Gli autori desiderano ringraziare i membri passati e presenti nel Adolfo García-Sastre e Peter Palese laboratori per lo sviluppo di tecniche di reverse influenza genetica e plasmidi. La ricerca in laboratori di AG-S è parzialmente finanziato dalla CRIP, un NIAID-finanziato Centro di Eccellenza per la Ricerca e la sorveglianza dell&#39;influenza (HHSN266200700010C) e da sovvenzioni NIAD R01AI046954, U01AI070469 e P01AI058113. La ricerca in laboratorio LM-S è parzialmente finanziato dal NIAID concedere RO1AI077719.

1. Virus influenzale trasfezione di soccorso Influenza A virus appartiene alla famiglia delle Orthomyxoviridae negativo-stranded RNA virus avvolto. Il genoma del virus influenzale A si compone di otto geni diversi RNA di polarità negativa che codificano, almeno, 11 proteine ​​virali (Figura 1) 4. Ci concentreremo, in questa relazione, il salvataggio di uno dei ceppo di laboratorio più comuni, l&#39;influenza A/PR/8/34, 5 usando plasmidi ambisense (PDZ) contenente l&#39;influenza 8 A/PR/8/34 segmenti virali ( Figura 2). Per il salvataggio dei virus influenzali ricombinante da DNA plasmidico, si consiglia 3 trasfezioni indipendenti per ogni virus ricombinante. Se più di un salvataggio virus ricombinante è tentato, scala le seguenti operazioni accordantly al numero di virus di essere salvati. La transfezione seguente e protocollo infezione è stabilita per 6-ben-piastre. Una rappresentazione schematica del protocollo è illustrato in Figura 3. <ol><li> OptiMEM-Lipofectamine 2000 (LPF2000) miscela: Preparare 250 microlitri di media OptiMEM e 6-8 ml di LPF2000 per trasfezione. Incubare per 5-10 minuti a temperatura ambiente (RT). Nel frattempo, preparare la miscela plasmide trasfezione. </li><li> Miscela di trasfezione plasmide: Preparare il cocktail di plasmide transfezione in 50 ml di mezzi OptiMEM. Usiamo solitamente 1 mg di ogni influenza del DNA plasmidico al salvataggio. Aggiungere 1 ml di i plasmidi PDZ (a 1 mg / mL) PB2, PB1, PA, HA, NP, NA, M, e NS in una provetta contenente 50 ml di mezzi OptiMEM. </li><li> OptiMEM-LPF2000-DNA miscela plasmide: Aggiungere 250 microlitri dal passo 1,1 nella miscela di trasfezione di DNA influenza plasmide (punto 1.2). Incubare la miscela per 20-30 minuti a temperatura ambiente. Nel frattempo, preparare sospensioni di cellule 293T e MDCK per la trasfezione. </li><li> Preparazione di 293T/MDCK co-coltura: Prima di iniziare, portare l&#39;1X PBS, DMEM 10% FBS 1% PS media e EDTA-tripsina miscela a 37 ° C. La densità delle cellule dovrebbe essere di 80-90% di confluenza del giorno di trasfezione. Di solito, una confluenti piatto 100 mm di 293T e un piatto confluenti 100 mm di cellule MDCK può essere utilizzato per 10-12 salvataggi. Abbiamo intenzione di utilizzare 250 microlitri di cellule per pozzetto. Entrambe le linee cellulari saranno risospese in un totale di 3 ml di DMEM 10% FBS 1% PS. <ul><li> Con attenzione risospendere ogni linea cellulare in 10 ml di DMEM 10% FBS 1% PS in una provetta da centrifuga da 15 ml. Avrete un tubo per le cellule 293T e un tubo per le cellule MDCK. </li><li> Risospendere le cellule 293T in 3 ml di DMEM 10% FBS 1% PS e quando risospeso, fornire i 3 ml per le cellule MDCK per sospendere di nuovo le cellule. Questo vi darà la miscela di cellule 293T e MDCK da utilizzare per il vostro co-coltura. </li><li> Aggiungere 250 microlitri di cellule 293T/MDCK per pozzetto (10-12 a 6 e pozzi). </li></ul></li><li> Dopo l&#39;incubazione 20-30 minuti RT (passo 1.3), aggiungere 1 ml di DMEM 10% FBS 1% PS al OptiMEM-LPF2000-influenzali miscela DNA plasmidico. </li><li> Aggiungere il 1,3 ml (passo 1,5) nei pozzetti con il 250 microlitri di cellule 293T/MDCK (passo 1,4). </li><li> Agitare delicatamente il 6-ben piatto e lasciare che la trasfezione incubare overnight (ON) in incubatrice a 37 ° C e 5% di CO 2. </li><li> Il giorno dopo, a circa 16-24 ore dopo la trasfezione, cambiare il supporto di trasfezione e incubare le cellule transfettate in BA DMEM 0,3% 1% PS contenente 1 mg / ml di TPCK-tripsina per 48 ore. </li><li> Dopo 48 ore di cambiare i media, trasferire il surnatante dalle cellule transfettate in una provetta. </li><li> Centrifugare il surnatante coltura di tessuti in una microcentrifuga per 1-2 minuti, 13.000 giri al minuto. </li><li> Infettare nuove cellule MDCK in 6 pozzetti (placcato il giorno prima) o 10 giorni di età uova embrionate di pollo con 200 ml di surnatanti centrifugati coltura dei tessuti dal punto 1.10. Incubare le cellule e / o uova a 37 ° C per 2-3 giorni. <ol><li> L&#39;infezione di uova embrionate di 10 giorni di età pollo: Tutte le procedure per infettare le uova embrionate di pollo vengono eseguite in condizioni sterili. <ol><li> Candela di 10 giorni di età le uova con un light-box speratura per vedere l&#39;interfaccia tra il sacco d&#39;aria e la cavità allantoidea. Fare un segno di matita sul bordo interfaccia. </li><li> Con un ago da siringa da 5 ml di fare un buco nel guscio d&#39;uovo. </li><li> Con una siringa da 1 ml, infettare ogni uovo con 200 ml di sovranatanti del tessuto dal punto 1.10. </li><li> Coprire il buco nel guscio d&#39;uovo con la cera fusa usando un