1. Personalizzato ZFN Process Design <ol><li> Per accelerare il processo di ZFN design, un investigatore dovrebbe fornire: </li><ul><li> Informazioni sul gene bersaglio come il nome del gene, specie, e gene annotazione / numero di identificazione. </li><li> Un chiaramente over-all obiettivo dell&#39;esperimento (ad esempio, Knockout o Knockin) </li><li> Eventuali fattori specifici del gene bersaglio che comprendono struttura atipica gene, biologia speciale implicato nel locus genetico, o qualsiasi regioni omologhe in altre regioni del genoma. </li><li> La gamma specifica di sequenza di DNA per il dito di zinco nucleasi di destinazione. </li></ul><li> La squadra Sigma bioinformatica conduce nel design silico ZFN di sviluppare iniziali di zinco siti bersaglio delle dita. </li><li> Iniziali siti bersaglio ZFN sono prestati ad una ZFN consulente scientifico tecnico. Per i progetti tecnicamente più complessi, questo scienziato Sigma collabora con gli inquirenti per sviluppare la strategia del progetto. </li><li&gt; La squadra Sigma bioinformatica effettua una prima analisi con algoritmi ZFN per generare in silico design ZFN. Questo include un intero genoma per la ricerca off-bersaglio siti, mascheramento ripetizione, e l&#39;analisi SNP per ogni sito potenziale bersaglio ZFN. </li><li> Bioinformatica fornisce i migliori siti bersaglio ZFN al ricercatore per la revisione. Dopo l&#39;approvazione dei siti potenziali destinatari ZFN, questa informazione viene fornita al team di produzione ZFN per iniziare il processo di fabbricazione ZFN. </li></ol> 2. Personalizzato ZFN Produzione <ol><li> L&#39;archivio dei moduli Sigma dita di zinco è usata per assemblare i disegni ZFN approvati. </li><li> Ogni disegno ZFN è assemblato e la sequenza verificato su una piattaforma alta clonazione throughput. </li><li> Una volta che la produzione di tutti i disegni ZFN è completare ogni ZFN viene inviato alla validazione. </li></ol> 3. Validazione dei ZFNs personalizzati <ol><li> Progetti in ZFNspecie umana, topo, ratto o CHO sono validati nelle linee di cellule ben caratterizzati per ciascuna specie, un saggio a base di lievito viene usato per altri organismi o tipi cellulari. </li><li> Costrutti ZFN vengono erogati nella linea cellulare appropriata nucleofection e le ZFNs sono espressi. </li><li> DNA viene raccolto dal pool di cellule trasfettate ZFN e la regione di interesse è amplificato mediante PCR. </li><li> Il-1 Cel saggio viene quindi effettuata sul prodotto PCR. Elettroforesi su gel viene eseguito sul test-1 Cel all&#39;attività ZFN convalidato. </li><li> Il disegno più alto ZFN attività come confermato dal Cel-1 test viene quindi fornito al cliente. ZFNs vengono consegnati in mRNA e DNA plasmidico con primer PCR per l&#39;Cel-1 saggio e DNA genomico come controllo positivo. </li></ol> 4. Consegna dei ZFNs convalidati da Nucleofection <ol><li> Seme le cellule ad una densità di 2x10 5 cellule / ml il giorno prima nucleofection. </li><li> Il giorno di nucleofection,estrarre cellule Linea Nucleofector Kit V e lasciare calda a temperatura ambiente. </li><li> Aggiungere il supplemento al Nucleofection Solution V secondo il protocollo del produttore. </li><li> Contare le celle. Densità cellulare dovrebbe essere tra 2,5-5x10 5 cellule / ml. </li><li> Riempire una piastra da 6 pozzetti con 2 ml di mezzo in ciascun pozzetto e pre-riscaldare in un incubatore a CO 2 37 ° C per almeno 20 minuti prima nucleofection. </li><li> Centrifugare 2x10 6 cellule per trasfezione (8x10 6 totale) a 200xg per 5 minuti. </li><li> Lavare le cellule due volte con 20 ml di soluzione salina bilanciata di Hank (HBSS). </li><li> Preparare le provette sperimentali: (vedi tabella in Custom ZFN bollettino tecnico) </li><li> Rimuovere la piastra da 6 pozzetti contenente supporti dal punto (6,5) da incubatrice. </li><li> Risospendere le cellule in 400 pl (100 pl / reazione) di soluzione Nucleofection V. </li><li> Una reazione alla volta, aggiungere 100 microlitri di cellule di ciascun DNA o mRNA contenente tubo. Trasfer la miscela ad una elettroporazione 2 millimetri cuvette e nucleofect su un Nucleofector con il programma appropriato. </li><li> Subito dopo nucleofection di ciascun campione, con una pipetta di trasferimento per aggiungere ~ 500 microlitri di terreno preriscaldata dalla piastra da 6 pozzetti in fase (6,9) nella cuvetta. Quindi, trasferire accuratamente le cellule dalla cuvetta al mezzo rimanente preriscaldata nella piastra da 6 pozzetti. </li><li> Fine tutte le reazioni e restituire la piastra da 6 pozzetti per la CO 2 incubatore a 37 ° C. </li></ol> 5. Raccolta DNA genomico dopo la consegna del ZFNs <ol><li> Piastra da 6 pozzetti - non raccogliere tutte le celle pool. E &#39;importante mantenere la cultura in modo da avere le celle a singolo clone di diluizione cella dopo aver confermato di avere Cel-1 digestione prodotti. Da uno a tre giorni dopo nucleofection raccogliere le cellule per preparare il DNA cromosomico con il GenElute mammiferi DNA genomico Kit Miniprep. </li></ol> 6. Cel-1 test </p&gt; <ol><li> PCR amplificare il DNA genomico nei campioni