Questo lavoro è stato parzialmente finanziato da sovvenzioni dal National Institutes of Health (HL105114, HL088391, NS066652, e HL068878 a YEC), l&#39;American Heart Association (National Scientist Development 0835237N a JZ). YEC è sostenuto finanziariamente come dotato di Federico Huetwell Professore di Medicina Cardiovascolare presso l&#39;Università del Michigan Medical Center (UMMC). Questo lavoro utilizzato Core Services supportati dal Center for Advanced Models per le Scienze e traslazionale Therapeutics (CAMTraST) a UMMC.

Tutte le procedure di manutenzione degli animali, la cura e l&#39;uso sono stati esaminati e approvati dal Comitato Università sull&#39;uso e la cura degli animali della University of Michigan. 1. ZFN Progettazione e Selezione <ol><li> Fornire le informazioni di sequenza genomica del gene di interesse (ad es coniglio ApoCIII) al fabbricante. Selezionare set ZFN (s) per gli esperimenti sulla base dei punteggi ZFN. </li></ol> 2. Coniglio Embryo Collection <ol><li> Superovulate sessualmente maturata (6-18 mesi) New Zealand White (NZW) coniglie per via sottocutanea (sc) iniezione di FSH due volte / die con un dosaggio di 3 mg per i primi due conferimenti, 5 mg per i prossimi due iniezioni e 6 mg per gli ultimi due iniezioni. </li><li> Somministrare una singola (iv) l&#39;iniezione endovenosa di 200 IU hCG a 72 ore dopo la prima iniezione FSH per indurre l&#39;ovulazione. Mate le femmine superovulate con un coniglio maschio subito dopo l&#39;iniezione di hCG. </li><li> Euthanize conigli donatori superovulate con sodio pentobarbital (150 mg / kg, iv) a 16-18 hr posto inseminazione (psi). </li><li> Recuperare le ampolle oviduct raccogliendo attentamente l&#39;intero ovidotti e ovaie struttura. </li><li> Scarica ogni oviduct con la manipolazione 10 ml di mezzo di tamponata con HEPES TCM 199 supplementato con siero bovino fetale al 10%, iniettando il mezzo dall&#39;estremità utero dell&#39;ovidotto. Raccogliere il mezzo arrossato all&#39;apertura ovaio-end dell&#39;ovidotto ad una piastra di Petri. </li><li> Osservare e identificare gli embrioni recuperati nel mezzo arrossato, lavare gli embrioni tre volte nel mezzo di manipolazione, tenerli nel mezzo di manipolazione a 38,5 ° C in aria, e osservare allo stereomicroscopio per il verificarsi di fecondazione. Preparazione per la microiniezione su embrioni pronuclei palco 19-21 h psi </li></ol> 3. Preparazione di ZFN mRNA <ol><li> Purificare il mRNA risultante prima risospensione in RNasi-free 0,1 X. TE (1 mM Tris-Cl pH8,0, 0,1 mM EDTA). Misurare la concentrazione e memorizzare l&#39;mRNA a -80 ° C fino all&#39;utilizzo. </li><li> Preparare gli mRNA codificanti ZFN coppia (4-10 ng / ml in 1 mMTris-Cl, 0,1 mM EDTA a pH 7.5), un&#39;aliquota in 10 fiale microlitri. Conservarli a -80 ° C fino al momento dell&#39;uso. Prima di microiniezione, scongelare il flaconcino RNA (s), e tenerlo in ghiaccio. </li></ol> 4. Embrione microiniezione <ol><li> Preparare la piattaforma microiniezione mettendo una goccia 5 ml di mezzo di manipolazione su un vetrino camera 1-bene che ha la camera di supporto rimossa. Coprire il calo medio con olio minerale e posto sul palco microscopio riscaldata. </li><li> Pipetta possesso (120 micron di diametro) nel braccio titolare del micromanipolatore e posizionarlo nella goccia di mezzo manipolazione. </li><li> Realizzare micropipette iniezione da riscaldamento e tirando tubi capillari in vetro borosilicato in un dispositivo micropipetta estrattore. Caricare il mRNA da iniettare nella pipetta di iniezione. </li><li>Accendere l&#39;aria compressa che è collegato ad un microinjector. </li><li> Pipetta iniezione nel supporto di iniezione, metterlo sul micromanipolatore e posizionarlo nella goccia di mezzo manipolazione. </li><li> Impostare il microinjector, con i seguenti parametri suggeriti: holdP = 2 psi, InjP = 20 psi, ClearP = 60 psi, Injtime = 1 sec, che si tradurrà in un volume di iniezione di 1-5 pl. </li><li> Aprire la punta della pipetta di iniezione picchiettando delicatamente contro la pipetta azienda. </li><li> Trasferire embrioni (30-50) al calo micromanipolazione sulla piattaforma. Utilizzare la pipetta azienda per catturare un embrione e allineare l&#39;ago per l&#39;iniezione, embrioni e la pipetta tenuta lungo l&#39;asse x. </li><li> Sotto 400X, avanzare la pipetta di iniezione attraverso l&#39;embrione. Fare attenzione a evitare il nucleo. Una volta che la membrana plasmatica è