Questo lavoro è stato sostenuto da NIH sovvenzioni P01 HL108801, R01-HL60234, R01-HL55330, R01-HL079904, a AMK Choi. S. Ryter ricevuto il sostegno di stipendio dal Lovelace Respiratory Research Institute.

Nota: Il Comitato Istituzionale cura degli animali ed uso presso il Brigham and Women Hospital / Harvard Medical School di Ambito ha approvato le procedure seguenti. 1. Cecal legatura e puntura Utilizzare i topi dello stesso background (C57Bl / 6), di sesso maschile, 8-10 settimane di vita. Topi di sesso femminile sono più resistenti dei maschi contro letalità indotta da sepsi. I topi più vecchi di 8 settimane producono risultati variabili in meno rispetto ai topi più giovani in termini di sopravvivenza dopo CLP. Circa N = 10 topi per gruppo rispetto dovrebbero essere usati per l&#39;analisi di sopravvivenza. N = 3-5 topi è sufficiente per saggi autofagia. <ol><li> Usare piccoli strumenti chirurgici sterili (cioè bisturi, forbici e pinze anatomiche contundenti), che dovrebbero essere adeguate per un intervento chirurgico roditore. </li><li> Preparare la miscela di anestesia: per 7,95 ml di PBS aggiungere 150 ml di xylazina (AnaSed iniezione di 100 mg / ml) e 700 ml di ketamina (Ketaset &#160; CIII, 100 mg / ml). </li><li> Per garantire condizioni asettiche durante la procedura, indossare guanti, mascherina e camice chirurgico. </li><li> Pesare animali. Li anestetizzare iniettando intraperitonally (ip) la miscela di cui al punto 3 in un dosaggio di microlitri (10x peso corporeo in g). Ad esempio, per un mouse pesatura 22 g, amministrare 10x22 = 220 microlitri della miscela anestetica. Così, le dosi finali di xilazina e ketamina sono 17 e 80 mg / kg di peso corporeo, rispettivamente. Assicurarsi che l&#39;anestesia sia adeguata, senza la flessione di arto dovrebbe essere prodotto dopo pizzico punta. Nota: Usare pomata oftalmica sugli occhi per prevenire la secchezza mentre sotto anestesia. </li><li> Posizionare gli animali su una superficie di lavoro pulita sulle loro spalle. Coda e le zampe posteriori sono orientati verso l&#39;investigatore. Disinfettare la cute addominale con alcool (soluzione di EtOH 70%) Nota:. Area chirurgica deve essere completamente rasata, per evitare la contaminazione della ferita attraverso il contatto conpelliccia. Inoltre, in modo ottimale, un pad circolare l&#39;acqua calda deve essere utilizzato per mantenere la normotermia di topi anestetizzati durante l&#39;intervento chirurgico. </li><li> Utilizzando un bisturi, fare una piccola incisione cutanea longitudinale parallelo e circa 1 cm a sinistra per linea mediana. Ancora non lo penetrare nella cavità peritoneale. Utilizzare piccole forbici per estendere l&#39;incisione iniziale. </li><li> Identify muscoli addominali e sezionare loro di accedere nella cavità peritoneale. </li><li> Utilizzando pinze anatomiche smussato, identificare il cieco e spostare fuori della cavità peritoneale. Fare attenzione a non danneggiare i vasi sanguigni mesenterial (questo potrebbe portare a un&#39;emorragia letale). </li><li> Legare il 60% del cieco per ottenere una sepsi di grado medio. Legando pari o superiore al 75% del cieco genere provoca alta qualità sepsi, mentre legando pari o inferiore al 25% dei risultati cieco a basso grado di sepsi. Fare attenzione a non legare la valvola ileocecale (questo potrebbe bloccare la continuità intestinale). </li><li> Utilizzando un21 ago G, perforare il cieco per uno attraverso-e-attraverso puntura (due fori) vicino al legatura. La direzione della perforazione dovrebbe essere dalla mesenterica al lato anti-mesenterico del cieco. Fare attenzione a non forare i vasi sanguigni mesenterial. </li><li> Rimuovere l&#39;ago. Premere delicatamente il cieco legatura per confermare la pervietà attraverso i due fori, solo una piccola quantità di feci deve essere estruso attraverso di loro. </li><li> Spostare il cieco ligato e forato nella cavità peritoneale. Nota: Per i topi sham, saltare i punti 1,10-1,12. </li><li> Utilizzare seta suture chirurgiche 6-0 con il taglio ago per chiudere muscolatura addominale. Utilizzare seta suture chirurgiche 6-0 con il taglio ago per chiudere cute addominale. </li><li> Iniettare 1 ml preriscaldata (37 ° C) normale ip soluzione fisiologica per sostituire il calore e l&#39;idratazione persa durante la procedura. Mettere i topi sotto una lampada di calore fino alla loro rianimazione Nota:. Ottimale, un dispositivo di riscaldamento più sicuro (such come