di ZFN trasfettate e il positivo DNA genomico di controllo fornito nel kit, utilizzando i primer forniti. La reazione PCR è impostato con le seguenti condizioni: (vedi tabella in Custom ZFN bollettino tecnico). </li><li> Per generare eteroduplex dai homoduplexes PCR prendono 10 microlitri di reazione PCR di ogni campione ZFN trattato più il controllo e utilizzare il seguente programma in un termociclatore: 95 ° C, 10 minuti 95 ° C a 85 ° C, -2 ° C / secondo 85 ° C a 25 ° C, -0,1 ° C / secondo 4 ° C, indefinitamente </li><li> Aggiungere 1 ml di enhancer e 1 ml di nucleasi S (dal numero di catalogo Transgenomic 706.025) ad ogni reazione e incubare a 42 ° C per 20-40 minuti. </li><li> Eseguire le digestioni su un 10% di PAGE-TBE gel con marcatori adeguati, come ad esempio DNA Ladder DirectLoad widerange (Numero di catalogo D7058) (vedere i risultati in bollettino personalizzato ZFN tecnico). </li><li> Suce segnale positivo è stato rilevato in ZFN trattati con le popolazioni di cel-I test, procedere all&#39;isolamento e alla caratterizzazione clonale. </li></ol> 7. Isolamento e caratterizzazione di cloni <ol><li> Single-cell clonare i ZFN trattati con campioni con metodi standard, tra cui FACS e la clonazione di diluizione. </li><li> Lasciare i cloni di espandersi a sufficienza, quindi dividere una certa proporzione di cellule per il raccolto DNA genomico, il congelamento indietro il resto come materiale sopraelevata. </li><li> Amplificare il DNA genomico dai cloni usando i Cel-I primer e analizzare l&#39;amplicone di Cel-I test (con e senza DNA WT diluiti in), oppure utilizzare questa amplicone di procedere direttamente genotipizzazione. </li><li> Cloni candidati genotipo identificata come avente alleli cura il metodo preferito. </li></ol> 8. Risultati rappresentativi Un esempio di tutta CompoZr ZFN flusso è presentata in Figura 2. ZFNs vengono consegnatialle cellule dove si legano e si unirà la sequenza corretta di DNA che crea una rottura a doppio filamento (DSB). Il processo di riparazione naturale, non omologhe fine unione (NHEJ), ripara il DSB. In alcune istanze aberranti risultati NHEJ a delezione, inserzione o sostituzione di nucleotidi. Amplificazione PCR del DNA genomico risultati raccolti nella formazione eteroduplex tra wild type e ampliconi modificati dopo la denaturazione / fase di ricottura della reazione PCR. Aggiunta dei Cel-1 risultati enzimatiche nella scissione di eventuali molecole eteroduplici. Cel-1 risultati vengono risolti mediante analisi PAGE per confermare clivaggio ZFN. Figura 3 fornisce una schematica del saggio Cel-1 ed i risultati attesi. Rappresentative Cel-1 risultati sono contenuti nelle figure 4 e 5 Figura 4 contiene i risultati di una coppia molto attiva di ZFNs (21%) in cellule K562;. Figura 5 contiene i risultati di una coppia meno attivo (2,4%) di ZFNs inK562. Attività ZFN è confermato in entrambe le figure dalla presenza di due frammenti di PCR sotto il frammento di PCR parentale. <img src="/files/ftp_upload/3304/3304fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. ZFNs rappresentazione delle nucleasi associati dito di zinco. Sono progettati proteine ​​costituite da un dito di zinco DNA-binding dominio fuse al dominio di clivaggio della endonucleasi di restrizione FokI. Quando è legato come un eterodimero, ZFNs creare un doppio filamento pausa una specifica sequenza di DNA utente. <img src="/files/ftp_upload/3304/3304fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2. Schema del flusso di lavoro personalizzato Servizio ZFN. Rappresentazione grafica del flusso di lavoro per generare una linea di cellule geneticamente modificate usando ZFNs CompoZr. <img src="/files/ftp_upload/3304/3304fig3.jpg" alt="Figura 3" /> Figura 3. Schematica del Cel-1 test e risultati. A) ZFN plasmide o<html> mRNA r è consegnato alle cellule. B) Espressa bind ZFNs e tagliare la loro sequenza bersaglio creando una rottura a doppio filamento (DSB) in una porzione di cellule. C) la riparazione aberrante di alcuni DSB da parte di non-omologa finiscono entrare risultati in nucleotide inserimento o la cancellazione. D) Il DNA genomico viene raccolto dal pool di cellule transfettate e amplificato a livello del locus di interesse. EF) PCR prodotto è denaturato e ri-creando la formazione di ricotta heteroduplex tra wild type e ampliconi modificati. G) I Cel-1 di mismatch tra le endonucleasi di risultati del test in scissione delle molecole eteroduplici. H) Cel-1 enzima digerisce vengono risolti PAGE. Il rapporto osservato del prodotto di scissione a banda parenterale, determinato da ImageJ software, indica il taglio frazione e l&#39;efficienza dei ZFNs. <img src="/files/ftp_upload/3304/3304fig4.jpg" alt="Figura 4" /> Figura 4. Cel-1 risultati dal 21% ZFNs attivi software ImageJ è disponibile all&#39;indirizzo:._blank &quot;&gt; http://rsbweb.nih.gov/ij/. <img src="/files/ftp_upload/3304/3304fig5.jpg" alt="Figura 5" /> Figura 5. Cel-1 risultati dal 2,4% ZFNs attivi software ImageJ è disponibile all&#39;indirizzo:. <a href="http://rsbweb.nih.gov/ij/" target="_blank">http://rsbweb.nih.gov/ij/~~HEAD=NNS</a> .

