Questa ricerca è stata sostenuta da un finanziamento dal NIH NCRR (R01 RR014166 a BHS), NIH NIDCD (R01 DC011422 BHS co-PI), il Dipartimento dell&#39;Agricoltura degli Stati Uniti (J Trumble PI; BH Smith co-PI) e Arizona State University. I finanziamenti per il workshop di formare gli studenti (dati in figura 4) è stata fornita dalla fondazione scienza del Cile.

<ol>
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The authors have no conflicts of interest to disclose.

Questo protocollo presentato due metodi affidabili per condizionare utilizzando la procedura PER. Questi sono due dei numerosi metodi che sono stati impiegati con successo 27, 21. Metodo 2 Ci avvaliamo per tutti gli studi sperimentali che utilizzano PER come è sempre affidabile, anche attraverso diversi sperimentatori. La stessa procedura di base è stato adattato a diversi tipi di studi con api da miele, compreso l&#39;uso di diversi stimoli condizionamento e diversi riflessi comportamentali. E &#39;stato anche legato alle indagini della base genetica delle differenze nell&#39;apprendimento 28,29, i correlati fisiologici della percezione olfattiva e della memoria nel cervello 13,14,30, e le modulatori e molecolari basi genetiche del comportamento 15,16,31 . A causa della conoscenza avanzata della rilevanza ecologica di apprendimento olfattivo alle api, che è iniziato con i primi studi di Karl von Frisch più di 100 anni fa <sup&gt; 31, i risultati di AL può essere facilmente collegato ad esigenze di sopravvivenza di una colonia. Più di recente, è stato adattato ad uno studio agricolo per studiare gli effetti subletali comportamentali di pesticidi e tossine ambientali 17. La procedura di base è potente nel senso che può essere applicato ad analizzare i problemi in altre specie. Due specie di falena, Manduca Sexta e Spodoptera littoralis, sono stati utilizzati in studi PER indagare le basi neurali di identificazione odore e capacità di apprendimento olfattivo &#39;ogni specie 32,33. PER esperimenti con i moscerini della frutta hanno fornito molte intuizioni sulle cascate di segnalazione molecolari coinvolti nella chemosensation e di apprendimento 34. E PER è stato recentemente utilizzato per studiare assuefazione alla pulce (Rhodnius prolixus) 35, un importante vettore di malattia. In generale, la procedura è robusto a variazioni nel metodo; l&#39;uso di dmetodi ifferent probabilmente produrrà la stessa differenza relativa tra i gruppi di trattamento. Nonostante la procedura relativamente semplice, diversi problemi possono a volte impedire alle api mellifere di imparare l&#39;associazione odore-saccarosio. I seguenti argomenti sono possibili modifiche al protocollo e alcuni dei problemi più comuni che possono insorgere durante PER condizionata. Considerazioni sul numero e tipo di prove nel protocollo condizionata Qualsiasi protocollo apprendimento richiederà l&#39;esposizione delle api a una serie di prove in fase di acquisizione. Questo numero dipende in gran parte la difficoltà del compito. Api del miele possono imparare un compito semplice dopo un singolo processo, ma hanno bisogno di almeno tre prove per indurre la formazione della memoria a lungo termine. Come previsto, le api mellifere richiederanno significativamente maggiore di prove per imparare adeguatamente un compito difficile. Generalmente, vi è un numero massimo di prove dalla quale le api non migliorano significativamente l&#39;prestazioni ir. Questa massima dipende dal compito specifico, i tipi di odori e concentrazioni, e la concentrazione di saccarosio. Quando si utilizza più di un tipo di prova con diversi odori, presentare i diversi tipi di prova in una sequenza pseudocasuale di mantenere le api da memorizzare una semplice sequenza di presentazioni odore invece di imparare le differenze tra gli odori 36. In queste sequenze pseudocasuali, ci deve essere un numero uguale di prove per ciascun tipo di odore. Inoltre, la probabilità di un processo di tipo odore preceduta da e seguito dallo stesso odore, o qualsiasi altri odori, deve essere uguale per tutti gli odori. Per due odori - A e B - utilizzare la seguente sequenza: ABBABAAB. Negli otto studi ogni odore è presentato quattro volte. Concatenare sequenze identiche per raggiungere il numero desiderato di prove per ciascun odore. Indipendentemente dal disegno sperimentale, ci sono alcuni parametri che devono rimanerecostante al fine di ottimizzare l&#39;apprendimento. La sovrapposizione tra il CS e gli Stati Uniti è fondamentale per il condizionamento efficace. L&#39;intervallo inter-trial (Figura 1, Tabella 1) deve essere costante e di essere ottimizzato per irregolarità o un intervallo inter-trial troppo corti o troppo lunghi possono influenzare in modo significativo l&#39;efficacia del protocollo di condizionamento 1. Considerazioni sull&#39;importanza e Progettazione di Trials test comportamentali Risposte registrati durante la &#39;fase di acquisizione&#39; di un esperimento, quando il CS e gli Stati Uniti sono presentati insieme, possono essere utili. Tuttavia, fate attenzione che le condizioni di presentazione odore possono variare da un tipo di prova per un altro. Durante le prove rinforzati, l&#39;odore seguita da saccarosio è presentato in combinazione con uno stimolo visivo (movimento del dispositivo per l&#39;erogazione della gocciolina saccarosio) che possono influenzare la risposta del ape. E le api hanno solo tre secondis per mostrare una risposta (quattro secondi di stimolazione odore meno quello sec sovrapposizione con la presentazione di saccarosio; Figura 1). Se l&#39;esperimento coinvolge le api imparano a differenziare i due odori (ad esempio, armato e non armato), l&#39;odore