tampone di cotone. </li><li> Incubare le uova infette al 37οC per 2-3 giorni. </li></ol></li><li> L&#39;infezione di nuove cellule MDCK: Il giorno prima il passaggio della coltura tissutale surnatante dal 293T/MDCK co-culture, prepare ben 6 piatti piatto con le cellule MDCK raggiungere 80-90% confluenza giorno successivo. Di solito, un tessuto confluenti 100 mm Piastra cultura può essere suddivisa in 6-8 pozzi. Lavare le cellule due volte con PBS 1X, trypsinize e preparare il 6-pozzetti. Agitare delicatamente a mano i piatti in modo da avere una distribuzione uniforme delle celle. Coltivare le cellule, ON, nel 37 ° C incubatore, 5% di CO 2. Prima dell&#39;infezione, controllare le cellule al microscopio per confermare un monostrato, quindi, procedere con l&#39;infezione: <ul><li> Lavare le cellule due volte, con 1 ml di PBS 1X. </li><li> Infettare con il 200 microlitri di surnatanti centrifugati coltura dei tessuti per 1 ora a temperatura ambiente. Non lasciare le pile a secco. Rock the 6-ben-piastra ogni 10 minuti. </li><li> Dopo 1 ora di assorbimento virale, rimuovere il supporto infezione dalle cellule MDCK e aggiungere 2 ml di DMEM BA 0,3% 1% PS contenente 1 mg / ml di TPCK-tripsina. </li><li> A 48-72 ore dopo il passaggio, a seconda dell&#39;efficacia trasfezione e la carica virale, un effetto citopatico (CPE) saranno osservati nelle cellule infette MDCK. CPE suggerisce un salvataggio di successo. Tuttavia, un test HA (sezione 2) devono ancora essere eseguiti per confermare la presenza del virus in sovranatanti tessuto. </li></ul></li></ol></li><li> Fluido raccolta allantoideo da uova embrionate di pollo infetto: Tutte le procedure per raccogliere il liquido allantoico da uova infette vengono eseguite in condizioni sterili. Circa il 8-12 ml di liquido allantoico può essere raccolto da ogni 10 giorni di età con infezione da uovo. Prima della raccolta del liquido allantoico, incubare le uova di gallina per 2 ore (o ON) a 4 ° C per uccidere l&#39;embrione di pollo e coagulare il sangue. <ul><li> Lavare i gusci d&#39;uovo con il 70% di etanolo per stabilire condizioni di sterilità. </li><li> Aprire l&#39;uovo, con attenzione, oltre la cavità d&#39;aria toccando con un cucchiaio. Togliere il guscio d&#39;uovo rotto con l&#39;aiuto di pinze. </li><li> Con un ago 1 ml, togliere la membrana allantoide senza rompere il tuorlo dell&#39;uovo. </li><li> Stabilizzare l&#39;embrione di pollo con una spatola come si guida a 10 ml, pipetta nel liquido allantoico. Raccogliere il maggior liquido allantoico possibile in una provetta da centrifuga da 15 ml sul ghiaccio in un secchio di ghiaccio, senza rompere o raccogliere qualsiasi tuorlo dell&#39;uovo. Utilizzare una provetta da centrifuga da 15 ml per ogni uovo. </li><li> Centrifugare per 5 minuti a 4 ° C e trasferire il liquido allantoico (senza prendere in pellet globuli rossi) ad un nuovo 15 ml provette centrifuga. </li><li> Conservare le provette contenenti il ​​liquido centrifugato allantoideo a 4 ° C fino a quando non vengono controllati per la presenza del virus in salvo con un saggio di emoagglutinazione (HA). </li></ul></li></ol> 2. HA test per confermare il salvataggio dei virus influenzali ricombinanti Saggio emoagglutinazione (HA) viene normalmente utilizzato per rilevare la presenza del virus in salvo a surnatanti MDCK colture di tessuti e / o il liquido allantoico di uova raccolte. In alternativa, test di immunofluorescenza (IFA) può essere anche eseguita. Una volta che un test individua la presenza del virus in salvo, il virus dovrebbe essere purificata placca e la composizione genetica del virus sarà confermata mediante RT-PCR e sequenziamento. La presenza del virus nei surnatanti MDCK coltura di tessuti e / o nel liquido allantoico da uova infette può essere determinata macroscopicamente con HA di pollo (o altra fonte) globuli rossi (RBC). La presenza del virus induce emoagglutinazione di RBC, mentre l&#39;assenza di virus permette la formazione di una pallina rossa sul fondo del pozzo (Figura 4). Nel caso del virus influenzale, si ritiene che circa il 10 3 -10 4 unità placca formando (PFU) sono tenuti a dare un segnale positivo nel test HA, quindi, un IFA può essere eseguita in parallelo con il test per confermare HA un risultato vero negativo. IFA con primarie anticorpi anti-influenzale è più sensibile il test HA perché meno di 103-104 virus può essere rilevato con questa tecnica. E &#39;possibile che surnatanti o fluidi allantoide che sono HA-negativi sono positivi da IFA. In questo caso, il virus dovrebbe essere amplificato da passaging, ancora una volta, in cellule MDCK o nelle uova. Liquido allantoico e / o surnatanti di coltura dal secondo passaggio dovrebbe essere chiaramente positivo nel saggio HA. Saggi di HA sono svolte in V-parte inferiore piastre a 96 pozzetti. Negativo (per esempio, PBS 1X) e positivo (surnatanti colture di tessuti e / o liquido allantoico da una infezione da virus influenzale), campioni di controllo devono essere sempre inclusi in qualsiasi test HA per convalidarlo. <ul><li> Dispensare 50 ml di PBS 1X in ciascun pozzetto della V-parte inferiore a 96 pozzetti. </li><li> Aggiungere 50 ml