Esta pesquisa foi apoiada por financiamento do NIH NCRR (R01 RR014166 a BHS), NIH NIDCD (R01 DC011422 BHS co-PI), o Departamento de Agricultura dos EUA (J Trumble PI; BH Smith co-PI) e da Universidade Estadual do Arizona. O financiamento para a oficina para treinar os alunos (dados da Figura 4) foi fornecido pela Fundação para a Ciência do Chile.

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The authors have no conflicts of interest to disclose.

Este protocolo apresentou dois métodos confiáveis ​​para o condicionamento usando o procedimento PER. Estes são dois dos vários métodos que têm sido empregados com sucesso 27, 21. Nós empregamos o método 2 para todos os estudos experimentais utilizando PER, pois é consistente e confiável, mesmo em diferentes experimentadores. O mesmo procedimento básico foi adaptado para muitos tipos diferentes de estudos com as abelhas, incluindo o uso de diferentes estímulos condicionado e diferentes reflexos comportamentais. Também tem sido associada com as investigações da base genética de diferenças na aprendizagem 28,29, as correlações fisiológicas de percepção olfactiva e memória no cérebro 13,14,30, e as bases genéticas e moleculares moduladores de comportamento 15,16,31 . Devido ao avançado conhecimento da relevância ecológica de aprendizado olfativo para as abelhas, que começou com os primeiros estudos realizados por Karl von Frisch mais de 100 anos atrás <sup&gt; 31, os resultados do PER pode ser facilmente ligado a necessidades de sobrevivência de uma colônia. Mais recentemente, ele foi adaptado para um estudo agrícola para investigar os efeitos comportamentais subletais de pesticidas e toxinas ambientais 17. O procedimento básico é poderosa em que ele pode ser aplicado para estudar problemas em outras espécies. Duas espécies de mariposas, Manduca sexta e Spodoptera littoralis, foram utilizados nos estudos por investigar as bases neurais da identificação odor e capacidades de aprendizagem olfativos de cada espécie 32,33. Experimentos com moscas de frutas POR forneceram muitos insights sobre as cascatas de sinalização moleculares envolvidos na chemosensation e aprendizagem 34. E PER recentemente tem sido usado para estudar a habituação no pulgas (Rhodnius prolixus) 35, um importante vetor da doença. Em geral, o processo é robusto às alterações no método; o uso de dmétodos iferentes provavelmente irá produzir a mesma diferença relativa entre os grupos de tratamento. Apesar de o processo relativamente simples, vários problemas podem impedir, por vezes, as abelhas de aprender a associação de odor-sacarose. Os tópicos a seguir são possíveis alterações ao protocolo e alguns dos problemas mais comuns que podem surgir durante PER condicionado. Considerações sobre o número eo tipo de ensaios, no Protocolo Condicionado Tanto o protocolo de aprendizagem requer exposição das abelhas a uma série de ensaios em fase de aquisição. Este número depende em larga medida da dificuldade da tarefa. As abelhas do mel pode aprender uma tarefa simples depois de uma única tentativa, mas eles precisam de pelo menos um de três ensaios para induzir a formação da memória de longo prazo. Como esperado, as abelhas exigirá significativamente mais ensaios para aprender adequadamente uma tarefa difícil. Geralmente, existe um número máximo de tentativas para além do qual as abelhas não melhoram significativamente adesempenho IR. Este máximo depende da tarefa específica, os tipos e concentrações de odor e a concentração de sacarose. Ao utilizar mais de um tipo de teste com diferentes odores, apresentar os diferentes tipos de teste em uma seqüência pseudo-aleatórios para manter as abelhas de memorizar uma sequência simples de apresentações de odor em vez de aprender as diferenças entre os odores 36. Nestas sequências pseudo-aleatórios, deve haver um número igual de ensaios para cada um dos tipos de odores. Além disso, a probabilidade de um ensaio de um tipo de odor serem precedidos por e seguido pelo mesmo odor, ou qualquer dos outros odores, devem ser iguais para todos os odores. Por dois odores - A e B - use a seguinte seqüência: ABBABAAB. Nos oito ensaios cada odor é apresentado quatro vezes. Concatenar sequências idênticas a atingir o número desejado de ensaios para cada odor. Independentemente do desenho experimental, existem alguns parâmetros que devem permanecerconstante, a fim de optimizar a aprendizagem. A sobreposição entre o CS e os EUA é fundamental para o condicionamento eficaz. O intervalo inter-julgamento (Figura 1, Tabela 1) precisa ser constante e ser otimizado, porque a irregularidade ou a um intervalo inter-julgamento muito curto ou muito longo pode influenciar significativamente a eficácia do protocolo condicionado 1. Considerações sobre a importância ea concepção dos ensaios testes comportamentais As respostas obtidas durante a &quot;fase de aquisição&quot; de um experimento, quando o CS e US forem apresentados juntos, pode ser útil. No entanto, tomar cuidado para que as condições de apresentação odor pode variar de um tipo de julgamento para outro. Durante os ensaios reforçados, o odor, seguido da sacarose é apresentado em conjunto com um estímulo visual (o movimento do dispositivo para entregar a gota de sacarose) que pode afectar a resposta do abelha. E as abelhas têm apenas três segundos para mostrar uma resposta (de quatro segundos de estimulação de odor, menos a um segundo sobreposição com a apresentação de sacarose, Figura 1). Se o experimento envolve as abelhas aprendem a diferenciar dois odores (por exemplo, armado e não armado), o odor sem reforço apresentado em ensaios alternativos ocorre sem o estímulo visual da apresentação recompensa e as abelhas têm o total de quatro segundos para responder. Portanto, as respostas aos dois odores não são totalmente comparáveis ​​durante a aquisição. Com qualquer protocolo condicionado, não dependa exclusivamente de curvas de aquisição de um. Para melhor conhecer o que as abelhas aprenderam, introduzir uma série de ensaios de teste sem reforço, durante a qual nem odor é reforçada, o que garante que os testes de todos os estímulos ocorre em condições idênticas. Dependendo da finalidade específica da experiência, o teste pode consistir em ensaios de teste individuais do odor condicionado ou uma série de ensaios com o od condicionadoou, ou uma combinação dos odores condicionado e novos. Um ensaio único teste do odor condicionado proporciona um simples ensaio de saber se as abelhas &#39;lembrar o odor condicionado. No entanto, a resposta ao primeiro ensaio de teste pode refletir o nível de motivação das abelhas, bem como a sua recordação do odor condicionado. Uma série de ensaios de teste, ou uma série de testes de extinção do odor condicionado ou uma série de testes individuais da condicionado e um ou mais novos odores, também pode ser utilizado para avaliar a memória. A série de testes de extinção pode avaliar o quão fortemente as abelhas &#39;lembrar a associação condicionado. Quanto mais forte a lembrança do maior número de ensaios necessários para extinguir a resposta condicionada. Uma série de testes individuais de odores condicionados e novos podem também avaliar a especificidade de memória do odor condicionado das abelhas. É também imperativo para condicionar e testar grupos controle e tratados no mesmo intervalo de tempo. Comparção do desempenho de abelhas logo após o condicionamento para as abelhas realizadas por períodos de tempo mais longos é problemática por causa da exposição para os EUA sacarose alimentando as abelhas até a saciedade. Por exemplo, uma diminuição no desempenho depois de longos intervalos pode ser devido a deterioração da memória ou pode ser devido a alterações no estado de motivação e / ou de aprendizagem induzidas pela exposição não reforçada para os EUA, tornando os resultados ambíguos. Por conseguinte, o desempenho de um grupo de tratamento deve ser sempre considerada em relação a um grupo de controlo de ar e testados nos mesmos pontos de tempo. Concentração Odor e Integridade Existem várias maneiras pelas quais a concentração e a integridade do odor (CS) podem ser comprometidas. O problema mais comum com a entrega de odor é a depleção dos cartuchos de odor por excesso de uso (Figura 2). Substitua os cartuchos de 10-12 usos (a cada 2 ou 3 estudos com grupos de cinco abelhas) para evitar essa armadilha. Também é crítico para utilizarcartuchos frescos para os ensaios de teste, uma vez que os