non rinforzato presentato sulla sperimentazione alternativi avviene senza lo stimolo visivo della presentazione ricompensa e le api hanno i ben quattro secondi per rispondere. Pertanto, le risposte alle due odori non sono pienamente comparabili durante l&#39;acquisizione. Con qualsiasi protocollo condizionata, non fare affidamento esclusivamente sulle curve di acquisizione 1. Per verificare meglio ciò che le api hanno imparato, introdurre una serie di prove di laboratorio, non armato, durante il quale né l&#39;odore è rinforzata, che assicura che i test di tutti gli stimoli si svolge in condizioni identiche. A seconda dello scopo specifico della sperimentazione, collaudo può essere costituita da prove di laboratorio singole odore condizionato o una serie di prove con il od condizionatao o una combinazione delle odori condizionati e nuovi. Uno studio singolo test dell&#39;odore condizionato fornisce un semplice test se ricordano le api l&#39;odore condizionata. Tuttavia, la risposta al primo test di prova può riflettere livello di motivazione delle api e il loro richiamo dell&#39;odore condizionato. Una serie di prove di laboratorio, sia una serie di prove di estinzione degli odori condizionata o una serie di singoli test del condizionato e uno o più nuovi odori, può anche essere utilizzato per valutare la memoria. La serie di prove di estinzione in grado di valutare quanto fortemente ricordano le api l&#39;associazione condizionato. Più forte è il richiamo del maggior numero di prove necessarie per estinguere la risposta condizionata. Una serie di singole prove di odori condizionati e nuovi può anche valutare la specificità memoria delle api dell&#39;odore condizionato. E &#39;inoltre indispensabile per condizionare e testare sia il controllo e gruppi trattati presso gli stessi punti temporali. Comparzione le prestazioni di api subito dopo condizionamento per le api detenuti per periodi di tempo più lunghi è problematico a causa della esposizione al saccarosio Uniti alimentando le api a sazietà. Ad esempio, un calo di prestazioni dopo lunghi intervalli di tempo potrebbe essere causa di memoria degrado o potrebbe essere dovuto a cambiamenti di stato motivazionale e / o apprendimento indotti dall&#39;esposizione rinforzato negli Stati Uniti, rendendo i risultati ambigui. Pertanto, le prestazioni di un gruppo di trattamento deve sempre essere giudicato rispetto a un gruppo di controllo condizionato e testato negli stessi punti temporali. Odore Concentrazione e Integrità Ci sono diversi modi in cui la concentrazione e l&#39;integrità del odore (CS) può essere compromessa. Il problema più diffuso con la consegna odore è l&#39;esaurimento delle cartucce di odori da un uso eccessivo (Figura 2). Sostituire le cartucce 10-12 usi (ogni 2 o 3 prove con gruppi di 5 api da miele) per evitare questa trappola. E &#39;inoltre fondamentale utilizzarecartucce freschi per prove di laboratorio, dal momento che le cartucce usate possono essere differenzialmente esauriti e quindi presenti stimoli odore ineguali. Un altro problema comune è la contaminazione cartuccia odore dovuto utilizzare la cartuccia per più di un odore completamente senza pulirlo. Un flusso d&#39;aria sporca o contaminata può anche involontariamente introdurre stimolo olfattivo aggiuntivo (filtri a carboni attivi possono prevenire contaminazione di fondo). Ciò è particolarmente problematico quando l&#39;accoppiamento PER condizionata con misure delle risposte fisiologiche l&#39;odore. Cartucce odore Leaky presentano un problema dal momento che le api da miele sono esposti agli odori prima del processo inizia, che riduce la salienza dello stimolo odore. Raccordo allentato la fornitura d&#39;aria per la consegna odore può causare poca o nessuna consegna odore quando si apre la valvola, riducendo artificialmente la risposta delle api per l&#39;odore previsto. Soluzione di saccarosio e stimolo incondizionato (Reward) L&#39;amonte, la concentrazione, e l&#39;integrità della soluzione di saccarosio utilizzato come gli Stati Uniti sono vitali per il successo dell&#39;esperimento. Il condizionamento è una funzione della quantità e concentrazione di soluzione di saccarosio-acqua usata come gli Stati Uniti 37. Le siringhe micrometriche utilizzati nel metodo 2 permettono un controllo molto preciso (fino a 0,2 ml) di consegna Stati Uniti, e si consiglia loro di utilizzare per entrambi i metodi descritti. L&#39;uso dei stuzzicadenti (metodo 1) è adeguato per le circostanze in cui non possono essere utilizzate le siringhe costosi, come ad esempio, nella formazione di grandi gruppi di studenti, lavoro nel campo, o con budget inferiori. Realizzazione accurata del metodo 1 è bene finché i tempi è mantenuta con regolare sostituzione di stuzzicadenti per evitare l&#39;accumulo di saccarosio (e la concentrazione consegnato). Tuttavia, utilizzando stuzzicadenti è più difficile da controllare con precisione e valutare la quantità e la grandezza degli USA erogata, che è importante per gli studi di condizionamento 1. La concentrazione di saccarosio necessaria perfornire una ricompensa sufficiente a mantenere le api motivati ​​a imparare l&#39;associazione condizionata può dipendere dalla difficoltà del compito e stato interno delle api o periodo dell&#39;anno. I compiti più difficili richiedono una soluzione di saccarosio più elevato per le api &#39;per imparare con successo il compito. Stampo può accumulo in soluzioni di saccarosio anche a 5 ° C, che compromettere l&#39;integrità della soluzione, che colpisce la salute e la percezione del premio delle api durante l&#39;esperimento. Si consiglia di sostituire la soluzione ogni pochi giorni. Precisione, Timing