volte in ogni blastomero). Un vantaggio di aspettare fino alla fase 2-4 cellulare è che si assicura l&#39;embrione ha cominciato a fendere normalmente. Tuttavia, se il tempo è l&#39;essenza, si può partire dalla fase 1-cella, con una piccola differenza nel risultato finale diverso da quello che hanno bisogno di più embrioni da iniettare. Embrioni allo stadio anziani può essere utilizzato come bene, e ciò è particolarmente utile se specifici tipi cellulari sono mirati per iniezione, ma come si preferiscono generalmente un&#39;espressione più ampia, si inietta in giovani embrioni per ridurre la necessità di iniezioni più numerosi. </li><li> Trasferimento embrioni iniettati in un piatto di plastica contenente 0,1 X. MMR e permettere loro di sviluppare sino alla fase 20-23 13. Embrioni incubare a 14 a 22 ° C a seconda spe desideratoed di sviluppo. (Per sezionare i tubi neurali il giorno seguente, utilizzare ~ 22 ° C. Per il giorno dopo, usare ~ 14 ° C) </li></ol> 3. Tubo neurale e Dissezione Placcatura <ol><li> Prima di eseguire le dissezioni, preparare i piatti della cultura 14. Primo, coprioggetti cappotto con soluzione abbastanza di 200 ug / ml di poli-lisina in PBS alla piscina sulla superficie del vetrino, di una o Mattek Lab-Tek piastre di coltura, e incubare per un&#39;ora (in alternativa, si potrebbe usare coprioggetto seduta sciolto in una capsula di Petri, per il posizionamento in seguito su vetrini per l&#39;imaging e immunocitochimica). Aspirare e lavare con un eccesso di PBS 3 volte, e lasciare asciugare. Poi i piatti cappotto con 10 mg / ml di laminina in PBS (di solito uso 500 microlitri per coprioggetto, basta mettere in comune su tutta la superficie) per un&#39;ora a 37 gradi. Aspirare soluzione laminina e lavare 3 volte con un eccesso di PBS, facendo attenzione a non far laminina rivestite superfici esposte diventano all&#39;interfaccia aria. Sostituendoe mezzi di coltura con PBS (50% di Ringer, 49% di L-15 supporti, 1% siero fetale bovino, oltre 50 ug / ml di penicillina / streptomicina, gentamicina e pH 7,4 e sterilizzato per filtrazione). (Ringer media, 115 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 2 mM CaCl 2, 10 mM Hepes pH 7.4, 0.5 mM EDTA). Mentre il nostro protocollo utilizza questo supporto, si deve rilevare che si tratta di un supporto comune più ricco per le vecchie culture gangliari della retina di Xenopus, in cui i neuroni hanno ridotto di energia riservati. Giovani culture del midollo spinale si sopravvivere e crescere per più di 24 ore in media Ringers puro, senza altri fattori di crescita, e questo è davvero uno dei vantaggi di utilizzare questo sistema. Opzionale: aggiungere NT3 e BDNF (a concentrazioni finali di 25 ng / ul ciascuno) per terreni di coltura per aumentare la conseguenza assone. </li><li> A causa della variabilità nell&#39;espressione di mRNA iniettato, embrioni possono esibire un mosaico di fluorescenza. Prima di eseguire dissezioni, embrioni di schermo per la presenza di fluorescenza, per identificare questi embrioni expremere la proteina fluorescente fusione nel tubo neurale. Posizionare embrioni allo stadio fluorescenti 20-23 in un piatto di agarosio rivestita di plastica pieno di supporti Steinberg (58 mM NaCl, 0,67 mM KCl, 0,44 mM Ca (NO 3) 2, 1,3 mM MgSO 4, 4,6 mM Tris, pH 7,8 per poi autoclavato) 5. Per rendere l&#39;agarosio rivestita piatto, fondo mano di piatto di plastica con il fuso 1% agarosio a 0,1 X. MMR e lasciare indurire. Ciò fornisce una superficie morbida in modo che non si verifichi danni ai pinza sottile e aghi tungsteno utilizzati durante le fasi successive di dissezione. Dissezione di embrioni di là stadio 23 è possibile, ma è più difficile da tessuti aderiscono più strettamente tra loro e quindi richiedono un trattamento più lungo con collagenasi. </li><li> Sotto un ambito dissezione, rimuovere la membrana vitellina con pinza sottile, e quindi isolare l&#39;intera porzione dorsale dell&#39;embrione, facendo una serie di incisioni. Mentre uno pinza tenere l&#39;embrione in posizione, utilizzare il secondo per fare un&#39;incisione sullalato dell&#39;embrione per esporre l&#39;interno cavo. Quindi, utilizzare entrambe le pinze per stringere lungo il tessuto tra le due metà dorsale e ventrale dell&#39;embrione, quindi riducendo l&#39;embrione a metà per isolare la parte dorsale che contiene il tubo neurale. </li><li> Posizionare l&#39;espianto dorsale in una provetta Eppendorf con 2 mg / ml di collagenasi in mezzi Steinberg per 15-20 minuti su un agitatore, per allentare i tessuti, e quindi espianto pipetta dorsale in una plastica agarosio rivestita piatto con soluzione fresca Steinberg. In alternativa, l&#39;espianto può essere introdotto in una piastra Petri contenente la soluzione di collagenasi per 15 minuti, in cui la dissezione intera potrebbe quindi essere effettuata. </li><li> Usando un paio di pinze, delicatamente sezionare il tubo neurale dall&#39;epidermide dorsale e ventrale della notocorda. Far scorrere la punta della pinza tra l&#39;epidermide e il tessuto sottostante e lentamente tirare indietro l&#39;epidermide, rivelando il tubo neurale sottostante. Quindi, utilizzare uno pinze per tenere il tessuto ed un altro per far scorrere la punta tra l&#39;tubo neurale e notocorda. Infine, utilizzare pinze per rimuovere i somiti su entrambi i lati del tubo. </li><li> Trasferire il tubo neurale ad un agarosio rivestita piatto riempito con terreni di coltura, come descritto al punto 3.1. </li><li> Dopo la raccolta di diversi tubi neurali, tagliarli a pezzi numerosi (circa 20, se il tubo è isolato intero) utilizzando aghi di tungsteno affilati o pinze, e poi piastra i pezzi in capsule di Petri riempite con terreno (preparato secondo il punto 3.1), diffondendo gli espianti in modo uniforme in file. </li><li> Dopo la placcatura, non spostare i piatti, perché questo avrebbe disturbato le cellule di fissaggio. Incubare gli espianti placcati del tubo neurale intorno a 20-22 ° C. Noi di solito lasciano il piatto di cellule in panchina a temperatura ambiente per una notte. Uno dei vantaggi di Xenopus laevis neuroni è che un incubatore per colture cellulari speciale che regola i livelli di CO 2 o di temperatura non è necessaria. Neuriti e coni di crescita può essere osservato e ripreso a temperatura ambiente 12-24 Ore dopo la placcatura, sebbene conseguenza può essere accelerata con l&#39;aggiunta di fattori di crescita. In generale, l&#39;espressione di un RNA o prodotto plasmide comporterà espressione variabile tra le cellule, e quindi non vi può essere una serie di livelli di espressione di fluorescenza tra i coni di crescita. Abbiamo osservato l&#39;espressione di RNA di proteine ​​fluorescenti a persistere oltre 48 ore dopo la placcatura, anche se questo dipende dalla particolare costrutto. </li></ol> 4. Risultati rappresentativi Dopo aver seguito il protocollo, che è riassunta in Figura 1A, sano, corretto espianti-sezionati e coltivate neurali invierà numerosi assoni o neuriti in ogni direzione su laminina / poli-lisina substrato, mostrato nella Figura 1B. I coni di crescita alle estremità degli assoni possono essere esposte da entrambi DIC ottica, come si vede in Figura 1C, alle dinamiche della motilità immagine complessiva, o ad alta risoluzione microscopia a fluorescenza per esaminare la localizzazione di fluorescenza etichetta proteine ​​citoscheletriche, per esempio, EB1-GFP è mostrato in figura 1D. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/4232/4232fig1.jpg" /> Figura 1. Sintesi del protocollo sperimentale e risultati attesi. A) Protocollo di diagramma di flusso. Guarda il filmato per i dettagli riguardanti la dissezione al giorno 3. Il tubo neurale intera deve essere tagliato in circa 20 pezzi della stessa dimensione e la diffusione in modo omogeneo in fila sul coprioggetto. In questo cartone animato, le forbici sono raffigurati per rappresentare il taglio del tessuto con una pinza sottile. CG gonadotropina corionica B) immagine DIC degli assoni o neuriti che crescono di espianto (espianto in alto a sinistra). C) ingrandimenti superiore del cono di crescita a punta di un assone. D) l&#39;immagine di microscopia a fluorescenza EB1-GFP in cono di crescita. Scala bar 10 micron. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/4232/4232fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per ingrandire la figura</a> .