cartuchos usados ​​podem ser diferencialmente esgotados e, portanto, apresentam estímulos odor desigual. Um outro problema comum é a contaminação do cartucho de odor devido à utilização do cartucho para mais do que um odor sem limpá-lo completamente. Um fluxo de ar sujo ou contaminado também pode introduzir involuntariamente estímulo olfativo adicional (filtros de carvão ativado pode evitar a contaminação de fundo). Isto é especialmente problemático quando o acoplamento POR condicionado com medições das respostas fisiológicas no odor. Cartuchos de odor Leaky apresentar um problema, já que as abelhas são expostas a um odor antes do julgamento começar, o que reduz a relevância do estímulo odor. Folgada sobre o suprimento de ar para entrega odor pode resultar em pouca ou nenhuma entrega odor quando a válvula abre, reduzindo artificialmente a resposta das abelhas para o odor pretendido. Solução de sacarose e estímulo incondicionado (Reward) A umde montagem, a concentração e a integridade da solução de sacarose utilizados como os EUA é vital para o sucesso da experiência. O condicionamento é uma função da quantidade e da concentração da solução de sacarose em água utilizado como os EUA 37. As seringas micrométricas utilizados no método 2 para permitir que muito precisa (até 0,2 l) de controle de entrega dos Estados Unidos, e recomendamos o uso deles para ambos os métodos descritos. O uso dos palitos (método 1) é adequado para situações em que as seringas caras não podem ser utilizados, tais como, na formação de grandes grupos de alunos, o trabalho no campo, ou com orçamentos mais baixos. Implementação cuidadosa do método 1 é bom, desde que tempo é mantida com a substituição regular de palitos de dente para evitar o acúmulo de sacarose (ea concentração entregues). No entanto, utilizando palitos é mais difícil de controlar com precisão e estimar a quantidade e magnitude de os EUA entregue, o que é importante para os estudos de condicionamento 1. A concentração de sacarose necessária paraoferecer uma recompensa suficiente para manter as abelhas motivados para aprender a associação condicionada pode depender da dificuldade da tarefa e estado interno das abelhas ou época do ano. As tarefas mais difíceis exigem uma solução de sacarose maior para o abelhas &#39;para aprender com sucesso a tarefa. Molde pode acúmulo em soluções de sacarose até a 5 ° C, o que irá comprometer a integridade da solução, afetando a saúde ea percepção da recompensa das abelhas durante o experimento. O melhor é substituir a solução de todos os dias. Precision, Timing, e consistência de CS e US Entrega A questão mais crítica sobre a aplicação adequada de um procedimento PER, ou para essa matéria qualquer procedimento condicionado, envolve precisão, tempestividade e consistência do CS e entrega US (Figura 1). Os investigadores que são novos para o procedimento freqüentemente são imprecisas sobre a entrega de um ou ambos os estímulos. ISI doque não permitir a sobreposição do CS e US resultar num desempenho fraco condicionado. O PLC automatiza um sinal sonoro para o experimentador para entregar sacarose 3 segundos após o início do fornecimento do odor. Os investigadores devem realizar a sacarose / gota de água perto da abelha para entrega rápida após o sinal. Estes procedimentos ajudar arrastam uma ISI consistente. Colocar um cronômetro na arena condicionado permite a colocação do julgamento tempo conveniente, bem como monitorar o tempo das abelhas na arena, tanto antes como após a entrega de estímulos. Dessa forma, as ITI do pode ser relativamente consistente e todo o procedimento pode ser executado em um ritmo controlado. ITI do que são muito curtos, por exemplo, menos de 1 min, ou muito tempo pode levar a um mau desempenho condicionado 1. Sazonais, ambientais e contextuais Efeitos sobre a Honey Bee Desempenho Desempenho das abelhas produtoras de mel pode ser significativamente influenciados por seus arredoresantes e durante o condicionamento. Freqüentemente, as variações de temperatura e disponibilidade de alimentos que vêm com a mudança das estações irá alterar a motivação das abelhas para aprender. Quando as flores estão em flor, a motivação das abelhas para aprender a associação condicionado no laboratório diminui 38. Quando a colônia é sublinhada - de temperaturas extremas, falta de alimentos ou estresse relacionado à doença - as abelhas &#39;mostrará uma redução do desempenho escolar no interior. As abelhas do mel mantido em um quarto de vôo pode aprender bem por um tempo, mas há também o estresse da doença e envelhecimento degradar seu desempenho de aprendizagem ao longo do tempo. O contexto durante condicionado também pode diminuir o desempenho das abelhas. Quaisquer cheiros estranhos, movimento e outros estímulos podem distrair a abelha a partir dos estímulos experimentais. Para evitar este problema, manter um contexto visual razoavelmente consistente, simplificado. Genótipo e experiência afeta o desempenho por &lt;p class = &quot;jove_content&quot;&gt; trabalhadores de abelhas podem diferir consideravelmente no desempenho em qualquer procedimento de condicionamento devido à especialização de tarefas, genótipo, ou outros fatores ambientais 20. Portanto, é importante para padronizar, tanto quanto possível, os tipos de animais utilizados em uma experiência de modo a reduzir a variação inter-individual. Em uma colônia liderada por uma rainha open-acoplado, o que significa que ela acasalou com vários drones diferentes, os trabalhadores serão diferentes no genótipo paterno. Background genético pode levar a grandes diferenças na capacidade de resposta sensorial 39 e 29 de desempenho de aprendizagem. Usando colônias lideradas por rainhas inseminadas instrumentalmente por esperma de drones individuais 28 reduz esta variação inter-individual. Os protocolos acima descritos, inclui um método para coleta de trabalhadores da abelha do mel da entrada do ninho. No entanto, estas abelhas diferem uns dos outros no que diz respeito à idade ou ao teste comportamental. Eles podem ser jovens (inexperienced) ou experientes) forrageiras mais velhos (mais. Eles podem ser abelhas jovens fazendo seus primeiros vôos de orientação. Ou podem ser abelhas de guarda. Para reduzir a variabilidade, marque as abelhas com uma tinta de esmalte de secagem rápida ou marcação etiquetas ou como eles emergem como adultos (para controlar para a idade) e / ou quando começam forrageamento (para controle de experiência). Então, alguns dias depois, recolher as abelhas marcadas para o condicionamento. Trabalhadores que estão envolvidas no comportamento de enfermagem podem ser coletadas a partir dos quadros dentro da colméia. Enfermeiros podem ser identificados positivamente quando inserir suas cabeças em uma célula de cria para alimentar e cuidar da larva dentro. Usando Virgin Rainhas ou Drones para PER Condicionado Além de abelhas operárias, rainhas virgens de abelhas e zangões podem ser facilmente acondicionados em um procedimento PER de estudos visando ao desenvolvimento de linhas genéticas de abelhas que diferem em desempenho 28 aprendendo. Rainhas virgens devem ser coletadas logo após ªey emergir da fase de pupa e colocado diretamente em arreios de contenção, sem anestesia. Drones jovens, imaturos coletados a partir do favos de cria dentro da colônia geralmente não são motivados a aprender. Depois que eles começaram a acasalar vôos, drones prontamente aprender tarefas por 28. Eles devem ser recolhidos ao retornarem de um vôo de acasalamento e mantido durante a noite em uma pequena gaiola em uma colônia utilizada para a criação de rainhas. Não tente aproveitá-los no dia anterior condicionado; eles não sobrevivem bem em arneses durante a noite. Um par de horas antes de condicionamento, os drones podem ser recolhidos das gaiolas e colocados em arreios de contenção, sem anestesia. Conclusões Este procedimento de PER, na forma de métodos, eleva-se a um ponto de partida para a concepção de experiências PER. A maioria dos protocolos por exigirá que o procedimento descrito ser alterado de alguma forma para implementar as metas específicas de cada ensaio e accommodate grupos de tratamento múltiplos. Ele é fácil de implementar. No entanto, a aplicação correcta exige atenção aos detalhes e prática. Uma vez dominado, pode ser um procedimento poderoso para adicionar uma ferramenta de pesquisa para vários programas de pesquisa básica e aplicada com diferentes espécies de insetos.

