Vorremmo ringraziare Patrick C. Wilson per monoclonale CR9114 anticorpo. Ringraziamo anche Jennifer Debeauchamp e Richard Webby per i plasmidi originali A/Anhui/1/13. Supporto parziale per questo lavoro è stato fornito dal National Institute for Allergy e Malattie Infettive-finanziato Progetto Programma di Grant AI097092-01A1 e CEIRS (centri di eccellenza per la ricerca e l&#39;Influenza Surveillance, HHSN26620070010C). FK è stato sostenuto da una borsa di Erwin Schrödinger (J 3232) dal Fondo austriaco della scienza (FWF).

1. Generazione di ricombinante Baculovirus <ol><li> Clonazione in baculovirus trasferimento-plasmidi <ol><li> Clone H7 HA e NA ectodomain N9 (o qualsiasi altro gene HA o NA) nella modificate trasferimento plasmidi pFastBac (vedi introduzione). Vettori per HA contenente un dominio trimerizzazione C-terminale e un tag hexahistidine, nonché per NA contenente un dominio di tetramerizzazione N-terminale e tag hexahistidine, sono stati descritti 1,10,11,22 (Figura 1) e possono essere richieste gli autori. Nota esplicativa: ectodomains HA espresse senza un dominio trimerizzazione saranno piegate in modo errato, con conseguente perdita di epitopi neutralizzanti conformazionali, soprattutto nel settore gambo. Analogamente, la funzione enzimatica NA basa su una corretta tetramerization. </li><li> Generazione di bacmids Trasforma il trasferimento-plasmidi baculovirus contenenti HA e NA geni nei batteri DH10Bac secondo utilizzando un&#39;espressione baculovirusil sistema secondo le istruzioni del produttore. Isolare e purificare bacmids utilizzando un kit Midiprep secondo le istruzioni del produttore (Figura 2). </li></ol></li><li> Salvataggio di baculovirus ricombinante e verifica dell&#39;espressione della proteina Nota esplicativa: Le seguenti operazioni devono essere eseguite in modo asettico in una cappa a flusso laminare. Eseguire questa procedura indipendente per HA e NA (o qualsiasi altro gene di interesse). Cellule di insetto di solito sono coltivate a 28 ° C senza CO 2. Cellule Sf9 di questo protocollo sono coltivate in mezzi cellule di insetto pieno TNM-FH supplementato con 10% FBS, 1% Pen-Strep * e 0,1% soluzione F68 Pluronic, se non diversamente indicato, e diversi passaggi 01:04 due volte a settimana. High Five cellule sono coltivate in mezzi siero libero SFX e diversi passaggi 01:15 due volte a settimana. * Aggiunta di antibiotici dovrebbe essere considerato facoltativo per tutto il protocollo e regolata secondo le pratiche utilizzate in ogni laboratorio. <ol><li> Piatto cellule di insetto Sf9 in piastre da 6 pozzetti ad una densità di 2 x 10 5 cellule / cm 2 e lasciate riposare per 20 minuti in un incubatore a 28 ° C (senza CO 2). </li><li> Mescolare 2 mg (conc. 0,5-2 mg / ul) di bacmid ricombinante con 100 ml di TNM-FH medio (siero gratuito, 1% Pen-Strep). Mescolare 6 ml di agente di trasfezione con 100 ml di TNM-FH medio (siero libero, Pen-Strep). Unire i due volumi, mescolare delicatamente e lasciate riposare per 20 minuti a temperatura ambiente (miscela di trasfezione). Includere un mock-trasfezione il controllo (Figura 3). </li><li> Rimuovere il surnatante dalle cellule Sf9 placcato (cellule verranno ora aderire alla piastra) e sostituirli con 2 ml di siero libero medio TNM-FH contenenti Pen-Strep (1%). Aggiungere il volume totale della miscela di trasfezione (dal punto 1.2.2) e rock del 6 pozzetti accuratamente per 5 sec. Incubare in un incubatore a 28 ° C senza CO 2 per 6 ore (Figura 3). </li><li> Sostituire il supporto with mezzi freschi TNM-FH completi (contenente 10% FBS, 1% Pen-Strep e 0,1% Pluronic F68). Incubare in un incubatore a 28 ° C senza CO 2 per 6 giorni. Controllare di tanto in tanto le cellule al microscopio. Cellule infette di solito appaiono più grande, rotondo, hanno ampliato nuclei, e iniziano a staccare (Figura 4). </li><li> Raccolta di cellule e conferma di espressione proteica <ol><li> Celle di raccolta 6 giorni dopo la trasfezione mediante centrifugazione a 2000 xg per 5 minuti a temperatura ambiente. Il supernatante contiene il baculovirus ricombinante - questo sarà usato per generare scorte lavoro subito, o può essere conservato a 4 ° C per anni. </li><li> Per controllare l&#39;espressione della proteina raccogliere pellet e risospendere in 500 ml di PBS. Mescolare 50 ml di sospensione con 50 microlitri di tampone SDS-PAGE carico (contenente un agente riducente). Eseguire SDS-PAGE ed eseguire una analisi Western blot con un anticorpo anti-hexahistidine per confermare l&#39;espressione genica. Includere cellule dal fintotrasfezione come controlli negativi (Figura 3). </li></ol></li><li> Preparazione delle scorte di lavoro <ol><li> Tavola 5 x 10 5 Sf9 cellule / cm 2 in un pallone T175 cm 2 e lasciate riposare per 20 minuti permettono loro di attaccarsi al piatto. Sostituire multimediale completo TNM-FH con i media TNM-FH contenente 3% FBS (e 1% Pen-Strep, 0,1% Pluronic F68). </li><li> Infettare le cellule con 100 ml di surnatante salvataggio. Incubare in un incubatore a 28 ° C senza CO 2 per 6 giorni e controllare ogni tanto se le cellule vengono infettati (come descritto al punto 1.2.5.). </li><li> Spin a 2.000 xg a temperatura ambiente per 5 minuti e raccogliere il surnatante. Questo è ora il tuo P2 magazzino. Questo archivio può essere conservato a tempo indeterminato a 4 ° C. Ripetere la procedura di infezione con 100 ml di stock P2 di infettare le cellule. L&#39;azione risultante è chiamato P3 o brodo di lavoro, che può essere conservato a 4 ° C o utilizzato direttamente per l&#39;espressione della proteina. La P3 magazzino di solito contiene 10 &lt;sup&gt; 7 -10 9 unità formanti placca / ml. </li></ol></li></ol></li></ol> 2. Proteine ​​Espressione e purificazione Nota esplicativa: le cellule Sf9 sostenere la crescita di baculovirus molto bene. Tuttavia, la loro capacità di secernere grandi quantità di proteina ricombinante è limitato. Pertanto usiamo