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Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Xenopus laevis espianti neurali inviare neuriti in modo molto robusto per 24 ore dopo placcatura sul laminina / poly-lisina substrato se le condizioni sono appropriate. Con questo substrato, coni di crescita sono altamente mobili e possono raggiungere lunghezze assone fino a 1 mm, si estende in tutte le direzioni verso l&#39;esterno dal espianto, sebbene lunghezze tipiche sono 100 um o più. Se neuriti non crescono fuori, ci sono un numero limitato di ragioni per questo essere il caso. Una possibilità è che g...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome del reagente </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td></tr><tr><td> Gonadotropina corionica </td><td> Argent laboratori chimici </td><td> C-HCG-ON-10 </td></tr><tr><td> Cisteina </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 52-90-4 </td></tr><tr><td> mMessage mmachine kit </td><td> Ambion </td><td> AM1340 </td></tr><tr><td> Capillare Aghi Borosil 1,2 mm (OD) x 0,9 mm (ID) </td><td> FHC </td><td> 30-31-0 </td></tr><tr><td> Ficoll </td><td> Sigma </td><td> F2637 </td></tr><tr><td> Dumont # 5 Biologie Inox Pinze </td><td> Strumenti Scienza Belle </td><td> 11252-20 </td></tr><tr><td> Collagenasi </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 9001-12-1 </td></tr><tr><td> Mattek piatti </td><td> Mat Tek Corporation </td><td> P35G-1.5-14-C </td></tr><tr><td> L-15 </td><td> Invitrogen </td><td> 21083-027 </td></tr><tr><td> Poly-L-lizzane </td><td> Sigma </td><td> P-1399 </td></tr><tr><td> Laminina </td><td> Sigma </td><td> L2020 </td></tr><tr><td> NT3 </td><td> Sigma </td><td> N1905 </td></tr><tr><td> BDNF </td><td> Sigma </td><td> B3795 </td></tr></tbody></table>