pad acqua calda circolante) può essere usata al posto di una lampada di calore. </li><li> Dopo l&#39;intervento iniettare buprenorfina (0,05 mg / kg di peso corporeo sc.) Per ottenere analgesia. Nota: Un animale non deve essere lasciato incustodito fino a quando non ha ripreso conoscenza sufficiente per mantenere decubito sternale. Un animale che ha subito un trattamento chirurgico non deve essere restituito alla compagnia di altri animali fino alla completa guarigione. </li><li> Mettere gli animali nel loro gabbie con accesso illimitato al cibo e all&#39;acqua. I topi saranno sacrificati quando diventano moribondi (indicato da segni clinici come l&#39;insufficienza di muoversi quando è toccato o cianosi). Controllare topi ogni 4 ore per evitare di dover morire prima di eutanasia. </li></ol> 2. Tissue Harvest e Fixation <ol><li> Preparare una soluzione al 4% paraformaldeide (PFA): per 889 ml di PBS aggiungere 111 ml di 37% PFA. </li><li> Sacrifica topi utilizzando CO 2 narcosi indotta o ketamina / xylazina soluzione in un alto dosaggio. </li><li> Immobilizzare il mouse su una superficie di lavoro pulita. Spruzzare la cute addominale e toracica con una soluzione di EtOH 70% di disinfettarlo. </li><li> Utilizzare un bisturi e piccole forbici per rimuovere la pelle addominale e toracica, nonche la pelle che copre la zona tracheale. </li><li> Rivela trachea rimuovendo suoi tessuti circostanti (muscoli e tessuto connettivo). </li><li> Collocare una sutura (senza tagliare ago) intorno alla trachea. Non serrare ancora. </li><li> Utilizzare un piccolo catetere venoso periferico (20 G) per trachea &#39;intubate&#39;. Prestare attenzione durante l&#39;inserimento del catetere per evitare tracheale strappo. Si noti che il diametro della trachea è appena sotto la cartilagine cricoide. </li><li> Stringere la sutura intorno alla trachea / catetere. Rimuovere l&#39;ago lasciando solo la cannula di plastica del catetere nella trachea. Ago serviva solo come un filo guida per l&#39;inserimento della cannula di plastica. </li><li> Dopo aver ottenuto la cannula di plastica nella trachea, tagliare the muscolatura addominale, aprire l&#39;addome e rivelare la membrana. </li><li> Utilizzando un ago, forare la membrana per produrre pneumotorace (cioè inserimento di aria nella cavità pleurica). I polmoni dovrebbero quindi essere crollati. </li><li> Utilizzando piccole forbici, rimuovere il diaframma, tagliare lungo lo sterno (sternotomia), rimuovere la gabbia toracica e rivelare il cuore ei polmoni. </li><li> Attraverso la cannula di plastica inserito nella trachea, fissare i polmoni con la soluzione di formaldeide sotto i 30 cm H 2 O di pressione. </li><li> Rimuovere i polmoni e metterli nel 4% PFA per 24 ore e successivamente in soluzione al 70% EtOH fino al trattamento. </li><li> Identificare e rimuovere cuore, fegato e reni. Allo stesso modo, posizionarli nel 4% PFA per 24 ore e successivamente in soluzione al 70% EtOH fino trasformazione. </li></ol> 3. I topi GFP e la visualizzazione di diapositive GFP <ol><li> Eseguire CLP e chirurgia simulata su topi GFP-LC3, come descritto al punto 1, e la procedura di postoperatorias come descritto al punto 2 del protocollo. </li><li> Incorporare i tessuti (in particolare i polmoni, cuore, fegato e reni) in paraffina e tagliarli in serie 5 micron sezioni. </li><li> Quando pronto per GFP colorazione, incubare a 60 ° C per 30-60 min finché si scioglie e tessuto paraffina appare traslucido. </li><li> Deparaffinare con lo standard serie graduata di xilene o sostituti, 5 min xilene 1, 2, xilene e xilene 3 di 3 min di incubazione in serie graduata di EtOH: 100%, 95%, 75%, e poi sciacquare con acqua distillata. Nota: Dopo deparaffinizzazione evitare l&#39;essiccamento dei tessuti, che aumenta del campione sfondo. </li><li> Eseguire recupero dell&#39;antigene utilizzando tampone acido citrico (10 mM acido citrato di sodio, 0,05% Tween 20, pH 6,0), nell&#39;apparecchiatura a microonde per 10-20 min. Fare attenzione di sostituire tampone periodicamente per evitare l&#39;essiccamento del tessuto. </li><li> Lasciare raffreddare la soluzione per 20 minuti in panchina per completare il recupero dell&#39;antigene. </li><li> Lavare 2-3x con PBS. Rimuovere l&#39;eccesso di tampone e tradinsfer scivola da rack per posizione orizzontale in una scatola diapositiva o altra camera umidificata per evitare l&#39;essiccamento. </li><li> Bloccare 45-60 min a temperatura ambiente con 10% di