un&#39;altra linea cellulare di insetto, cellule High Five, per l&#39;espressione di proteine ​​ricombinanti secrete. Queste cellule non supportare la replica baculovirus a titoli molto alte 13 ma hanno elevata capacità secretoria. <ol><li> Crescendo High Five cellule Crescere High Five cellule in cellule di insetto SFX terreno di coltura in T175 cm 2 palloni. Passaggio a giorni 1:3. Per una cultura espressione 200 ml avrete bisogno di crescere cinque palloni confluenti. </li><li> Raccolta e infettare le cellule High Five <ol><li> Staccare High Five celle da 5 T175 cm 2 palloni toccando i palloni con la mano. Raccogliere il Sosp cellularension e trasferire in 50 provette ml di centrifugazione. </li><li> Spin a 1.200 xg per 7 minuti a temperatura ambiente. Rimuovere il surnatante per decantazione e unire le palline da loro risospensione in 15 ml di P3 magazzino. </li><li> Lasciare riposare per 15 min in cappa a flusso (figura 5). </li><li> Trasferire 200 ml di Hyclone SFX terreno di coltura in una sterile 1.000 ml matraccio agitatore pulito (senza Buffles, sigillato con un foglio di alluminio prima della sterilizzazione in autoclave, non avrebbero dovuto essere utilizzati per colture batteriche prima). </li><li> Trasferire la sospensione P3/cell nel pallone shaker. Sigillare con un foglio di alluminio sterile e pallone trasferimento in uno shaker. Agitare a 70 giri al minuto a 28 ° C per 72-96 ore. </li></ol></li><li> Raccolta proteina ricombinante da High Five surnatanti di espressione delle cellule <ol><li> 72-96 h dopo l&#39;infezione di trasferimento cultura surnatanti in 500 ml secchi centrifugazione. Spin a 5.500 xg per 20 min a 4 ° C. Nel frattempo lavare le fiasche shaker 3x con acqua bidistillata(DDH 2 O). </li><li> Trasferimento 3 ml Ni-resina fanghiglia in un tubo da 50 ml con 45 ml di PBS (occorreva per 200 ml cultura). Agitare bene e centrifugare a 3000 xg a temperatura ambiente per 10 min. Decantare il PBS e mantenere il pellet. Mescolare il surnatante delle cellule di insetto con il pellet Ni-resina e trasferire nelle beute shaker già risciacquati. Incubare a 4 ° C per 2-4 ore, agitando (Figura 6). </li><li> Supporto 10 ml colonna polipropilene su una pinza su un cavalletto di sostegno. Rimuovere entrambi i tappi e mettere un bicchiere sotto la colonna di raccogliere il flusso attraverso (rifiuti). Prendere il matraccio shaker su shaker e inizia a trasferire la miscela sovranatante / slurry sulla colonna; manterrà le Ni-resina e solo il supernatante fluirà attraverso. Passare l&#39;intero volume sopra la colonna (Figura 7). </li><li> Lavare i 4x in resina con 15 ml di tampone di lavaggio (50 mM Na 2 HCO 3, NaCl 300 mM, imidazolo 20 mM, pH 8). Che tutti lo scarico tampone di lavaggiodalla colonna e chiudere con il coperchio (lato inferiore). </li><li> Aggiungere 2 ml di tampone di eluizione (50 mM Na 2 HCO 3, NaCl 300 mM, imidazolo 300 mM, pH 8) e lasciate riposare per 5 minuti. Aprire colonna e raccogliere l&#39;eluato. Ripeti 3 volte (per un totale di 8 ml di tampone di eluizione). Eluato contenente alte concentrazioni di proteina mostra tipicamente schiuma se agitato (Figura 7). Tenere eluato su ghiaccio bagnato quando possibile. </li></ol></li><li> Scambio Buffer e concentrazione <ol><li> Prespin 15 ml ultrafiltrazione unità di centrifugazione (30 kDa cut-off per HA / NA ma possono variare a seconda delle dimensioni proteina purificata) con PBS (pH 7.4-7.6) a 3000 xga 4 ° C per 20 min. Scartare il flusso attraverso e carico eluato sulla colonna di spin. Riempire con 5 ml di sterile, freddo ghiaccio PBS e centrifugare per 60 min a 3000 xg a 4 ° C. </li><li> Flusso di scarico attraverso di nuovo, riempire con 15 ml di ghiaccio freddo PBS e centrifugare per 60 min a 3000 xg a 4 ° C. Ripetere questa proceduraDure ancora una volta. </li><li> Prendere la colonna di spin fuori dalla centrifuga e raccogliere il buffer scambiato concentrato (in genere 200 ml). Questo è molto concentrata proteina ricombinante. Lavare la colonna con 400 ml di sterile freddo ghiaccio PBS e aggiungere questo al concentrato. Conservare il concentrato su ghiaccio in ogni momento. </li></ol></li></ol> 3. Caratterizzazione e Controllo Qualità <ol><li> Misurare la concentrazione di proteine Prelevare un &#39;aliquota del concentrato e misurare utilizzando il metodo di quantificazione delle proteine ​​di scelta. Impostare concentrazione proteica di 1 mg / ml aggiungendo PBS e congelare piccole aliquote a -80 ° C. Disgelo congelamento danneggiano la struttura delle proteine ​​e può portare all&#39;aggregazione. </li><li> SDS-PAGE e colorazione con Coomassie Eseguire 500 ng della proteina su una SDS-PAGE ed eseguire una colorazione Coomassie. Per la colorazione veloce e conveniente usare Coomassie reagente in combinazione con un protocollo microonde. Proteine ​​HA compaiono tipicamente a 64kDa mentre le proteine ​​NA devono funzionare ad una dimensione di circa 56 kDa (figure 8A e B). Utilizzando il protocollo descritto non si dovrebbe vedere tutti i prodotti di degradazione. Se si verifica la degradazione di solito è un segno di contaminazione da lieviti / funghi durante espressione. In questo caso, ripetere la procedura e assicurarsi di tenere tutto sterile. </li><li> Western Blot / ELISA Al fine di verificare l&#39;identità della proteina si consiglia di fare un Western Blot o test ELISA con un anticorpo specifico. Idealmente, saggi ELISA vengono eseguite con un anticorpo che si lega ad epitopi conformazionali (ad esempio anticorpi anti-HA gambo 1). L&#39;utilizzo di un tale anticorpo il corretto ripiegamento della proteina può essere confermata (Figura 8C). </li><li> Misurare NA attività Corretto ripiegamento della NA virale può anche essere determinata misurando l&#39;attività NA. Si consiglia di eseguire questo test utilizzando il saggio NA * STAR disponibile in commercio (basta seguire le linee guida dell&#39;utente). </li></ol>