trafitto, premere il pedale del piede per iniettare. Dopo l&#39;iniezione, ritirare l&#39;ago, rilasciare l&#39;embrione. Ripetere la procedura per tutti em rimanentibryos. </li><li> Lavare embrioni iniettati tre volte in embrione terreno di coltura, che consiste in soluzione salina bilanciata di Earle (EBSS) supplementato con amminoacidi non essenziali (NEAA), amminoacidi essenziali (EAA), 1 mM L-glutammina, piruvato di sodio 0,4 mM, e 10% FBS. </li><li> Incubare embrioni a 38,5 ° C in 5% CO 2 in aria per 1-2 ore prima di essere chirurgicamente trasferiti nei ovidotti di un destinatario sincronizzato femmina NZW coniglio (vedere la fase 5.1). In alternativa, la cultura gli embrioni fino a raggiungere stadio di blastocisti prima di essere utilizzati per la validazione in vitro o saggi. </li></ol> 5. Embryo Transfer <ol><li> Selezionare una femmina di coniglio NZW 5-12 mesi di età, in buona salute, del peso di ca. 4,0-5,0 kg come destinatario degli animali. Somministrare rilasciante le gonadotropine (GnRH) intramuscolare iniezione (im, 50 mcg / ml, 0,3 ml / animale) al destinatario nello stesso punto temporale con quella di hCG iniezione al donatore (s) (vedi passo 2.2). </li&gt; <li> Dopo il completamento della microiniezione, preparare il coniglio destinatario per il trasferimento dell&#39;embrione (normalmente 16-24 ore dopo l&#39;iniezione GnRH). Anestetizzare il coniglio con 10-40 mg / kg di ketamina (im), e / o vaporizzato isoflurano (2-4%) per inalazione. Proteggere gli occhi dei conigli da eccessivo essiccamento mediante l&#39;applicazione di una pomata oftalmica sterile. Osservare l&#39;animale fino a quando non è completamente inconscio, vale a dire. non risponde ai riflessi pedale, stringendo il rilievo del piede viene utilizzata per controllare per mancanza di pedale riflesso che è un&#39;indicazione di anestesia adeguata. </li><li> Shave addome del coniglio, lavare con scrub antisettico, seguita da soluzione antisettica, e pulire la zona rasata con spugne garza sterile. </li><li> Eseguire un intervento chirurgico in condizioni sterili, registrare i segni vitali del coniglio destinatario circa ogni 15 min durante l&#39;intervento chirurgico. </li><li> Trasferire 10-25 embrioni a un destinatario animale, a seconda del numero disponibile di embrioni. </li><li> Alla fine delprocedure chirurgiche, chiudono lo strato muscolare con rivestito sutura riassorbibile. Suturare la pelle o con una sutura intradermica con sutura riassorbibile o con semplici suture cutanee interrotti mediante sutura nonabsorable (ad es monofilo di nylon o simile). </li><li> Tenere il caldo animale e monitorarlo fino alla sua decubito sternale è raggiunto. </li><li> Monitorare l&#39;animale al giorno. Seguire le istruzioni del veterinario per la cura per l&#39;animale. Somministrare meloxicam (sc 1,0 mg / kg) per alleviare il dolore e / o ridurre la febbre operazione di post al giorno, se ritenuto necessario dal veterinario. </li><li> Rimuovere suture cutanee nonabsorable a circa 10-14 giorni dopo l&#39;operazione. </li></ol> 6. Rilevamento di ZFN indotta Turbativa Gene <ol><li> Per validazione in vitro, eseguire la genotipizzazione sulle embrioni coltivati ​​in vitro. Lisare embrioni singoli che si sono sviluppati a tappe morula / blastocisti in 5 ml soluzione NP40 (1% NP40 più 1 ug / ml proteinasi K in Taq Buffer) Per 0,5-1 ore a 55 ° C e 10 min a 95 ° C. </li><li> Per la genotipizzazione della prole, raccogliere campioni di pelle dell&#39;orecchio da kit neonati, estrarre il DNA genomico, e li usa come modelli per PCR sequenziamento. Applicare Kwik-Stop per la zona di campionamento dopo la raccolta per fermare l&#39;emorragia e ridurre il disagio. </li><li> Utilizzare la lisi dal punto 6.2 o 6.3 come stampo per la PCR utilizzando LA-Taq PCR e coppia di primer, che si trovano a monte (5&#39;-TGAGGCCGGGAAGGGAGCAGTCG-3 &#39;) ed a valle (5&#39;-GCCAGGCCCACCCACGGAACAGC-3&#39;) del sito bersaglio ZFN . </li><li> Purificare prodotti di PCR e di sequenza con la sequenza di primer (5&#39;-TCTGCACGCTTGGGGCTGGAG-3 &#39;). </li><li> Identificare i campioni mutanti, cercando di doppia curva nel diagramma di sequenza attorno al targeting per sito. Etichettare quelli con curve doppie come &quot;positivo&quot;. </li><li> Clonare i prodotti di PCR &quot;positivi&quot; in TA vettore di clonazione, raccogliere 10-20 cloni, sequenza gli inserti, e confermare le mutazioni in tutto il tsito argeting. </li></ol>