diil MDCK surnatanti coltura di tessuti e / o liquido allantoico dalle uova infette al pozzo prima e, fanno diluizioni seriali di 2 volte per i pozzi di seguito. Scartare la extra di 50 microlitri dal pozzo scorso. </li><li> Aggiungere 50 ml di 0,5% -1,0% globuli rossi di pollo (preparato in PBS 1X) in ciascun pozzetto. </li><li> Incubare il V-basso 96-pozzetti per 30-45 minuti (fino a un punto rosso è visibile nella parte inferiore di un campione di controllo negativo PBS) su ghiaccio. Leggere e interpretare i risultati come indicato in Figura 4. </li></ul> 3. Passaggio di surnatanti coltura dei tessuti Un risultato negativo nel test HA può essere il risultato di bassa efficienza di trasfezione con bassi livelli di virus presente di essere in sovranatanti il ​​tessuto e / o liquido allantoico. Passaggio di questi campioni in MDCK uova fresche e / o embrionate permetterà l&#39;amplificazione del virus (come indicato nella figura 3) Le infezioni sono eseguiti come precedentemente descritto nel paragrafo 1.11.2. 4. Rappresentante Risultati Successo di soccorso virus influenzale sarà confermata dalla presenza di un test positivo HA (Figura 4). Inoltre, l&#39;esistenza di CPE nelle cellule infette con sovranatanti il ​​tessuto o con il liquido allantoico da uova proporrà un salvataggio positivo virale. <img src="/files/ftp_upload/2057/2057fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. Struttura virus dell&#39;influenza: Il virus dell&#39;influenza è circondato da un doppio strato lipidico contenente i due glicoproteine ​​virali (HA, NA) e, inoltre, la proteina del canale ionico, M2. HA è la proteina virale attaccamento, responsabile per il legame di acido sialico contenenti recettori. NA è responsabile del rilascio dei virus da cellule ospiti. Sotto il doppio strato lipidico, è uno strato proteico costituito da proteine ​​della matrice interna busta superficie 1, M1, che svolge un ruolo nel virione assemblaggio e in erba e la proteina nucleare esportatore (NEP), richiesti per l&#39;esportazione nucleare di ribonucleocapsids virale. Il nucleo del virus è costituito da un complesso ribonucleoproteina (RNP), composta da 8 geni negativi a singolo filamento di RNA virale encapsidated dal nucleoproteina virale, NP. Associata con il complesso RNP sono i virale RNA-dipendente di RNA polimerasi subunità PA, PB1, e PB2. Le proteine ​​non strutturali NS1 e PB1-F2, codificate dai segmenti di RNA NS e PB1, rispettivamente, non fanno parte della struttura del virione. <img src="/files/ftp_upload/2057/2057fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2. Influenza plasmidi salvataggio virus: Gli otto geni del virus influenzale clonato nel PDZ ambisense plasmide sono indicati. plasmide PDZ 6, derivato dalla espressione della proteina plasmide pCAGGs 7, è un vettore bidirezionale plasmide con un umano RNA polimerasi I promoter del mouse e una sequenza di terminazione che codifica l&#39;RNA genomico senso negativo, con orientamento opposto al polimerasi mi unisco, una polimerasi II cassetta di trascrizione (pollo β-actina promotore e polyA) codifica le proteine ​​virali da lo stesso gene virale. cDNA da ogni segmento virali sono generati mediante RT-PCR con primer avanti e indietro che contiene il sito di restrizione Sapi endonucleasi e le regioni non codificanti di ogni segmento (scatole nere, alla fine dei geni virali). Il prodotto PCR è clonato nel PDZ digerito con Sap-I. <img src="/files/ftp_upload/2057/2057fig3.jpg" alt="Figura 3" /> Figura 3. Otto plasmide basato salvataggio del sistema influenza: PDZ plasmidi contenenti i geni 8 influenza virale sono co-trasfettate, in sospensione, in-293T MDCK cellule co-culture (giorno 1). Ventiquattro ore dopo la trasfezione, i media senza FBS ma contenente TPCK / tripsina viene sostituito (giorno 2). Quarantotto ore dopo la sostituzione del supporto, supernatante di coltura di tessuto viene raccolta e utilizzata per infettare MDCK o 10 giorni di età uova embrionate di pollo (giorno 4). 48-72 ore post-amplificazione, sovranatante di coltura tissutale da MDCK cellule infette o liquido allantoico da uova vengono raccolti e analizzati per la presenza del virus da HA (giorno 6). Se nessun virus è rilevato, il sovranatante stesso e / o liquidi allantoideo può essere ri-diversi passaggi in fresco le cellule MDCK e / o uova embrionate. <img src="/files/ftp_upload/2057/2057fig4.jpg" alt="Figura 4" /> Figura 4. Emoagglutinina saggio (HA): emoagglutinazione di RBC da particella del virus è visibile macroscopicamente ed è la base per rilevare particelle virali nei supernatanti colture di tessuti e / o fluidi allantoideo. Anche se il test HA non discrimina tra particelle virali infettive e che sono particelle che sono degradati e non più in grado di infettare le cellule, il saggio è un buon indicatore della presenza del virus nei campioni. A) L&#39;assenza (in alto) di presenza (in basso) del virus nei campioni biologici è determinato dalla presenza di RBC sul fondo del piatto o la loro assenza, respectively. B) Un risultato rappresentante di un test HA senza livelli rilevabili di virus (in alto) o presenza (in basso) del virus è mostrato.