neural explant cultures from xenopus laevis

Il complesso processo di orientamento assone è dovuto in gran parte il cono di crescita, che è la struttura dinamica mobili sulla punta l&#39;assone. Durante la conseguenza dell&#39;assone, il cono di crescita deve integrare diverse fonti di informazioni di guida spunto per modulare la sua citoscheletro, al fine di spingere il cono di crescita in avanti e passare a trovare con precisione gli obiettivi specifici 1. Come tale integrazione avviene a livello citoscheletrico è ancora emergente, e l&#39;esame di proteine ​​del citoscheletro e dinamiche effettrici all&#39;interno del cono di crescita può consentire la delucidazione di questi meccanismi. Xenopus laevis coni di crescita sono abbastanza grandi (10-30 micron di diametro) per eseguire elevata -risoluzione di immagini in tempo reale della dinamica del citoscheletro (ad esempio 2-4) e sono facili da isolare e manipolare in un laboratorio rispetto ad altri vertebrati. La rana è un sistema modello classico per gli studi di sviluppo, neurobiologia e importanti intuizioni iniziali in mic cono di crescitadinamiche rotubule sono stati inizialmente trovati con questo sistema 5-7. In questo metodo 8, uova vengono raccolte e fecondati in vitro, iniettato con RNA codifica etichetta fluorescente proteine ​​di fusione o altri costrutti citoscheletro di manipolare l&#39;espressione genica, e poi lasciata sviluppare alla fase tubo neurale. Tubi neurali sono isolati da dissezione e poi sono messi in coltura, e coni di crescita di neuriti che diventano troppo grandi vengono esposte. In questo articolo, si descrive come eseguire questo metodo, il cui obiettivo è quello di cultura di Xenopus laevis coni di crescita per la successiva analisi ad alta risoluzione delle immagini. Mentre forniamo l&#39;esempio della proteina di fusione TIP + EB1-GFP, questo metodo può essere applicato a qualsiasi numero di proteine ​​di chiarire loro comportamenti nel cono di crescita.