e coerenza di CS e US Consegna La questione più critica sulla corretta attuazione di una procedura di PER, o per quella materia qualsiasi procedura condizionata, comporta la precisione, i tempi e la consistenza di CS e la consegna degli Stati Uniti (Figura 1). Gli investigatori che sono nuovi alla procedura spesso sono imprecise circa la consegna di uno o entrambi gli stimoli. ISI diche non riescono a consentire la sovrapposizione CS e US compromettere le prestazioni condizionata. Il PLC automatizza un segnale acustico per lo sperimentatore di consegnare saccarosio 3 secondi dopo l&#39;inizio della consegna odore. Gli investigatori devono tenere il saccarosio / acqua goccia vicino al ape per una rapida consegna dopo il segnale. Queste procedure aiutano a trascinare un ISI coerente. Posizionamento di un cronometro da l&#39;arena di condizionamento permette per un comodo posizionamento momento del processo, nonché il monitoraggio il tempo delle api in campo sia prima che dopo la consegna degli stimoli. In questo modo l&#39;ITI di può essere relativamente coerente e l&#39;intera procedura può essere eseguito ad un ritmo controllato. ITI di che sono troppo brevi, per esempio meno di 1 min, o troppo lungo può portare a scarso rendimento condizionata 1. Stagionali, ambientali e contestuali Effetti sulla Honey Bee Prestazioni Prestazioni di miele d&#39;api può essere significativamente influenzato da suoi dintornisia prima che durante il condizionamento. Spesso, le fluttuazioni di temperatura e disponibilità di cibo che vengono con il mutare delle stagioni altereranno la motivazione delle api per imparare. Quando i fiori sono in fiore, la motivazione delle api per imparare l&#39;associazione condizionato in laboratorio diminuisce 38. Quando la colonia viene sottolineato - da temperature estreme, carenze alimentari, o di stress-correlate alla patologia - le api mostreranno una riduzione delle loro prestazioni di apprendimento all&#39;interno. Api del miele conservati in una stanza volo può imparare bene per un po &#39;, ma c&#39;è anche lo stress della malattia e invecchiamento degradano le loro prestazioni di apprendimento nel tempo. Il contesto durante il condizionamento può anche ridurre le prestazioni delle api. Eventuali odori estranei, di movimento, e altri stimoli possono distrarre l&#39;ape dagli stimoli sperimentali. Per evitare questo problema, mantenere un contesto visivo semplificato ragionevolmente coerenti. Genotipo e esperienza Influisce PER Prestazioni &lt;p class = &quot;jove_content&quot;&gt; lavoratori api possono differire notevolmente in termini di prestazioni su qualsiasi procedura di condizionamento dovuto alla specializzazione compito, genotipo, o altri fattori ambientali 20. Pertanto, è importante standardizzare, per quanto possibile, i tipi di animali utilizzati in un esperimento per ridurre variazione inter-individuale. In una colonia guidata da una regina open-accoppiati, il che significa che si accoppiò con molti diversi droni, gli operai saranno diversi nel genotipo paterno. Sfondo genetica può portare a differenze drammatiche reattività sensoriale 39 e l&#39;apprendimento delle prestazioni 29. Utilizzando colonie guidati da regine inseminate strumentalmente dallo sperma da singoli droni 28 riduce questo inter-individuale variazione. I protocolli descritti sopra, comprende un metodo per la raccolta di lavoratori api dall&#39;ingresso nido. Tuttavia, queste api mellifere differiscono l&#39;uno dall&#39;altro per quanto riguarda l&#39;età o l&#39;attività comportamentale. Possono essere giovani (inexperienced) o più anziani (più) raccoglitori esperti. Essi possono essere giovani api mellifere rendendo i loro primi voli di orientamento. Oppure possono essere le api di guardia. Per ridurre la variabilità, contrassegnare le api con smalto ad asciugatura rapida o tag di marcatura sia come emergono come adulti (da controllare per l&#39;età) e / o quando cominciano foraggiamento (per controllare per esperienza). Poi, pochi giorni dopo, raccogliere le api marcate per il condizionamento. I lavoratori che sono impegnati in comportamenti di cura possono essere raccolti dai fotogrammi all&#39;interno dell&#39;alveare. Gli infermieri possono essere identificati positivamente quando inseriscono le loro teste in una cella di covata per nutrire e curare la larva dentro. Utilizzando Vergine Queens o Droni per PER condizionata Oltre alle operaie api da miele, vergine regine api e droni possono essere facilmente condizionati in una procedura di PER per gli studi volti a sviluppare linee genetiche di api che si differenziano per l&#39;apprendimento delle prestazioni 28. Regine Vergini devono essere raccolti subito dopo they emergono da impupamento e messo direttamente in imbracature di ritenuta, senza anestesia. Giovani, droni immaturi raccolto dal favo di covata all&#39;interno della colonia non sono generalmente motivati ​​a imparare. Dopo che hanno iniziato l&#39;accoppiamento voli, droni facilmente imparano PER compiti 28. Essi devono essere raccolti che tornano da un volo di accoppiamento e mantenuto durante la notte in una piccola gabbia in una colonia utilizzato per l&#39;allevamento regine. Non tentare di imbrigliare il giorno prima di condizionamento; essi non sopravvivono bene in cablaggi durante la notte. Un paio di ore prima del condizionamento i droni possono essere raccolti dalle gabbie e inserito nel imbracature di ritenuta, senza anestesia. Conclusioni Questa procedura PER, nel modo di metodi, pari a un punto di partenza per la progettazione di esperimenti PER. La maggior parte dei protocolli PER richiederanno che la procedura descritta da modificare in qualche modo per attuare gli obiettivi specifici della sperimentazione e AlloggiE i gruppi di trattamento multipli. E &#39;facile da implementare. Tuttavia, la corretta esecuzione richiede attenzione ai dettagli e la pratica. Una volta masterizzato può essere un potente procedura per aggiungere come strumento di ricerca per diversi programmi di ricerca di base e applicata con diverse specie di insetti.

