Il nostro protocollo facilita la preparazione di topi geneticamente modificati in modo semplice, efficiente e rapido da embrioni di topo a singola cellula. Il nostro protocollo combina l'uso di embrioni a una cellula congelati ed elettroporazione che consentono la rapida generazione di topi geneticamente modificati, compresi i topi mutanti ad alta efficienza e bassi tassi di mosaico. Per la fecondazione in vitro, iniziare con la super ovulazione di topi C57BL/6J di quattro o otto settimane tramite iniezione intraperitoneale di 7,5 unità internazionali di gonadotropina del siero della cavalla incinta seguita da iniezione intraperitoneale di 7,5 unità internazionali di gonadotropina corionica umana 48 ore dopo.
Successivamente, rimuovere l'epididimo cauda dai topi C57BL/6J maschi sessualmente maturi di tre o cinque mesi e utilizzare un ago sezionante per estrarre coaguli di spermatozoi. Quindi incubare i coaguli in una goccia di 200 microliter di HTF a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica per 1,5 ore per la capacità. Da 16 a 18 ore dopo l'iniezione di gonadotropina corionica umana, raccogliere i complessi di ovocite cumulos dagli ovidotti e incubare i complessi con 200 microlitri di HTF coperti di paraffina liquida per un'incubazione non superiore a due ore nell'incubatore di coltura cellulare.
Alla fine dell'incubazione, aggiungere da uno a cinque microlitri di sospensione dello sperma dal limite del mezzo di incubazione alla goccia di 200 microlitri dei complessi di ovocito cumulo e posizionare la co-coltura nell'incubatore di coltura cellulare per tre ore. Al termine dell'incubazione, lavare gli ovociti con potassio integrato con il mezzo di ottimizzazione simplex tre volte per rimuovere eventuali spermatozoi e cellule cumuliche rimanenti e utilizzare un microscopio invertito per controllare la formazione pronucleare e il grado degli embrioni di una cellula. Per la crioconservazione di un embrione cellulare, trasferire gli embrioni in una nuova goccia di 200 microliter di HTF integrata con siero bovino fetale al 20% per un'incubazione di 10 minuti nell'incubatore di coltura cellulare.
Al termine dell'incubazione, trasferire da 20 a 100 embrioni a 50 microlitri di una soluzione di solfossido di dimetile molare e trasferire fino a 100 embrioni in cinque microlitri di soluzione sul fondo di un criotubo. Raffreddare gli embrioni per cinque minuti a zero gradi Celsius prima di aggiungere 45 microlitri di soluzione DAP213 lungo il lato del tubo. Dopo il tappo, conservare le celle per altri cinque minuti a zero gradi Celsius prima di conservare rapidamente il tubo in azoto liquido.
Preparare un microgrammo per microlitro di RNA CRISPR e un microgrammo per microlitro di tracrRNA in un mezzo essenziale minimo siero ridotto. Aggiungere sei microlitri di ogni soluzione di RNA a 42 microlitri di tampone privo di nucleasi e posizionare la miscela in un riscaldatore a secco per tre minuti a 95 gradi Celsius. Al termine dell'incubazione, raffreddare la miscela a temperatura ambiente per cinque minuti e preparare un microgrammo per microlitri della proteina HiFi Cas9 con mezzo essenziale minimo siero ridotto.
Aggiungere sei microlitri della soluzione HiFi Cas9 diluita alla soluzione di RNA e trasferire fino a 100 embrioni scongelati in 25 microlitri della soluzione complessa di ribonucleoproteina risultante in un intero scivolo di vetro. Quindi incubare gli embrioni per 10 minuti a 37 gradi Celsius. Per l'elettroporazione embrionale, al termine dell'incubazione, impostare i parametri dell'elettroporatore e caricare il vetrino sull'elettroporatore.
L'elettroporazione deve essere eseguita entro un'ora dal disgelo dell'embrione per garantire che l'editing del genoma avvenga prima della prima replicazione del DNA e per prevenire il mosaicismo. Dopo l'elettroporazione, lavare gli embrioni tre volte con tampone di bicarbonato Krebs-Ringer modificato due mezzi in due lavaggi con una goccia di potassio integrata mezzo di ottimizzazione simplex ricoperto di paraffina liquida. Quindi incubare gli embrioni in potassio fresco integrato mezzo di ottimizzazione simplex nell'incubatore di coltura cellulare durante la notte.
L'uso di questo metodo di crioconservazione modificato per embrioni a una cellula migliora il tasso di sviluppo degli embrioni congelati allo stadio a due cellule. Usando questo metodo, tutti i topi generati in questo esperimento rappresentativo erano albini con un solo topo a mosaico con un mantello con macchie bianche e nere. Qui si può osservare una sezione rappresentativa di un cromatogramma di un topo albino contenente l'allele M1.
Come illustrato, il protocollo può generare topi knockout e knock-in con alta efficienza e bassi tassi di mosaico. Infatti, la progenie F1 della prole Omozigota F0 è eterozigote contenente un allele mutante e un allele di tipo selvatico senza mutazioni disparate. Ricorda che l'uovo fecondato è fragile in una fase di una cellula.
L'aggiunta di siero bovino fetale rinforza l'embrione. Tuttavia, deve essere gestito con attenzione in ogni fase. Questo metodo può contribuire all'analisi della funzione genica e alla ricerca sulle malattie umane facilitando una produzione più rapida ed efficiente di topi geneticamente modificati.