siero asino normale (anche 5% di siero albumina bovina, o preferibilmente siero dall&#39;animale in cui si genera l&#39;anticorpo secondario) in PBS. </li><li> Incubare i campioni in anticorpo GFP primario in diluizione 1:100 in PBS notte a 4 ° C in camera umidificata. Applicare delicatamente piccoli pezzi di Parafilm su tessuto con anticorpi per favorire il contatto omogeneo con il tessuto ed evitare l&#39;evaporazione. Nota: passaggi rimanenti vengono eseguiti a temperatura ambiente. </li><li> Lavare 5x con PBS per rimuovere l&#39;anticorpo primario in eccesso. Incubare con anticorpo secondario 1:500-1:1,000 in PBS per 1-2 ore a temperatura ambiente. </li><li> Lavare 5x con PBS per rimuovere l&#39;anticorpo secondario in eccesso. Se lo si desidera, Controcolorare il vetrini in questa fase. </li><li> Se si utilizza anticorpo secondario fluorescente, incubare 0,1% di nero Sudan nel 70% EtOH fo 15-20 min per ridurre autofluorescenza. Pulire l&#39;eccesso Nero Sudan da circa tessuto e lavare 5x con PBS oltre 20 min. </li><li> Montare campione con vetrino e conservare in orizzontale, fino a soluzione di montaggio è impostato. </li></ol> 4. Protocollo Alternativa: Rilevazione diretta di GFP-LC3 <ol><li> Cannulare e gonfiare i polmoni con una ~ 500 ml di 50/50 v / v Ottobre PBS. </li><li> Incorporare in OCT mettendo una piccola quantità di Office nella parte inferiore di un cryomold. </li><li> Posizionare con cura il complesso polmone sezionato nello stampo. </li><li> Lentamente gelare metilbutano refrigerati con ghiaccio secco. </li><li> Aggiungere più OCT finché il tessuto è completamente coperto e solidifica. Tenere in ghiaccio secco e conservare a -80 ° C. </li><li> Utilizzando un cryomicrotome, tagliare 5-10 micron sezioni spesse proteggono le sezioni dalla luce. Sezioni negozio e tessuto rimanente a -80 ° C. </li><li> Per preparare i vetrini per l&#39;imaging, togliere la parte dal congelatore e applicare immediatamente una goccia di PBS per prevenire l&#39;essiccamento. </li><li> Fix per 30 minuti con 4% PFA. Lavare con PBS. </li><li> Applicare DAPI / Hoescht per 10 min. Lavare 3x con PBS. </li><li> Montare campione con vetrino e conservare in orizzontale, fino a soluzione di montaggio è impostato. </li><li> Immagine con epifluorescenza o microscopio confocale. Conservare i campioni a 4 ° C per un massimo di un mese. </li></ol> 5. Preparazione di tessuto per microscopia elettronica <ol><li> Tagliare i tessuti in circa 1 millimetro cubi per il fissaggio. </li><li> Fissare il tessuto in 2% di formaldeide, glutaraldeide al 2,5% in 0,1 M tampone cacodilato di sodio, pH 7,4. </li><li> Lavare con 0,1 M tampone cacodilato di sodio per 1-2 ore. Nota: tessuto fisso può essere memorizzato in 0.1 M sodio cacodilato a 4 ° C. </li><li> Posta fix in 1% tetrossido di osmio in 0.2 M di sodio tampone cacodilato per 1 ora. </li><li> Sciacquare in 0.2 M di sodio tampone cacodilato per 10 min 3x. </li><li> Disidratare nel 70% EtOH, 20 min 2x. Disidratare nel 90% EtOH, 10 min 2x. Disidratare in 100% EtOH,20 min 2x. </li><li> Incubare con ossido di propilene (propano epossidica) per 10 min 2x. </li><li> Incubare con miscela di resina di ossido di propilene / epossidico (50:50) per 1 ora. La miscela di resina epossidica è: 24 g Agar resina 100, 13 g di anidride dodecenylsuccinic, 13 g di anidride methylnadic e 1 ml di N-benzildimetilammina. Mescolare accuratamente in un bicchiere usa e getta con una spatola di legno. </li><li> Incubare con epossidica notte resina in fiale non ridotti (questo consente a qualsiasi ossido di propilene residuo evaporare). </li><li> Incorpora in capsule etichettati con resina appena preparato. Polimerizzare a 60 ° C per 48 ore. </li><li> Sezioni di tessuto delle fotografie al microscopio elettronico a trasmissione a 80 o 60 kV su pellicola microscopio elettronico. Stampare le immagini su carta fotografica o memorizzare media come digitali. </li><li> Analizzare la formazione dell&#39;autofagosoma in cellule intatte contenenti nucleo. Campi a bassa potenza (e. G. 2.000-4.000 X) possono essere utilizzate per identificare le cellule nucleate. Tipicamente 6,800-10,000 immagini X vengono utilizzati per ªè la quantificazione dell&#39;autofagosoma. Conte autophagosomes per unità di superficie 15-30 campi per la rappresentazione statistica del caso. Autophagosomes hanno una struttura a doppia membrana, dove autophogosomes fase avanzata somigliavano vacuoli pieni. </li></ol>