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I ricercatori in grado di fornire ZFN cellule modificate o animali a collaboratori nell&#39;ambito dell&#39;accordo di licenza standard di ricerca. In questa circostanza Sigma chiede che un accordo di trasferimento di materiale viene messo in atto tra Sigma, il cliente ZFN e il loro collaboratore. La licenza di ricerca può essere consultato all&#39;indirizzo: <a href="http://www.sigma.com/zfn" target="_blank">http://www.sigma.com/zfn</a> . Se c&#39;è un potenziale per un&#39;applicazione commerciale utilizzando ZFN modificato cellule Sigma chiede poi che una licenza commerciale sia messo in atto. Produzione e l&#39;accesso gratuito a questo articolo è sponsorizzato da Sigma, Inc.

Una volta ZFN modificati cellule sono isolate hanno permanenti e modificazioni ereditabili del DNA. Il risultato è la capacità di generare linee cellulari stabilmente modificati o di animali di razza con desiderati modificazioni genetiche per condurre una ricerca. CompoZr ZFNs personalizzati fornire un metodo efficace per la modifica del genoma in un&#39;ampia varietà di tipi cellulari. Pubblicazione del genoma successo editing con ZFNs include ma non si limita a linee cellulari umane, topo, ratto, zebrafish, rana, suini e modelli di ricerca CHO. 3,4,5,6,7,8,9 La possibilità di creare un doppio filamento pausa al sito bersaglio desiderato nel tipo cellulare specificato è garantita quando le ZFNs siano correttamente consegnato in una cellula. È anche possibile eseguire sequenziali modifiche zinc finger a una cella in modo da avere più di una modificazione genetica all&#39;interno di una cellula. 10 La possibilità di selezionare una specifica sequenza bersaglio e modificare solo che locus particolare, è una causa principale per la capacità di creare più modificationi. Il CompoZr personalizzata certificato ZFN di analisi è generato con i reagenti stessi forniti nel kit assicurando così che tutti i componenti del kit sono stati accuratamente convalidato per il successo del cliente. Passaggi critici del flusso di lavoro dall&#39;inizio alla fine sono presentati qui di seguito: Cella clonazione La capacità di isolare ed espandere una linea cellulare dato dovrebbe essere testato prima di iniziare qualsiasi esperimento ZFN. Cellule singole devono essere isolate ed espanse per assicurare che un derivato clonale popolazione è possibile. Alcune linee cellulari sono recalcitranti in questa materia, e trucchi, come arricchimento per i cloni modificati, o cultura con mezzi condizionati può aiutare a superare queste sfide. Consegna l&#39;efficienza Ottimizzazione dell&#39;efficienza di consegna è un must prima della consegna delle ZFNs. Molti metodi possono essere usati anche a base lipidica trasfezione, elettroporazione, e nucleofectisul. Il metodo di consegna ideale consiste di una miscela che offre la più ottimale di efficacia di somministrazione e la sopravvivenza cellulare. Quantificare tali incrementi di efficienza può essere stimata, fornendo un controllo GFP plasmide e quantificare mediante ispezione visiva o FACS 24-48 ore post-parto. Cel-I test È indispensabile che Cel-I test viene eseguito in parallelo con gli opportuni controlli per assicurare che i parametri di PCR, la digestione, e elettroforesi non interferire con l&#39;interpretazione di ZFN dell&#39;esperimento. Ogni kit comprende il DNA genomico di controllo che viene utilizzato per creare il Cel-I immagine nel certificato di analisi. Amplificazione dal DNA di controllo con i primers fornite seguiti da Cel-I test permetterà all&#39;utente di confrontare i risultati con quanto previsto nel certificato di analisi (COFA) di immagini, e isolare eventuali inefficienze potenziali in questo aspetto di un esperimento. Un controllo adeguato negativo, come una finta, o GFP trattati cellularecampione devono essere inclusi anche per consentire chiarimento di eventuali prodotti non specifici scissione. Qualitativa / Analisi quantitativa di singoli cloni di cellule Dopo il trattamento ZFN e clonazione singola cellula, le popolazioni di cellule possono essere sottoposti a screening per la modifica al locus di interesse da un certo numero di metodi. Cel-I test può essere effettuata su DNA genomico da cloni allo scopo di identificare cloni candidati per la genotipizzazione ulteriore. È importante amplicone spike WT PCR nelle ampliconi campione in un rapporto 1:1 prima di eseguire la Cel-I digerire cloni mutanti omozigoti conterrà molecole omogenee, e quindi trasmettere un negativo Cel-I test risultato. Un metodo alternativo per lo screening di questi cloni candidati è quello di progettare un atterraggio di PCR direttamente sul sito bersaglio ZFN. Usato in combinazione con uno dei primer di controllo, un risultato negativo saggio indica la perdita della sequenza WT. Un clone eterozigote contenente almeno un allele WT sarà aySUL POSTO PCR segnale, ma possono essere separati dai cloni completamente WT eseguendo la PCR nel contesto di SYBR qPCR. Una volta cloni candidati sono stati identificati con i metodi di cui sopra, possono essere genotipizzati mediante pirosequenziamento standard, sequenziamento profondo, o altri metodi di sequenziamento. Per tutti i metodi di sequenziamento, un amplicone creato dal DNA genomico clonale deve essere generata. Per alleli pirosequenziamento tradizionali possono essere separati da TA-clonaggio del prodotto di PCR e sequenziamento le colonie individuali. Per i metodi di sequenziamento profondo come questo passaggio non è necessario. Omologia Repair Regia (HDR) Questo protocollo fornisce il metodo per knockout gene ZFN via mediata NHEJ. L&#39;integrazione dei transgeni possono anche essere condotte mediante l&#39;introduzione di un donatore plasmide con le braccia di omologia che fiancheggiano un sito di taglio ZFN 11. In questo scenario, il ZFN creato a doppio filamento pausa è riparato da HDR, invece di NHEJ. HDR ho direttontegrazione dei transgeni può essere confermata con metodi simili alle procedure previste in questo protocollo. Risoluzione dei problemi Consegna dei ZFNs ZFN consegna e di espressione-delivery può essere controllato dalla consegna di una GFP o di altra natura plasmide per la visualizzazione e / o la quantificazione. Bassa espressione a causa di incompatibilità promotore con il tipo cellulare di interesse possono essere superate con la consegna di ZFNs in formato mRNA. Inoltre, il metodo urto a freddo può essere utilizzato per aumentare ulteriormente l&#39;efficacia di ZFNs nelle cellule. MRNA 12 Se viene utilizzato è imperativo che le cellule sono lavate prima della consegna per garantire che tutti siero-RNasi derivati ​​sono stati rimossi. E &#39;anche prudente per scongelare il mRNA su ghiaccio, e aggiungere il che le celle a l&#39;ultimo momento per ridurre al minimo ogni possibilità di degrado. Cel-I test La fondazione del Cel-I ASSAy è amplificazione specifica e ampia del locus di interesse. Se non specifici prodotti di amplificazione sono stati osservati utilizzare PCR standard delle procedure di risoluzione dei problemi per aumentare la specificità come l&#39;ottimizzazione della quantità template, concentrazione dei primer, e il ciclismo parametri. Eseguire analisi PAGE rispetto a standard di agarosio come quest&#39;ultimo metodo non fornisce adeguata risoluzione e la sensibilità. Cel-I Condizioni digest può anche essere ottimizzata se nessun prodotto digerito o sbavature eccessive si osserva. Titolazione della quantità di Cel-1 nucleasi e / o la lunghezza del tempo di digestione può essere titolati per migliorare questi aspetti.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome del reattivo </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td></tr><tr><td> Nucleasi S (Cel-1 Enzyme) </td><td> Transgenomic </td><td> 706025 </td></tr><tr><td> Expand High Fidelity PCR System </td><td> Roche </td><td> 03 300 242 001 </td></tr><tr><td> Linea cellulare Nucleofector Kit V </td><td> Lonza </td><td> VCA-1003 </td></tr><tr><td> GenElute HP endotossina-Free Plasmide Maxiprep Kit </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> NA0400 </td></tr></tbody></table>