Molti insetti conoscere stimoli ecologicamente rilevanti, e quindi cambiano le loro risposte comportamentali a tali stimoli al fine di adattarsi a nuove relazioni predittive nel loro ambiente. Diversi meccanismi diversi possono essere alla base questa plasticità comportamentale (ad esempio, non associativa, associativa / pavloviano, e operante / strumentale 1). Questi tipi di plasticità differiscono nel modo stimoli o comportamenti sono associati a eventi importanti, quali il verificarsi di cibo, un compagno, o pericolo. La comprensione di queste forme di plasticità è molto importante per la ricerca di base nel modo in cui il sistema nervoso cambia per codificare nuove memorie 2. E &#39;anche importante per comprendere i comportamenti adattivi di insetti che sono vettori di malattie importanti (ad esempio, tse-tse e la zanzara) e di insetti che sono importanti agricolo, sia nella produzione agricola (api da miele) o come parassiti. Studiare la plasticità comportamentale in qualsiasi animAl richiede un livello di controllo sperimentale su un numero di variabili che non è realizzabile nel campo 1. Si richiede lo sviluppo di un protocollo di condizionamento robusto che può essere impiegato in condizioni più controllate, ma che sono ancora rilevanti per il comportamento in condizioni naturali. Il miele delle api (Apis mellifera) è un ottimo modello per come sviluppare un protocollo per l&#39;esecuzione di analisi controllate di plasticità comportamentale 3,4. La risposta estensione proboscide (PER) in api mellifere è un riflesso naturale comportamentale in cui l&#39;ape estende la sua proboscide in risposta alla stimolazione antenne con una soluzione di zucchero. Durante il normale comportamento di foraggiamento, PER verifica quando il miele delle api trova il nettare in un fiore. Fortunatamente, le api mellifere saranno prontamente presentare questo comportamento semplice e facilmente quantificabile in laboratorio. Questo rende possibile studiare, in un ambiente controllato, i meccanismi che influenzano questo comportamento ecologicamente rilevante 5. PER can essere utilizzato anche all&#39;interno di un protocollo di condizionamento per indagare la percezione dello stimolo e l&#39;apprendimento e la memoria in diverse condizioni di trattamento, che sono progettati per rivelare i meccanismi comportamentali e neurali che sono alla base della plasticità 6. Fin dai primi studi di Kuwabara 7, PER condizionata è stato ampiamente utilizzato per rivelare non associativa, associativo e meccanismi operanti che sono alla base della plasticità comportamentale api mellifere 8. Questi meccanismi sono identici a quelli rivelato negli studi di liberamente battenti api mellifere 9. A differenza degli studi di liberamente volanti api da miele, PER protocolli di condizionamento possono essere accoppiati con elettrofisiologia 10,11 o live-cell imaging di fluorescenza 12-14 del cervello. Inoltre, i protocolli PER permettono di manipolazione sperimentale dei processi neurali attraverso trattamenti farmacologici o genetici molecolari per verificare ipotesi circa i ruoli dei componenti specifici della rete, come ad esempio neuromodulators 15,16. PER protocolli hanno anche fornito un modo importante per valutare gli effetti subletali di condizioni ambientali e tossine sulla salute e bottinatrici efficienza delle api mellifere 17. Questa procedura descrive due metodi di consegna odore in parallelo. Metodo 1 è una versione di odore e di stimolo incondizionato (saccarosio) consegna che fornisce un metodo poco costoso e tecnicamente semplice per presentare l&#39;odore e la ricompensa di saccarosio. Questo metodo è buono per la formazione di base e quando l&#39;automazione non è possibile. Si tratta di un ottimo modo per introdurre questa tecnica per un laboratorio di classe o di insegnamento. Durante condizionata per gli esperimenti che coinvolgono compiti più difficili e valutazioni fisiologiche accoppiati della percezione degli odori, l&#39;apprendimento, o la memoria, è molto importante per regolare in modo accurato e preciso l&#39;insorgenza, tempistiche di consegna, la durata degli stimoli. Per la consegna stimolo più affidabile, usare un mezzo di automatizzare la consegna di un odorend un preciso metodo di consegna ricompensa. Metodo 2 impiega automatizzato consegna odore e precisa consegna saccarosio. E &#39;tecnicamente più sofisticato e richiede più per la configurazione iniziale di metodo 1, ma aumenta in modo significativo la coerenza dei tempi e la quantità di stimoli utilizzati per il condizionamento e dovrebbe essere usato quando possibile.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1278">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:203px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:587px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">Sucrose</td>
			<td style="width:203px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">S9378-1KG</td>
			<td style="width:587px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">Odorant compounds (for example):</td>
			<td style="width:203px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td rowspan="6" style="width:587px;">For additional examples of odorants, see any of the papers on olfactory processing from the Smith lab</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">1-hexanol</td>