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Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Nel presente lavoro, cinque conigli ApoCIII KO sono stati generati utilizzando la tecnologia ZFN. In precedenza l&#39;unico rapporto della produzione di conigli GTT utilizzato anche la tecnologia ZFN 18. Il presente lavoro ha confermato che ZFN è utile per raggiungere in modo efficace i geni nei conigli. Nel presente studio, il tasso di transgenico (kit positivo / totale nato) is23.8% (5/21), che è paragonabile a quello della precedente relazione ZFN nei conigli (30,8%, 16/52) 18, e quelli segnalati di utilizzare ZFN in altre specie animali, tra cui pesce zebra 19, 20 topi, ratti e maiali 21 17. Questo tasso è infatti superiore ai tassi di molti studi di produzione coniglio transgenico tradizionali, che normalmente rientrano nel range del 5-20%. Ad esempio, nel tentativo di prodotto ApoCIII conigli transgenici mediante microiniezione di DNA convenzionali, Ding et al. Ottenuto 3 fondatori positivi su 54 cuccioli nati (5,6%) 22. Coerentemente con i risultati precedenti, le mutazioni nei siti di targeting sono variabili, tra cui delezioni o inserzioni costituiti da un diverso numero di basi (che vanno 1-21 in cinque conigli KO). Sulla base delle informazioni di sequenza specifica degli animali fondatori, si prevede che almeno quattro (cioè. Quelli contenenti Δ1, +1, +1, o Δ20 mutazioni) avrebbe perdita di funzionalità della ApoCIII. R-16 animale con Δ21 non può visualizzare perdita funzionale, in quanto questa mutazione è previsto per solo causare la perdita di sette amminoacidi, ma non un cambiamento reading frame. In ultima analisi, saggi fenotipo sono necessari per determinare se questi animali fondatori veramente mostrano la perdita delle funzioni ApoCIII. Nessuno dei cinque conigli KO generati nel presente studio contiene modifiche biallelici. È interessante notare che questo è anche il caso nella precedente relazione coniglio ZFN. Al contrario, quando ZFNs rivolti α1 ,3-galattosiltransferasi stati applicati al maialecellule, la frequenza di mira un singolo allele variava 7-46%, con circa un terzo dei creando mutazioni passo singolo biallelica Fori a sfondare 23. Coerentemente, quando TALEN è stato applicato a cellule di fibroblasti maiale, le modifiche biallelici trovata in circa 15-40% del totale dei cloni positivi 14. E &#39;possibile che la mancata produzione conigli KO biallelici nel presente studio può indicare una differenza specie (cioè conigli vs suini) per tale capacità di nucleasi basato gene targeting. È tuttavia più probabile che questo è semplicemente perché il numero di conigli KO generati in questo progetto è relativamente piccola. Noi crediamo che ZFN è in grado di generare mutazioni bialleic nei conigli, che dovrebbero essere considerati come un altro potenziale vantaggio della produzione di coniglio GTT basata ZFN. Ulteriori esperimenti sono necessari per confermare tale capacità di ZFN nei conigli. In conclusione, il presente lavoro dimostra che ZGenica basata FN approccio mirato è efficace nel produrre conigli KO. In particolare, abbiamo generato cinque conigli ApoCIII KO con un tasso transgenico soddisfacente del 23,8%. Questi animali si ritiene di fornire informazioni più significative sul ruolo di questa proteina sul metabolismo dei lipidi nell&#39;uomo rispetto ai corrispondenti modelli del mouse. Prevediamo il targeting genica basata ZFN, così come altre tecnologie nucleasi based come TALEN e RGEN, negli animali nonmurine faciliterà notevolmente lo sviluppo di nuovi modelli animali per studiare varie malattie umane. <img alt="Figura 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50957/50957fig1.jpg" width="500px" /> Figura 1. Diagramma di flusso della produzione di conigli eliminazione diretta utilizzando la tecnologia ZFN. Produzione di conigli KO con tecnologia ZFN inizia con la selezione del gene di interesse. Le informazioni di sequenza viene fornito, set ZFN sono progettati e Subjette a base di lievito di convalida in casa. Al punto di controllo (CP) 1 (CP-1), solo i set passati di convalida in casa (50% o superiore del controllo interno positivo) saranno forniti agli utenti per la selezione. Se nessun set passano CP-1, sequenza aggiuntiva può essere necessario per la progettazione di efficaci set ZFN. Una convalida embrione in vitro è seguito per assicurare il set ZFN selezionato può indurre mutazioni in siti selezionati (CP-2). Set ZFN (s) sarà usato solo se passa CP-2 (&gt; = 10% i tassi di mutazione in embrioni in vitro). Guasto al CP-2 richiederà una riprogettazione dei set ZFN. I donatori di embrioni saranno preparati ed embrioni pronuclei fase saranno microiniettati con i set ZFN convalidati. Questi embrioni microiniettati saranno trasferiti ai destinatari embrione sincronizzati. Dopo periodo di un mese di gestazione, neonati saranno genotipizzati (CP-3). Se nessuno dei neonati sono positivi, verrà eseguita microiniezione supplementare. Ci vogliono 2-3 mesi dall&#39;inizio del progetto alla CP-2, assumendo no guasto durante il processo. Ci vogliono altri 2-3 mesi dalla CP-2 per CP-3. Pertanto è possibile generare un coniglio ko in un arco di tempo di 4-6 mesi utilizzando la tecnologia ZFN. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50957/50957fig1highres.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere l&#39;immagine ingrandita</a> . <img alt="Figura 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50957/50957fig2.jpg" width="500px" /> Figura 2. Disegno ZFN. Tre set ZFN (Set 1, 2, e 3) sono stati progettati mira diverse sequenze di Exon 1 o Exon 2 di coniglio ApoCIII (A). Tutti e tre i gruppi sono stati sottoposti al lievito MEL-1 giornalista test per determinare le attività ZFN. Secondo protocolli del produttore, ZFNs che mostrano attività&gt; 50% di quella del controllo positivo interno della fabbricazione sono considerati utili per in vitro e in vivo genoma esperimenti di editing.Le attività ZFN erano 224,2% per Set 1, 196,9% per Set 2 e 177,8% per Set 3 (B), quindi Set 1 è stato selezionato nel presente studio. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50957/50957fig2highres.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere l&#39;immagine ingrandita</a> . <img alt="Figura 3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50957/50957fig3.jpg" width="500px" /> Figura 3. In vitro convalida embrione di ZFN. L&#39;mRNA (5 pg / ml) di Set 1 è stato microiniettati al citoplasma di 35 embrioni pronuclei fase di coniglio (A). Embrioni cancellato senza trattamento microiniezione (n = 31) sono stati utilizzati come gruppo di controllo. Il tasso di sviluppo BL era 77,4% nel gruppo di controllo. Nel gruppo microiniezione, il tasso di BL è stata del 51,4%. 16 BL sottoposti a PCR sequenziamento, 8 (50%) sono stati identificati come positivi, indicando Set 1 è un set ZFN efficace per indurre mutazioni al targesito ting (B, apoc3wt.seq, black-boxed), del ApoCIII nei conigli. La BLS contenenti mutazioni sono BL # Ap-3, 4, 5, 7, 11, 13, 15, e 17 (B, rosso sottolineate). I restanti BL (# Ap-2, 6, 9, 10, 12, 14 e 16) non hanno mutazioni presso il targeting per sito. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50957/50957fig3highres.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere l&#39;immagine ingrandita</a> . <img alt="Figura 4" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50957/50957fig4.jpg" width="500px" /> Figura 4. La produzione di conigli ApoCIII KO. Cento e quarantacinque embrioni microiniettati con ZFN Set 1 mRNA sono stati trasferiti a 7 conigli destinatario pseudo-gravidanza (A). Embrioni appena lavata (n = 75) senza ZFN microiniezione sono state trasferite a destinatari (n = 6) come gruppo di controllo. Il tasso di termine calcolato come kit totale termine / embrioni totali nel gruppo dell&#39;esperimento è di 14.5% (21/145), mentre il tasso è del 29,3% (22/75) nel gruppo di controllo (A). Su 21 kit nati nel gruppo microiniezione, cinque (R1, R9, R11, R12 e R16), dopo PCR sequenziamento (B) sono stati identificati come i kit positive KO. I indels presso il targeting per sito comprendono due inserimenti (+1 per entrambi R9 e R11) e tre eliminazioni (Δ1, Δ 20, Δ 21 per R1, R12 e R16, rispettivamente). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50957/50957fig4highres.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere l&#39;immagine ingrandita</a> .