Muitos insetos aprender sobre estímulos ecologicamente relevantes, e, em seguida, mudar suas respostas comportamentais a esses estímulos, a fim de adaptar-se a novas relações preditivas em seu ambiente. Vários mecanismos diferentes podem estar subjacentes a esta plasticidade comportamental (por exemplo, não associativa, associativa / pavloviano e operante / instrumental 1). Estes tipos de plasticidade diferem na forma como os estímulos ou comportamentos estão associados com eventos importantes, tais como a ocorrência de comida, um companheiro, ou perigo. Entender essas formas de plasticidade é muito importante para a pesquisa básica sobre como o sistema nervoso muda para codificar novas memórias 2. Também é importante para a compreensão dos comportamentos adaptativos de insetos que são vetores importantes da doença (por exemplo, tsé-tsé e mosquitos) e insetos que são importantes na agricultura, seja na produção agrícola (abelhas) ou como pragas. Estudando plasticidade comportamental em qualquer animal requer um nível de controle experimental sobre um número de variáveis ​​que não é viável no campo 1. É necessário o desenvolvimento de um protocolo de condicionamento robusta que pode ser empregue sob condições mais controladas, mas que ainda são relevantes para o comportamento em condições naturais. O mel de abelha (Apis mellifera) é um excelente modelo de como desenvolver um protocolo para a realização de análises de controlo comportamental 3,4 plasticidade. O narigudo Extensão Resposta (PER) em abelhas é um reflexo do comportamento natural em que a abelha estende sua tromba em resposta à estimulação da antena com uma solução de açúcar. Durante o forrageamento normal, PER ocorre quando a abelha encontra o néctar em uma flor. Felizmente, as abelhas prontamente apresentar este comportamento simples e facilmente quantificáveis ​​em laboratório. Isso torna possível para estudar, em um ambiente controlado, os mecanismos que influenciam esse comportamento ecologicamente relevante 5. PER can também ser usado dentro de um protocolo de condicionamento para investigar a percepção do estímulo e aprendizagem e memória em diferentes condições de tratamento, que são projetados para revelar os mecanismos comportamentais e neurais subjacentes à plasticidade 6. Desde os primeiros estudos realizados por Kuwabara 7, PER condicionado tem sido amplamente utilizada para revelar não associativa, associativa e mecanismos operantes que fundamentam a plasticidade comportamental em abelhas 8. Estes mecanismos são idênticas àquelas reveladas em estudos de que voam livremente abelhas 9. Ao contrário dos estudos de voar livremente abelhas, protocolos POR condicionado pode ser acoplado com eletrofisiologia 10,11 ou células vivas imagens de fluorescência 12-14 do cérebro. Além disso, protocolos por permitir a manipulação experimental de vias neurais através de tratamentos farmacológicos ou genéticos moleculares para testar hipóteses sobre os papéis dos componentes específicos da rede, tais como neuromodulators 15,16. Protocolos por também ter fornecido uma forma importante de avaliar os efeitos subletais de condições ambientais, bem como toxinas sobre a saúde e a eficiência de forrageamento das abelhas 17. Este procedimento descreve dois métodos de entrega de odor em paralelo. Método 1 é uma versão de odor e de estímulo não condicionado (sacarose) de entrega que fornece um método barato e tecnicamente simples para a apresentação do odor e recompensa sacarose. Este método é bom para o treinamento básico e quando a automatização não é possível. É uma excelente maneira de introduzir esta técnica para uma sala de aula ou laboratório de ensino. Durante o condicionamento para experimentos envolvendo tarefas mais difíceis e as avaliações fisiológicas acopladas de percepção de odor, a aprendizagem, ou de memória, é muito importante para a precisão e exatidão regular o início, o tempo de entrega da duração dos estímulos. Para a entrega de estímulo mais fiável, utilizar um meio de automatizar a entrega de um odornd um método preciso de entrega recompensa. Método 2 emprega automatizado entrega odor e entrega de sacarose mais precisa. É tecnicamente mais sofisticado e exige mais para a configuração inicial do método 1, mas aumenta significativamente a coerência entre o calendário ea quantidade de estímulos utilizados para o condicionamento e deve ser usado sempre que possível.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1278">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:203px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:587px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">Sucrose</td>
			<td style="width:203px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">S9378-1KG</td>
			<td style="width:587px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">Odorant compounds (for example):</td>
			<td style="width:203px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td rowspan="6" style="width:587px;">For additional examples of odorants, see any of the papers on olfactory processing from the Smith lab</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">1-hexanol</td>
			<td style="width:203px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">471402-100ML</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:371px;">2-octanone</td>
			<td style="width:203px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">W280208-800G-K</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">heptanol</td>
			<td style="width:203px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">51778-5ML</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">gerianol</td>
			<td style="width:203px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">163333-25G</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">nonanal</td>
			<td style="width:203px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">131210-100ML</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">Hexane</td>
			<td style="width:203px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">296090-1L</td>
			<td style="width:587px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">Heavy Mineral Oil</td>
			<td style="width:203px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">330760-1L</td>
			<td style="width:587px;">Make sure it&#8217;s odorless</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">Ethanol</td>
			<td style="width:203px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">459836-1L</td>
			<td style="width:587px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">Scintillation vials</td>
			<td style="width:203px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">Z190535-1PAK</td>
			<td style="width:587px;">Use a small drill bit to bore a small hole in the cap of the vials&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">Bee harness</td>
			<td style="width:203px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:587px;">Custom-made from 0.9 cm diameter plastic soda straws or hard plastic/metal tubing</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">Duct tape</td>
			<td style="width:203px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:587px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">Kimwipes</td>
			<td style="width:203px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">Z188956-1PAK</td>
			<td style="width:587px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">Wash bottles</td>
			<td style="width:203px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">Z560847-3EA</td>
			<td style="width:587px;">For the 70% ethanol&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">Small fan in mountable housing</td>
			<td style="width:203px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:587px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">Dryer tubing</td>
			<td style="width:203px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:587px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;"></td>
			<td style="width:203px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:587px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;"></td>
			<td style="width:203px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:587px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;"></td>
			<td style="width:203px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">FOR METHOD 1 ONLY</td>
			<td style="width:203px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">Name</td>
			<td style="width:203px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:587px;">Comments</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">20 ml disposable plastic syringes</td>
			<td style="width:203px;">Cole-Parmer</td>
			<td style="width:119px;">WU-07945-18</td>
			<td style="width:587px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">15 mm filter paper circles</td>
			<td style="width:203px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">Z274844-1PAK</td>
			<td style="width:587px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">Pushpins</td>
			<td style="width:203px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:587px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">Toothpicks</td>
			<td style="width:203px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:587px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;"></td>
			<td style="width:203px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:587px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;"></td>
			<td style="width:203px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:587px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;"></td>
			<td style="width:203px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">FOR METHOD 2 ONLY</td>
			<td style="width:203px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">Name</td>
			<td style="width:203px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:587px;">Comments</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">Gilmont Micrometer syringe, 0.2 mL</td>
			<td style="width:203px;">Cole-Parmer</td>
			<td style="width:119px;">EW-07840-00</td>
			<td style="width:587px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">Gilmont micrometer syringe tip</td>
			<td style="width:203px;">Cole-Parmer</td>
			<td style="width:119px;">EW-07841-00</td>
			<td style="width:587px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">26G 3/8&#8221; Leur hub hypodermic needles</td>
			<td style="width:203px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">14-826-10</td>
			<td style="width:587px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:371px;">1cc tuberculin syringes (plastic/glass)</td>
			<td style="width:203px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">Z181641-1EA&#160;&#160; OR &#160;&#160;Z192090-200EA</td>
			<td style="width:587px;">glass tuberculin syringes are available, but plastic syringes are much less expensive and will work well for a limited number of uses</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Small rubber/silicone restrictors</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>EW-95702-02</td>
			<td>Made from 4.8 mm outer diameter silicone tubing or the rubber tips of the 1 cc syringe plungers</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">Parafilm</td>
			<td style="width:203px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P7793-1EA</td>
			<td style="width:587px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">75 X 100 mm filter paper</td>
			<td style="width:203px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">Z695106-500EA</td>
			<td style="width:587px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:371px;">Direct Logic 05 Programmable Logic Controller</td>
			<td style="width:203px;">Koyo Electronics Industries Co, Ltd</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:587px;">http://www.koyoele.co.jp/&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; OR&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; english/support/dlc.html#plc</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:371px;">1 mm, 4mm &#38; 6 mm inner diameter PVC or silicone tubing&#160;</td>
			<td style="width:203px;">Cole-Parmer</td>
			<td style="width:119px;">Various</td>
			<td style="width:587px;">Cole-Parmer has a wide selection of suitable tubing</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">Polypropylene connectors &#38; leur fittings</td>
			<td style="width:203px;">Cole-Parmer</td>
			<td style="width:119px;">Various</td>
			<td style="width:587px;">Cole-Parmer has a wide selection of connectors and fittings for many tube sizes</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">65-mm Correlated Flowmeter</td>
			<td style="width:203px;">Cole-Parmer</td>
			<td style="width:119px;">EW-03216-08</td>
			<td style="width:587px;">Aluminum with Glass float; For Liquids and Gases, With Valve</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">&#160;&#160;&#160;&#160; OR&#160;</td>
			<td style="width:203px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:587px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:371px;">Tetra Whisper 300 (Tetratek DW96-2) Aquarium Air Pump</td>
			<td style="width:203px;">Aquacave</td>
			<td style="width:119px;">AE-TETRA-300</td>
			<td style="width:587px;">www.aquacave.com</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:371px;">LIF series Solenoid Valves for .042 &#34; ID Tubing, Configuration &#34;E&#34;</td>
			<td style="width:203px;">The Lee Company</td>
			<td style="width:119px;">LFAA1200118H</td>
			<td style="width:587px;">Neoprene, 430 SS, 302 SS, 280mWatts&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; http://www.theleeco.com/LEEWEB2.NSF</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">PC-Board 12VDC 70dB Piezo Buzzer</td>
			<td style="width:203px;">RadioShack</td>
			<td style="width:119px;">273-074</td>
			<td style="width:587px;">www.radioshack.com</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a proboscis extension response protocol for investigating behavioral plasticity in insects: application to basic, biomedical, and agricultural research