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Neural Explant Cultures from Xenopus laevis

Espianti coltura neurali di sezionato<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Embrioni che esprimono proteine ​​di fusione fluorescenti permette l&#39;imaging con la dinamica del citoscheletro cono di crescita.

Culture Explant neurali di<em&gt; Xenopus laevis</em

The complex process of axon guidance is largely driven by the growth cone, which is the dynamic motile structure at the tip of the growing axon. During ...

neural-explant-cultures-from-xenopus-laevis

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neural Explant Cultures from Xenopus laevis

12.5K Views.  Harvard Medical School. Espianti coltura neurali di sezionato Xenopus laevis Embrioni che esprimono proteine ​​di fusione fluorescenti permette l'imaging con la dinamica del citoscheletro cono di crescita.

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Neural-Colony Forming Cell Assay: An Assay To Discriminate Bona Fide Neural Stem Cells from Neural Progenitor Cells

The neurosphere assay (NSA) is one of the most frequently used methods to isolate, expand and also calculate the frequency of neural stem cells (NSCs). Furthermore, this serum-free culture system has also been employed to expand stem cells and determine their frequency from a variety of tumors and normal tissues. It has been shown recently that a one-to-one relationship does not exist between neurosphere formation and NSCs. This suggests that the NSA as currently applied, overestimates the frequency of NSCs in a mixed population of neural precursor cells isolated from both the embryonic and adult mammalian brain. This video practically demonstrates a novel collagen based semi- solid assay, the neural-colony forming cell assay (N-CFCA), which has the ability to discriminate stem from progenitor cells based on their long-term proliferative potential, and thus provides a method to enumerate NSC frequency. In the N-CFCA, colonies &ge;2 mm in diameter are derived from cells that meet all the functional criteria of a NSC, while colonies &lt; 2mm are derived from progenitors. The N-CFCA procedure can be used for cells prepared from different sources including primary and cultured adult or embryonic mouse CNS cells. Here we use cells prepared from passage one neurospheres generated from embryonic day 14 mice brain to perform N-CFCA. The cultures are replenished with proliferation medium every seven days for three weeks to allow the plated cells to exhibit their full proliferative potential and then the frequency of neural progenitor and bona fide neural stem cells is calculated respectively by counting the number of colonies that are &lt; 2mm and the ones that are &ge;2mm in reference to the number of cells that were initially plated.

This video protocol demonstrates how to discriminate and enumerate bona fide neural stem cells in a mixed population of neural precursor cells using the neural colony-forming cell assay.

Neural-formanti colonia saggio Cell: un test per discriminare Bona Fide cellule staminali neurali da cellule progenitrici neurali

The neurosphere assay (NSA) is one of the most frequently used methods to isolate, expand and also calculate the frequency of neural stem cells (NSCs). ...

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Isolation and Culture of Neural Crest Cells from Embryonic Murine Neural Tube

The embryonic neural crest (NC) is a multipotent progenitor population that originates at the dorsal aspect of the neural tube, undergoes an epithelial to mesenchymal transition (EMT) and migrates throughout the embryo, giving rise to diverse cell types 1-3. NC also has the unique ability to influence the differentiation and maturation of target organs4-6. When explanted in vitro, NC progenitors undergo self-renewal, migrate and differentiate into a variety of tissue types including neurons, glia, smooth muscle cells, cartilage and bone. 
NC multipotency was first described from explants of the avian neural tube7-9. In vitro isolation of NC cells facilitates the study of NC dynamics including proliferation, migration, and multipotency. Further work in the avian and rat systems demonstrated that explanted NC cells retain their NC potential when transplanted back into the embryo10-13. Because these inherent cellular properties are preserved in explanted NC progenitors, the neural tube explant assay provides an attractive option for studying the NC in vitro. 
To attain a better understanding of the mammalian NC, many methods have been employed to isolate NC populations. NC-derived progenitors can be cultured from post-migratory locations in both the embryo and adult to study the dynamics of post-migratory NC progenitors11,14-20, however isolation of NC progenitors as they emigrate from the neural tube provides optimal preservation of NC cell potential and migratory properties13,21,22. Some protocols employ fluorescence activated cell sorting (FACS) to isolate a NC population enriched for particular progenitors11,13,14,17. However, when starting with early stage embryos, cell numbers adequate for analyses are difficult to obtain with FACS, complicating the isolation of early NC populations from individual embryos. Here, we describe an approach that does not rely on FACS and results in an approximately 96% pure NC population based on a Wnt1-Cre activated lineage reporter23. 
The method presented here is adapted from protocols optimized for the culture of rat NC11,13. The advantages of this protocol compared to previous methods are that 1) the cells are not grown on a feeder layer, 2) FACS is not required to obtain a relatively pure NC population, 3) premigratory NC cells are isolated and 4) results are easily quantified. Furthermore, this protocol can be used for isolation of NC from any mutant mouse model, facilitating the study of NC characteristics with different genetic manipulations. The limitation of this approach is that the NC is removed from the context of the embryo, which is known to influence the survival, migration and differentiation of the NC2,24-28.