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Gli autori non hanno concorrenti interessi finanziari di dichiarare

Il principale vantaggio di CLP è che permette ai ricercatori di indagare sepsi di diversi livelli di gravità (cioè da basso a medio e alto grado). Gravità della sepsi indotta è influenzata dalla lunghezza del cieco ligato (che il determinante più importante), la dimensione di ago usato per puntura e il numero di fori eseguiti 15. Inoltre, il ceppo di topi e di genere possono avere un impatto sulla gravità della sepsi; diversi ceppi sono più sensibili di altri e maschi sono generalmente più s...

La sepsi, la risposta infiammatoria sistemica all&#39;infezione, rappresenta una delle principali cause di morte nei pazienti criticamente malati-1. Infezioni intra-addominali, spesso portano alla sepsi polimicrobica, rappresentano il 20% dei casi di sepsi, che hanno sostanziale la mortalità fino al 60% 2. La mortalità associata alla sepsi risulta principalmente dalla disfunzione multi-organo con conseguente insufficienza d&#39;organo 3,4. Ulteriori indagini nel meccanismo patogenetico di questa malattia è urgentemente necessaria per promuovere lo sviluppo di nuove e più efficaci terapie. Il metodo di legatura del cieco e puntura (CLP) è una procedura comunemente utilizzata per la modellazione sepsi in vivo. Come il cieco è piena di batteri, i risultati di puntura in peritonite polimicrobica, traslocazione di batteri nel sangue (batteriemia), shock settico, disfunzione multi-organo e, infine, morte 5. E &#39;generalmente accettato che CLP riflette clinicarealtà più accurato rispetto alle tecniche precedenti, come l&#39;iniezione di endotossina o batteri anche depurati nei roditori, Così, CLP è considerato il gold standard (non senza limitazioni) 6 per l&#39;induzione sperimentale e, quindi, l&#39;indagine della patogenesi della sepsi. In questa monografia, descriviamo protocolli progettati per valutare se i meccanismi patogenetici di sepsi sono autofagia. L&#39;autofagia, un processo cellulare evolutivamente conservata, facilita il turnover delle proteine ​​e organelli come i mitocondri danneggiati e svolge un ruolo importante nella clearance dei patogeni intracellulari, tra cui i batteri 7,8. Durante l&#39;autofagia, proteine ​​citosoliche o organuli sono sequestrate in vescicole di membrana matrimoniali sono nominate autophagosomes, che vengono successivamente consegnati ai lisosomi per la degradazione 9. Un certo numero di proteine ​​sono stati identificati come gli omologhi mammiferi di geni autophagy correlati (ATG),originariamente identificato nel lievito, che regolano il processo di autofagia. La conversione dei microtubuli proteina associata-1 catena leggera 3B (LC3B) (omologo di Atg8) dal LC3B-I (forma libera) per LC3B-II (forma fosfatidiletanolamina coniugata) rappresenta un passo importante nella formazione dell&#39;autofagosoma 9. La disfunzione autophagic è associato con l&#39;invecchiamento e le malattie umane, tra cui il cancro e le malattie neurodegenerative 10. Inoltre, l&#39;autofagia colpisce l&#39;immunità innata e adattativa quali la presentazione dell&#39;antigene, lo sviluppo dei linfociti e la secrezione di citochine da parte delle cellule immunitarie 8. Pertanto, sembra ragionevole che autofagia potrebbe anche svolgere un ruolo nella risposta infiammatoria sistemica all&#39;infezione (cioè nella sepsi). Fino ad oggi diversi metodi sono stati descritti per valutare il ruolo dell&#39;autofagia in lesioni dei tessuti in vivo. Questi includono l&#39;uso di proteina fluorescente verde (GFP)-LC3 topi che esprimono e la quantificazione delle autophagosomes nel tessuto mediante microscopia elettronica (questi due metodi sono descritti in questa monografia). Altri metodi includono la quantificazione dell&#39;espressione della proteina autophagic in omogenati di tessuto, e l&#39;analisi del flusso autofagica (come descritto altrove) 11-13. L&#39;obiettivo di questa revisione è quello di fornire attuali protocolli per valutare l&#39;autofagia in vivo nel contesto della sepsi sperimentale.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" >
	<tbody>
		<tr >
			<td >GFP-LC3 Transgenic Mice</td>
			<td >Riken (Japan)</td>
			<td >RBRC00806</td>
			<td >GFP-LC3#53</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Xylazine</td>
			<td >Henry-Schein</td>
			<td >568-0606</td>
			<td>Xylazine HCl Injection Vet</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Ketamine</td>
			<td >Henry-Schein</td>
			<td >995-2949</td>
			<td>Ketaset Inj 100 mg/ml</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >EtOH</td>
			<td >Fisher</td>
			<td>A405-20</td>
			<td>Histology Grade</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >EtOH</td>
			<td >Fisher</td>
			<td>A407-1</td>
			<td>For Sterilizatiion</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >silk surgical sutures 6-0</td>
			<td >Owens &#38; Minor</td>
			<td >2300-0078OG, 017624</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >buprenorphine-HCl</td>
			<td >Henry-Schein</td>
			<td >614-5157</td>
			<td>Buprenex Ampules</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >paraformaldehyde (37%) solution</td>
			<td >JT Baker</td>
			<td >S898-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >xylenes</td>
			<td >Fisher</td>
			<td>X3P-1GAL </td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >anti-GFP monoclonal antibody</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>G10362</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Hoescht</td>
			<td >Sigma</td>
			<td>944403</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >DAPI</td>
			<td >Invitrogen</td>
			<td >D1306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >OCT</td>
			<td >VWR scientific</td>
			<td >25608-930</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sudan Black</td>
			<td >Santa Cruz</td>
			<td >sc-203760</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >EM grade Glutaraldehyde 2.5% in sodium cacodylate</td>
			<td >Electron microscopy Sciences</td>
			<td>15960</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >propylene oxide</td>
			<td >Sigma</td>
			<td>240397</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Agar 100 resin</td>
			<td >Agar scientific</td>
			<td > R1045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >dodecenylsuccinic anhydride</td>
			<td >Sigma</td>
			<td>46346</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >methylnadic anhydride</td>
			<td >Sigma</td>
			<td>45359</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >N-benzyldimethylamine</td>
			<td >Sigma</td>
			<td>185582</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

cecal ligation and puncture-induced sepsis as a model to study autophagy in mice

Sepsi sperimentale può essere indotta in topi usando la legatura del cieco e puntura metodo (CLP), che causa sepsi polimicrobica. Qui, un protocollo è realizzato per indurre sepsi di gravità variabile nei topi usando la tecnica CLP. L&#39;autofagia è una risposta tessuto fondamentale per lo stress e patogeno invasione. Due protocolli attuali per valutare autofagia in vivo nel contesto della sepsi sperimentale sono anche presentati qui. (I) topi transgenici che esprimono la proteina fluorescente verde proteina (GFP)-LC3 di fusione sono sottoposti a CLP. Valorizzazione localizzata di segnale GFP (puncta), come saggiata mediante analisi immunoistochimica o confocale, può essere utilizzato per rilevare la formazione dell&#39;autofagosoma maggiore e, quindi, l&#39;attivazione alterata della via autofagia. (II) rafforzata vacuole autophagic (dell&#39;autofagosoma) formazione per area di tessuto dell&#39;unità (come marcatore di stimolazione dell&#39;autofagia) può essere quantificato usando la microscopia elettronica. Lo studio delle risposte autofagiche a sepsi è un comp criticoonent di comprendere i meccanismi attraverso i quali i tessuti rispondono alle infezioni. Risultati della ricerca in questo settore possono infine contribuire a comprendere la patogenesi della sepsi, che rappresenta un problema importante in terapia intensiva.