			<td style="width:203px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">471402-100ML</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:371px;">2-octanone</td>
			<td style="width:203px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">W280208-800G-K</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">heptanol</td>
			<td style="width:203px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">51778-5ML</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">gerianol</td>
			<td style="width:203px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">163333-25G</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">nonanal</td>
			<td style="width:203px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">131210-100ML</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">Hexane</td>
			<td style="width:203px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">296090-1L</td>
			<td style="width:587px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">Heavy Mineral Oil</td>
			<td style="width:203px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">330760-1L</td>
			<td style="width:587px;">Make sure it&#8217;s odorless</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">Ethanol</td>
			<td style="width:203px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">459836-1L</td>
			<td style="width:587px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">Scintillation vials</td>
			<td style="width:203px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">Z190535-1PAK</td>
			<td style="width:587px;">Use a small drill bit to bore a small hole in the cap of the vials&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">Bee harness</td>
			<td style="width:203px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:587px;">Custom-made from 0.9 cm diameter plastic soda straws or hard plastic/metal tubing</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">Duct tape</td>
			<td style="width:203px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:587px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">Kimwipes</td>
			<td style="width:203px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">Z188956-1PAK</td>
			<td style="width:587px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">Wash bottles</td>
			<td style="width:203px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">Z560847-3EA</td>
			<td style="width:587px;">For the 70% ethanol&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">Small fan in mountable housing</td>
			<td style="width:203px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:587px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">Dryer tubing</td>
			<td style="width:203px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:587px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;"></td>
			<td style="width:203px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:587px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;"></td>
			<td style="width:203px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:587px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;"></td>
			<td style="width:203px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">FOR METHOD 1 ONLY</td>
			<td style="width:203px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">Name</td>
			<td style="width:203px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:587px;">Comments</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">20 ml disposable plastic syringes</td>
			<td style="width:203px;">Cole-Parmer</td>
			<td style="width:119px;">WU-07945-18</td>
			<td style="width:587px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">15 mm filter paper circles</td>
			<td style="width:203px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">Z274844-1PAK</td>
			<td style="width:587px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">Pushpins</td>
			<td style="width:203px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:587px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">Toothpicks</td>
			<td style="width:203px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:587px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;"></td>
			<td style="width:203px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:587px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;"></td>
			<td style="width:203px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:587px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;"></td>
			<td style="width:203px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">FOR METHOD 2 ONLY</td>
			<td style="width:203px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">Name</td>
			<td style="width:203px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:587px;">Comments</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">Gilmont Micrometer syringe, 0.2 mL</td>
			<td style="width:203px;">Cole-Parmer</td>
			<td style="width:119px;">EW-07840-00</td>
			<td style="width:587px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">Gilmont micrometer syringe tip</td>
			<td style="width:203px;">Cole-Parmer</td>
			<td style="width:119px;">EW-07841-00</td>
			<td style="width:587px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">26G 3/8&#8221; Leur hub hypodermic needles</td>
			<td style="width:203px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">14-826-10</td>
			<td style="width:587px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:371px;">1cc tuberculin syringes (plastic/glass)</td>
			<td style="width:203px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">Z181641-1EA&#160;&#160; OR &#160;&#160;Z192090-200EA</td>