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Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Anche se l&#39;espressione del virus dell&#39;influenza HA e NA proteine ​​in cellule di insetto che utilizzano il sistema di espressione baculovirus è generalmente semplice, ci sono diversi punti importanti da considerare. E &#39;importante, come ricordato in premessa, che i ectodomains di HA e NA sono espressi in fusione con domini trimerizzazione o tetramerization rispettivamente. Questi domini garantiscono corretto ripiegamento delle molecole solitamente assistiti dal dominio transmembrana, che non è presente ...

Come prima risposta alla recente nascita del romanzo H7N9 dell&#39;influenza ceppo del virus in Cina, abbiamo acquisito plasmidi che trasportano le sequenze genomiche per l&#39;emoagglutinina (HA) e neuraminidasi (NA) geni dei primi due isolati. L&#39;utilizzo di questi plasmidi siamo stati in grado di costruire rapidamente vettori di espressione baculovirali per la produzione di ricombinanti HA e NA in cellule di insetto. Questo sistema di espressione è ben consolidata nel nostro laboratorio e si è dimostrato fondamentale per molti dei nostri progetti di ricerca in corso 1-8. Cellule di insetto sono in grado di piegare correttamente e post-traduzionale modificare proteine ​​complesse. Queste modifiche comprendono glicosilazione N-linked, che è importante per molte glicoproteine ​​virali. Come tale, non è sorprendente che il sistema baculovirus è abbastanza stabilito per esprimere antigeni di superficie del virus dell&#39;influenza. In realtà, molte delle strutture cristalline HA e NA sono stati risolti utilizzando cellule espresso proteine ​​insetti 9-11. Un altro vantaggio delsistema risiede nella sua affidabilità rendimenti ad alto contenuto proteico fino a 30 mg di coltura cellulare HA / L (sulla base della nostra esperienza con oltre 50 diverse proteine ​​HA) - una conseguenza del virus-infezione espressione guidato dal promotore forte poliedrina. La rimozione del transmembrana e endodomain delle proteine ​​HA e NA permette a manifestare versioni secretable, solubili delle proteine ​​e quindi facilita notevolmente il processo di purificazione. Inoltre, questi ectodomains sono hexahistidine marchiato e possono quindi essere purificati mediante cromatografia per affinità utilizzando Ni 2 +-resina. I domini transmembrana di proteine ​​HA e NA contribuiscono omotrimero e formazione omotetramero rispettivamente. Per preservare questi oligomerizations, si aggiunge un dominio trimerizzazione C-terminale al HA-, e un dominio di tetramerizzazione N-terminale al NA costrutti (Figura 1). Abbiamo dimostrato in modo conclusivo che tale dominio trimerizzazione stabilizza funzionale, conserved epitopi conformazionali sul gambo dominio di HA 1. La corretta tetramerizzazione della NA potrebbe anche contribuire a correggere la piegatura e la funzione NA 10. Sequenze e vettori Baculo trasferimento ospitano domini trimerizzazione o tetramerizzazione possono essere richiesti da parte degli autori o da altri laboratori del settore, 9,10,12. Un altro aspetto importante per l&#39;espressione di proteine ​​secrete in cellule di insetto è la scelta della linea cellulare di destra. Mentre Spodoptera frugiperda derivato cellule Sf9 supportano la replica baculovirus molto bene e sono generalmente utilizzati per il salvataggio e la propagazione del virus, hanno limitato la capacità di secernere grandi quantità di proteine. Trichoplusia ni derivato BTI-TN-5B1-4 celle (comunemente noto come High Five) avere una maggiore capacità di secrezione e sono la linea cellulare di scelta per l&#39;espressione in questo protocollo 13,14. Inoltre, è utile per ridurre o addirittura eliminare siero fetale bovino (FBS) dalle culture di espressione. Usiamo quindi media con ridotta (3%) Contenuto FBS per la crescita degli stock di lavoro di virus, e noi eseguiamo l&#39;espressione della proteina nel siero media liberi. Proteine ​​HA e NA ricombinanti sono utilizzati per vari tecniche immunologiche. Forse il più comune è in saggi ELISA per misurare la conversione del siero su di vaccinazione in esseri umani o animali 4,6,7,15. Ha e AN sono utilizzati anche in saggi ELISPOT come entrambe le molecole stimolatorie e reagenti di rilevamento per anticorpi cellule che secernono 16. Il loro impiego come esche molecolari permette di ordinare specificamente per plasmablasts o altri tipi di cellule B che possono poi essere utilizzati per isolare (terapeutici) anticorpi monoclonali (mAb). Molecole di HA e NA ricombinanti sono ulteriormente utilizzati nella caratterizzazione di questi anticorpi monoclonali 8. Altri esempi includono lo studio della stabilità del pH o della specificità del recettore di ha espresso da diversi isolati di virus, o quantitativamente valutazione specifica enzimatica NAattività o resistenza agli inibitori. Inoltre, ricombinante, HA purificato può essere utilizzato per standardizzare il contenuto di HA di vaccini a virus influenzali inattivati. Importante, umana ricombinante (e in una certa misura NA) candidati vaccini sono attualmente in fase di sperimentazione in modelli animali e studi clinici con un vaccino candidato di essere autorizzato dalla FDA nel 2013 2,17-19. Il vantaggio