La batteriemia è presente nei topi fin da 6 ore dopo sepsi CLP-indotta 14. I segni clinici di sepsi (compresi i brividi, tachipnea e l&#39;attività motoria) compaiono circa 12 ore dopo la procedura. I topi sottoposti a CLP cominciare a morire in circa 18 ore dopo l&#39;induzione di peritonite. Il più grave è la sepsi più aumentata è la letalità 15. In particolare, ad alto grado di sepsi provoca una mortalità del 100% nel giro di 2-3 giorni, mentre i mid-grade risultati sepsi nella mortalit?...

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Cecal Ligation and Puncture-induced Sepsis as a Model To Study Autophagy in Mice

Sepsi sperimentale può essere indotta in topi usando la legatura del cieco e puntura metodo (CLP). Attuali protocolli per valutare autofagia in vivo nel contesto della sepsi CLP-indotta sono presentati qui: Un protocollo per misurare autofagia utilizzando topi (GFP)-LC3, e un protocollo per misurare formazione dell&#39;autofagosoma mediante microscopia elettronica.

Cecal legatura e la puntura indotta da sepsi come modello per studiare autofagia nei topi

Experimental sepsis can be induced in mice using the cecal ligation and puncture (CLP) method, which causes polymicrobial sepsis. Here, a protocol is ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

28.1K Views.  Brigham and Women's Hospital.  Sepsi sperimentale può essere indotta in topi usando la legatura del cieco e puntura metodo (CLP). Attuali protocolli per valutare autofagia in vivo nel contesto della sepsi CLP-indotta sono presentati qui: Un protocollo per misurare autofagia utilizzando topi (GFP)-LC3, e un protocollo per misurare formazione dell'autofagosoma mediante microscopia elettronica. 

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Colon Ascendens Stent Peritonitis (CASP) - a Standardized Model for Polymicrobial Abdominal Sepsis

Sepsis remains a persistent problem on intensive care units all over the world. Understanding the complex mechanisms of sepsis is the precondition for establishing new therapeutic approaches in this field. Therefore, animal models are required that are able to closely mimic the human disease and also sufficiently deal with scientific questions. The Colon Ascendens Stent Peritonitis (CASP) is a highly standardized model for polymicrobial abdominal sepsis in rodents. In this model, a small stent is surgically inserted into the ascending colon of mice or rats leading to a continuous leakage of intestinal bacteria into the peritoneal cavity. The procedure results in peritonitis, systemic bacteraemia, organ infection by gut bacteria, and systemic but also local release of several pro- and anti-inflammatory cytokines. The lethality of CASP can be controlled by the diameter of the inserted stent. A variant of this model, the so-called CASP with intervention (CASPI), raises opportunity to remove the septic focus by a second operation according to common procedures in clinical practice. CASP is an easily learnable and highly reproducible model that closely mimics the clinical course of abdominal sepsis. It leads way to study on questions in several scientific fields e.g. immunology, infectiology, or surgery.

Colon Ascendens Stent Peritonitis CASP - a Standardized Model for Polymicrobial Abdominal Sepsis

The Colon Ascendens Stent Peritonitis (CASP) is a highly standardized model for polymicrobial abdominal sepsis in rodents. This article describes the surgical procedure of CASP. The CASP model and its variants allow the systematic investigation of various problems concerning the subject of sepsis.

Colon Ascendens stent Peritonite (CASP) - un modello standardizzato per polimicrobiche sepsi addominale

Sepsis remains a persistent problem on intensive care units all over the world. Understanding the complex mechanisms of sepsis is the precondition for ...

Ricerca

Immunologia e infezioni

Dissecting Host-virus Interaction in Lytic Replication of a Model Herpesvirus

In response to viral infection, a host develops various defensive responses, such as activating innate immune signaling pathways that lead to antiviral cytokine production1,2. In order to colonize the host, viruses are obligate to evade host antiviral responses and manipulate signaling pathways. Unraveling the host-virus interaction will shed light on the development of novel therapeutic strategies against viral infection.
Murine &gamma;HV68 is closely related to human oncogenic Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus and Epsten-Barr virus3,4. &gamma;HV68 infection in laboratory mice provides a tractable small animal model to examine the entire course of host responses and viral infection in vivo, which are not available for human herpesviruses. In this protocol, we present a panel of methods for phenotypic characterization and molecular dissection of host signaling components in &gamma;HV68 lytic replication both in vivo and ex vivo. The availability of genetically modified mouse strains permits the interrogation of the roles of host signaling pathways during &gamma;HV68 acute infection in vivo. Additionally, mouse embryonic fibroblasts (MEFs) isolated from these deficient mouse strains can be used to further dissect roles of these molecules during &gamma;HV68 lytic replication ex vivo.
Using virological and molecular biology assays, we can pinpoint the molecular mechanism of host-virus interactions and identify host and viral genes essential for viral lytic replication. Finally, a bacterial artificial chromosome (BAC) system facilitates the introduction of mutations into the viral factor(s) that specifically interrupt the host-virus interaction. Recombinant &gamma;HV68 carrying these mutations can be used to recapitulate the phenotypes of &gamma;HV68 lytic replication in MEFs deficient in key host signaling components. This protocol offers an excellent strategy to interrogate host-pathogen interaction at multiple levels of intervention in vivo and ex vivo.
Recently, we have discovered that &gamma;HV68 usurps an innate immune signaling pathway to promote viral lytic replication5. Specifically, &gamma;HV68 de novo infection activates the immune kinase IKK&beta; and activated IKK&beta; phosphorylates the master viral transcription factor, replication and transactivator (RTA), to promote viral transcriptional activation. In doing so, &gamma;HV68 efficiently couples its transcriptional activation to host innate immune activation, thereby facilitating viral transcription and lytic replication. This study provides an excellent example that can be applied to other viruses to interrogate host-virus interaction.