Apolipoproteina (Apo) C-III (ApoCIII) è una piccola proteina secretoria O-glicosilata che viene sintetizzata principalmente nel fegato e nell&#39;intestino. Esso risiede sulla superficie del plasma chilomicroni (CM), lipoproteine ​​a bassissima densità (VLDL) e lipoproteine ​​ad alta densità (HDL). ApoCIII è stata riconosciuta come un fattore di rischio per la malattia cardiovascolare 1. I pazienti con deficit ereditario di ApoCIII hanno un basso trigliceridi (TG) i livelli e riduzione subclinica coronarica aterosclerosi 2,3. Veduta livello ApoCIII plasma, d&#39;altra parte, spesso correlata alla resistenza all&#39;insulina, obesità, e ipertrigliceridemia (HTG) 4,5. Gene knockout (KO) è un potente mezzo per studiare la funzione di un gene. Coerentemente con le osservazioni in popolazioni mutanti umani, knockout del gene ApoCIII nei topi ha portato ad una riduzione del plasma TG e protezione da HTG postprandiale 6. Tale ruolo positivo di ApoCIII apparveessere indipendente Apolipoproteina E (ApoE), come topi deficienti sia di ApoE e ApoCIII sono anche protetti da iperlipidemia postprandiale 7. Sebbene questi modelli murini ApoCIII KO hanno fornito informazioni preziose sulle possibili funzioni di ApoCIII nell&#39;uomo, si osserva che il metabolismo della lipoproteina di topi è diverso da quello degli umani in molti aspetti. Ad esempio, mouse manca plasma cholesteryl proteina di trasferimento degli esteri (CETP), un importante enzima coinvolto nel trasporto di VLDL, LDL, HDL e 8. Pertanto, è necessario sviluppare un modello animale appropriato per meglio comprendere il ruolo fisiologico di ApoCIII in vivo. Il coniglio è un classico modello di specie animali 9-11. Ha un breve periodo di gestazione (30-31 giorni), di grandi dimensioni cucciolata (4-12/litter) e può essere alloggiato comodamente in una struttura indoor. Rispetto ai topi, conigli sono più affine all&#39;uomo 10. È importante sottolineare che, come huuomo, ma a differenza di topi, conigli sono mammiferi ricchi di LDL e hanno livelli sostanziali di CETP 10,12. Inoltre, essi sono suscettibili di aterosclerosi indotta dalla dieta ricca di colesterolo con le lesioni simili a quelle osservate in aterosclerosi umana 13. Per queste ragioni, abbiamo ipotizzato che i conigli ApoCIII KO può servire come un modello migliore rispetto ai loro omologhi di topo per studiare i ruoli di ApoCIIIplay nel metabolismo dei lipidi e aterosclerosi nell&#39;uomo. Produzione di gene targeting transgenici (GTT) conigli è stata una sfida. Ciò è dovuto principalmente alla mancanza di linea germinale trasmissione cellule staminali embrionali (ESC), e la bassissima efficienza di trasferimento nucleare di cellule somatiche (SCNT) in conigli. ESC è lo strumento principale per generare topi GTT, che e SCNT è stato applicato con successo per generare animali KO in specie manca linea germinale CES trasmissione, compresi i suini, ovini e bovini, ma non conigli. Recentemente Zinc Finger nucleasi (ZFN), Transcrizione Activator-Like Effettuatore Nuclease (TALEN) 14, e RNA Endonuclease guidata (RGEN) 15 emersi come mezzi potenti per la modifica del genoma. Questi nucleasi, i cosiddetti &quot;forbici molecolari&quot;, sono efficaci nel generare rotture del doppio filamento (DSB) nel genoma che possono portare ad un KO funzionale del gene targeting o utilizzati per integrare una sequenza di DNA in un luogo specifico nel genoma in un certo numero di specie 16. Nel 2011, tra i primi adattare la tecnologia ZFN, abbiamo generato proliferazione dei perossisomi-activated receptor gamma (PPAR) KO le cellule suine tramite questo approccio e generati con successo maiali PPAR KO dopo l&#39;utilizzo di queste cellule per SCNT 17. Nello stesso anno, efficiente perturbazione gene immunoglobuline e sostituzione mirata nei conigli utilizzando anche ZFN è stato segnalato 18. Nel presente studio, cinque conigli ApoCIII KO sono stati generati come confermato mediante PCR sequenziamento, utilizzando Set ZFN 1 (vedere la Figura 1 </strong&gt;. per il diagramma di flusso illustrazione). Questi animali sono nuove risorse per studiare i ruoli di ApoCIII nel metabolismo dei lipidi.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="824">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:245px;">APOC3-ZFN</td>
			<td style="width:276px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:136px;">CSTZFNY-1KT</td>
			<td style="width:167px;">Target Gene: APOC3, Lot Number: 12201118MN</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">mMESSAGE kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM1344M</td>
			<td>mRNA synthesis</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MEGAclear Kit&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td style="width:136px;">AM1908M</td>
			<td>mRNA purification</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Follicle-stimulating hormone</td>
			<td>Bioniche Life Sciences</td>
			<td style="width:136px;">Folltropin-V</td>
			<td>Treating embryo donor rabbits</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Human chorionic gonadotropin</td>
			<td>Intervet</td>
			<td style="width:136px;">Chorulon</td>
			<td>Treating embryo donor rabbits</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Gonadotropin-releasing hormone</td>
			<td>Prospecbio</td>
			<td>HOR-255</td>
			<td>Treating embryo recipient rabbits</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Earle&#39;s Balanced Salt Solution (EBSS)&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:136px;">SH30029.02</td>
			<td>Embryo culture, base medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MEM (nonessential amino acid)</td>
			<td style="width:276px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:136px;">M7145</td>
			<td>Embryo culture, supplements</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BME AMINO ACIDS solution</td>
			<td style="width:276px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:136px;">B6766</td>
			<td>Embryo culture, supplements</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glutamine</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25030-149</td>
			<td>Embryo culture, supplements</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium pyruvate&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11360-070</td>
			<td>Embryo culture, supplements</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fetal bovine serum</td>
			<td style="width:276px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>12003C</td>
			<td>Embryo culture, supplements</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HEPES buffered TCM 199&#160;</td>
			<td>Gibco&#160;</td>
			<td style="width:136px;">12350039</td>
			<td>Embryo manipulation medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:245px;">Incubator</td>
			<td style="width:276px;">Eppendorf&#160;</td>
			<td style="width:136px;">Galaxy 170</td>
			<td>Embryo culture equipment</td>
		</tr>
		<tr height="18">
			<td height="18" style="height:18px;">Micromanipulator&#160;</td>
			<td>Eppendorf&#160;</td>
			<td style="width:136px;">TransferMan NK 2</td>
			<td>Embryo manipulation equipment</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Micropipette puller</td>
			<td>Sutter Instruments Inc.</td>
			<td style="width:136px;">P-1000</td>
			<td>Embryo manipulation equipment</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Microinjector&#160;</td>
			<td>Tritech Research</td>
			<td style="width:136px;">MINJ-D&#160;</td>
			<td>Embryo manipulation equipment</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Borosilicate glass capillary tubes&#160;</td>
			<td>World Precision Instruments, Inc.</td>
			<td style="width:136px;">TW100F-6</td>
			<td>Embryo manipulation supply</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:245px;">Euthasol (pentobarbitol sodium)</td>
			<td style="width:276px;">Virbac AH, Inc.</td>
			<td style="width:136px;">ANADA#200-071</td>
			<td>Euthanization of embryo donor rabbits</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