genome editing with compozr custom zinc finger nucleases (zfns)

Genome editing è una tecnica potente che può essere utilizzata per delucidare funzione genica e la base genetica della malattia. Gene modifica i metodi tradizionali come i prodotti chimici a base di mutagenesi o l&#39;integrazione casuale di sequenze di DNA conferiscono indiscriminati cambiamenti genetici in maniera globale inefficiente e richiedono integrazione di indesiderabili sequenze sintetiche o l&#39;uso di aberranti condizioni di coltura, potenzialmente confondibili studio biologico. Per contro, l&#39;espressione transiente ZFN in una cellula può facilitare preciso, ereditabile editing gene in maniera altamente efficiente senza la necessità per la somministrazione di sostanze chimiche o integrazione di transgeni sintetici. Nucleasi dito di zinco (ZFNs) sono enzimi che si legano e tagliare le sequenze distinte di DNA a doppio filamento (dsDNA). Una unità funzionale CompoZr ZFN consiste di due singole proteine ​​monomeriche che legano un DNA &quot;half-site&quot; di circa 15-18 nucleotidi (vedi Figura 1). Quando due ZFN monomers &quot;casa&quot; ai loro siti bersaglio adiacenti i DNA-scissione domini dimerizzano e creare una rottura a doppio filamento (DSB) nel DNA. 1 Introduzione di ZFN-mediate DSB nel genoma costituisce il fondamento per la modifica del genoma altamente efficiente. Imperfect riparazione di DSB in una cella attraverso il non-omologa end-joining (NHEJ) pathway di riparazione del DNA può portare a piccole inserzioni e delezioni (indels). Creazione di indels all&#39;interno della sequenza del gene codificante di una cellula può provocare frameshift e successiva knockout funzionale di un locus genico ad alta efficienza. 2 Durante questo protocollo descrive l&#39;uso di ZFNs per creare un gene knockout, l&#39;integrazione di transgeni può anche essere effettuata tramite omologia-diretto di riparazione presso il sito di taglio ZFN. Il CompoZr personalizzato ZFN Servizio rappresenta un approccio sistematico, completo e ben caratterizzato per l&#39;editing genica mirata per la comunità scientifica con la tecnologia ZFN. Sigma scienziati lavorano a stretto contatto con gli investigatori a 1) perform l&#39;analisi di due diligence compresa l&#39;analisi della struttura del gene corrispondente, la biologia, e il sistema del modello conformemente agli obiettivi del progetto, 2) applicare questa conoscenza per sviluppare una buona strategia di targeting, 3) poi progettare, costruire, validare e funzionalmente ZFNs per l&#39;attività in una rilevante linea cellulare. L&#39;investigatore riceve positivo DNA genomico di controllo e primer, e pronto per l&#39;uso ZFN reagenti forniti sia DNA plasmide e in-vitro formato mRNA trascritto. Questi reagenti possono poi essere consegnati per l&#39;espressione transiente nella linea cellulare del ricercatore o tipo di cellula di scelta. I campioni vengono poi testati per la modifica genetica al locus di interesse mediante le normali tecniche di biologia molecolare tra cui PCR, digestione enzimatica ed elettroforesi. Dopo segnale positivo per l&#39;editing gene viene rilevato nella popolazione iniziale, le cellule sono unicellulare clonato e genotipizzati per l&#39;identificazione di cloni mutanti / alleli.