We describe a protocol to identify key roles of host signaling molecules in lytic replication of a model herpesvirus, gamma herpesvirus 68 (&gamma;HV68). Utilizing genetically modified mouse strains and embryonic fibroblasts for &gamma;HV68 lytic replication, the protocol permits both phenotypic characterization and molecular interrogation of virus-host interactions in viral lytic replication.

Dissezione Host-virus Interazione in replica litico di un Herpesvirus modello

In response to viral infection, a host develops various defensive responses, such as activating innate immune signaling pathways that lead to antiviral ...

Introducing Shear Stress in the Study of Bacterial Adhesion

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the initial and determining step of the pathogenesis. Although experimentally adhesion is mostly studied in static conditions adhesion actually takes place in the presence of flowing liquid. First encounters between bacteria and their host often occur at the mucosal level, mouth, lung, gut, eye, etc. where mucus flows along the surface of epithelial cells. Later in infection, pathogens occasionally access the blood circulation causing life-threatening illnesses such as septicemia, sepsis and meningitis. A defining feature of these infections is the ability of these pathogens to interact with endothelial cells in presence of circulating blood. The presence of flowing liquid, mucus or blood for instance, determines adhesion because it generates a mechanical force on the pathogen. To characterize the effect of flowing liquid one usually refers to the notion of shear stress, which is the tangential force exerted per unit area by a fluid moving near a stationary wall, expressed in dynes/cm2. Intensities of shear stress vary widely according to the different vessels type, size, organ, location etc. (0-100 dynes/cm2). Circulation in capillaries can reach very low shear stress values and even temporarily stop during periods ranging between a few seconds to several minutes 1. On the other end of the spectrum shear stress in arterioles can reach 100 dynes/cm2 2. The impact of shear stress on different biological processes has been clearly demonstrated as for instance during the interaction of leukocytes with the endothelium 3. To take into account this mechanical parameter in the process of bacterial adhesion we took advantage of an experimental procedure based on the use of a disposable flow chamber 4. Host cells are grown in the flow chamber and fluorescent bacteria are introduced in the flow controlled by a syringe pump. We initially focused our investigations on the bacterial pathogen Neisseria meningitidis, a Gram-negative bacterium responsible for septicemia and meningitis. The procedure described here allowed us to study the impact of shear stress on the ability of the bacteria to: adhere to cells 1, to proliferate on the cell surface 5and to detach to colonize new sites 6 (Figure 1). Complementary technical information can be found in reference 7. Shear stress values presented here were chosen based on our previous experience1 and to represent values found in the literature. The protocol should be applicable to a wide range of pathogens with specific adjustments depending on the objectives of the study.

During the infection process, a key step is the adhesion of pathogens with host cells. In most instances this adhesion step occurs in the presence of mechanical stress generated by flowing liquid. We describe a technique that introduces shear stress as an important parameter in the study of bacterial adhesion.

L&#39;introduzione di shear stress nello studio di adesione batterica

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the ...

An In vitro Model to Study Heterogeneity of Human Macrophage Differentiation and Polarization

Monocyte-derived macrophages represent an important cell type of the innate immune system. Mouse models studying macrophage biology suffer from the phenotypic and functional differences between murine and human monocyte-derived macrophages. Therefore, we here describe an in vitro model to generate and study primary human macrophages. Briefly, after density gradient centrifugation of peripheral blood drawn from a forearm vein, monocytes are isolated from peripheral blood mononuclear cells using negative magnetic bead isolation. These monocytes are then cultured for six days under specific conditions to induce different types of macrophage differentiation or polarization. The model is easy to use and circumvents the problems caused by species-specific differences between mouse and man. Furthermore, it is closer to the in vivo conditions than the use of immortalized cell lines. In conclusion, the model described here is suitable to study macrophage biology, identify disease mechanisms and novel therapeutic targets. Even though not fully replacing experiments with animals or human tissues obtained post mortem, the model described here allows identification and validation of disease mechanisms and therapeutic targets that may be highly relevant to various human diseases.

An In vitro Model to Study Heterogeneity of Human Macrophage Differentiation and Polarization

Monocyte-derived macrophages are important cells of the innate immune system. Here, we describe an easy to use in vitro model to generate these cells. Using gradient centrifugation, negative bead isolation and specific cell culture conditions, monocyte-derived macrophages can be generated for phenotypic and functional studies.

Un<em&gt; In vitro</em&gt; Modello per studiare eterogeneità di differenziazione dei macrofagi umani e polarizzazione

Monocyte-derived macrophages represent an important cell type of the innate immune system. Mouse models studying macrophage biology suffer from the ...