production of apolipoprotein c-iii knockout rabbits using zinc finger nucleases

Apolipoproteina (Apo) C-III (ApoCIII) risiede sulla superficie del plasma chilomicroni (CM), lipoproteine ​​a bassissima densità (VLDL) e lipoproteine ​​ad alta densità (HDL). E &#39;stato riconosciuto che alti livelli di plasma ApoCIII fattore di rischio COSTITUIRE per malattie cardiovascolari (CVD). Elevati livelli plasmatici ApoCIII spesso correla con l&#39;insulino-resistenza, obesità, e ipertrigliceridemia. Conoscenze per il ruolo di ApoCIIIin metabolismi lipidici e CVD è stato ottenuto da modelli di topi transgenici compresi ApoCIII knockout (KO) topi, tuttavia, si osserva che il metabolismo di lipoproteine ​​nel topo è diverso da quello degli umani in molti aspetti. Non è noto fino ad ora se elevato plasma ApoCIII direttamente aterogenica. Abbiamo lavorato per sviluppare conigli ApoCIII KO nel presente studio basata sull&#39;ipotesi che i conigli possono servire come reasonablemodelfor studio del metabolismo lipidico umano e aterosclerosi. Zinc finger nucleasi (ZFN) insiemi di targeting coniglio ApoCIIIgene sono stati sottoposti a validazione in vitro prima embrione microiniezione. L&#39;mRNA è stato iniettato nel citoplasma di 35 embrioni di coniglio pronuclei stadio, e valutato i tassi di mutazione allo stato di blastocisti. Di sedici blastocisti che sono stati dosati, un ritmo soddisfacente 50% mutazione (8/16) presso il targeting per sito è stato raggiunto, sostenere l&#39;uso di Set 1 per esperimenti in vivo. Successivamente, abbiamo microiniettato 145 embrioni con Set 1 mRNA, e trasferito questi embrioni a 7 conigli destinatario. Dopo 30 giorni di gestazione, 21 kit sono nati, di cui cinque sono stati confermati come conigli ApoCIII KO dopo PCR test di sequenziamento. Il tasso di animali KO (# kit KO / totale nati) è stata del 23,8%. L&#39;efficienza produttiva complessiva è del 3,4% (5 kits/145 embrioni trasferiti). Il presente lavoro ha dimostrato che ZFN è un metodo molto efficiente per produrre conigli KO. Questi conigli ApoCIII KO sono nuove risorse per studiare ruoli di ApoCIII nel metabolismo dei lipidi.

In validazione in vitro di coppie ZFN Sedici coppie ZFN sono state inizialmente concepite. La sequenza distruzione mirata Set 1 è situato in esone 2 di coniglio ApoCIII (Figura 2A). Tre coppie (Set 1, 2, e 3, Figura 2A) sono stati selezionati e sottoposti al lievito MEL-1 test giornalista per determinare le attività ZFN (Figura 2b). Set 1 ha un punteggio ZFN del 224,2%, superiori a quelli di Set 2 (196,9%) e Set 3 (177,8%) e molto superiore alla soglia di selezione (ossia il 50% del controllo interno positivo). Pertanto Set 1 è stato selezionato per esperimenti di validazione in vitro. Un insieme particolare deve comportare un tassi positivi in embrioni di 10% o superiore per passare la validazione in vitro dell&#39;embrione, sulla base dei criteri di validazione interna. L&#39;mRNA (5 pg / ml) di Set 1 è stato microiniettati al citoplasma di 35 pronuclei embrioni fase di coniglio (Figura 3A &lt;/ Strong&gt;). Embrioni cancellato senza trattamento microiniezione (n = 31) sono stati utilizzati come gruppo di controllo. Diciotto embrioni del gruppo microiniezione sviluppati per fase BL su D5, di cui sedici sono stati sequenziati, e otto (BL # Ap-3, 4, 5, 7, 11, 13, 15, 17, Figura 3B, rosso sottolineate) visualizzati mutati sequenze del targeting per sito (nero-scatola, figura 2B, fila in alto, apoC3wt.seq). Il tasso BL del gruppo microiniezione (51,4%) è inferiore a quella del gruppo di controllo (77,4%), indicando competenza allo sviluppo leggermente alterata di embrioni microiniettati. Il tasso di mutazione positiva degli embrioni microiniettati è 50,0% (8/16), molto superiore alla soglia di selezione (10%). Questi risultati hanno rivelato che 1 Set è un set ZFN efficace per indurre mutazioni nel sito di mira ApoCIII coniglio. Pertanto Set 1 è stato scelto per la produzione in vivo di conigli ApoCIII KO. La produzione di conigli ApoCIII KO L&#39;mRNA of Set ZFN 1 è stato microiniettato al citoplasma di coniglio embrioni pronuclei stadio, e trasferiti 145 embrioni microiniettati a 7 conigli destinatario pseudo-gravidanza (Figura 4A). Embrioni appena lavata (n = 75) senza ZFN microiniezione sono state trasferite a destinatari (n = 6) come gruppo di controllo. Dopo 30 giorni di gestazione, 21 kit sono nati nel gruppo microiniezione. PCR sequenziamento ha identificato cinque (APOC3-R1, R9, R11, R12 e R16) in kit KO positivi (Figura 4B). Il tasso di termine calcolato come kit totale termine / embrioni totale è del 14,5% (21/145), mentre il tasso è del 29,3% (22/75) nel gruppo di controllo. Il tasso KO calcolato come kit in totale KO / totale termine è del 23,8% (5/21). Un kit KO (Ap-R16) è morto cinque giorni dopo il parto (20,0%, 1/5). Il indelsat il targeting per sito comprendono due inserzioni e delezioni tre, ma areΔ1, +1, +1, Δ20 e Δ21, per Conigli # R1, R9, R11, R12, e R16, rispettivamente (Figura 4B). Bianalisi oinformatics è stato utilizzato per identificare il potenziale ZFN off-target con 7 o meno mismatch a Set 1 sequenza, come descritto in precedenza 17. Solo uno predetto possibile sito off-target, localizzato sul cromosoma 14, è stato identificato con 7 bps corrispondenti. PCR rilevato nessun evento fuori bersaglio in nessuno degli animali fondatori.