<ol>
	<li>Neumann, G., Watanabe, T., Ito, H., Watanabe, S., Goto, H., Gao, P., Hughes, M., Perez, D. R., Donis, R., Hoffmann, E., Hobom, G., Kawaoka, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+influenza+A+viruses+entirely+from+cloned+cDNAs.">Generation of influenza A viruses entirely from cloned cDNAs.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 96, 9345-9350 (1999).</li><li>Fodor, E., Devenish, L., Engelhardt, O. G., Palese, P., Brownlee, G. G., Garcia-Sastre, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rescue+of+influenza+A+virus+from+recombinant+DNA.">Rescue of influenza A virus from recombinant DNA.</a> J Virol. 73, 9679-9682 (1999).</li><li>Martinez-Sobrido, L., Garcia-Sastre, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recombinant+influenza+virus+vectors.">Recombinant influenza virus vectors.</a> Future Virology. 2, 401-416 (2007).</li><li>Palese, P., Shaw, M. L., Knipe, D. M., Howley, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Orthomyxoviridae.+The+viruses+and+their+replication.">Orthomyxoviridae. The viruses and their replication.</a> Fields Virology. , 1647-1689 (2006).</li><li>Schickli, J. H., Flandorfer, A., Nakaya, T., Martinez-Sobrido, L., Garcia-Sastre, A., Palese, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasmid-only+rescue+of+influenza+A+virus+vaccine+candidates.">Plasmid-only rescue of influenza A virus vaccine candidates.</a> Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 356, 1965-1973 (2001).</li><li>Quinlivan, M., Zamarin, D., Garcia-Sastre, A., Cullinane, A., Chambers, T., Palese, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Attenuation+of+equine+influenza+viruses+through+truncations+of+the+NS1+protein.">Attenuation of equine influenza viruses through truncations of the NS1 protein.</a> J Virol. 79, 8431-8439 (2005).</li><li>Niwa, H., Yamamura, K., Miyazaki, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+selection+for+high-expression+transfectants+with+a+novel+eukaryotic+vector.">Efficient selection for high-expression transfectants with a novel eukaryotic vector.</a> Gene. 108, 193-199 (1991).</li></ol>