Isolation of embryonic neural crest from the neural tube facilitates the use of in vitro methods for studying migration, self-renewal, and multipotency of neural crest.

Isolamento e la coltura delle cellule della cresta neurale da Embryonic Murine tubo neurale

The embryonic neural crest (NC) is a multipotent progenitor population that originates at the dorsal aspect of the neural tube, undergoes an epithelial to ...

Dissection, Culture, and Analysis of Xenopus laevis Embryonic Retinal Tissue

The process by which the anterior region of the neural plate gives rise to the vertebrate retina continues to be a major focus of both clinical and basic research. In addition to the obvious medical relevance for understanding and treating retinal disease, the development of the vertebrate retina continues to serve as an important and elegant model system for understanding neuronal cell type determination and differentiation1-16. The neural retina consists of six discrete cell types (ganglion, amacrine, horizontal, photoreceptors, bipolar cells, and M&uuml;ller glial cells) arranged in stereotypical layers, a pattern that is largely conserved among all vertebrates 12,14-18.
While studying the retina in the intact developing embryo is clearly required for understanding how this complex organ develops from a protrusion of the forebrain into a layered structure, there are many questions that benefit from employing approaches using primary cell culture of presumptive retinal cells 7,19-23. For example, analyzing cells from tissues removed and dissociated at different stages allows one to discern the state of specification of individual cells at different developmental stages, that is, the fate of the cells in the absence of interactions with neighboring tissues 8,19-22,24-33. Primary cell culture also allows the investigator to treat the culture with specific reagents and analyze the results on a single cell level 5,8,21,24,27-30,33-39. Xenopus laevis, a classic model system for the study of early neural development 19,27,29,31-32,40-42, serves as a particularly suitable system for retinal primary cell culture 10,38,43-45.
Presumptive retinal tissue is accessible from the earliest stages of development, immediately following neural induction 25,38,43. In addition, given that each cell in the embryo contains a supply of yolk, retinal cells can be cultured in a very simple defined media consisting of a buffered salt solution, thus removing the confounding effects of incubation or other sera-based products 10,24,44-45.
However, the isolation of the retinal tissue from surrounding tissues and the subsequent processing is challenging. Here, we present a method for the dissection and dissociation of retinal cells in Xenopus laevis that will be used to prepare primary cell cultures that will, in turn, be analyzed for calcium activity and gene expression at the resolution of single cells. While the topic presented in this paper is the analysis of spontaneous calcium transients, the technique is broadly applicable to a wide array of research questions and approaches (Figure 1).

Dissection, Culture, and Analysis of Xenopus laevis Embryonic Retinal Tissue

Xenopus laevis provides an ideal model system for studying cell fate specification and physiological function of individual retinal cells in primary cell culture. Here we present a technique for dissecting retinal tissues and generating primary cell cultures that are imaged for calcium activity and analyzed by in situ hybridization.

Dissezione, Cultura, e analisi di<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Tessuto embrionale della retina

The process by which  the anterior region of the neural plate gives rise to the vertebrate retina  continues to be a major focus of both clinical and ...