Insetos modificar suas respostas a estímulos através da experiência de associar esses estímulos com eventos importantes para a sobrevivência (por exemplo, alimentos, companheiros, ameaças). Existem vários mecanismos comportamentais através do qual um inseto aprende associações salientes e relaciona-os com esses eventos. É importante compreender que esta plasticidade comportamental para os programas destinados para dar assistência aos insetos que são benéficos para a agricultura. Este entendimento também pode ser utilizado para descobrir soluções para problemas biomédicos e agrícolas criada por insectos que actuam como vectores de doenças e pragas. O protocolo condicionado narigudo Extensão Resposta (PER) foi desenvolvido para as abelhas (Apis mellifera) com mais de 50 anos atrás para estudar como eles percebem e aprender sobre os odores florais, que sinalizam os recursos de néctar e pólen de necessidades para a sobrevivência da colônia. O procedimento PER fornece uma estrutura robusta e fácil de empregar para estudar vários mecha ecologicamente relevantes diferentenismos de plasticidade comportamental. Ela é facilmente adaptável para utilização com várias outras espécies de insectos e outros reflexos comportamentais. Estes protocolos podem ser prontamente empregues em conjunto com vários meios para a monitorização da actividade neuronal no SNC através de electrofisiologia ou bioimaging, ou para manipular vias neuromoduladores segmentados. É um ensaio robusto para uma rápida detecção de efeitos subletais sobre o comportamento causados ​​por estressores ambientais, toxinas ou pesticidas. Nós mostramos como o protocolo PER é fácil de implementar utilizando dois procedimentos. Um deles é adequado como um exercício de laboratório para os estudantes ou para ensaios rápidos do efeito de um tratamento experimental. O outro fornece controle completo mais de variáveis, o que é importante para os estudos de condicionamento comportamental. Mostramos como várias medidas de resposta comportamental que variam de binários sim / não para mais variável contínua como latência e duração da extensão tromba pode ser usado para testar hypotheses. E, discutimos algumas armadilhas que os pesquisadores comumente se deparam quando usar o procedimento pela primeira vez.