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Production of Apolipoprotein C-III Knockout Rabbits using Zinc Finger Nucleases

Recenti sviluppi nel gene strumenti di targeting rende la produzione di knockout (KO) conigli possibile. Nel presente lavoro, abbiamo generato cinque conigli apolipoproteina (Apo) C-III KO con zinco nucleasi dito (ZFN). Questo lavoro ha dimostrato che ZFN è un metodo molto efficiente per produrre conigli KO.

La produzione di apolipoproteina C-III Conigli Knockout utilizzando zinco nucleasi dito

Apolipoprotein (Apo) C-III (ApoCIII) resides on the surface of plasma chylomicron (CM), very low density lipoprotein (VLDL) and high density lipoproteins ...

production-apolipoprotein-c-iii-knockout-rabbits-using-zinc-finger

Research

JoVE Journal

Medicine

18.0K Views.  University of Michigan Medical Center.  Recenti sviluppi nel gene strumenti di targeting rende la produzione di knockout (KO) conigli possibile. Nel presente lavoro, abbiamo generato cinque conigli apolipoproteina (Apo) C-III KO con zinco nucleasi dito (ZFN). Questo lavoro ha dimostrato che ZFN è un metodo molto efficiente per produrre conigli KO. 

Video: Production of Apolipoprotein C-III Knockout Rabbits using Zinc Finger Nucleases

Isolating and Using Sections of Bovine Mesenteric Artery and Vein as a Bioassay to Test for Vasoactivity in the Small Intestine

Mammalian gastrointestinal systems are constantly exposed to compounds (desirable and undesirable) that can have an effect on blood flow to and from that system. Changes in blood flow to the small intestine can result in effects on the absorptive functions of the organ. Particular interest in toxins liberated from feedstuffs through fermentative and digestive processes has developed in ruminants as an area where productive efficiencies could be improved. The video associated with this article describes an in vitro bioassay developed to screen compounds for vasoactivity in isolated cross-sections of bovine mesenteric artery and vein using a multimyograph. Once the blood vessels are mounted and equilibrated in the myograph, the bioassay itself can be used: as a screening tool to evaluate the contractile response or vasoactivity of compounds of interest; determine the presence of receptor types by pharmacologically targeting receptors with specific agonists; determine the role of a receptor with the presence of one or more antagonists; or determine potential interactions of compounds of interest with antagonists. Through all of this, data are collected real-time, tissue collected from a single animal can be exposed to a large number of different experimental treatments (an in vitro advantage), and represents vasculature on either side of the capillary bed to provide an accurate picture of what could be happening in the afferent and efferent blood supply supporting the small intestine.

The small intestine is frequently exposed to toxins that can influence blood flow and negatively impact nutrient absorption. Using a multimyograph and mesenteric artery and vein isolates, compounds or toxins of interest can be screened for vasoactivity.

Isolare e utilizzo Sezioni di mesenterica bovina arteria e vena come un saggio biologico per verificare Vasoactivity nel piccolo intestino

Mammalian gastrointestinal systems are constantly exposed to compounds (desirable and undesirable) that can have an effect on blood flow to and from that ...

Ricerca

Medicina

A Step by Step Protocol for Subretinal Surgery in Rabbits

Age related macular degeneration (AMD), retinitis pigmentosa, and other RPE related diseases are the most common causes for irreversible loss of vision in adults in industrially developed countries. RPE transplantation appears to be a promising therapy, as it may replace dysfunctional RPE, restore its function, and thereby vision.
Here we describe a method for transplanting a cultured RPE monolayer on a scaffold into the subretinal space (SRS) of rabbits. After vitrectomy xenotransplants were delivered into the SRS using a custom made shooter consisting of a 20-gauge metallic nozzle with a polytetrafluoroethylene (PTFE) coated plunger. The current technique evolved in over 150 rabbit surgeries over 6 years. Post-operative follow-up can be obtained using non-invasive and repetitive in vivo imaging such as spectral domain optical coherence tomography (SD-OCT) followed by perfusion-fixed histology.
The method has well-defined steps for easy learning and high success rate. Rabbits are considered a large eye animal model useful in preclinical studies for clinical translation. In this context rabbits are a cost-efficient and perhaps convenient alternative to other large eye animal models.

Retinal pigment epithelium (RPE) replacement strategies and gene-based therapy are considered for several retinal degenerative conditions. For clinical translation, large eye animal models are required to study surgical techniques applicable in patients. Here we present a rabbit model for subretinal surgery geared towards RPE transplantation, which is versatile and cost-efficient.

Un passo per passo protocollo per la chirurgia sottoretinico in Conigli

Age related macular degeneration (AMD), retinitis pigmentosa, and other RPE related diseases are the most common causes for irreversible loss of vision in ...

A High Throughput, Multiplexed and Targeted Proteomic CSF Assay to Quantify Neurodegenerative Biomarkers and Apolipoprotein E Isoforms Status

Many neurodegenerative diseases are&#160;still lacking effective treatments. Reliable biomarkers for identifying and classifying these diseases will be important in the development of future novel therapies. Often&#160;potential new biomarkers do not make it&#160;into the clinic&#160;due to limitations&#160;in their development and&#160;high costs.&#160;However,&#160;targeted proteomics using Multiple Reaction Monitoring Liquid Chromatography-tandem/Mass Spectrometry (MRM LC-MS/MS), specifically using triple quadrupole mass spectrometers, is one method that can be used to rapidly evaluate and validate biomarkers&#160;for clinical translation into diagnostic laboratories. Traditionally, this platform has been used extensively for measurement of small molecules&#160;in clinical laboratories, but it is the potential to analyze proteins, that makes it an attractive alternative to ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay)-based methods. We describe here how targeted proteomics can be used to measure multiplexed markers of dementia, including the detection and quantitation of the known risk factor apolipoprotein E isoform 4 (ApoE4).
In order to make the assay suitable for translation, it is designed to be rapid, simple, highly specific and cost effective. To achieve this, every step in the development of the assay must be optimized for the individual proteins and tissues they are analyzed in. This method describes a typical workflow including various tips and tricks to developing a targeted proteomics MRM LC-MS/MS for translation.
The method development is optimized using custom synthesized versions of tryptic quantotypic peptides, which calibrate&#160;the MS for detection and then spiked into CSF to determine correct identification of the endogenous peptide in the chromatographic separation prior to analysis in the MS. To achieve absolute quantitation, stable isotope-labeled internal standard versions of the peptides with short amino acid sequence tags and containing a trypsin cleavage site, are included in the assay.