Mount Sinai School of Medicine ha i diritti di proprietà intellettuale nel campo dei virus influenzali ricombinanti, e AG-S è un inventore di questa proprietà intellettuale.

Salvataggio dei virus influenzali ricombinante da DNA plasmidico è un processo semplice e lineare una volta che il protocollo è eseguita di routine in laboratorio, ma in principio, più cose possono andare storte. E &#39;indispensabile avere una buona preparazione plasmide per generare il virus. La corretta manutenzione delle linee cellulari (293T e MDCK) è fondamentale per un salvataggio di successo virale. Tradizionalmente, un tag genetico viene inserito in una influenza gene codifica plasmide, da mutagenesi silenz...

Linee cellulari 293T (numero di catalogo CRL-11268) e MDCK (numero di catalogo CCL-34) linee di cellule sono mantenute in un incubatore a 37 ° C con 5% di CO 2 in DMEM 10% FBS, 1% PS. Le cellule vengono modulo disponibile l&#39;American Type Culture Collection (ATCC, 10801 Università Boulevard, Manassas, in Virginia. 20110-2209 USA). Uova embrionate di pollo Embrionate di 10 giorni di età uova di pollo può essere ottenuto da Charles River Laboratories, organismi patogeni specifici di alimentazione aviaria Fee (SPAFAS) aviaria Prodotti e Servizi. Franklin Commons, 106 Route 32, North Franklin, CT 06254 USA. Le uova vengono incubate a 37 ° C precedente e dopo l&#39;infezione virale. Prima e dopo l&#39;infezione virale, le uova sono candled a determinare la vitalità degli embrioni. E &#39;molto importante per cercare le uova morti prima e dopo l&#39;infezione virale. Prima dell&#39;infezione un uovo morto può essere facilmente individuato per l&#39;assenza di vasi sanguigni così come l&#39;assenza di mobilità dell&#39;embrione. Quando esaminate, embrioni vivi movimento. Dopo l&#39;infezione virale un uovo morto (probabilmente correlati all&#39;infezione da virus influenzale) sarà facilmente individuato dalla comparsa cattiva dell&#39;uovo come si vede dal volume più piccolo e sanguinario di liquido allantoico. Infetti-uova vengono scartati in due sacchetti autoclavabili e sterilizzati in autoclave seguendo le procedure standard. Pollo globuli rossi (RBC) Pollo RBC possono essere acquistati presso Fattorie Truslow, 201 Valley Road, Chestertown, MD 21620. Conservare a 4 ° C. Per i saggi di HA, lavare 5 ml di globuli rossi di pollo con 45 ml di PBS 1X in un tubo da centrifuga da 50 ml. Centrifugare per 5 minuti a 1000 rpm, RT. Scartare con attenzione il sopranatante e utilizzare una diluizione 1:1000 del RBC pellet in PBS 1X (concentrazione finale del 0.5-1.0% RBC). Tessuti e fluidi sovranatanti allantoideo Entrambi, surnatanti colture di tessuti e fluidi allantoideo può essere conservato a 4 ° C per un breve periodo di tempo. Dopo aver confermato di soccorso virus, virus da surnatanti di cellule o liquido allantoico sono conservati a -80 ° C. Plasmidi Tutti i plasmidi sono preparati con le raccomandazioni di un plasmide produttore di kit maxi successivo. Tutti i plasmidi sono aliquota a concentrazioni di 1 mg / ml in DDH 2 O e conservati a -20 ° C. Per la conservazione a breve termine, il plasmide si può mantenere a 4 ° C. La concentrazione del DNA plasmidico purificato è determinata dalla spettrofotometria a 260 nm, con purezza di essere stimato utilizzando il rapporto 260:280 nm. Preparazioni a 1,8-2,0 260:280 rapporti nm sono considerati appropriati per operazioni di ripristino del virus. Inoltre, la concentrazione e la purezza plasmide deve essere confermata con gel cromatografia. Ambisense PDZ plasmidi (6) contenente l&#39;influenza otto A/PR/8/34 geni virali (7) sono illustrati nella Figura 2. Virus Il protocollo descritto per il salvataggio influenza A/PR/8/34 può essere effettuata sotto il livello di biosicurezza (BSL) 2 condizioni. Materiali contaminati, comprese sovranatanti tessuti e uova embrionate, devono essere sterilizzati prima dello smaltimento. Salvataggio del virus dell&#39;influenza altri possono esigere condizioni BSL superiore e, di conseguenza, le condizioni speciali / misure di sicurezza dovranno essere seguite. Terreni di coltura dei tessuti e soluzioni DMEM 10% FBS 1% PS: 445 ml di Dulbecco modificato Eagle medium (DMEM), 50 ml di siero fetale bovino (FBS), e 5 ml di 100X penicillina / streptomicina (PS). Conservare a 4 ° C. Questo supporto sarà utilizzato per mantenere le cellule 293T e MDCK così come per la transfezione. DMEM BA 0,3% 1% PS: 495,7 ml di DMEM, 4,3 ml di 35% di albumina bovina (BA). Conservare a 4 ° C. Appena prima dell&#39;uso, aggiungere tripsina TPCK trattati per una concentrazione finale di 1 mg / ml. Mezzi di comunicazione infettivi. Fosfato 10X soluzione salina tamponata (PBS): 80 g di NaCl, 2 g di KCl, 11,5 g di Na 2 HPO 4 0,7 H 2 O, 2 g di KH 2 PO 4. Aggiungi DDH 2 O fino a 1 litro. Regolare il pH a 7,3. Sterilizzare in autoclave. Conservare a temperatura ambiente. PBS 1X: Diluire 10X PBS 1:10 con DDH 2 O. Sterilizzare in autoclave e conservare a temperatura ambiente.