Simultaneous Pre- and Post-synaptic Electrophysiological Recording from Xenopus Nerve-muscle Co-cultures

Much information about the coupling of presynaptic ionic currents with the release of neurotransmitter has been obtained from invertebrate preparations, most notably the squid giant synapse1. However, except for the preparation described here, few vertebrate preparations exist in which it is possible to make simultaneous measurements of neurotransmitter release and presynaptic ionic currents. Embryonic Xenopus motoneurons and muscle cells can be grown together in simple culture medium at room temperature; they will form functional synapses within twelve to twenty-four hours, and can be used to study nerve and muscle cell development and synaptic interactions for several days (until overgrowth occurs). Some advantages of these co-cultures over other vertebrate preparations include the simplicity of preparation, the ability to maintain the cultures and work at room temperature, and the ready accessibility of the synapses formed2-4. The preparation has been used widely to study the biophysical properties of presynaptic ion channels and the regulation of transmitter release5-8. In addition, the preparation has lent itself to other uses including the study of neurite outgrowth and synaptogenesis9-12, molecular mechanisms of neurotransmitter release13-15, the role of diffusible messengers in neuromodulation16,17, and in vitro synaptic plasticity18-19.

Simultaneous Pre- and Post-synaptic Electrophysiological Recording from Xenopus Nerve-muscle Co-cultures

This video demonstrates the procedures used to grow primary cultures of embryonic Xenopus nerve and muscle cells and the usefulness of this preparation for making simultaneous pre- and post-synaptic patch clamp recordings.

Simultanea di pre-e post-sinaptica registrazione elettrofisiologica da<em&gt; Xenopus</em&gt; Nervo-muscolo Co-colture

Much information about the coupling of  presynaptic ionic currents with the release of neurotransmitter has been obtained  from invertebrate preparations, ...

One Mouse, Two Cultures: Isolation and Culture of Adult Neural Stem Cells from the Two Neurogenic Zones of Individual Mice

The neurosphere assay and the adherent monolayer culture system are valuable tools to determine the potential (proliferation or differentiation) of adult neural stem cells in vitro. These assays can be used to compare the precursor potential of cells isolated from genetically different or differentially treated animals&#160;to determine the effects of exogenous factors on neural precursor cell proliferation and differentiation and to generate neural precursor cell lines that can be assayed over continuous passages. The neurosphere assay is traditionally used for the post-hoc identification of stem cells, primarily due to the lack of definitive markers with which they can be isolated from primary tissue&#160;and has the major advantage of giving a quick estimate of precursor cell numbers in brain tissue derived from individual animals. Adherent monolayer cultures, in contrast, are not traditionally used to compare proliferation between individual animals, as each culture is generally initiated from the combined tissue of between 5-8 animals. However, they have the major advantage that, unlike neurospheres, they consist of a mostly homogeneous population of precursor cells and are useful for following the differentiation process in single cells. Here, we describe, in detail, the generation of neurosphere cultures and, for the first time, adherent cultures from individual animals. This has many important implications including paired analysis of proliferation and/or differentiation potential in both the subventricular zone (SVZ) and dentate gyrus (DG) of treated or genetically different mouse lines, as well as a significant reduction in animal usage.

Here we describe a detailed protocol for the simultaneous generation of neural precursor cell cultures, as either adherent monolayers or neurospheres, from the subventricular zone and dentate gyrus of individual adult mice.

Un mouse, due culture: isolamento e la coltura di Adult Neural Stem Cells dalle due zone neurogena Mice individuale

The neurosphere assay and the adherent monolayer culture system are valuable tools to determine the potential (proliferation or differentiation) of adult ...

A Simple Behavioral Assay for Testing Visual Function in Xenopus laevis

Measurement of the visual function in the tadpoles of the frog, Xenopus laevis, allows screening for blindness in live animals. The optokinetic response is a vision-based, reflexive behavior that has been observed in all vertebrates tested. Tadpole eyes are small so the tail flip response was used as alternative measure, which requires a trained technician to record the subtle response. We developed an alternative behavior assay based on the fact that tadpoles prefer to swim on the white side of a tank when placed in a tank with both black and white sides. The assay presented here is an inexpensive, simple alternative that creates a response that is easily measured. The setup consists of a tripod, webcam and nested testing tanks, readily available in most Xenopus laboratories. This article includes a movie showing the behavior of tadpoles, before and after severing the optic nerve. In order to test the function of one eye, we also include representative results of a tadpole in which each eye underwent retinal axotomy on consecutive days. Future studies could develop an automated version of this assay for testing the vision of many tadpoles at once.