			<td style="width:587px;">glass tuberculin syringes are available, but plastic syringes are much less expensive and will work well for a limited number of uses</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Small rubber/silicone restrictors</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>EW-95702-02</td>
			<td>Made from 4.8 mm outer diameter silicone tubing or the rubber tips of the 1 cc syringe plungers</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">Parafilm</td>
			<td style="width:203px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P7793-1EA</td>
			<td style="width:587px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">75 X 100 mm filter paper</td>
			<td style="width:203px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">Z695106-500EA</td>
			<td style="width:587px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:371px;">Direct Logic 05 Programmable Logic Controller</td>
			<td style="width:203px;">Koyo Electronics Industries Co, Ltd</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:587px;">http://www.koyoele.co.jp/&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; OR&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; english/support/dlc.html#plc</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:371px;">1 mm, 4mm &#38; 6 mm inner diameter PVC or silicone tubing&#160;</td>
			<td style="width:203px;">Cole-Parmer</td>
			<td style="width:119px;">Various</td>
			<td style="width:587px;">Cole-Parmer has a wide selection of suitable tubing</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">Polypropylene connectors &#38; leur fittings</td>
			<td style="width:203px;">Cole-Parmer</td>
			<td style="width:119px;">Various</td>
			<td style="width:587px;">Cole-Parmer has a wide selection of connectors and fittings for many tube sizes</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">65-mm Correlated Flowmeter</td>
			<td style="width:203px;">Cole-Parmer</td>
			<td style="width:119px;">EW-03216-08</td>
			<td style="width:587px;">Aluminum with Glass float; For Liquids and Gases, With Valve</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">&#160;&#160;&#160;&#160; OR&#160;</td>
			<td style="width:203px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:587px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:371px;">Tetra Whisper 300 (Tetratek DW96-2) Aquarium Air Pump</td>
			<td style="width:203px;">Aquacave</td>
			<td style="width:119px;">AE-TETRA-300</td>
			<td style="width:587px;">www.aquacave.com</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:371px;">LIF series Solenoid Valves for .042 &#34; ID Tubing, Configuration &#34;E&#34;</td>
			<td style="width:203px;">The Lee Company</td>
			<td style="width:119px;">LFAA1200118H</td>
			<td style="width:587px;">Neoprene, 430 SS, 302 SS, 280mWatts&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; http://www.theleeco.com/LEEWEB2.NSF</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">PC-Board 12VDC 70dB Piezo Buzzer</td>
			<td style="width:203px;">RadioShack</td>
			<td style="width:119px;">273-074</td>
			<td style="width:587px;">www.radioshack.com</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a proboscis extension response protocol for investigating behavioral plasticity in insects: application to basic, biomedical, and agricultural research

Insetti modificano le loro risposte agli stimoli attraverso l&#39;esperienza di associare quegli stimoli con eventi importanti per la sopravvivenza (per esempio, cibo, compagni, minacce). Ci sono diversi meccanismi comportamentali attraverso i quali un insetto apprende associazioni salienti e li riferisce a questi eventi. E &#39;importante capire questo plasticità comportamentale per i programmi volti ad assistere i insetti che sono benefiche per l&#39;agricoltura. Questa comprensione può essere utilizzato anche per scoprire le soluzioni ai problemi biomedici e agricoli creati da insetti che fungono da vettori di malattie e parassiti. Il protocollo condizionata Proboscis Extension Response (PER) è stato sviluppato per api da miele (Apis mellifera) oltre 50 anni fa per studiare come percepiscono e conoscere gli odori floreali, che segnalano le risorse di nettare e polline una colonia ha bisogno per la sopravvivenza. La procedura PER fornisce un quadro solido e di facile impiego per lo studio di molti diversi mecha ecologicamente rilevantinismi di plasticità comportamentale. È facilmente adattabile all&#39;uso di parecchie altre specie di insetti ed altri riflessi comportamentali. Questi protocolli possono essere facilmente impiegati in combinazione con vari mezzi per il monitoraggio dell&#39;attività neuronale nel sistema nervoso centrale tramite elettrofisiologia o Bioimmagini, o per manipolare percorsi di neuromodulatori mirati. Si tratta di un test affidabile per rilevare rapidamente gli effetti sub-letali sul comportamento causati da stress ambientali, tossine o pesticidi. Mostriamo come il protocollo di PER è semplice da implementare utilizzando due procedure. Uno è adatto come un esercizio di laboratorio per gli studenti o per rapide analisi degli effetti di un trattamento sperimentale. L&#39;altro fornisce un maggiore controllo accurato di variabili, che è importante per gli studi di condizionamento comportamentale. Mostriamo come diverse misure per la risposta comportamentale che vanno dal binario sì / no a più variabile continua come la latenza e la durata della proroga proboscide può essere usato per testare Hypotheses. E, discutiamo alcuni problemi che i ricercatori incontrano comunemente quando utilizzano la procedura per la prima volta.