di questi nuovi vaccini è che, a causa della natura ricombinante di queste proteine, il processo laborioso di generazione di virus reassortant alta crescita potrebbe essere evitato. Forse ancora più rilevante è il fatto che il loro rendimento HA è elevata e riproducibile da ceppo a ceppo. Inoltre, poiché questi vaccini sono prodotti in un sistema privo di uovo, non contengono contaminanti proteici che sono problematici per le persone con allergie uovo. Qui abbiamo scelto di esprimere le proteine ​​HA e NA da due isolati del virus dell&#39;influenza romanzo cinese H7N9, A / Anhui/1/13 e A/Shanghai/1/13 20,21. Questi sono esempi tempestivi, ma il protocollo descritto può essere utilizzato per l&#39;espressione di qualsiasi influenza A e B proteine ​​HA o NA e possono essere adattati per esprimere eventuali altre proteine ​​virali o cellulari secrete. Proteine ​​transmembrana trimeric o tetramerici possono essere clonati in cassette di espressione utilizzati per HA e NA, rispettivamente. Tuttavia, proteine ​​cellulari secrete più solubili, come interferoni per esempio, non hanno bisogno di un dominio aggiuntivo per la stabilizzazione e possono essere espressi solo con un tag hexahistidine C-terminale.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of Material/ Equipment</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bac-to-Bac Baculovirus expression system</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10359-016</td>
			<td>Follow manufacturer&#39;s instructions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TNM-FH insect medium</td>
			<td>Gemini Bioproducts</td>
			<td>600-311</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HyClone SFX-Insect</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>SH30278.02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cellfectin II Reagent</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>P/N58760</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pluronic F68</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>1000702664</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SimplyBlue SafeStain</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>LC6060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ni-NTA Agarose</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>1018240</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Ultra Centrigual filters Ultracel 30K</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>UFC902024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen Strep</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polypropylene Columns (5 ml)</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>34964</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Max efficiency DH10Bac bacteria</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10361-012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PureLink HiPure Plasmid Filter Midiprep Kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>K210015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I2399-100G</td>
			<td>for elution and wash buffers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sf9 cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td><a href="http://www.atcc.org/Products/All/CRL-1711.aspx" target="_blank">CRL-1711</a></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High Five cells</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>B85502</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

expression of functional recombinant hemagglutinin and neuraminidase proteins from the novel h7n9 influenza virus using the baculovirus expression system

Il sistema di espressione baculovirus è un potente strumento per l&#39;espressione di proteine ​​ricombinanti. Qui usiamo per produrre versioni piegati correttamente e glicosilata del virus dell&#39;influenza A glicoproteine ​​di superficie del virus - l&#39;emoagglutinina (HA) e neuraminidasi (NA). Come esempio, abbiamo scelto le proteine ​​HA e NA espresse dal virus H7N9 romanzo che recentemente emersa in Cina. Tuttavia il protocollo può essere facilmente adattato per HA e NA proteine ​​espresse da qualsiasi altra influenza A e B ceppi virali. Proteine ​​ricombinanti HA (umana ricombinante) e NA (RNA) sono reagenti importanti per saggi immunologici quali ELISPOT e ELISA, e sono in largo uso per il vaccino contro la standardizzazione, la scoperta di anticorpi, isolamento e caratterizzazione. Inoltre, molecole NA ricombinanti possono essere utilizzate per lo screening di piccole molecole inibitrici e sono utili per la caratterizzazione della funzione enzimatica della NA, così come la sua sensibilità ai farmaci antivirali. Proteine ​​HA ricombinanti sono anche being testato come vaccini sperimentali in modelli animali, e un vaccino ricombinante basato su HA è stato recentemente autorizzato dalla FDA per l&#39;uso nell&#39;uomo. Il metodo che descriviamo qui di produrre queste molecole è semplice e può facilitare la ricerca in laboratori influenza, in quanto consente la produzione di grandi quantità di proteine ​​veloci ea basso costo. Anche qui ci concentriamo su glicoproteine ​​di superficie del virus dell&#39;influenza, questo metodo può anche essere usato per produrre altre proteine ​​di superficie virali e cellulari.