We describe a high-throughput, multiplex, and targeted proteomic cerebrospinal fluid (CSF) assay developed with potential for clinical translation. The test can quantitate potential markers and risk factors for neurodegeneration, such as the apolipoprotein E variants (E2, E3 and E4), and measure their allelic expression.

A High Throughput, Multiplexer e mirata Proteomica CSF test per quantificare neurodegenerative Biomarkers e apolipoproteina E Isoforme Stato

Many neurodegenerative diseases are&#160;still lacking effective treatments. Reliable biomarkers for identifying and classifying these diseases will be ...

Induction of Atherosclerotic Plaques Through Activation of Mineralocorticoid Receptors in Apolipoprotein E-deficient Mice

Atherosclerosis is due to a chronic inflammatory response affecting vascular endothelium and is promoted by several factors such as hypertension, dyslipidemia, and diabetes. To date, there is evidence to support a role for circulating aldosterone as a risk factor for the development of cardiovascular disease. Transgenic mouse models have been generated to study cellular and molecular processes leading to atherosclerosis. In this manuscript, we describe a protocol that takes advantage of continuous infusion of aldosterone in ApoE-/- mice and generates atherosclerotic plaques in the aortic root after 4 weeks of treatment. We, therefore, illustrate a method for quantification and characterization of atherosclerotic lesions at the aortic root level. The added value of aldosterone infusion is represented by the generation of atherosclerotic lesions rich in lipid and inflammatory cells after 4 weeks of treatment. We describe in detail the staining procedures to quantify lipid and macrophage content within the plaque. Notably, in this protocol, we perform heart tissue-embedding in OCT in order to preserve the antigenicity of cardiac tissue and facilitate detectability of antigens of interest. Analysis of the plaque phenotype represents a valid approach to study the pathophysiology of atherosclerosis development and to identify novel pharmacological targets for the development of anti-atherogenic drugs.

We describe a protocol to induce atherosclerosis in the aortic root of ApoE-/- mice fed with an atherogenic diet, through a continuous release of aldosterone. Methods to characterize plaque composition are also described.

Induzione delle placche aterosclerotiche attraverso l'attivazione dei recettori mineralcorticoidi nei topi E-carenti dell'apolipoproteina

Atherosclerosis is due to a chronic inflammatory response affecting vascular endothelium and is promoted by several factors such as hypertension, ...

Preclinical Model of Hind Limb Ischemia in Diabetic Rabbits

Peripheral vascular disease is a widespread clinical problem that affects millions of patients worldwide. A major consequence of peripheral vascular disease is the development of ischemia. In severe cases, patients can develop critical limb ischemia in which they experience constant pain and an increased risk of limb amputation. Current therapies for peripheral ischemia include bypass surgery or percutaneous interventions such as angioplasty with stenting or atherectomy to restore blood flow. However, these treatments often fail to the continued progression of vascular disease or restenosis or are contraindicated due to the overall poor health of the patient. A promising potential approach to treat peripheral ischemia involves the induction of therapeutic neovascularization to allow the patient to develop collateral vasculature. This newly formed network alleviates peripheral ischemia by restoring perfusion to the affected area. The most frequently employed preclinical model for peripheral ischemia utilizes the creation of hind limb ischemia in healthy rabbits through femoral artery ligation. In the past, however, there has been a strong disconnect between the success of preclinical studies and the failure of clinical trials regarding treatments for peripheral ischemia. Healthy animals typically have robust vascular regeneration in response to surgically induced ischemia, in contrast to the reduced vascularity and regeneration in patients with chronic peripheral ischemia. Here, we describe an optimized animal model for peripheral ischemia in rabbits that includes hyperlipidemia and diabetes. This model has reduced collateral formation and blood pressure recovery in comparison to a model with a higher cholesterol diet. Thus, the model may provide better correlation with human patients with compromised angiogenesis from the common co-morbidities that accompany peripheral vascular disease.

We describe a surgical procedure used to induce peripheral ischemia in rabbits with hyperlipidemia and diabetes. This surgery acts as a preclinical model for conditions experienced in peripheral artery disease in patients. Angiography is also described as a means to measure the extent of introduced ischemia and recovery of perfusion.

Modello preclinico di ischemia degli arti posteriori nei conigli diabetici

Peripheral vascular disease is a widespread clinical problem that affects millions of patients worldwide. A major consequence of peripheral vascular ...

Establishment of a Severe Dry Eye Model Using Complete Dacryoadenectomy in Rabbits

Dry eye disease (DED) is a complex disease with multiple etiologies and variable symptoms, having ocular surface inflammation as its key pathophysiologic step. Despite advances in our understanding of DED, significant knowledge gaps remain. Advances are limited in part due to the lack of informative animal models. The authors recently reported on a method of DED induced by injecting all orbital lacrimal gland (LG) tissues with the lectin concanavalin A. Here, we report a novel model of aqueous-deficient DED based on the surgical resection of all orbital LG (dacryoadenectomy) tissues. Both methods use rabbits because of their similarity to human eyes in terms of the size and structure of the ocular surface. One week after removal of the nictitating membrane, the orbital superior LG was surgically removed under anesthesia, followed by removal of the palpebral superior LG, and finally removal of the inferior LG. Dacryoadenectomy induced severe DED, evidenced by a marked reduction in the tear break up time test and the Schirmer&#39;s tear test, and significantly increased tear osmolarity and rose bengal staining. Dacryoadenectomy-induced DED lasted at least eight weeks. There were no complications and animals tolerated the procedure well. The technique can be mastered relatively easily by those with adequate surgical experience and appreciation of the relevant rabbit anatomy. Since this model recapitulates the features of human aqueous-deficient DED, it is suitable for studies of ocular surface homeostasis, DED, and candidate therapeutics.