A Simple Behavioral Assay for Testing Visual Function in Xenopus laevis

Xenopus laevis tadpoles prefer swimming on the white side of a black/white tank. This behavior is guided by their vision. Based on this behavior, we present a simple assay to test the visual function of tadpoles.

Un test comportamentale semplice for Testing Funzione visiva in<em&gt; Xenopus laevis</em

Measurement of the visual function in the tadpoles of the frog, Xenopus laevis, allows screening for blindness in live animals. The optokinetic response ...

Recording Temperature-induced Neuronal Activity through Monitoring Calcium Changes in the Olfactory Bulb of Xenopus laevis

The olfactory system, specialized in the detection, integration and processing of chemical molecules is likely the most thoroughly studied sensory system. However, there is piling evidence that olfaction is not solely limited to chemical sensitivity, but also includes temperature sensitivity. Premetamorphic Xenopus laevis are translucent animals, with protruding nasal cavities deprived of the cribriform plate separating the nose and the olfactory bulb. These characteristics make them well suited for studying olfaction, and particularly thermosensitivity. The present article describes the complete procedure for measuring temperature responses in the olfactory bulb of X. laevis larvae. Firstly, the electroporation of olfactory receptor neurons (ORNs) is performed with spectrally distinct dyes loaded into the nasal cavities in order to stain their axon terminals in the bulbar neuropil. The differential staining between left and right receptor neurons serves to identify the &#947;-glomerulus as the only structure innervated by contralateral presynaptic afferents. Secondly, the electroporation is combined with focal bolus loading in the olfactory bulb in order to stain mitral cells and their dendrites. The 3D brain volume is then scanned under line-illumination microscopy for the acquisition of fast calcium imaging data while small temperature drops are induced at the olfactory epithelium. Lastly, the post-acquisition analysis allows the morphological reconstruction of the thermosensitive network comprising the &#947;-glomerulus and its innervating mitral cells, based on specific temperature-induced Ca2+ traces. Using chemical odorants as stimuli in addition to temperature jumps enables the comparison between thermosensitive and chemosensitive networks in the olfactory bulb.

Recording Temperature-induced Neuronal Activity through Monitoring Calcium Changes in the Olfactory Bulb of Xenopus laevis

Here we describe a protocol for measuring and analyzing temperature responses in the olfactory bulb of Xenopus laevis. Olfactory receptor neurons and mitral cells are differentially stained, after which calcium changes are recorded, reflecting a sensitivity of some neural networks in the bulb to temperature drops induced at the nose.

Registrazione neuronale attività Temperatura indotta attraverso il monitoraggio dei cambiamenti di calcio nel bulbo olfattivo di<em&gt; Laevis Xenopus</em

The olfactory system, specialized in the detection, integration and processing of chemical molecules is likely the most thoroughly studied sensory system. ...

Derivation of Leptomeninges Explant Cultures from Postmortem Human Brain Donors

Even though great progress has been made in the clinical characterization of Parkinson&#39;s disease, several studies report that the diagnosis of Parkinson&#39;s disease is not pathologically confirmed in up to 25% of clinically diagnosed Parkinson&#39;s disease. Therefore, tissue collected from clinically diagnosed patients with idiopathic Parkinson&#39;s disease can have a high rate of misdiagnosis; hence in vitro studies from such tissues to study Parkinson&#39;s disease as a preclinical model can become futile.
By collecting postmortem human leptomeninges with a confirmed neuropathological diagnosis of Parkinson&#39;s disease and characterized by nigrostriatal cell loss and intracellular protein inclusions called Lewy bodies, one can be certain that clinically observed parkinsonism is not caused by another underlying disease process (e.g. tumor, arteriosclerosis).
This protocol presents the dissection and preparation of postmortem human leptomeninges for derivation of a meningeal fibroblast culture. This procedure is robust and has a high success rate. The challenge of the culture is sterility as the brain procurement is generally not performed under sterile conditions. Therefore, it is important to supplement the culture media with a cocktail of penicillin, streptomycin, and amphotericin B.
The derivation of meningeal fibroblasts from autopsy-confirmed cases with Parkinson&#39;s disease provides the foundation for in vitro modeling of Parkinson&#39;s disease. Meningeal fibroblasts appear 3-9 days after sample preparation and about 20-30 million cells can be cryopreserved in 6-8 weeks. The meningeal fibroblast culture is homogenous and the cells express fibronectin, a commonly used marker to identify meninges.