Molecole di HA da A/Shanghai/1/13 e A/Anhui/1/13 espressi bene con rese di circa 20 mg / L cultura. NA molecole di entrambi i ceppi hanno mostrato livelli di espressione moderati da 0,2 mg / L di coltura per A/Shanghai/1/13 a 0,7 mg / L per A/Anhui/1/13. Tutti e quattro i preparati proteici avevano ben poco a che nessuna impurità (Figure 8A e B) con ha l&#39;essere di purezza superiore AN che può essere spiegato con il livello di espressione. A/Shanghai/1/13 HA è stato ulteriormente ...

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Expression of Functional Recombinant Hemagglutinin and Neuraminidase Proteins from the Novel H7N9 Influenza Virus Using the Baculovirus Expression System

Qui si descrive un modo per esprimere antigeni di superficie del virus dell&#39;influenza piegati correttamente e funzionali derivati ​​dal romanzo virus H7N9 cinese in cellule di insetto. La tecnica può essere adattata per esprimere ectodomains di eventuali proteine ​​di superficie virali o cellulari.

Espressione dei funzionali ricombinante emoagglutinina e neuraminidasi proteine ​​del virus Novel H7N9 Influenza utilizzando l&#39;espressione sistema Baculovirus

The baculovirus expression system is a powerful tool for expression of  recombinant proteins. Here we use it to produce correctly folded and  glycosylated ...

expression-functional-recombinant-hemagglutinin-neuraminidase

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

23.8K Views.  Icahn School of Medicine at Mount Sinai.  Qui si descrive un modo per esprimere antigeni di superficie del virus dell'influenza piegati correttamente e funzionali derivati ​​dal romanzo virus H7N9 cinese in cellule di insetto. La tecnica può essere adattata per esprimere ectodomains di eventuali proteine ​​di superficie virali o cellulari. 

Video: Expression of Functional Recombinant Hemagglutinin and Neuraminidase Proteins from the Novel H7N9 Influenza Virus Using the Baculovirus Expression System

Generation of Recombinant Influenza Virus from Plasmid DNA

Efforts by a number of influenza research groups have been pivotal in the development and improvement of influenza A virus reverse genetics. Originally established in 1999 1,2 plasmid-based reverse genetic techniques to generate recombinant viruses have revolutionized the influenza research field because specific questions have been answered by genetically engineered, infectious, recombinant influenza viruses. Such studies include virus replication, function of viral proteins, the contribution of specific mutations in viral proteins in viral replication and/or pathogenesis and, also, viral vectors using recombinant influenza viruses expressing foreign proteins 3.

Rescue of influenza A viruses from plasmid DNA is a basic and essential experimental technique that allows influenza researchers to generate recombinant viruses to study multiple aspects in the biology of influenza virus, and to be used as potential vectors or vaccines.

Generazione di influenza da virus ricombinante del DNA plasmidi

Efforts by a number of influenza research groups have been pivotal in the development and improvement of influenza A virus reverse genetics. Originally ...

Ricerca

Immunologia e infezioni

Using Bioluminescent Imaging to Investigate Synergism Between Streptococcus pneumoniae and Influenza A Virus in Infant Mice

During the 1918 influenza virus pandemic, which killed approximately 50 million people worldwide, the majority of fatalities were not the result of infection with influenza virus alone. Instead, most individuals are thought to have succumbed to a secondary bacterial infection, predominately caused by the bacterium Streptococcus pneumoniae (the pneumococcus). The synergistic relationship between infections caused by influenza virus and the pneumococcus has subsequently been observed during the 1957 Asian influenza virus pandemic, as well as during seasonal outbreaks of the virus (reviewed in 1, 2). Here, we describe a protocol used to investigate the mechanism(s) that may be involved in increased morbidity as a result of concurrent influenza A virus and S. pneumoniae infection. We have developed an infant murine model to reliably and reproducibly demonstrate the effects of influenza virus infection of mice colonised with S. pneumoniae. Using this protocol, we have provided the first insight into the kinetics of pneumococcal transmission between co-housed, neonatal mice using in vivo imaging 3.

Using Bioluminescent Imaging to Investigate Synergism Between Streptococcus pneumoniae and Influenza A Virus in Infant Mice

A concurrent infection with influenza A virus is one of the factors implicated in the induction of invasive pneumococcal disease during asymptomatic Streptococcus pneumoniae carriage. Here we describe a mixed infection method using infant mice to investigate the synergism between these two respiratory pathogens.

Utilizzando Imaging Bioluminescent per Indagare il sinergismo tra Streptococcus pneumoniae E Influenza A virus in topi neonati

During the 1918 influenza virus pandemic, which killed approximately 50 million people worldwide, the majority of fatalities were not the result of ...

Packaging HIV- or FIV-based Lentivector Expression Constructs &amp; Transduction of VSV-G Pseudotyped Viral Particles