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Genome Editing with CompoZr Custom Zinc Finger Nucleases ZFNs

Il CompoZr personalizzati a dita di zinco nucleasi (ZFN) Service consente editing preciso genoma in qualsiasi organismo o linea cellulare in qualsiasi luogo definito dall&#39;utente. Questo articolo descrive il processo per la progettazione, produzione, validazione e implementazione del Servizio CompoZr personalizzato ZFN.

Genome Editing con nucleasi zinco Finger CompoZr personalizzati (ZFNs)

Genome editing is a powerful technique that can be used to elucidate gene function and the genetic basis of disease. Traditional gene editing methods such ...

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Biology

Genome Editing with CompoZr Custom Zinc Finger Nucleases (ZFNs)

25.3K Views.  Sigma Life Science. Il CompoZr personalizzati a dita di zinco nucleasi (ZFN) Service consente editing preciso genoma in qualsiasi organismo o linea cellulare in qualsiasi luogo definito dall'utente. Questo articolo descrive il processo per la progettazione, produzione, validazione e implementazione del Servizio CompoZr personalizzato ZFN.

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Gross and Fine Dissection of Inner Ear Sensory Epithelia in Adult Zebrafish (Danio rerio)

Neurosensory epithelia in the inner ear are the crucial structures for hearing and balance functions. Therefore, it is important to understand the cellular and molecular features of the epithelia, which are mainly composed of two types of cells: hair cells (HCs) and supporting cells (SCs). Here we choose to study the inner ear sensory epithelia in adult zebrafish not only because the epithelial structures are highly conserved in all vertebrates studied, but also because the adult zebrafish is able to regenerate HCs, an ability that mammals lose shortly after birth. We use the inner ear of adult zebrafish as a model system to study the mechanisms of inner ear HC regeneration in adult vertebrates that could be helpful for clinical therapy of hearing/balance deficits in human as a result of HC loss.
Here we demonstrate how to do gross and fine dissections of inner ear sensory epithelia in adult zebrafish. The gross dissection removes the tissues surrounding the inner ear and is helpful for preparing tissue sections, which allows us to examine the detailed structure of the sensory epithelia. The fine dissection cleans up the non-sensory-epithelial tissues of each individual epithelium and enables us to examine the heterogeneity of the whole epithelium easily in whole-mount epithelial samples.

Gross and Fine Dissection of Inner Ear Sensory Epithelia in Adult Zebrafish Danio rerio

The inner ear sensory epithelium of adult zebrafish is a good model system for understanding the mechanisms of hair cell regeneration in adult vertebrates. This protocol demonstrates the fine dissection of the epithelia, through which we can get tissue samples for studying the regenerative events at cellular and subcellular levels.

Dissezione lordo e Arti di epiteli sensoriali dell&#39;orecchio interno in adulti Zebrafish ( Danio rerio)

Neurosensory epithelia in the inner ear are the crucial structures for hearing and balance functions. Therefore, it is important to understand the ...

Ricerca

Biologia

A Tactile Automated Passive-Finger Stimulator (TAPS)

Although tactile spatial acuity tests are used in both neuroscience research and clinical assessment, few automated devices exist for delivering controlled spatially structured stimuli to the skin. Consequently, investigators often apply tactile stimuli manually. Manual stimulus application is time consuming, requires great care and concentration on the part of the investigator, and leaves many stimulus parameters uncontrolled. We describe here a computer-controlled tactile stimulus system, the Tactile Automated Passive-finger Stimulator (TAPS), that applies spatially structured stimuli to the skin, controlling for onset velocity, contact force, and contact duration. TAPS is a versatile, programmable system, capable of efficiently conducting a variety of psychophysical procedures. We describe the components of TAPS, and show how TAPS is used to administer a two-interval forced-choice tactile grating orientation test.
Corresponding Author: Daniel Goldreich

A Tactile Automated Passive-Finger Stimulator TAPS

We describe a computer-controlled device for investigating the sense of touch: the Tactile Automated Passive-finger Stimulator (TAPS). We describe the components of TAPS, and show how TAPS is used to administer a two-interval forced-choice tactile grating orientation test.

Un tattile automatica Passive-Finger stimolatore (TAPS)

Although tactile spatial acuity tests are used in both neuroscience research and clinical assessment, few automated devices exist for delivering ...