Use of Galleria mellonella as a Model Organism to Study Legionella pneumophila Infection

Legionella pneumophila, the causative agent of a severe pneumonia named Legionnaires&#39; disease, is an important human pathogen that infects and replicates within alveolar macrophages. Its virulence depends on the Dot/Icm type IV secretion system (T4SS), which is essential to establish a replication permissive vacuole known as the Legionella containing vacuole (LCV). L. pneumophila infection can be modeled in mice however most mouse strains are not permissive, leading to the search for novel infection models. We have recently shown that the larvae of the wax moth Galleria mellonella are suitable for investigation of L. pneumophila infection. G. mellonella is increasingly used as an infection model for human pathogens and a good correlation exists between virulence of several bacterial species in the insect and in mammalian models. A key component of the larvae&#39;s immune defenses are hemocytes, professional phagocytes, which take up and destroy invaders. L. pneumophila is able to infect, form a LCV and replicate within these cells. Here we demonstrate protocols for analyzing L. pneumophila virulence in the G. mellonella model, including how to grow infectious L. pneumophila, pretreat the larvae with inhibitors, infect the larvae and how to extract infected cells for quantification and immunofluorescence microscopy. We also describe how to quantify bacterial replication and fitness in competition assays. These approaches allow for the rapid screening of mutants to determine factors important in L. pneumophila virulence, describing a new tool to aid our understanding of this complex pathogen.

Use of Galleria mellonella as a Model Organism to Study Legionella pneumophila Infection

The larva of the wax moth Galleria mellonella was recently established as an in vivo model to study Legionella pneumophila infection. Here, we demonstrate fundamental techniques to characterize the pathogenesis of Legionella in the larvae, including inoculation, measurement of bacterial virulence and replication as well as extraction and analysis of infected hemocytes.

Uso di<em&gt; Galleria mellonella</em&gt; Come organismo modello per studiare<em&gt; Legionella pneumophila</em&gt; Infezione

Legionella pneumophila, the causative agent of a severe pneumonia named Legionnaires&#39; disease, is an important human pathogen that infects and ...

Use of Shigella flexneri to Study Autophagy-Cytoskeleton Interactions

Shigella flexneri is an intracellular pathogen that can escape from phagosomes to reach the cytosol, and polymerize the host actin cytoskeleton to promote its motility and dissemination. New work has shown that proteins involved in actin-based motility are also linked to autophagy, an intracellular degradation process crucial for cell autonomous immunity. Strikingly, host cells may prevent actin-based motility of S. flexneri by compartmentalizing bacteria inside &#8216;septin cages&#8217; and targeting them to autophagy. These observations indicate that a more complete understanding of septins, a family of filamentous GTP-binding proteins, will provide new insights into the process of autophagy. This report describes protocols to monitor autophagy-cytoskeleton interactions caused by S. flexneri in vitro using tissue culture cells and in vivo using zebrafish larvae. These protocols enable investigation of intracellular mechanisms that control bacterial dissemination at the molecular, cellular, and whole organism level.

Use of Shigella flexneri to Study Autophagy-Cytoskeleton Interactions

To counteract pathogen dissemination, host cells reorganize their cytoskeleton to compartmentalize bacteria and induce autophagy. Using Shigella infection of tissue culture cells, host and pathogen determinants underlying this process are identified and characterized. Using zebrafish models of Shigella infection, the role of discovered molecules and mechanisms are investigated in vivo.

Uso di<em&gt; Shigella flexneri</em&gt; Per studiare le interazioni autofagia-Citoscheletro

Shigella flexneri is an intracellular pathogen that can escape from phagosomes to reach the cytosol, and polymerize the host actin cytoskeleton to promote ...

Transplantation of Tail Skin to Study Allogeneic CD4 T Cell Responses in Mice

The study of T cell responses and their consequences during allo-antigen recognition requires a model that enables one to distinguish between donor and host T cells, to easily monitor the graft, and to adapt the system in order to answer different immunological questions. Medawar and colleagues established allogeneic tail-skin transplantation in mice in 1955. Since then, the skin transplantation model has been continuously modified and adapted to answer specific questions. The use of tail-skin renders this model easy to score for graft rejection, requires neither extensive preparation nor deep anesthesia, is applicable to animals of all genetic background, discourages ischemic necrosis, and permits chemical and biological intervention. 
In general, both CD4+ and CD8+ allogeneic T cells are responsible for the rejection of allografts since they recognize mismatched major histocompatibility antigens from different mouse strains. Several models have been described for activating allogeneic T cells in skin-transplanted mice. The identification of major histocompatibility complex (MHC) class I and II molecules in different mouse strains including C57BL/6 mice was an important step toward understanding and studying T cell-mediated alloresponses. In the tail-skin transplantation model described here, a three-point mutation (I-Abm12) in the antigen-presenting groove of the MHC-class II (I-Ab) molecule is sufficient to induce strong allogeneic CD4+ T cell activation in C57BL/6 mice. Skin grafts from I-Abm12 mice on C57BL/6 mice are rejected within 12-15 days, while syngeneic grafts are accepted for up to 100 days. The absence of T cells (CD3-/- and Rag2-/- mice) allows skin graft acceptance up to 100 days, which can be overcome by transferring 2 x 104 wild type or transgenic T cells. Adoptively transferred T cells proliferate and produce IFN-&#947; in I-Abm12-transplanted Rag2-/- mice.

Tail-skin transplantation is a powerful model for studying T cell-dependent rejection and tolerance induction during allogeneic immune responses in mice. The advantages of this protocol are minor invasive surgery, and ease of monitoring with no need to sacrifice the recipient mouse.

Il trapianto di coda della pelle per studiare allogenico di cellule T CD4 risposte in topi

The study of T cell responses and their consequences during allo-antigen recognition requires a model that enables one to distinguish between donor and ...