As with standard plasmid vectors, it is possible to transfect lentivectors in plasmid form into cells with low-to-medium efficiency to obtain transient expression of effectors. Packaging lentiviral expression constructs into pseudoviral particles, however, enables up to 100% transduction, even with difficult-to-transfect cells, such as primary, stem, and differentiated cells. Moreover, the lentiviral delivery does not produce the specific cellular responses typically associated with chemical transfections, such as cell death resulting from toxicity of the transfection reagent 1, 2. When transduced into target cells, the lentiviral construct integrates into genomic DNA and provides stable expression of the small hairpin RNA (shRNA), cDNA, microRNA or reporter gene 3, 4. Target cells stably expressing the effector molecule can be isolated using a selectable marker contained in the expression vector construct such as puromycin or GFP. After pseudoviral particles infect target cells, they cannot replicate within target cells because the viral structural genes are absent and the long terminal repeats (LTRs) are designed to be self-inactivating upon transduction 5, 6.
There are three main components necessary for efficient lentiviral packaging 1, 5, 6, 7. 
1. The lentiviral expression vector that contains some of the genetic elements required for packaging, stable integration of the viral expression construct into genomic DNA, and expression of the effector or reporter. 
2. The lentiviral packaging plasmids that provide the proteins essential for transcription and packaging of an RNA copy of the expression construct into recombinant pseudoviral particles. This protocol uses the pPACK plasmids (SBI) that encode for gag, pol, and rev from the HIV or FIV genome and Vesicular Stomatitis Virus g protein (VSV-G) for the viral coat protein. 
3. 293TN producer cells (derived from HEK293 cells) that express the SV40 large T antigen, which is required for high-titer lentiviral production and a neomycin resistance gene, useful for reselecting the cells for maintenance.
An overview of the viral production protocol can be seen in Figure 1. Viral production starts by co-transfecting 293TN producer cells with the lentiviral expression vector and the packaging plasmids. Viral particles are secreted into the media. After 48-72 hours the cell culture media is harvested. Cellular debris is removed from the cell culture media, and the viral particles are precipitated by centrifugation with PEG-it for concentration. Produced lentiviral particles are then titered and can be used to transduce target cells. Details of viral titering are not included in this protocol, but can be found at:
<a href="http://www.systembio.com/downloads/global_titer_kit_web_090710.pdf" target="_blank">http://www.systembio.com/downloads/global_titer_kit_web_090710.pdf</a> 8.
This protocol has been optimized using the specific products indicated. Other reagents may be substituted, but the same results cannot be guaranteed.

Lentiviral expression vectors are the most effective vehicles for stably expressing different effector molecules or reporter constructs in dividing and non-dividing mammalian cells and whole organisms. Here we provide a protocol on how to package lentivector expression constructs in pseudoviral particles and to transduce target cells using the pseudoviral particles.

Packaging HIV o FIV-based Lentivector costrutti di espressione e di trasduzione del VSV-G Pseudotyped particelle virali

As with standard plasmid vectors, it is possible to transfect lentivectors in plasmid form into cells with low-to-medium efficiency to obtain transient ...

Affinity Purification of Influenza Virus Ribonucleoprotein Complexes from the Chromatin of Infected Cells

Like all negative-strand RNA viruses, the genome of influenza viruses is packaged in the form of viral ribonucleoprotein complexes (vRNP), in which the single-stranded genome is encapsidated by the nucleoprotein (NP), and associated with the trimeric polymerase complex consisting of the PA, PB1, and PB2 subunits. However, in contrast to most RNA viruses, influenza viruses perform viral RNA synthesis in the nuclei of infected cells. Interestingly, viral mRNA synthesis uses cellular pre-mRNAs as primers, and it has been proposed that this process takes place on chromatin1. Interactions between the viral polymerase and the host RNA polymerase II, as well as between NP and host nucleosomes have also been characterized1,2.
Recently, the generation of recombinant influenza viruses encoding a One-Strep-Tag genetically fused to the C-terminus of the PB2 subunit of the viral polymerase (rWSN-PB2-Strep3) has been described. These recombinant viruses allow the purification of PB2-containing complexes, including vRNPs, from infected cells. To obtain purified vRNPs, cell cultures are infected, and vRNPs are affinity purified from lysates derived from these cells. However, the lysis procedures used to date have been based on one-step detergent lysis, which, despite the presence of a general nuclease, often extract chromatin-bound material only inefficiently. 
Our preliminary work suggested that a large portion of nuclear vRNPs were not extracted during traditional cell lysis, and therefore could not be affinity purified. To increase this extraction efficiency, and to separate chromatin-bound from non-chromatin-bound nuclear vRNPs, we adapted a step-wise subcellular extraction protocol to influenza virus-infected cells. Briefly, this procedure first separates the nuclei from the cell and then extracts soluble nuclear proteins (here termed the "nucleoplasmic" fraction). The remaining insoluble nuclear material is then digested with Benzonase, an unspecific DNA/RNA nuclease, followed by two salt extraction steps: first using 150 mM NaCl (termed "ch150"), then 500 mM NaCl ("ch500") (Fig. 1). These salt extraction steps were chosen based on our observation that 500 mM NaCl was sufficient to solubilize over 85% of nuclear vRNPs yet still allow binding of tagged vRNPs to the affinity matrix.
After subcellular fractionation of infected cells, it is possible to affinity purify PB2-tagged vRNPs from each individual fraction and analyze their protein and RNA components using Western Blot and primer extension, respectively. Recently, we utilized this method to discover that vRNP export complexes form during late points after infection on the chromatin fraction extracted with 500 mM NaCl (ch500)3.

Influenza viruses replicate their RNA genome in association with host-cell chromatin. Here, we present a method to purify intact viral ribonucleoprotein complexes from the chromatin of infected cells. Purified viral complexes can be analyzed by both Western blot and primer extension of protein and RNA content, respectively.

Purificazione per affinità di Complessi virus influenzali ribonucleoproteina dalla cromatina delle cellule infettate

Like all negative-strand RNA viruses, the genome of influenza viruses is packaged in the form of viral ribonucleoprotein complexes (vRNP), in which the ...