Apresentam-se dois exemplos de utilização dos protocolos POR descritos acima. O primeiro exemplo, feito uso do método 2 para estudar o modo como as abelhas perceber odores diferentes como uma função da semelhança molecular de odor utilizado como o CS 5,24,25. O segundo é um exemplo do uso do método 1 e algumas das precauções que devem ser tomadas quando começar a usar PER experimentos de condicionamento no laboratório de pesquisa. Estudos como este têm sido usados ​​para descrever o &#39;espaço perceptivo &quot;olfativa das abelhas e mariposas em conjunto com bioimaging 13 ou eletrofisiológico analisa 26. As abelhas do mel (n = 20) foram condicionados a associar o odorante decanal com reforço de sacarose ao longo de 12 ensaios para a frente emparelhamento condicionado (Figura 3A). Aproximadamente 10% das abelhas respondeu &quot;espontaneamente&quot; no primeiro ensaio, que é normal. Depois que o percentual que Responded aumentar ao longo dos próximos ensaios até 100% das abelhas respondeu na quinta tentativa e cada posterior julgamento. Vários estudos têm demonstrado que este aumento na resposta é específica para a condição para a frente o emparelhamento (Figura 1), em relação a vários processos de controlo importantes 3. Após a fase de aquisição, cada abelha foi submetido a uma série de ensaios teste não reforçada (Figura 3B), que envolveu a exposição ao odor CS e para vários outros odorantes que sistematicamente se diferenciou do CS em estruturas moleculares. As abelhas do mel responderam mais fortemente para o CS. Suas respostas para as outras odorants diminuiu em função das mudanças sistemáticas na estrutura, com as menores respostas aos odores menos como o CS. Na Figura 4, os resultados de um recente workshop em que os alunos aprenderam, pela primeira vez, como condicionar as abelhas utilizam o método 1 são ilustrados. Estudantes abetos<html> t condicionado abelhas por frente emparelhamento methycyclohexanone (HCM), ou octanol (OCT) com reforço de sacarose (Figura 4A). Respostas por cento foram menores no primeiro julgamento e aumentou em julgamentos posteriores, indicando que as abelhas aprenderam a associação odor-sacarose. Houve diferenças no grau que as abelhas aprenderam a associação condicionada pelos diferentes grupos de alunos. Na nossa experiência, estes tipos de diferenças podem ser devido ao odor, que foi usado como o CS, para os elementos imprecisos no método (Método 1), ou para o nível de formação dos experimentadores. No terceiro caso, o desempenho rapidamente torna-se mais consistente com o aumento da experiência dos pesquisadores. Após o condicionamento, cada abelha foi testado duas vezes com cada odor. Em grupos de abelhas que havia sido condicionado com emparelhamento frente de outubro ou MCH, a resposta foi, como esperado, o mais forte para o odor condicionado (Figura 4B). <html> ent &quot;&gt; O segundo grupo de abelhas que passaram para a frente de emparelhamento para outubro foi acondicionado em paralelo a um outro grupo no qual o odor outubro foi para trás combinado com sacarose. emparelhamento para trás é um dos vários tipos de procedimentos de controle para demonstrar que o aumento da resposta é específica de transmitir o emparelhamento e não devido a um outro processo, como a excitação não-específica de sensibilização. Para o emparelhamento para trás, os EUA sacarose e odor CS são apresentados em ordem inversa ao que é mostrado na Figura 1. Aquisição de Dados de emparelhamento para trás são não mostrado porque o RC não podem ser marcados dada a apresentação do odor SC após a apresentação de sacarose. Como seria previsível para o condicionamento associativo, os níveis de resposta para outubro foram maiores no grupo para a frente emparelhado em relação ao grupo de trás (Figura 4C). &quot;Width =&quot; 7fig1highres.jpg 500 &quot;/&gt; Figura 1: Diagrama de projeto experimental para o condicionamento usando a frente de emparelhamento. Ver Tabela 1 para a definição dos termos usados ​​nesta figura. (A) O CS (odor) precede e se sobrepõe com os EUA (solução / água sacarose). A relação entre o CS e US mostrado é o ideal para as abelhas produtoras de mel condicionado e mariposas. Mas o ISI ideal pode depender do protocolo condicionado e espécie animal 1. (B) Composição e temporização relativa de CS, CR, US e UR. O CR que ocorra antes da apresentação US ou durante os ensaios sem reforço &#39;test&#39; é a medida depende de protocolos experimentais. <img alt="Figura 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51057/51057fig2highres.jpg" width="500" /> Figura 2 esgotamento Odor com reaproveitamento de cartuchos. Para esses dados, cartuchos de odor foramset-up com hexanol, como descrito no texto. Hexanol é comumente usado como um CS nos estudos por; no entanto, a taxa efectiva de depleção dependerá do odor e do solvente. Os cartuchos foram então usados ​​uma vez para 4 seg a cada minuto mais de 8 ensaios (assumindo 5 abelhas / trial em um experimento padrão que seria igual a 40 usos). As diluições no solvente indicado, que eram relativamente norma para experiências POR, foram de 2,0 M (A) e 0,2 M (B). (A, B) O odor foi amostrada após o primeiro e oitavo ensaios por adsorção sobre uma fase sólida microextração (SPME) de fibra que foi então dessorvido em um cromatógrafo a gás. As áreas relativas sob os picos foram superiores após o primeiro ensaio em relação ao oitavo para ambos os solventes e para ambas as concentrações (Wilcoxon pares assinado teste rank p &lt;0,05 [*] ou superior), o que mostra que menos odor foi entregue a partir do cartucho depois de o cartucho ter sido utilizado um número de vezes. (C, D) Os mesmos dados que mostram apenas o oitavo tr<html> ial com o eixo y expandido. Ela mostra que a depleção foi ligeiramente maior para hexano relativo ao óleo mineral, mas apenas a uma concentração mais baixa. <img alt="Figura 3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51057/51057fig3highres.jpg" width="500" /> Figura 3 Aquisição e teste usando decanal como o CS e método 2 para condicionado. (A) Teste-de-ensaio de resposta (CR) ao longo de 12 ensaios de emparelhamento para a frente (Figura 1). Os dados são de abelhas n = 20 mel condicionado em quatro grupos de cinco abelhas cada. O ISI foi de 3 segundos e o ITI foi 6 min. (B), utilizando testes não reforçada odores que diferem decanal pelo comprimento e / ou na posição do carbono do carbonilo da cadeia de carbono. Os odores foram apresentados numa série ao acaso entre os quatro grupos e foram intercaladas com ensaios reforçados com decanal (cada dois a três ensaios), a fim de evitar a extinção da CR. e_content &quot;fo: manter-together.within-page =&quot; always &quot;&gt; <img alt="Figura 4" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51057/51057fig4highres.jpg" width="500" /> Figura 4. Dados de um seminário durante o qual pós-graduação foram treinados para condicionar as abelhas usando PER método 1. dados (a) Aquisição de três grupos de abelhas condicionados a octanol (n = 23 e 15 para GPS 1 e 2, respectivamente) e metilciclohexanona (n = 10) (B) CRs durante os testes não reforçados com ambos os odores.; quatro ensaios apresentados na série aleatória entre os grupos. (C) sem reforço testes com ambos os odores em dois grupos de abelhas, um para a frente emparelhado (Gp 1, n = 23) e um para trás pareado (n = 25). <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Prazo (abreviação) </td><td> Definição </td><td> Exemplo relevante </td></tr><tr><td> Estímulo condicionado (CS) </td><td> Aestímulo que provoca pouca ou nenhuma resposta às primeira e sinaliza US </td><td> CHEIRO </td></tr><tr><td> Resposta condicionada (CR) uma </td><td> A resposta ao CS após associação com os EUA </td><td> PROBOSCIS EXTENSÃO </td></tr><tr><td> Estímulo incondicionado (US) </td><td> Um estímulo biologicamente significativo que provoca uma resposta </td><td> Solução de sacarose / ÁGUA </td></tr><tr><td> Unconditioned Response (UR) a </td><td> A resposta para os EUA </td><td> PROBOSCIS EXTENSÃO </td></tr><tr><td> Inter-Stimulus Interval (ISI) </td><td> O tempo entre o início do CS e início de os EUA </td><td> CHEIRO de intervalo SACAROSE </td></tr><tr><td> Inter-Ensaio Interval (ITI) </td><td> O tempo entre sucessivos emparelhamentos CS-americanos para um único animal </td><td> CHEIRO (trial n) CHEIRO (trial n + 1) intervalo </td></tr></tbody></table> Tabela 1 Importante Terminologia. Consulte a Figura 1 para uma ilustração destes termos. um lucro por condicionar o CR e UR são os mesmos, embora para outros tipos de associações e reflexos do CR e UR podem ser diferentes. <a href="/files/ftp_upload/51057/BEE_4.avi" target="_blank">Filme 1.</a> Um vídeo de uma abelha do mel realizando PER depois de ter sido condicionado a responder a um odor. Observe a resposta PER da abelha aproximadamente 1,5 seg após o início odor. Acompanhando software mapeados os movimentos da antena, em resposta à apresentação do odor. As linhas traçadas no canto superior direito do vídeo mostram os movimentos reais da antena. Os dois gráficos na parte inferior da tela mostram movimentos antenais no X (à esquerda) e Y (direita) coordena. As linhas verticais no gráfico mostrado no vídeo indicam, da esquerda para a direita, a luz ON, PER, luz apagada e probóscide retração.