generation of recombinant influenza virus from plasmid dna

Gli sforzi da una serie di gruppi di ricerca sono stati influenzali fondamentale per lo sviluppo e il miglioramento della genetica del virus dell&#39;influenza A inversa. Originariamente fondata nel 1999<sup&gt; 1,2</sup&gt; Le tecniche di reverse plasmide basato genetica per creare virus ricombinanti hanno rivoluzionato il campo della ricerca, perché l&#39;influenza specifiche domande hanno avuto risposta da parte geneticamente modificati, infettive, virus influenzali ricombinanti. Tali studi includono la replicazione del virus, la funzione delle proteine ​​virali, il contributo di specifiche mutazioni nelle proteine ​​virali in replicazione virale e / o patogenesi e, anche, vettori virali con virus influenzali ricombinanti che esprimono proteine ​​estranee<sup&gt; 3</sup&gt;.

Watch this Scientific Journal Video about Generation of Recombinant Influenza Virus from Plasmid DNA at JoVE.com

Generation of Recombinant Influenza Virus from Plasmid DNA

Salvataggio di virus dell&#39;influenza A dal DNA plasmide è una tecnica di base ed essenziale sperimentale che consente ai ricercatori di generare virus influenzali ricombinanti per studiare i molteplici aspetti della biologia del virus dell&#39;influenza, e da utilizzare come potenziali vettori o vaccini.

Generazione di influenza da virus ricombinante del DNA plasmidi

Efforts by a number of influenza research groups have been pivotal in the development and improvement of influenza A virus reverse genetics. Originally ...

generation-of-recombinant-influenza-virus-from-plasmid-dna

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

30.1K Views.  University of Rochester School of Medicine and Dentistry. Salvataggio di virus dell'influenza A dal DNA plasmide è una tecnica di base ed essenziale sperimentale che consente ai ricercatori di generare virus influenzali ricombinanti per studiare i molteplici aspetti della biologia del virus dell'influenza, e da utilizzare come potenziali vettori o vaccini.

Video: Generation of Recombinant Influenza Virus from Plasmid DNA

High-throughput Detection Method for Influenza Virus

Influenza virus is a respiratory pathogen that causes a high degree of morbidity and mortality every year in multiple parts of the world. Therefore, precise diagnosis of the infecting strain and rapid high-throughput screening of vast numbers of clinical samples is paramount to control the spread of pandemic infections. Current clinical diagnoses of influenza infections are based on serologic testing, polymerase chain reaction, direct specimen immunofluorescence and cell culture 1,2.
Here, we report the development of a novel diagnostic technique used to detect live influenza viruses. We used the mouse-adapted human A/PR/8/34 (PR8, H1N1) virus 3 to test the efficacy of this technique using MDCK cells 4. MDCK cells (104 or 5 x 103 per well) were cultured in 96- or 384-well plates, infected with PR8 and viral proteins were detected using anti-M2 followed by an IR dye-conjugated secondary antibody. M2 5 and hemagglutinin 1 are two major marker proteins used in many different diagnostic assays. Employing IR-dye-conjugated secondary antibodies minimized the autofluorescence associated with other fluorescent dyes. The use of anti-M2 antibody allowed us to use the antigen-specific fluorescence intensity as a direct metric of viral quantity. To enumerate the fluorescence intensity, we used the LI-COR Odyssey-based IR scanner. This system uses two channel laser-based IR detections to identify fluorophores and differentiate them from background noise. The first channel excites at 680 nm and emits at 700 nm to help quantify the background. The second channel detects fluorophores that excite at 780 nm and emit at 800 nm. Scanning of PR8-infected MDCK cells in the IR scanner indicated a viral titer-dependent bright fluorescence. A positive correlation of fluorescence intensity to virus titer starting from 102-105 PFU could be consistently observed. Minimal but detectable positivity consistently seen with 102-103 PFU PR8 viral titers demonstrated the high sensitivity of the near-IR dyes. The signal-to-noise ratio was determined by comparing the mock-infected or isotype antibody-treated MDCK cells.
Using the fluorescence intensities from 96- or 384-well plate formats, we constructed standard titration curves. In these calculations, the first variable is the viral titer while the second variable is the fluorescence intensity. Therefore, we used the exponential distribution to generate a curve-fit to determine the polynomial relationship between the viral titers and fluorescence intensities. Collectively, we conclude that IR dye-based protein detection system can help diagnose infecting viral strains and precisely enumerate the titer of the infecting pathogens.