Differentiating Functional Roles of Gene Expression from Immune and Non-immune Cells in Mouse Colitis by Bone Marrow Transplantation

To understand the role of a gene in the development of colitis, we compared the responses of wild-type mice and gene-of-interest deficient knockout mice to colitis. If the gene-of-interest is expressed in both bone marrow derived cells and non-bone marrow derived cells of the host; however, it is possible to differentiate the role of a gene of interest in bone marrow derived cells and non- bone marrow derived cells by bone marrow transplantation technique. To change the bone marrow derived cell genotype of mice, the original bone marrow of recipient mice were destroyed by irradiation and then replaced by new donor bone marrow of different genotype. When wild-type mice donor bone marrow was transplanted to knockout mice, we could generate knockout mice with wild-type gene expression in bone marrow derived cells. Alternatively, when knockout mice donor bone marrow was transplanted to wild-type recipient mice, wild-type mice without gene-of-interest expressing from bone marrow derived cells were produced. However, bone marrow transplantation may not be 100% complete. Therefore, we utilized cluster of differentiation (CD) molecules (CD45.1 and CD45.2) as markers of donor and recipient cells to track the proportion of donor bone marrow derived cells in recipient mice and success of bone marrow transplantation. Wild-type mice with CD45.1 genotype and knockout mice with CD45.2 genotype were used. After irradiation of recipient mice, the donor bone marrow cells of different genotypes were infused into the recipient mice. When the new bone marrow regenerated to take over its immunity, the mice were challenged by chemical agent (dextran sodium sulfate, DSS 5%) to induce colitis. Here we also showed the method to induce colitis in mice and evaluate the role of the gene of interest expressed from bone-marrow derived cells. If the gene-of-interest from the bone derived cells plays an important role in the development of the disease (such as colitis), the phenotype of the recipient mice with bone marrow transplantation can be significantly altered. At the end of colitis experiments, the bone marrow derived cells in blood and bone marrow were labeled with antibodies against CD45.1 and CD45.2 and their quantitative ratio of existence could be used to evaluate the success of bone marrow transplantation by flow cytometry. Successful bone marrow transplantation should show a vast majority of donor genotype (in term of CD molecule marker) over recipient genotype in both the bone marrow and blood of recipient mice.

Bone marrow transplantation provides a way to change the genotype of the bone marrow derived cells. If the gene of interest is expressed in both bone marrow derived cells and non-bone marrow derived cells, bone marrow transplantation can change the bone marrow derived cells to a different genotype without changing the non-bone marrow derived cell genotype.

Differenziare i ruoli funzionali di espressione genica di cellule immunitarie e non immunitarie in Colite mouse da trapianto di midollo osseo

To understand the role of a gene in the development of colitis, we compared the responses of wild-type mice and gene-of-interest deficient knockout mice ...

Rescue of Recombinant Newcastle Disease Virus from cDNA

Newcastle disease virus (NDV), the prototype member of the Avulavirus genus of the family Paramyxoviridae1, is a non-segmented, negative-sense, single-stranded, enveloped RNA virus (Figure 1) with potential applications as a vector for vaccination and treatment of human diseases. In-depth exploration of these applications has only become possible after the establishment of reverse genetics techniques to rescue recombinant viruses from plasmids encoding their complete genomes as cDNA2-5. Viral cDNA can be conveniently modified in vitro by using standard cloning procedures to alter the genotype of the virus and/or to include new transcriptional units. Rescue of such genetically modified viruses provides a valuable tool to understand factors affecting multiple stages of infection, as well as allows for the development and improvement of vectors for the expression and delivery of antigens for vaccination and therapy. Here we describe a protocol for the rescue of recombinant NDVs.

Newcastle disease virus (NDV) has been extensively studied in the last few years in order to develop new vectors for vaccination and therapy, among others. These studies have been possible due to techniques to rescue recombinant virus from cDNA, such as those we describe here.

Salvataggio di virus ricombinante malattia di Newcastle da cDNA

Newcastle disease virus (NDV), the prototype member of  the Avulavirus genus of the family Paramyxoviridae1, is a non-segmented,  negative-sense, ...

Co-immunoprecipitation of the Mouse Mx1 Protein with the Influenza A Virus Nucleoprotein

Studying the interaction between proteins is key in understanding their function(s). A very powerful method that is frequently used to study interactions of proteins with other macromolecules in a complex sample is called co-immunoprecipitation. The described co-immunoprecipitation protocol allows to demonstrate and further investigate the interaction between the antiviral myxovirus resistance protein 1 (Mx1) and one of its viral targets, the influenza A virus nucleoprotein (NP). The protocol starts with transfected mammalian cells, but it is also possible to use influenza A virus infected cells as starting material. After cell lysis, the viral NP protein is pulled-down with a specific antibody and the resulting immune-complexes are precipitated with protein G beads. The successful pull-down of NP and the co-immunoprecipitation of the antiviral Mx1 protein are subsequently revealed by western blotting. A prerequisite for successful co-immunoprecipitation of Mx1 with NP is the presence of N-ethylmaleimide (NEM) in the cell lysis buffer. NEM alkylates free thiol groups. Presumably this reaction stabilizes the weak and/or transient NP&#8211;Mx1 interaction by preserving a specific conformation of Mx1, its viral target or an unknown third component. An important limitation of co-immunoprecipitation experiments is the inadvertent pull-down of contaminating proteins, caused by nonspecific binding of proteins to the protein G beads or antibodies. Therefore, it is very important to include control settings to exclude false positive results. The described co-immunoprecipitation protocol can be used to study the interaction of Mx proteins from different vertebrate species with viral proteins, any pair of proteins, or of a protein with other macromolecules. The beneficial role of NEM to stabilize weak and/or transient interactions needs to be tested for each interaction pair individually.

This co-immunoprecipitation protocol allows to study the interaction between the influenza A virus nucleoprotein and the antiviral Mx1 protein in human cells. The protocol emphasizes the importance of N-ethylmaleimide for successful co-immunoprecipitation of Mx1 and influenza A virus nucleoprotein.