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A Proboscis Extension Response Protocol for Investigating Behavioral Plasticity in Insects: Application to Basic, Biomedical, and Agricultural Research

The Proboscis Extension Response (PER) conditioning protocol, developed for the honey bee (Apis mellifera), provides an ecologically-relevant and easily quantifiable means for studying several different mechanisms of learning in many insect species.

Um protocolo de resposta narigudo Extensão para investigar plasticidade comportamental em Insetos: Aplicação para Basic, biomédica e Pesquisa Agropecuária

Insects modify their responses to stimuli through experience of associating those stimuli with events important for survival (e.g., food, mates, threats). ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

33.9K visualizações.  Arizona State University. The Proboscis Extension Response (PER) conditioning protocol, developed for the honey bee (Apis mellifera), provides an ecologically-relevant and easily quantifiable means for studying several different mechanisms of learning in many insect species. 

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Enabling High Grayscale Resolution Displays and Accurate Response Time Measurements on Conventional Computers

Display systems based on conventional computer graphics cards are capable of generating images with 8-bit gray level resolution. However, most experiments in vision research require displays with more than 12 bits of luminance resolution. Several solutions are available. Bit++ 1 and DataPixx 2 use the Digital Visual Interface (DVI) output from graphics cards and high resolution (14 or 16-bit) digital-to-analog converters to drive analog display devices. The VideoSwitcher 3 described here combines analog video signals from the red and blue channels of graphics cards with different weights using a passive resister network 4 and an active circuit to deliver identical video signals to the three channels of color monitors. The method provides an inexpensive way to enable high-resolution monochromatic displays using conventional graphics cards and analog monitors. It can also provide trigger signals that can be used to mark stimulus onsets, making it easy to synchronize visual displays with physiological recordings or response time measurements.
Although computer keyboards and mice are frequently used in measuring response times (RT), the accuracy of these measurements is quite low. The RTbox is a specialized hardware and software solution for accurate RT measurements. Connected to the host computer through a USB connection, the driver of the RTbox is compatible with all conventional operating systems. It uses a microprocessor and high-resolution clock to record the identities and timing of button events, which are buffered until the host computer retrieves them. The recorded button events are not affected by potential timing uncertainties or biases associated with data transmission and processing in the host computer. The asynchronous storage greatly simplifies the design of user programs. Several methods are available to synchronize the clocks of the RTbox and the host computer. The RTbox can also receive external triggers and be used to measure RT with respect to external events. 
Both VideoSwitcher and RTbox are available for users to purchase. The relevant information and many demonstration programs can be found at <a href="http://lobes.usc.edu/">http://lobes.usc.edu/</a>.

Conventional computer hardware can not generate visual stimuli with sufficiently high grayscale resolution and measure response times with sufficient accuracy. We describe how to use the VideoSwitcher to produce high-resolution monochromatic displays, and the RTbox to measure response times with high accuracy on conventional computer hardware.

Ativando alta escala de cinza monitores de resolução e Medidas resposta precisa de tempo em computadores convencionais

Display systems based on conventional computer graphics cards are capable of generating images with 8-bit gray level resolution. However, most experiments ...

Neurociência

A General Method for Evaluating Incubation of Sucrose Craving in Rats

For someone on a food-restricted diet, food craving in response to food-paired cues may serve as a key behavioral transition point between abstinence and relapse to food taking 1. Food craving conceptualized in this way is akin to drug craving in response to drug-paired cues. A rich literature has been developed around understanding the behavioral and neurobiological determinants of drug craving; we and others have been focusing recently on translating techniques from basic addiction research to better understand addiction-like behaviors related to food 2-4.
As done in previous studies of drug craving, we examine sucrose craving behavior by utilizing a rat model of relapse. In this model, rats self-administer either drug or food in sessions over several days. In a session, lever responding delivers the reward along with a tone+light stimulus. Craving behavior is then operationally defined as responding in a subsequent session where the reward is not available. Rats will reliably respond for the tone+light stimulus, likely due to its acquired conditioned reinforcing properties 5. This behavior is sometimes referred to as sucrose seeking or cue reactivity. In the present discussion we will use the term "sucrose craving" to subsume both of these constructs.
In the past decade, we have focused on how the length of time following reward self-administration influences reward craving. Interestingly, rats increase responding for the reward-paired cue over the course of several weeks of a period of forced-abstinence. This "incubation of craving" is observed in rats that have self-administered either food or drugs of abuse 4,6. This time-dependent increase in craving we have identified in the animal model may have great potential relevance to human drug and food addiction behaviors.
Here we present a protocol for assessing incubation of sucrose craving in rats. Variants of the procedure will be indicated where craving is assessed as responding for a discrete sucrose-paired cue following extinction of lever pressing within the sucrose self-administration context (Extinction without cues) or as responding for sucrose-paired cues in a general extinction context (Extinction with cues).

