La linea cellulare O9-1 è uno strumento molto utile per studiare le cellule della cresta neurale in vitro. Ha un grande potenziale di utilizzo in un'ampia gamma di applicazioni in vari usi della ricerca. Le cellule O9-1 hanno evidenti vantaggi, come un facile accesso, e ottengono rapidamente numeri di cellule sufficienti per gli esperimenti, rendendolo un metodo potente gratuito per gli studi in vitro sulle cellule della cresta neurale.
Per iniziare, preparare i supporti basali per la coltura cellulare O9-1, secondo il protocollo di testo. Quindi, filtrare il supporto basale e avvolgerlo in un foglio per proteggerlo dalla luce. Successivamente, raccogliere supporti basali condizionati da celle STO attivate secondo il protocollo di testo.
In primo luogo, scongelare un'aliquota di matrice di membrana basale sul ghiaccio per due ore. Quindi, diluire la matrice della membrana basale con DMEM sterilizzato filtrato con 10%FBS a una concentrazione finale di 0,5 mg / ml. Rivestire la piastra con la matrice della membrana del seminterrato a temperatura ambiente per un'ora.
Quindi, aspirare la matrice della membrana del seminterrato inclinando la piastra. Asciugare i piatti a 30 gradi Celsius per 30 minuti. Quando si aggiunge la matrice della membrana del seminterrato alla piastra, assicurarsi che la soluzione coprisse il pozzo in modo uniforme per mantenere le caratteristiche cellulari ed evitare inutili variazioni tra gli esperimenti.
Recuperare le cellule O9-1 posizionando un crio-flaconcino in un bagno d'acqua di 37 gradi Celsius. Ruotare lentamente il flaconcino fino a quando la soluzione si trasforma completamente in liquido. Successivamente, trasferire la soluzione cellulare dal crio-flaconcino a un tubo di centrifuga da 15 ml.
Aggiungere cinque volumi di DMEM con 10%FBS al tubo per sospendere di nuovo le celle. Centrifugare le cellule per tre minuti a 180 Gs.Quindi, aspirare il supernatente, facendo attenzione a non disturbare il pellet. Successivamente, sospendere nuovamente il pellet in mezzi basali condizionati integrati con LIF e BFGF.
Seminare le cellule in una piastra di sei po 'e agitare il piatto per seminare le cellule in modo uniforme. Quando si agita la piastra, farlo orizzontalmente e verticalmente, poiché ruotando la piastra le celle si concentreranno verso il centro. E permettere a quelle cellule di attaccarsi e crescere in un incubatore di coltura cellulare standard durante la notte.
Assicurarsi che le celle siano collegate prima di modificare il supporto. Quando le celle O9-1 raggiungono l'80% di confluenza, scongelare la matrice della membrana basale e preparare una piastra rivestita a matrice di membrana basale come descritto in precedenza. Quindi aggiungere mezzi basali integrati con LIF e BFGF alla matrice di membrana.
Risciacquare delicatamente i pozzi con 2 ml di DPBS due volte. Quindi, dissociare le cellule con 1 ml di 0,05% di edta di tripsiderina a 37 gradi Celsius per tre minuti. Neutralizzare la tripina con una quantità uguale di DMEM con 10%FBS tubazionando ripetutamente il liquido su tutta la superficie del pozzo.
Quindi, trasferire la soluzione cellulare in un tubo di centrifuga. E centrifugare per tre minuti a 180 Gs.Aspira il supernatente senza disturbare il pellet di cellule. Successivamente, risospendare il pellet cellulare pippetting delicatamente mezzi basali condizionati integrati con LIF e BFGF.
Seminare le cellule nella piastra rivestita come descritto in precedenza. Quindi, consentire alle cellule di attaccarsi e crescere in un incubatore di coltura cellulare standard. In primo luogo, preparare il supporto di congelamento 2X secondo il protocollo di testo.
Quindi, filtrare-sterilizzare il supporto. Risciacquare le pareti della piastra con DPBS due volte, pipettando delicatamente per evitare di perdere cellule. Successivamente dissociare le cellule con EDTA allo 0,05% di tripside a 37 gradi Celsius per tre minuti.
Neutralizzare la tripina con un importo uguale a 10%FBS e DMEM. Trasferire il contenuto della piastra su un tubo di centrifuga e centrifugare per tre minuti a 180 Gs.Quindi, aspirare il supernatente e aggiungere 2 ml di PBS per rimescolare il pellet. Centrifugare ancora una volta la soluzione cellulare e aspirare il supernatente.
Regolare la quantità di mezzi basali nel tubo in base alle esigenze e aggiungere una quantità uguale di supporto di congelamento 2X. Quindi, trasferire le celle sulle fiale criogeniche etichettate. Posizionare i flaconcini criogenici all'interno di una scatola di polistirolo con un coperchio per ottenere una velocità di raffreddamento lenta a 80 gradi Celsius per almeno 24 ore.
Per eseguire il knockdown di SIRNA nelle cellule O9-1, recuperare e seminare le cellule. Diluire i liposomi in un volume appropriato di mezzi senza siero. Quindi, diluire SIRNA in supporti senza siero secondo il protocollo di testo.
Successivamente, aggiungere il SIRNA diluito ai liposomi diluiti, secondo le istruzioni del produttore. Mescolare la soluzione con pipettazione e incubare per cinque minuti a temperatura ambiente. Successivamente, aggiungere un volume appropriato di complesso lipidico SIRNA alle cellule.
Quindi, incubare le cellule per 24 ore in un incubatore di coltura cellulare standard. Le cellule O9-1 possono differenziarsi in diversi tipi di cellule in specifiche condizioni di coltura di differenziazione. Per differenziare le cellule O9-1 in osteoplasti, preparare mezzi di differenziazione osteogenica secondo il protocollo di testo.
Infine, rilevare l'osteocalcina marcatore osteoplasto in osteoplasti differenziati mediante colorazione immuno. Per differenziare le cellule O9-1 in cellule muscolari lisce, culturerle sotto mezzi di differenziazione secondo il protocollo di testo e valutare la differenziazione mediante colorazione immuno actina muscolo-liscia. In questo protocollo, sono stati eseguiti sia l'esperimento knock out che l'esperimento knock down per studiare la perdita di funzione di Yap nelle cellule O9-1.
In condizioni di differenziazione muscolare liscia, la maggior parte delle cellule selvatiche di tipo O9-1 ha dato origine a un atto muscolare liscio in cellule muscolari lisce positive. Le cellule nulle di Yap tuttavia generalmente non sono riuscite a differenziarsi in cellule muscolari lisce positive SMA. Ciò indica che Yap svolge un ruolo fondamentale nella differenziazione delle cellule della cresta neurale in cellule muscolari lisce.
Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di gestire la linea cellulare O9-1 in modo delicato e attento durante l'intero processo. Assicurarsi di diluire e utilizzare correttamente la matrice della membrana basale e utilizzare lo 0,05% di tripside per la dissociazione cellulare. Non dimenticare che durante la preparazione per la coltura cellulare O9-1, lavorare con la mitomicina c può essere estremamente pericoloso e precauzioni come indossare un camice da laboratorio e guanti dovrebbero sempre essere prese durante l'esecuzione di questa procedura.