A novel approach is presented to induce chronic dry eye disease in rabbits by surgically removing all orbital lacrimal glands. This method, distinct from those previously reported, produces a stable, reproducible model of aqueous deficient dry eye well suited to study tear physiology and pathophysiology and ocular therapeutics.

Istituzione di un modello di occhio secco severo utilizzando la dacrigofectomia completa nei conigli

Dry eye disease (DED) is a complex disease with multiple etiologies and variable symptoms, having ocular surface inflammation as its key pathophysiologic ...

Blind Endotracheal Intubation in Neonatal Rabbits

The newborn rabbit is a useful animal model for various pathologies and procedures. Airway management of the rabbit is complex due to its anatomical characteristics, which is further complicated in the case of the newborn. Of the different methods of advanced airway management, endotracheal intubation is less aggressive than tracheostomy, and is more feasible than supraglottic management given the lack of supraglottic devices of such a small size. As direct glottis visualization is very difficult in animals this size, this blind intubation model is presented as an effective alternative, especially for experiments requiring prolonged anesthesia. Using this method, we performed blind intubations with a 90% success rate.

We describe a technique of endotracheal intubation in newborn rabbits after esophageal catheterization with a gastric tube.

Intubazione endotracheale cieca nei conigli neonatale

The newborn rabbit is a useful animal model for various pathologies and procedures. Airway management of the rabbit is complex due to its anatomical ...

Multi-system Monitoring for Identification of Seizures, Arrhythmias and Apnea in Conscious Restrained Rabbits

Patients with ion channelopathies are at a high risk of developing seizures and fatal cardiac arrhythmias. There is a higher prevalence of heart disease and arrhythmias in people with epilepsy (i.e., epileptic heart.) Additionally, cardiac and autonomic disturbances have been reported surrounding seizures. 1:1,000 epilepsy patients/year die of sudden unexpected death in epilepsy (SUDEP). The mechanisms for SUDEP remain incompletely understood. Electroencephalograms (EEG) and electrocardiograms (ECG) are two techniques routinely used in the clinical setting to detect and study the substrates/triggers for seizures and arrhythmias. While many studies and descriptions of this methodology are in rodents, their cardiac electrical activity differs significantly from humans. This article provides a description of a non-invasive method for recording simultaneous video-EEG-ECG-oximetry-capnography in conscious rabbits. As cardiac electrical function is similar in rabbits and humans, rabbits provide an excellent model of translational diagnostic and therapeutic studies. In addition to outlining the methodology for data acquisition, we discuss the analytical approaches for examining neuro-cardiac electrical function and pathology in rabbits. This includes arrhythmia detection, spectral analysis of EEG and a seizure scale developed for restrained rabbits.

Using simultaneous video-EEG-ECG-oximetry-capnography, we developed a methodology to evaluate the susceptibility of rabbit models to develop provoked arrhythmias and seizures. This novel recording system establishes a platform to test the efficacy and safety of therapeutics and can capture the complex cascade of multi-system events that culminate in sudden death.

Monitoraggio multi-sistema per l'identificazione di convulsioni, aritmie e apnee nei conigli trattenuti coscienti

Patients with ion channelopathies are at a high risk of developing seizures and fatal cardiac arrhythmias. There is a higher prevalence of heart disease ...

Three-Dimensional Finger Motion Tracking during Needling: A Solution for the Kinematic Analysis of Acupuncture Manipulation

Three-dimensional (3D) motion tracking has been used in many fields, such as the researches of sport and medical skills. This experiment aimed to use 3D motion tracking technology to measure the kinematic parameters of the joints of fingers during acupuncture manipulation (AM) and establish three technical indicators "amplitude, velocity and time". This method can reflect the operation characteristics of AM and provide quantitative parameters along three axes of multiple finger joints. The current evidence shows that the method has great potential for future applications such as the study of the dose-effect relationship of acupuncture, teaching, and learning of AM, and the measurement and preservation of famous acupuncturists' AM.

This experimental method describes a solution for the kinematic analysis of acupuncture manipulation with three-dimensional finger motion tracking technology.

Tracciamento tridimensionale del movimento delle dita durante il needling: una soluzione per l'analisi cinematica della manipolazione dell'agopuntura

Three-dimensional (3D) motion tracking has been used in many fields, such as the researches of sport and medical skills. This experiment aimed to use 3D ...

A Modified Technique for Arteriovenous Fistula Construction in Rabbits

Juxta-anastomotic stenosis is a challenging problem that often causes non-maturation and decreases the patency of an arteriovenous fistula (AVF). Injury to the veins and arteries during the operation and hemodynamic changes can lead to intimal hyperplasia, leading to juxta-anastomotic stenosis. To reduce injury to the veins and arteries during the operation, this study proposes a new modified no-touch technique (MNTT) for AVF construction that can decrease the rate of juxta-anastomotic stenosis and improve the AVF patency. To unravel the hemodynamic changes and mechanisms of the MNTT, this study presented an AVF procedure using this technique. Although this procedure is technically challenging, 94.4% procedural success was achieved after adequate training. Ultimately, 13 out of 34 rabbits had a functional AVF 4 weeks after the surgery, leading to a 38.2% AVF patency rate. However, at 4 weeks, the survival rate was 86.1%. Ultrasonography showed active blood flow through AVF anastomosis. Furthermore, the spiral laminar flow was observed in the vein and artery near the anastomosis, suggesting that this technique may improve the hemodynamics of the AVF. On histological observation, significant venous intimal hyperplasia was observed at the AVF anastomosis, whereas no significant intimal hyperplasia was observed at the proximal external jugular vein (EJV) of the anastomosis. This technique will improve the understanding of the mechanisms underlying the use of MNTT for AVF construction and provide technical support for the further optimization of the surgical approach in AVF construction.

The present protocol proposes the creation of an arteriovenous fistula in rabbits using a modified no-touch technique. The technique involves the side-to-side anastomosis of the common carotid artery and external jugular vein without the dissection of the perivenous tissues or cutting off the artery.

Una tecnica modificata per la costruzione della fistola artero-venosa nei conigli

Juxta-anastomotic stenosis is a challenging problem that often causes non-maturation and decreases the patency of an arteriovenous fistula (AVF). Injury ...