Responding for food or drug-paired cues increases over the course of a period of abstinence and this may relate to an increased susceptibility to relapse behaviors. Here we detail a procedure for evaluating this "incubation of craving" in rats that have self-administered sucrose.

Um método geral para a avaliação de Incubação de Craving Sacarose em Ratos

For someone on a food-restricted diet, food craving in response to food-paired cues may serve as a key behavioral transition point between abstinence and ...

A Lightweight, Headphones-based System for Manipulating Auditory Feedback in Songbirds

Experimental manipulations of sensory feedback during complex behavior have provided valuable insights into the computations underlying motor control and sensorimotor plasticity1. Consistent sensory perturbations result in compensatory changes in motor output, reflecting changes in feedforward motor control that reduce the experienced feedback error. By quantifying how different sensory feedback errors affect human behavior, prior studies have explored how visual signals are used to recalibrate arm movements2,3 and auditory feedback is used to modify speech production4-7. The strength of this approach rests on the ability to mimic naturalistic errors in behavior, allowing the experimenter to observe how experienced errors in production are used to recalibrate motor output.
Songbirds provide an excellent animal model for investigating the neural basis of sensorimotor control and plasticity8,9. The songbird brain provides a well-defined circuit in which the areas necessary for song learning are spatially separated from those required for song production, and neural recording and lesion studies have made significant advances in understanding how different brain areas contribute to vocal behavior9-12. However, the lack of a naturalistic error-correction paradigm - in which a known acoustic parameter is perturbed by the experimenter and then corrected by the songbird - has made it difficult to understand the computations underlying vocal learning or how different elements of the neural circuit contribute to the correction of vocal errors13.
The technique described here gives the experimenter precise control over auditory feedback errors in singing birds, allowing the introduction of arbitrary sensory errors that can be used to drive vocal learning. Online sound-processing equipment is used to introduce a known perturbation to the acoustics of song, and a miniaturized headphones apparatus is used to replace a songbird's natural auditory feedback with the perturbed signal in real time. We have used this paradigm to perturb the fundamental frequency (pitch) of auditory feedback in adult songbirds, providing the first demonstration that adult birds maintain vocal performance using error correction14. The present protocol can be used to implement a wide range of sensory feedback perturbations (including but not limited to pitch shifts) to investigate the computational and neurophysiological basis of vocal learning.

We describe the design and assembly of miniaturized headphones suitable for replacing a songbird&#x2019;s natural auditory feedback with a manipulated acoustic signal. Online sound processing hardware is used to manipulate song output, introduce real-time errors in auditory feedback via the headphones, and drive vocal motor learning.

Um leve, sistema de fones baseado para manipular feedback auditivo em Songbirds

Experimental manipulations of sensory feedback during complex behavior have provided valuable insights into the computations underlying motor control and ...

Inducing Plasticity of Astrocytic Receptors by Manipulation of Neuronal Firing Rates

Close to two decades of research has established that astrocytes in situ and in vivo express numerous G protein-coupled receptors (GPCRs) that can be stimulated by neuronally-released transmitter. However, the ability of astrocytic receptors to exhibit plasticity in response to changes in neuronal activity has received little attention. Here we describe a model system that can be used to globally scale up or down astrocytic group I metabotropic glutamate receptors (mGluRs) in acute brain slices. Included are methods on how to prepare parasagittal hippocampal slices, construct chambers suitable for long-term slice incubation, bidirectionally manipulate neuronal action potential frequency, load astrocytes and astrocyte processes with fluorescent Ca2+ indicator, and measure changes in astrocytic Gq GPCR activity by recording spontaneous and evoked astrocyte Ca2+ events using confocal microscopy. In essence, a &#8220;calcium roadmap&#8221; is provided for how to measure plasticity of astrocytic Gq GPCRs. Applications of the technique for study of astrocytes are discussed. Having an understanding of how astrocytic receptor signaling is affected by changes in neuronal activity has important implications for both normal synaptic function as well as processes underlying neurological disorders and neurodegenerative disease.

Here we describe an adaptation of protocols used to induce homeostatic plasticity in neurons for the study of plasticity of astrocytic G protein-coupled receptors. Recently used to examine changes in astrocytic group I mGluRs in juvenile mice, the method can be applied to measure scaling of various astrocytic GPCRs, in tissue from adult mice in situ and in vivo, and to gain a better appreciation of the sensitivity of astrocytic receptors to changes in neuronal activity.

Induzir Plasticidade de astrocítica Receptores de Manipulação de Neuronal queima de moeda

Close to two decades of research has established that astrocytes in situ and in vivo express numerous G protein-coupled receptors (GPCRs) that can be ...

Dyeing Insects for Behavioral Assays: the Mating Behavior of Anesthetized Drosophila

Mating experiments using Drosophila have contributed greatly to the understanding of sexual selection and behavior. Experiments often require simple, easy and cheap methods to distinguish between individuals in a trial. A standard technique for this is CO2 anaesthesia and then labelling or wing clipping each fly. However, this is invasive and has been shown to affect behavior. Other techniques have used coloration to identify flies. This article presents a simple and non-invasive method for labelling Drosophila that allows them to be individually identified within experiments, using food coloring. This method is used in trials where two males compete to mate with a female. Dyeing allowed quick and easy identification. There was, however, some difference in the strength of the coloration across the three species tested. Data is presented showing the dye has a lower impact on mating behavior than CO2 in Drosophila melanogaster. The impact of CO2 anaesthesia is shown to depend on the species of Drosophila, with D. pseudoobscura and D. subobscura showing no impact, whereas D. melanogaster males had reduced mating success. The dye method presented is applicable to a wide range of experimental designs.

Dyeing Insects for Behavioral Assays: the Mating Behavior of Anesthetized Drosophila

This protocol describes a simple, cost effective way to individually identify Drosophila or other insects. Demonstration data investigating mating success across three species of Drosophila show that this method is comparable or better than the use of CO2 anaesthesia.

Tingimento Insetos para Comportamentais Ensaios: o comportamento de acasalamento dos anestesiado<em&gt; Drosophila</em

Mating experiments using Drosophila have contributed greatly to the understanding of sexual selection and behavior. Experiments often require simple, easy ...