Measurement Of Neuromagnetic Brain Function In Pre-school Children With Custom Sized MEG

Magnetoencephalography is a technique that detects magnetic fields associated with cortical activity [1]. The electrophysiological activity of the brain generates electric fields  - that can be recorded using electroencephalography (EEG)- and their concomitant magnetic fields  - detected by MEG. MEG signals are detected by specialized sensors known as superconducting quantum interference devices (SQUIDs). Superconducting sensors require cooling with liquid helium at -270 &deg;C. They are contained inside a vacumm-insulated helmet called a dewar, which is filled with liquid. SQUIDS are placed in fixed positions inside the helmet dewar in the helium coolant, and a subject's head is placed inside the helmet dewar for MEG measurements. The helmet dewar must be sized to satisfy opposing constraints. Clearly, it must be large enough to fit most or all of the heads in the population that will be studied. However, the helmet must also be small enough to keep most of the SQUID sensors within range of the tiny cerebral fields that they are to measure. Conventional whole-head MEG systems are designed to accommodate more than 90% of adult heads. However adult systems are not well suited for measuring brain function in pre-school chidren whose heads have a radius several cm smaller than adults. The KIT-Macquarie Brain Research Laboratory at Macquarie University uses a MEG system custom sized to fit the heads of pre-school children. This child system has 64 first-order axial gradiometers with a 50 mm baseline[2] and is contained inside a magnetically-shielded room (MSR) together with a conventional adult-sized MEG system [3,4]. There are three main advantages of the customized helmet dewar for studying children. First, the smaller radius of the sensor configuration brings the SQUID sensors into range of the neuromagnetic signals of children's heads. Second, the smaller helmet allows full insertion of a child's head into the dewar. Full insertion is prevented in adult dewar helmets because of the smaller crown to shoulder distance in children. These two factors are fundamental in recording brain activity using MEG because neuromagnetic signals attenuate rapidly with distance. Third, the customized child helmet aids in the symmetric positioning of the head and limits the freedom of movement of the child's head within the dewar. When used with a protocol that aligns the requirements of data collection with the motivational and behavioral capacities of children, these features significantly facilitate setup, positioning, and measurement of MEG signals.

The advent of MEG systems sized for young children opens important new opportunities to study brain development. The new system, together with a protocol that aligns experimental requirements with the capacities of children, can be used to study cognitive and language processes in healthy, awake children aged three to six.

Misurazione della funzione cerebrale Neuromagnetic In bambini in età prescolare con dimensioni personalizzate MEG

Magnetoencephalography is a technique that detects magnetic fields associated with cortical activity [1]. The electrophysiological activity of the brain ...

iCLIP - Transcriptome-wide Mapping of Protein-RNA Interactions with Individual Nucleotide Resolution

The unique composition and spatial arrangement of RNA-binding proteins (RBPs) on a transcript guide the diverse aspects of post-transcriptional regulation1. Therefore, an essential step towards understanding transcript regulation at the molecular level is to gain positional information on the binding sites of RBPs2.
Protein-RNA interactions can be studied using biochemical methods, but these approaches do not address RNA binding in its native cellular context. Initial attempts to study protein-RNA complexes in their cellular environment employed affinity purification or immunoprecipitation combined with differential display or microarray analysis (RIP-CHIP)3-5. These approaches were prone to identifying indirect or non-physiological interactions6. In order to increase the specificity and positional resolution, a strategy referred to as CLIP (UV cross-linking and immunoprecipitation) was introduced7,8. CLIP combines UV cross-linking of proteins and RNA molecules with rigorous purification schemes including denaturing polyacrylamide gel electrophoresis. In combination with high-throughput sequencing technologies, CLIP has proven as a powerful tool to study protein-RNA interactions on a genome-wide scale (referred to as HITS-CLIP or CLIP-seq)9,10. Recently, PAR-CLIP was introduced that uses photoreactive ribonucleoside analogs for cross-linking11,12.
Despite the high specificity of the obtained data, CLIP experiments often generate cDNA libraries of limited sequence complexity. This is partly due to the restricted amount of co-purified RNA and the two inefficient RNA ligation reactions required for library preparation. In addition, primer extension assays indicated that many cDNAs truncate prematurely at the crosslinked nucleotide13. Such truncated cDNAs are lost during the standard CLIP library preparation protocol. We recently developed iCLIP (individual-nucleotide resolution CLIP), which captures the truncated cDNAs by replacing one of the inefficient intermolecular RNA ligation steps with a more efficient intramolecular cDNA circularization (Figure 1)14. Importantly, sequencing the truncated cDNAs provides insights into the position of the cross-link site at nucleotide resolution. We successfully applied iCLIP to study hnRNP C particle organization on a genome-wide scale and assess its role in splicing regulation14.

The spatial arrangement of RNA-binding proteins on a transcript is a key determinant of post-transcriptional regulation. Therefore, we developed individual-nucleotide resolution UV crosslinking and immunoprecipitation (iCLIP) that allows precise genome-wide mapping of the binding sites of an RNA-binding protein.

iClip - trascrittoma livello Mappatura delle interazioni proteina-RNA con risoluzione individuale Nucleotide

The unique composition and spatial arrangement of RNA-binding proteins (RBPs) on a transcript guide the diverse aspects of post-transcriptional ...