Presentiamo due esempi di utilizzo dei protocolli PER sopra descritti. Il primo esempio fatto uso del metodo 2 di studiare come le api il miele percepiscono odori diversi in funzione della somiglianza molecolare per l&#39;odore utilizzato come CS 5,24,25. Il secondo è un esempio di utilizzo del metodo 1 e alcune delle precauzioni che devono essere prese quando si inizia ad usare PER condizionata esperimenti nel laboratorio di ricerca. Studi come questo sono stati utilizzati per descrivere la olfattiva &#39;spazio percettivo&#39; di api e falene in combinazione con Bioimmagini 13 o elettrofisiologico analisi 26. Le api da miele (n = 20) sono stati condizionati ad associare l&#39;odorizzante decanale con rinforzo saccarosio oltre 12 avanti l&#39;associazione di condizionamento prove (Figura 3a). Circa il 10% delle api mellifere risposto &#39;spontaneamente&#39; il primo processo, che è normale. Dopo che la percentuale che responded aumentare nel corso dei prossimi studi fino al 100% delle api mellifere risposto alla quinta prova e ogni prova successiva. Diversi studi hanno dimostrato che questo aumento di risposta è specifico alla condizione in avanti accoppiamento (figura 1) rispetto a diversi importanti procedure di controllo 3. Dopo la fase di acquisizione, ogni ape è stato sottoposto ad una serie di prove di laboratorio, non rinforzate (Figura 3B) che comporta l&#39;esposizione al odore CS e diversi altri odoranti che sistematicamente diversi dalla CS in strutture molecolari. Le api da miele hanno risposto maggiormente al CS. Le loro risposte agli altri odoranti diminuite in funzione dei cambiamenti sistematici nella struttura, con le risposte più bassi ai odoranti meno come il CS. Nella Figura 4, i risultati di un recente workshop in cui gli studenti hanno imparato, per la prima volta, come per condizionare le api mellifere utilizzando il metodo 1 sono illustrati. Studenti abeti<html> t condizionato api da miele di avanti accoppiamento methycyclohexanone (MCH) o ottanolo (OCT) con rinforzo saccarosio (Figura 4A). Risposte per cento sono stati inferiori al primo processo e sono aumentati in prove successive, indicando che le api hanno imparato l&#39;associazione odore-saccarosio. Ci sono state differenze nel grado che le api hanno imparato l&#39;associazione condizionata tra i diversi gruppi di studenti. Nella nostra esperienza, questi tipi di differenze potrebbero essere dovute al odore che è stato utilizzato come CS, agli elementi imprecisi nel metodo (metodo 1), o al livello di formazione degli sperimentatori. Nel terzo caso, la prestazione diventa rapidamente più coerente con maggiore esperienza degli sperimentatori. Dopo il condizionamento, ogni ape è stato testato due volte con ogni odore. In gruppi di api che erano stati condizionati con abbinamento avanti di PTOM o MCH, la risposta è stata, come previsto, più forte l&#39;odore condizionato (Figura 4B). <html> ent &quot;&gt; Il secondo gruppo di api mellifere che hanno subito in avanti accoppiamento di ottobre è stata condizionata in parallelo ad un altro gruppo in cui l&#39;odore ottobre è stata all&#39;indietro accoppiato con saccarosio. abbinamento a ritroso è uno dei diversi tipi di procedure di controllo per dimostrare che l&#39;aumento della risposta è specifico per inoltrare l&#39;accoppiamento e non a causa di un altro processo, come ad esempio l&#39;eccitazione non specifico da sensibilizzazione. Per accoppiamento all&#39;indietro, il saccarosio Stati Uniti e l&#39;odore CS sono presentati in ordine inverso di ciò che viene mostrato in Figura 1. Acquisizione Dati da accoppiamento indietro siamo non mostrato perché la CR non può essere segnata data la presentazione dell&#39;odore CS dopo la presentazione del saccarosio. come sarebbe previsto per il condizionamento associativo, i livelli di risposta a ottobre erano più alti nel gruppo in avanti accoppiato rispetto al gruppo all&#39;indietro (Figura 4C). 7fig1highres.jpg &quot;width =&quot; 500 &quot;/&gt; Figura 1: Schemi di disegno sperimentale per il condizionamento utilizzando avanti accoppiamento. Vedere la Tabella 1 per le definizioni dei termini utilizzati in questa figura. (A) Il CS (odore) precede e si sovrappone con gli Stati Uniti (soluzione di acqua / saccarosio). Il rapporto tra il CS e US mostrato è ottimale per le api da miele condizionata e falene. Ma l&#39;ottimale ISI può dipendere dal protocollo di condizionamento e specie animale 1. (B) Ripartizione e relativa tempistica di CS, CR, Stati Uniti, e UR. Il CR che si verifica sia prima presentazione degli Stati Uniti o nel corso degli studi non armato &quot;test&quot; è la misura dipendente per protocolli sperimentali. <img alt="Figura 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51057/51057fig2highres.jpg" width="500" /> Figura 2 Odore esaurimento con il riutilizzo di cartucce. Per questi dati, cartucce odore eranoset-up con esanolo come descritto nel testo. Esanolo è comunemente usato come un CS in studi PER; Tuttavia, il tasso effettivo di esaurimento dipenderà l&#39;odore e solvente. Le cartucce sono stati poi utilizzati una volta per 4 secondi ogni minuto su 8 prove (supponendo 5 api mellifere / processo in un esperimento standard che sarebbe pari a 40 usi). Le diluizioni che il solvente indicato, che erano relativamente standard per gli esperimenti PER, erano 2,0 M (A) e 0,2 M (B). (A, B) L&#39;odore è stata campionata dopo la