Online Transcranial Magnetic Stimulation Protocol for Measuring Cortical Physiology Associated with Response Inhibition

We describe the development of a reproducible, child-friendly motor response inhibition task suitable for online Transcranial Magnetic Stimulation (TMS) characterization of primary motor cortex (M1) excitability and inhibition. Motor response inhibition prevents unwanted actions and is abnormal in several neuropsychiatric conditions. TMS is a non-invasive technology that can quantify M1 excitability and inhibition using single- and paired-pulse protocols and can be precisely timed to study cortical physiology with high temporal resolution. We modified the original Slater-Hammel (S-H) stop signal task to create a &#34;racecar&#34; version with TMS pulses time-locked to intra-trial events. This task is self-paced, with each trial initiating after a button push to move the racecar towards the 800 ms target. GO trials require a finger-lift to stop the racecar just before this target. Interspersed randomly are STOP trials (25%) during which the dynamically adjusted stop signal prompts subjects to prevent finger-lift. For GO trials, TMS pulses were delivered at 650 ms after trial onset; whereas, for STOP trials, the TMS pulses occurred 150 ms after the stop signal. The timings of the TMS pulses were decided based on electroencephalography (EEG) studies showing event-related changes in these time ranges during stop signal tasks. This task was studied in 3 blocks at two study sites (n=38) and we recorded behavioral performance and event-related motor-evoked potentials (MEP). Regression modelling was used to analyze MEP amplitudes using age as a covariate with multiple independent variables (sex, study site, block, TMS pulse condition [single- vs. paired-pulse], trial condition [GO, successful STOP, failed STOP]). The analysis showed that TMS pulse condition (p&#60;0.0001) and its interaction with trial condition (p=0.009) were significant. Future applications for this online S-H/TMS paradigm include the addition of simultaneous EEG acquisition to measure TMS-evoked EEG potentials. A potential limitation is that in children, the TMS pulse sound could&#160;affect behavioral task performance.

We describe an experimental procedure to quantify excitability and inhibition of primary motor cortex during a motor response inhibition task by using Transcranial Magnetic Stimulation throughout the course of a Stop Signal Task.

Protocolo de estimulação magnética transcraniana on-line para medir Cortical fisiologia associada com inibição de resposta

We describe the development of a reproducible, child-friendly motor response inhibition task suitable for online Transcranial Magnetic Stimulation (TMS) ...

SwarmSight: Real-time Tracking of Insect Antenna Movements and Proboscis Extension Reflex Using a Common Preparation and Conventional Hardware

Many scientifically and agriculturally important insects use antennae to detect the presence of volatile chemical compounds and extend their proboscis during feeding. The ability to rapidly obtain high-resolution measurements of natural antenna and proboscis movements and assess how they change in response to chemical, developmental, and genetic manipulations can aid the understanding of insect behavior. By extending our previous work on assessing aggregate insect swarm or animal group movements from natural and laboratory videos using the video analysis software SwarmSight, we developed a novel, free, and open-source software module, SwarmSight Appendage Tracking (SwarmSight.org) for frame-by-frame tracking of insect antenna and proboscis positions from conventional web camera videos using conventional computers. The software processes frames about 120 times faster than humans, performs at better than human accuracy, and, using 30 frames per second (fps) videos, can capture antennal dynamics up to 15 Hz. The software was used to track the antennal response of honey bees to two odors and found significant mean antennal retractions away from the odor source about 1 s after odor presentation. We observed antenna position density heat map cluster formation and cluster and mean angle dependence on odor concentration.

This protocol describes steps for using the novel software, SwarmSight, for frame-by-frame tracking of insect antenna and proboscis positions from conventional web camera videos using conventional computers. The free, open-source software processes frames about 120 times faster than humans and performs at better than human accuracy.

SwarmSight: Acompanhamento em tempo real dos movimentos de antena do inseto e reflexo de extensão Proboscis usando uma preparação comum e Hardware convencional

Many scientifically and agriculturally important insects use antennae to detect the presence of volatile chemical compounds and extend their proboscis ...

Spectral Reflectometric Microscopy on Myelinated Axons In Situ

In a mammalian nervous system, myelin provides an electrical insulation by enwrapping the axon fibers in a multilayered spiral. Inspired by its highly-organized subcellular architecture, we recently developed a new imaging modality, named spectral reflectometry (SpeRe), which enables unprecedented label-free nanoscale imaging of the live myelinated axons in situ. The underlying principle is to obtain nanostructural information by analyzing the reflectance spectrum of the multilayered subcellular structure. In this article, we describe a detailed step-by-step protocol for performing a basic SpeRe imaging of the nervous tissues using a commercial confocal microscopic system, equipped with a white-light laser and a tunable filter. We cover the procedures of sample preparation, acquisition of spectral data, and image processing for obtaining nanostructural information.

Spectral Reflectometric Microscopy on Myelinated Axons In Situ

Here, we present a step-by-step protocol for imaging myelinated axons in a fixed brain slice using a label-free nanoscale imaging technique based on spectral reflectometry.

Microscopia de reflectométrica espectral em dendritos In Situ

In a mammalian nervous system, myelin provides an electrical insulation by enwrapping the axon fibers in a multilayered spiral. Inspired by its ...

Simple Surgical Induction of Conductive Hearing Loss with Verification Using Otoscope Visualization and Behavioral Clap Startle Response in Rat

Conductive hearing loss (CHL) is a prevalent hearing impairment in humans. The goal of the protocol is to describe a simple surgical procedure for inducing CHL in rodents. The protocol demonstrates CHL by tympanic membrane puncture. Verification of CHL surgery was by otoscope examination and behavioral assessment by clap startle response, both replicable and reliable, and are simple methods to demonstrate hearing loss has occurred. The simple CHL procedure is advantageous due to its reproducibility and flexibility to different pursuits in hearing loss research. The limitations of inducing CHL by a surgical approach are associated with the learning curve to perform the surgical procedure and confidence in audiological examination. Inducing a hearing impairment by CHL allows one to readily study the neural manifestations and behavioral outcomes of hearing loss.

Here, we present a protocol to establish a replicable conductive hearing loss induction via surgical tympanic membrane puncture and verification by otoscope visualization and behavioral assessment by clap startle.

Indução cirúrgica simples da perda auditiva condutora com verificação usando a visualização do otoscópio e a resposta comportável do startle do clap no rato

Conductive hearing loss (CHL) is a prevalent hearing impairment in humans. The goal of the protocol is to describe a simple surgical procedure for ...

The Power of Interstimulus Interval for the Assessment of Temporal Processing in Rodents

Temporal processing deficits have been implicated as a potential elemental dimension of higher-level cognitive processes, commonly observed in neurocognitive disorders. Despite the popularization of prepulse inhibition (PPI) in recent years, many current protocols promote using a percent of control measure, thereby precluding the assessment of temporal processing. The present study used cross-modal PPI and gap prepulse inhibition (gap-PPI) to demonstrate the benefits of employing a range of interstimulus intervals (ISIs) to delineate effects of sensory modality, psychostimulant exposure, and age. Assessment of sensory modality, psychostimulant exposure, and age reveals the utility of an approach varying the interstimulus interval (ISI) to establish the shape of the ISI function, including increases (sharper curve inflections) or decreases (flattening of the response amplitude curve) in startle amplitude. Additionally, shifts in peak response inhibition, suggestive of a differential sensitivity to the manipulation of ISI, are often revealed. Thus, the systematic manipulation of ISI affords a critical opportunity to evaluate temporal processing, which may reveal the underlying neural mechanisms involved in neurocognitive disorders.

Temporal processing, a preattentive process, may underlie deficits in higher-level cognitive processes, including attention, commonly observed in neurocognitive disorders. Using prepulse inhibition as an exemplar paradigm, we present a protocol for manipulating interstimulus interval (ISI) to establish the shape of the ISI function to provide an assessment of temporal processing.