Performing Custom MicroRNA Microarray Experiments

microRNAs (miRNAs) are a large family of &tilde; 22 nucleotides (nt) long RNA molecules that are widely expressed in eukaryotes 1. Complex genomes encode at least hundreds of miRNAs, which primarily inhibit the expression of a vast number of target genes post-transcriptionally 2, 3. miRNAs control a broad range of biological processes 1. In addition, altered miRNA expression has been associated with human diseases such as cancers, and miRNAs may serve as biomarkers for diseases and prognosis 4, 5. It is important, therefore, to understand the expression and functions of miRNAs under many different conditions.
Three major approaches have been employed to profile miRNA expression: real-time PCR, microarray, and deep sequencing. The technique of miRNA microarray has the advantage of being high-throughput, generally less expensive, and most of the experimental and analysis steps can be carried out in a molecular biology laboratory at most universities, medical schools and associated hospitals. Here, we describe a method for performing custom miRNA microarray experiments. A miRNA probe set will be printed on glass slides to produce miRNA microarrays. RNA is isolated using a method or reagent that preserves small RNA species, and then labeled with a fluorescence dye. As a control, reference DNA oligonucleotides corresponding to a subset of miRNAs are also labeled with a different fluorescence dye. The reference DNA will serve to demonstrate the quality of the slide and hybridization and will also be used for data normalization. The RNA and DNA are mixed and hybridized to a microarray slide containing probes for most of the miRNAs in the database. After washing, the slide is scanned to obtain images, and intensities of the individual spots quantified. These raw signals will be further processed and analyzed as the expression data of the corresponding miRNAs. Microarray slides can be stripped and regenerated to reduce the cost of microarrays and to enhance the consistency of microarray experiments. The same principles and procedures are applicable to other types of custom microarray experiments.

A simple procedure of performing custom microRNA microarray experiments is described. The steps include isolating RNA, labeling RNA and reference DNA, hybridizing the samples to microarrays, scanning the microarrays, quantifying and analyzing hybridization signals.

Esecuzione personalizzati Esperimenti di Microarray MicroRNA

microRNAs (miRNAs) are a large family of &tilde; 22 nucleotides (nt) long RNA molecules that are widely expressed in eukaryotes 1.  Complex genomes encode ...

Mouse Genome Engineering Using Designer Nucleases

Transgenic mice carrying site-specific genome modifications (knockout, knock-in) are of vital importance for dissecting complex biological systems as well as for modeling human diseases and testing therapeutic strategies. Recent advances in the use of designer nucleases such as zinc finger nucleases (ZFNs), transcription activator-like effector nucleases (TALENs), and the clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/CRISPR-associated (Cas) 9 system for site-specific genome engineering open the possibility to perform rapid targeted genome modification in virtually any laboratory species without the need to rely on embryonic stem (ES) cell technology. A genome editing experiment typically starts with identification of designer nuclease target sites within a gene of interest followed by construction of custom DNA-binding domains to direct nuclease activity to the investigator-defined genomic locus. Designer nuclease plasmids are in vitro transcribed to generate mRNA for microinjection of fertilized mouse oocytes. Here, we provide a protocol for achieving targeted genome modification by direct injection of TALEN mRNA into fertilized mouse oocytes.

Designer nucleases such as zinc finger nucleases (ZFNs) and transcription activator-like effector nucleases (TALENs) can be used to modify the genome of mouse preimplantation embryos by triggering both the nonhomologous end joining (NHEJ) and homologous recombination (HR) pathways. These advances enable the rapid generation of mice with precise genetic modifications.

Genoma Ingegneria mouse usando Nucleases Designer

Transgenic mice carrying site-specific genome modifications (knockout, knock-in) are of vital importance for dissecting complex biological systems as well ...

Zinc-finger Nuclease Enhanced Gene Targeting in Human Embryonic Stem Cells

One major limitation with current human embryonic stem cell (ESC) differentiation protocols is the generation of heterogeneous cell populations.&#160;These cultures contain the cells of interest, but are also contaminated with undifferentiated ESCs, non-neural derivatives and other neuronal subtypes.&#160; This limits their use in in vitro and in vivo applications, such as in vitro modeling for drug discovery or cell replacement therapy. To help overcome this, reporter cell lines, which offer a means to visualize, track and isolate cells of interest, can be engineered.&#160;However, to achieve this in human embryonic stem cells via conventional homologous recombination is extremely inefficient.&#160;This protocol describes targeting of the Pituitary homeobox 3 (PITX3) locus in human embryonic stem cells using custom designed zinc-finger nucleases, which introduce site-specific double-strand DNA breaks, together with a PITX3-EGFP-specific DNA donor vector. Following the generation of the PITX3 reporter cell line, it can then be differentiated using published protocols for use in studies such as in vitro Parkinson&#8217;s disease modeling or cell replacement therapy.

Reporter cell lines offer a means to visualize, track and isolate cells of interest from heterogeneous populations.&#160;However, gene-targeting using conventional homologous recombination in human embryonic stem cells is extremely inefficient. Herein, we describe targeting CNS midbrain specific transcription factor PITX3 locus with EGFP using zinc-finger nuclease enhanced homologous recombination.

Zinc-finger nucleasi avanzata gene targeting in cellule staminali embrionali umane

One major limitation with current human embryonic stem cell (ESC) differentiation protocols is the generation of heterogeneous cell ...