Co-immunoprecipitazione della proteina mouse Mx1 con il virus nucleoproteina Influenza A

Studying the interaction between proteins is key in understanding their function(s). A very powerful method that is frequently used to study interactions ...

Nasal Wipes for Influenza A Virus Detection and Isolation from Swine

Surveillance for influenza A viruses in swine is critical to human and animal health because influenza A virus rapidly evolves in swine populations and new strains are continually emerging. Swine are able to be infected by diverse lineages of influenza A virus making them important hosts for the emergence and maintenance of novel influenza A virus strains. Sampling pigs in diverse settings such as commercial swine farms, agricultural fairs, and live animal markets is important to provide a comprehensive view of currently circulating IAV strains. The current gold-standard ante-mortem sampling technique (i.e. collection of nasal swabs) is labor intensive because it requires physical restraint of the pigs. Nasal wipes involve rubbing a piece of fabric across the snout of the pig with minimal to no restraint of the animal. The nasal wipe procedure is simple to perform and does not require personnel with professional veterinary or animal handling training. While slightly less sensitive than nasal swabs, virus detection and isolation rates are adequate to make nasal wipes a viable alternative for sampling individual pigs when low stress sampling methods are required. The proceeding protocol outlines the steps needed to collect a viable nasal wipe from an individual pig.

The authors present a protocol to collect swine nasal wipes to detect and isolate influenza A viruses.

Panni nasale per l&#39;influenza A rilevazione antivirus e isolamento da Suina

Surveillance for influenza A viruses in swine is critical to human and animal health because influenza A virus rapidly evolves in swine populations and ...

A Miniaturized Glycan Microarray Assay for Assessing Avidity and Specificity of Influenza A Virus Hemagglutinins

Influenza A virus (IAV) hemagglutinins recognize sialic acids on the cell surface as functional receptors to gain entry into cells. Wild waterfowl are the natural reservoir for IAV, but IAV can cross the species barrier to poultry, swine, horses and humans. Avian viruses recognize sialic acid attached to a penultimate galactose by a &#945;2-3 linkage (avian-type receptors) whereas human viruses preferentially recognize sialic acid with a &#945;2-6 linkage (human-type receptors). To monitor if avian viruses are adapting to human type receptors, several methods can be used. Glycan microarrays with diverse libraries of synthetic sialosides are increasingly used to evaluate receptor specificity. However, this technique is not used for measuring avidities. Measurement of avidity is typically achieved by evaluating the binding of serially diluted hemagglutinin or virus to glycans adsorbed to conventional polypropylene 96-well plates. In this assay, glycans with &#945;2-3 or &#945;2-6 sialic acids are coupled to biotin and adsorbed to streptavidin plates, or are coupled to polyacrylamide (PAA) which directly adsorb to the plastic. We have significantly miniaturized this assay by directly printing PAA-linked sialosides and their non PAA-linked counterparts on micro-well glass slides. This set-up, with 48 arrays on a single slide, enables simultaneous assays of 6 glycan binding proteins at 8 dilutions, interrogating 6 different glycans, including two non-sialylated controls. This is equivalent to 18x 96-well plates in the traditional plate assay. The glycan array format decreases consumption of compounds and biologicals and thus greatly enhances efficiency.

Using a printed glycan microarray strategy, a conventional 96-well plate assay was miniaturized for analysis of influenza A virus hemagglutinin avidity and specificity for sialic acid containing receptors.

Un miniaturizzato Glycan microarray test per la valutazione avidità e Specificità del virus influenzale A emoagglutinine

Influenza A virus (IAV) hemagglutinins recognize sialic acids on the cell surface as functional receptors to gain entry into cells. Wild waterfowl are the ...

Fluorescence-based Neuraminidase Inhibition Assay to Assess the Susceptibility of Influenza Viruses to The Neuraminidase Inhibitor Class of Antivirals

The neuraminidase (NA) inhibitors are the only class of antivirals approved for the treatment and prophylaxis of influenza that are effective against currently circulating strains. In addition to their use in treating seasonal influenza, the NA inhibitors have been stockpiled by a number of countries for use in the event of a pandemic. It is therefore important to monitor the susceptibility of circulating influenza viruses to this class of antivirals. There are different types of assays that can be used to assess the susceptibility of influenza viruses to the NA inhibitors, but the enzyme inhibition assays using either a fluorescent substrate or a chemiluminescent substrate are the most widely used and recommended. This protocol describes the use of a fluorescence-based assay to assess influenza virus susceptibility to NA inhibitors. The assay is based on the NA enzyme cleaving the 2&#8242;-(4-Methylumbelliferyl)-&#945;-D-N-acetylneuraminic acid (MUNANA) substrate to release the fluorescent product 4-methylumbelliferone (4-MU). Therefore, the inhibitory effect of an NA inhibitor on the influenza virus NA is determined based on the concentration of the NA inhibitor that is required to reduce 50% of the NA activity, given as an IC50 value.

We describe the use of a phenotypic fluorescence-based neuraminidase inhibition assay to assess the susceptibility of influenza A and B viruses to the neuraminidase inhibitor class of antivirals.

Basato sulla fluorescenza neuraminidasi Inibizione Assay per valutare la suscettibilità dei virus influenzali di neuraminidasi Inhibitor classe di antivirali

The neuraminidase (NA) inhibitors are the only class of antivirals approved for the treatment and prophylaxis of influenza that are effective against ...

Espressione dei funzionali ricombinante emoagglutinina e neuraminidasi proteine ​​del virus Novel H7N9 Influenza utilizzando l'espressione sistema Baculovirus

Espressione dei funzionali ricombinante emoagglutinina e neuraminidasi proteine del virus Novel H7N9 Influenza utilizzando l'espressione sistema Baculovirus