A Controlled Mouse Model for Neonatal Polymicrobial Sepsis

Neonatal sepsis remains a global burden. A preclinical model to screen effective prophylactic or therapeutic interventions is needed. Neonatal mouse polymicrobial sepsis can be induced by injecting cecal slurry intraperitoneally into day of life 7 mice and monitoring them for the following week. Presented here are the detailed steps necessary for the implementation of this neonatal sepsis model. This includes making a homogeneous cecal slurry stock, diluting it to a weight- and litter-adjusted dose, an outline of the monitoring schedule, and a definition of observed health categories used to define humane endpoints. The generation of a homogeneous cecal slurry stock from pooled donors allows for the administration into many litters over time, reducing the variation between donors, and preventing the use of potentially toxic glycerol. The monitoring strategy used allows for the anticipation of survival outcome and the identification of mice that would later progress to death, allowing for an earlier identification of the humane endpoint. Two main behavioral features are used to define the health scores, namely, the ability of the neonatal mice to right themselves when placed on their back and their level of mobility. These criteria could potentially be applied to address humane endpoints in other studies of neonatal disease in mice, as long as a pilot study is performed to confirm accuracy. In conclusion, this approach provides a standardized method to model newborn sepsis in mice, while providing resources to assess animal welfare used to define early humane endpoints for challenged animals.

This protocol provides the necessary steps to establish and evaluate neonatal sepsis in 7-day-old mice.

Un modello di Mouse controllata per sepsi polimicrobica neonatale

Neonatal sepsis remains a global burden. A preclinical model to screen effective prophylactic or therapeutic interventions is needed. Neonatal mouse ...

Design of Cecal Ligation and Puncture and Intranasal Infection Dual Model of Sepsis-Induced Immunosuppression

Sepsis, a severe and complicated life-threatening infection, is characterized by an imbalance between pro- and anti-inflammatory responses in multiple organs. With the development of therapies, most patients survive the hyperinflammatory phase but progress to an immunosuppressive phase, which increases the emergence of secondary infections. Therefore, improved understanding of the pathogenesis underlying secondary hospital-acquired infections in the immunosuppressive phase during sepsis is of tremendous importance. Reported here is a model to test infectious outcomes by creating double-hit infections in mice. A standard surgical procedure is used to induce polymicrobial peritonitis by cecal ligation and puncture (CLP) and followed by intranasal infection of Staphylococcus aureus to simulate pneumonia occurring in immune suppression that is frequently seen in septic patients. This dual model can reflect the immunosuppressive state occurring in patients with protracted sepsis and susceptibility to secondary infection from nosocomial pneumonia. Hence, this model provides a simple experimental approach to investigate the pathophysiology of sepsis-induced secondary bacterial pneumonia, which may be used for discovering novel treatments for sepsis and its complications.

This protocol describes techniques to measure infectious outcomes underlying secondary hospital-acquired infections in the immunosuppressive condition, first by establishing cecal ligation/puncture mice then challenging them with intranasal infection to create a clinically relevant model of immunosuppression sepsis.

Progettazione del doppio modello di legatura e puntura ceca dell'infezione intranasale dell'immunosoppressione indotta dalla sepsi

Sepsis, a severe and complicated life-threatening infection, is characterized by an imbalance between pro- and anti-inflammatory responses in multiple ...

Use of the Invertebrate Galleria mellonella as an Infection Model to Study the Mycobacterium tuberculosis Complex

Tuberculosis is the leading global cause of infectious disease mortality and roughly a quarter of the world&#8217;s population is believed to be infected with Mycobacterium tuberculosis. Despite decades of research, many of the mechanisms behind the success of M. tuberculosis as a pathogenic organism remain to be investigated, and the development of safer, more effective antimycobacterial drugs are urgently needed to tackle the rise and spread of drug resistant tuberculosis. However, the progression of tuberculosis research is bottlenecked by traditional mammalian infection models that are expensive, time consuming, and ethically challenging. Previously we established the larvae of the insect Galleria mellonella (greater wax moth) as a novel, reproducible, low cost, high-throughput and ethically acceptable infection model for members of the M. tuberculosis complex. Here we describe the maintenance, preparation, and infection of G. mellonella with bioluminescent Mycobacterium bovis BCG lux. Using this infection model, mycobacterial dose dependent virulence can be observed, and a rapid readout of in vivo mycobacterial burden using bioluminescence measurements is easily achievable and reproducible. Although limitations exist, such as the lack of a fully annotated genome for transcriptomic analysis, ontological analysis against genetically similar insects can be carried out. As a low cost, rapid, and ethically acceptable model for tuberculosis, G. mellonella can be used as a pre-screen to determine drug efficacy and toxicity, and to determine comparative mycobacterial virulence prior to the use of conventional mammalian models. The use of the G. mellonella-mycobacteria model will lead to a reduction in the substantial number of animals currently used in tuberculosis research.

Use of the Invertebrate Galleria mellonella as an Infection Model to Study the Mycobacterium tuberculosis Complex

Galleria mellonella was recently established as a reproducible, cheap, and ethically acceptable infection model for the Mycobacterium tuberculosis complex. Here we describe and demonstrate the steps taken to establish successful infection of G. mellonella with bioluminescent Mycobacterium bovis BCG lux.

Uso della mellonella Invertebrate Galleria come modello di infezione per studiare il complesso di tubercolosi Mycobacterium

Tuberculosis is the leading global cause of infectious disease mortality and roughly a quarter of the world&#8217;s population is believed to be infected ...