This method describes the use of Infrared dye based imaging system for detection of H1N1 in bronchioalveolar lavage (BAL) fluid of infected mice at a high sensitivity. This methodology can be performed in a 96- or 384-well plate, requires &lt;10 &mu;l volume of test material and has the potential for concurrent screening of multiple pathogens.

High-throughput Metodo di rilevazione per il virus dell&#39;influenza

Influenza virus is a respiratory pathogen that causes a high degree of morbidity and mortality every year in multiple parts of the world. Therefore, ...

Ricerca

Immunologia e infezioni

Affinity Purification of Influenza Virus Ribonucleoprotein Complexes from the Chromatin of Infected Cells

Like all negative-strand RNA viruses, the genome of influenza viruses is packaged in the form of viral ribonucleoprotein complexes (vRNP), in which the single-stranded genome is encapsidated by the nucleoprotein (NP), and associated with the trimeric polymerase complex consisting of the PA, PB1, and PB2 subunits. However, in contrast to most RNA viruses, influenza viruses perform viral RNA synthesis in the nuclei of infected cells. Interestingly, viral mRNA synthesis uses cellular pre-mRNAs as primers, and it has been proposed that this process takes place on chromatin1. Interactions between the viral polymerase and the host RNA polymerase II, as well as between NP and host nucleosomes have also been characterized1,2.
Recently, the generation of recombinant influenza viruses encoding a One-Strep-Tag genetically fused to the C-terminus of the PB2 subunit of the viral polymerase (rWSN-PB2-Strep3) has been described. These recombinant viruses allow the purification of PB2-containing complexes, including vRNPs, from infected cells. To obtain purified vRNPs, cell cultures are infected, and vRNPs are affinity purified from lysates derived from these cells. However, the lysis procedures used to date have been based on one-step detergent lysis, which, despite the presence of a general nuclease, often extract chromatin-bound material only inefficiently. 
Our preliminary work suggested that a large portion of nuclear vRNPs were not extracted during traditional cell lysis, and therefore could not be affinity purified. To increase this extraction efficiency, and to separate chromatin-bound from non-chromatin-bound nuclear vRNPs, we adapted a step-wise subcellular extraction protocol to influenza virus-infected cells. Briefly, this procedure first separates the nuclei from the cell and then extracts soluble nuclear proteins (here termed the "nucleoplasmic" fraction). The remaining insoluble nuclear material is then digested with Benzonase, an unspecific DNA/RNA nuclease, followed by two salt extraction steps: first using 150 mM NaCl (termed "ch150"), then 500 mM NaCl ("ch500") (Fig. 1). These salt extraction steps were chosen based on our observation that 500 mM NaCl was sufficient to solubilize over 85% of nuclear vRNPs yet still allow binding of tagged vRNPs to the affinity matrix.
After subcellular fractionation of infected cells, it is possible to affinity purify PB2-tagged vRNPs from each individual fraction and analyze their protein and RNA components using Western Blot and primer extension, respectively. Recently, we utilized this method to discover that vRNP export complexes form during late points after infection on the chromatin fraction extracted with 500 mM NaCl (ch500)3.

Influenza viruses replicate their RNA genome in association with host-cell chromatin. Here, we present a method to purify intact viral ribonucleoprotein complexes from the chromatin of infected cells. Purified viral complexes can be analyzed by both Western blot and primer extension of protein and RNA content, respectively.

Purificazione per affinità di Complessi virus influenzali ribonucleoproteina dalla cromatina delle cellule infettate

Like all negative-strand RNA viruses, the genome of influenza viruses is packaged in the form of viral ribonucleoprotein complexes (vRNP), in which the ...

Rescue of Recombinant Newcastle Disease Virus from cDNA

Newcastle disease virus (NDV), the prototype member of the Avulavirus genus of the family Paramyxoviridae1, is a non-segmented, negative-sense, single-stranded, enveloped RNA virus (Figure 1) with potential applications as a vector for vaccination and treatment of human diseases. In-depth exploration of these applications has only become possible after the establishment of reverse genetics techniques to rescue recombinant viruses from plasmids encoding their complete genomes as cDNA2-5. Viral cDNA can be conveniently modified in vitro by using standard cloning procedures to alter the genotype of the virus and/or to include new transcriptional units. Rescue of such genetically modified viruses provides a valuable tool to understand factors affecting multiple stages of infection, as well as allows for the development and improvement of vectors for the expression and delivery of antigens for vaccination and therapy. Here we describe a protocol for the rescue of recombinant NDVs.