prima e l&#39;ottava prove di adsorbimento su una fase solida microestrazione (SPME) fibra che è stato poi desorbito su un gascromatografo. Le relative aree sotto i picchi erano più alti dopo il primo processo relativo alla ottava per entrambi i solventi e per entrambe le concentrazioni (Wilcoxon abbinato coppie firmato rank test p &lt;0.05 [*] o maggiore), il che dimostra che meno l&#39;odore è stato consegnato dalla cartuccia dopo che la cartuccia è stata utilizzata più volte. (C, D) Gli stessi dati mostrano solo l&#39;ottavo tr<html> IAL con l&#39;asse y espanso. Essa mostra che la deplezione era leggermente maggiore per esano rispetto all&#39;olio minerale, ma solo alla concentrazione più bassa. <img alt="Figura 3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51057/51057fig3highres.jpg" width="500" /> Figura 3 Acquisizione e test utilizzando decanale come il CS e il metodo 2 di condizionamento. (A) Trial-by-trial di risposta (CR) su 12 prove di abbinamento a termine (Figura 1). I dati sono da api n = 20 miele condizionata in quattro gruppi di 5 api mellifere ciascuno. L&#39;ISI è stato di 3 secondi e l&#39;ITI era 6 min. (B) prove non rinforzate con odori diversi da decanale per lunghezza e / o la posizione del carbonio carbonilico catena di carbonio. Gli odori sono stati presentati in una serie randomizzato tra i quattro gruppi e sono stati intervallati da prove rinforzati con Decanal (ogni due o tre prove), al fine di evitare l&#39;estinzione del CR. e_content &quot;fo: keep-together.within-page =&quot; always &quot;&gt; <img alt="Figura 4" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51057/51057fig4highres.jpg" width="500" /> Figura 4. dati provenienti da un workshop durante il quale studenti universitari sono stati addestrati a condizionare le api mellifere utilizzando PER metodo 1. dati (A) Acquisizione da tre gruppi di api da miele condizionati per ottanolo (n = 23 e 15 per Gps 1 e 2, rispettivamente) e metilcicloesanone (n = 10) (B) CR durante le prove non rinforzate con entrambi gli odori.; quattro studi presentati in serie casuale di tutti i gruppi. (C) prove non rinforzate con entrambi gli odori in due gruppi di api da miele, uno in avanti accoppiato (Gp 1, n = 23) e uno indietro accoppiati (n = 25). <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Term (sigla) </td><td> Definizione </td><td> Esempio Rilevante </td></tr><tr><td> Stimolo condizionato (CS) </td><td> Lastimolo che suscita poca o nessuna risposta in un primo momento e segnala Uniti </td><td> ODOR </td></tr><tr><td> Risposta condizionata (CR) un </td><td> La risposta al CS dopo associazione con gli Stati Uniti </td><td> Proboscide ESTENSIONE </td></tr><tr><td> Stimolo incondizionato (US) </td><td> Uno stimolo biologicamente significativo che suscita una risposta </td><td> Saccarosio / SOLUZIONE ACQUA </td></tr><tr><td> Risposta incondizionata (UR) un </td><td> La risposta alla US </td><td> Proboscide ESTENSIONE </td></tr><tr><td> Inter-Stimulus Interval (ISI) </td><td> Il tempo tra l&#39;inizio della SC e insorgenza degli Stati Uniti </td><td> ODORE di intervallo saccarosio </td></tr><tr><td> Inter-Trial Interval (ITI) </td><td> Il tempo tra successivi abbinamenti CS-USA per un singolo animale </td><td> ODORE (prova n) ODORE (prova n + 1) Intervallo </td></tr></tbody></table> Tabella 1 Importante Terminologia. Fare riferimento alla Figura 1 per un esempio di questi termini. Per un PER di condizionamento del CR e UR sono gli stessi, anche se per altri tipi di associazioni e riflessi del CR e UR possono differire. <a href="/files/ftp_upload/51057/BEE_4.avi" target="_blank">Movie 1.</a> Un video di un miele delle api PER esecuzione dopo che era stato condizionato a rispondere a un odore. Nota la risposta PER dell&#39;ape circa 1,5 sec seguente odore insorgenza. Software di monitoraggio mappato i movimenti delle antenne in risposta alla presentazione del odore. Le linee tracciate in alto a destra del video raffigurano i movimenti delle antenne reali. I due grafici in basso dello schermo mostrano movimenti delle antenne sulla X (a sinistra) e Y (destra) coordinate. Le linee verticali nel grafico mostrato nel video indicano, da sinistra a destra, la luce ON, PER, luce fuori e proboscide retrazione.

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A Proboscis Extension Response Protocol for Investigating Behavioral Plasticity in Insects: Application to Basic, Biomedical, and Agricultural Research

The Proboscis Extension Response (PER) conditioning protocol, developed for the honey bee (Apis mellifera), provides an ecologically-relevant and easily quantifiable means for studying several different mechanisms of learning in many insect species.

Una proboscide risposta estensione Protocollo per Indagare plasticità comportamentale in Insetti: Applicazione di base, biomedica e ricerca agricola

Insects modify their responses to stimuli through experience of associating those stimuli with events important for survival (e.g., food, mates, threats). ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

33.3K Views.  Arizona State University. The Proboscis Extension Response (PER) conditioning protocol, developed for the honey bee (Apis mellifera), provides an ecologically-relevant and easily quantifiable means for studying several different mechanisms of learning in many insect species. 

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