The leptomeninges explant culture protocol from human postmortem brain is a technically robust and simple way to derive fibronectin-positive meningeal fibroblasts within 6-8 weeks and cryopreserve approximately 20-30 million cells.

Derivazione delle Culture leptomeningi Explant da Postmortem cervello umano donatori

Even though great progress has been made in the clinical characterization of Parkinson&#39;s disease, several studies report that the diagnosis of ...

Time-dependent Increase in the Network Response to the Stimulation of Neuronal Cell Cultures on Micro-electrode Arrays

Micro-electrode arrays (MEAs) can be used to investigate drug toxicity, design paradigms for next-generation personalized medicine, and study network dynamics in neuronal cultures. In contrast with more traditional methods, such as patch-clamping, which can only record activity from a single cell, MEAs can record simultaneously from multiple sites in a network, without requiring the arduous task of placing each electrode individually. Moreover, numerous control and stimulation configurations can be easily applied within the same experimental setup, allowing for a broad range of dynamics to be explored. One of the key dynamics of interest in these in vitro studies has been the extent to which cultured networks display properties indicative of learning. Mouse neuronal cells cultured on MEAs display an increase in response following training induced by electrical stimulation. This protocol demonstrates how to culture neuronal cells on MEAs; successfully record from over 95% of the plated dishes; establish a protocol to train the networks to respond to patterns of stimulation; and sort, plot, and interpret the results from such experiments. The use of a proprietary system for stimulating and recording neuronal cultures is demonstrated. Software packages are also used to sort neuronal units. A custom-designed graphical user interface is used to visualize post-stimulus time histograms, inter-burst intervals, and burst duration, as well as to compare the cellular response to stimulation before and after a training protocol. Finally, representative results and future directions of this research effort are discussed.

Mouse neuronal cells cultured on multi-electrode arrays display an increase in response following electrical stimulation. This protocol demonstrates how to culture neurons, how to record activity, and how to establish a protocol to train the networks to respond to patterns of stimulation.

Aumento del tempo della risposta alla rete alla stimolazione delle colture cellulari neuronali sulle matrici di microelettrodi

Micro-electrode arrays (MEAs) can be used to investigate drug toxicity, design paradigms for next-generation personalized medicine, and study network ...

Simultaneous Recordings of Cortical Local Field Potentials, Electrocardiogram, Electromyogram, and Breathing Rhythm from a Freely Moving Rat

Monitoring the physiological dynamics of the brain and peripheral tissues is necessary for addressing a number of questions about how the brain controls body functions and internal organ rhythms when animals are exposed to emotional challenges and changes in their living environments. In general experiments, signals from different organs, such as the brain and the heart, are recorded by independent recording systems that require multiple recording devices and different procedures for processing the data files. This study describes a new method that can simultaneously monitor electrical biosignals, including tens of local field potentials in multiple brain regions, electrocardiograms that represent the cardiac rhythm, electromyograms that represent awake/sleep-related muscle contraction, and breathing signals, in a freely moving rat. The recording configuration of this method is based on a conventional micro-drive array for cortical local field potential recordings in which tens of electrodes are accommodated, and the signals obtained from these electrodes are integrated into a single electrical board mounted on the animal's head. Here, this recording system was improved so that signals from the peripheral organs are also transferred to an electrical interface board. In a single surgery, electrodes are first separately implanted into the appropriate body parts and the target brain areas. The open ends of all of these electrodes are then soldered to individual channels of the electrical board above the animal's head so that all of the signals can be integrated into the single electrical board. Connecting this board to a recording device allows for the collection of all of the signals into a single device, which reduces experimental costs and simplifies data processing, because all data can be handled in the same data file. This technique will aid the understanding of the neurophysiological correlates of the associations between central and peripheral organs.

This study introduces a method for the simultaneous recording of local field potentials in the brain, electrocardiograms, electromyograms, and breathing signals of a freely moving rat. This technique, which reduces experimental costs and simplifies data analysis, will contribute to the understanding of the interactions between the brain and peripheral organs.

Registrazioni simultanee di potenziali di campo locale corticale, elettrocardiogramma, elettromiogramma e respirazione ritmo da un ratto liberamente commovente

Monitoring the physiological dynamics of the brain and peripheral tissues is necessary for addressing a number of questions about how the brain controls ...