Direct Protein Delivery to Mammalian Cells Using Cell-permeable Cys2-His2 Zinc-finger Domains

Due to their modularity and ability to be reprogrammed to recognize a wide range of DNA sequences, Cys2-His2 zinc-finger DNA-binding domains have emerged as useful tools for targeted genome engineering. Like many other DNA-binding proteins, zinc-fingers also possess the innate ability to cross cell membranes. We recently demonstrated that this intrinsic cell-permeability could be leveraged for intracellular protein delivery. Genetic fusion of zinc-finger motifs leads to efficient transport of protein and enzyme cargo into a broad range of mammalian cell types. Unlike other protein transduction technologies, delivery via zinc-finger domains does not inhibit enzyme activity and leads to high levels of cytosolic delivery. Here a detailed step-by-step protocol is presented for the implementation of zinc-finger technology for protein delivery into mammalian cells. Key steps for achieving high levels of intracellular zinc-finger-mediated delivery are highlighted and strategies for maximizing the performance of this system are discussed.

Direct Protein Delivery to Mammalian Cells Using Cell-permeable Cys2-His2 Zinc-finger Domains

Zinc-finger domains are intrinsically cell-permeable and capable of mediating protein delivery into a broad range of mammalian cell types. Here, a detailed step-by-step protocol for implementing zinc-finger technology for intracellular protein delivery is presented.

Diretto Protein Consegna a cellule di mammifero Utilizzando Cell-permeabile Cys<sub&gt; 2</sub&gt; -Il suo<sub&gt; 2</sub&gt; domini zinc-finger

Due to their modularity and ability to be reprogrammed to recognize a wide range of DNA sequences, Cys2-His2 zinc-finger DNA-binding domains have emerged ...

Genome Editing in Astyanax mexicanus Using Transcription Activator-like Effector Nucleases (TALENs)

Identifying alleles of genes underlying evolutionary change is essential to understanding how and why evolution occurs. Towards this end, much recent work has focused on identifying candidate genes for the evolution of traits in a variety of species. However, until recently it has been challenging to functionally validate interesting candidate genes. Recently developed tools for genetic engineering make it possible to manipulate specific genes in a wide range of organisms. Application of this technology in evolutionarily relevant organisms will allow for unprecedented insight into the role of candidate genes in evolution. Astyanax mexicanus (A. mexicanus) is a species of fish with both surface-dwelling and cave-dwelling forms. Multiple independent lines of cave-dwelling forms have evolved from ancestral surface fish, which are interfertile with one another and with surface fish, allowing elucidation of the genetic basis of cave traits. A. mexicanus has been used for a number of evolutionary studies, including linkage analysis to identify candidate genes responsible for a number of traits. Thus, A. mexicanus is an ideal system for the application of genome editing to test the role of candidate genes. Here we report a method for using transcription activator-like effector nucleases (TALENs) to mutate genes in surface A. mexicanus. Genome editing using TALENs in A. mexicanus has been utilized to generate mutations in pigmentation genes. This technique can also be utilized to evaluate the role of candidate genes for a number of other traits that have evolved in cave forms of A. mexicanus.

Genome Editing in Astyanax mexicanus Using Transcription Activator-like Effector Nucleases TALENs

Gene-targeting mutagenesis is now possible in a wide range of organisms using genome editing techniques. Here, we demonstrate a protocol for targeted gene mutagenesis using transcription activator like effector nucleases (TALENs) in Astyanax mexicanus, a species of fish that includes surface fish and cavefish.

Genome Editing in<em&gt; Mexicanus Astianatte</em&gt; Uso Trascrizione Activator simile Effector nucleasi (Talens)

Identifying alleles of genes underlying evolutionary change is essential to understanding how and why evolution occurs.  Towards this end, much recent ...

Assessing Mineral Availability in Fish Feeds using Complementary Methods Demonstrated with the Example of Zinc in Atlantic Salmon

Assessing the availability of dietary micro-minerals is a major challenge in mineral nutrition of fish species. The present article aims to describe a systematic approach combining different methodologies to assess the availability of zinc (Zn) in Atlantic salmon (Salmo salar). Considering that several Zn chemical species can be present in an Atlantic salmon feed, it was hypothesised that Zn availability is influenced by the Zn chemical species present in the feed. Thus, in this study, the first protocol is about how to extract the different Zn chemical species from the feed and to analyze them by a size exclusion chromatography-inductively coupled plasma mass spectroscopy (SEC-ICP-MS) method. Subsequently, an in vitro method was developed to evaluate the solubility of dietary Zn in Atlantic salmon feeds. The third protocol describes the method to study the impact of changing Zn chemical species composition on the uptake of Zn in a fish intestinal epithelial model using a rainbow trout gut cell line (RTgutGC). Together, the findings from the in vitro methods were compared with an in vivo study examining the apparent availability of inorganic and organic sources of Zn supplemented to Atlantic salmon feeds. The results showed that several Zn chemical species can be found in feeds and the efficiency of an organic Zn source depends very much on the amino acid ligand used to chelate Zn. The findings of the in vitro methods had less correlation with that outcome of the in vivo study. Nevertheless, in vitro protocols described in this article provided crucial information regarding Zn availability and its assessment in fish feeds.

This article explains in detail a systematic approach to assess micro-mineral availability in Atlantic salmon. The methodology includes tools and models with increasing biological complexity: (1) chemical speciation analysis, (2) in vitro solubility, (3) uptake studies in cell lines, and (4) in vivo fish studies.&#160;

Valutazione della disponibilità di minerali nei mangimi per pesci utilizzando metodi complementari dimostrati con l'esempio di zinco nel salmone atlantico

Assessing the availability of dietary micro-minerals is a major challenge in mineral nutrition of fish species. The present article aims to describe a ...