Newcastle disease virus (NDV) has been extensively studied in the last few years in order to develop new vectors for vaccination and therapy, among others. These studies have been possible due to techniques to rescue recombinant virus from cDNA, such as those we describe here.

Salvataggio di virus ricombinante malattia di Newcastle da cDNA

Newcastle disease virus (NDV), the prototype member of  the Avulavirus genus of the family Paramyxoviridae1, is a non-segmented,  negative-sense, ...

Expression of Functional Recombinant Hemagglutinin and Neuraminidase Proteins from the Novel H7N9 Influenza Virus Using the Baculovirus Expression System

The baculovirus expression system is a powerful tool for expression of recombinant proteins. Here we use it to produce correctly folded and glycosylated versions of the influenza A virus surface glycoproteins - the hemagglutinin (HA) and the neuraminidase (NA). As an example, we chose the HA and NA proteins expressed by the novel H7N9 virus that recently emerged in China. However the protocol can be easily adapted for HA and NA proteins expressed by any other influenza A and B virus strains. Recombinant HA (rHA) and NA (rNA) proteins are important reagents for immunological assays such as ELISPOT and ELISA, and are also in wide use for vaccine standardization, antibody discovery, isolation and characterization. Furthermore, recombinant NA molecules can be used to screen for small molecule inhibitors and are useful for characterization of the enzymatic function of the NA, as well as its sensitivity to antivirals. Recombinant HA proteins are also being tested as experimental vaccines in animal models, and a vaccine based on recombinant HA was recently licensed by the FDA for use in humans. The method we describe here to produce these molecules is straight forward and can facilitate research in influenza laboratories, since it allows for production of large amounts of proteins fast and at a low cost. Although here we focus on influenza virus surface glycoproteins, this method can also be used to produce other viral and cellular surface proteins.

Here we describe a way to express correctly folded and functional influenza virus surface antigens derived from the novel Chinese H7N9 virus in insect cells. The technique can be adapted to express ectodomains of any viral or cellular surface proteins.

Espressione dei funzionali ricombinante emoagglutinina e neuraminidasi proteine ​​del virus Novel H7N9 Influenza utilizzando l&#39;espressione sistema Baculovirus

The baculovirus expression system is a powerful tool for expression of  recombinant proteins. Here we use it to produce correctly folded and  glycosylated ...

Influenza Virus Propagation in Embryonated Chicken Eggs

Influenza infection is associated with about 36,000 deaths and more than 200,000 hospitalizations every year in the United States. The continuous emergence of new influenza virus strains due to mutation and re-assortment complicates the control of the virus and necessitates the permanent development of novel drugs and vaccines. The laboratory-based study of influenza requires a reliable and cost-effective method for the propagation of the virus. Here, a comprehensive protocol is provided for influenza A virus propagation in fertile chicken eggs, which consistently yields high titer viral stocks. In brief, serum pathogen-free (SPF) fertilized chicken eggs are incubated at 37 &#176;C and 55-60% humidity for 10 &#8211; 11 days. Over this period, embryo development can be easily monitored using an egg candler. Virus inoculation is carried out by injection of virus stock into the allantoic cavity using a needle. After 2 days of incubation at 37 &#176;C, the eggs are chilled for at least 4 hr at 4 &#176;C. The eggshell above the air sac and the chorioallantoic membrane are then carefully opened, and the allantoic fluid containing the virus is harvested. The fluid is cleared from debris by centrifugation, aliquoted and transferred to -80 &#176;C for long-term storage. The large amount (5-10 ml of virus-containing fluid per egg) and high virus titer which is usually achieved with this protocol has made the usage of eggs for virus preparation our favorable method, in particular for in vitro studies which require large quantities of virus in which high dosages of the same virus stock are needed.

Fertile chicken eggs are widely used to produce large amounts of human influenza A virus as they provide a convenient and cost-effective system to prove high yields of virus.

Influenza Virus Propagazione in embrionate di pollo Uova

Influenza infection is associated with about 36,000 deaths and more than 200,000 hospitalizations every year in the United States. The continuous ...

Intranasal Administration of Recombinant Influenza Vaccines in Chimeric Mouse Models to Study Mucosal Immunity

Vaccines are one of the greatest achievements of mankind, and have saved millions of lives over the last century. Paradoxically, little is known about the physiological mechanisms that mediate immune responses to vaccines perhaps due to the overall success of vaccination, which has reduced interest into the molecular and physiological mechanisms of vaccine immunity. However, several important human pathogens including influenza virus still pose a challenge for vaccination, and may benefit from immune-based strategies. 
Although influenza reverse genetics has been successfully applied to the generation of live-attenuated influenza vaccines (LAIVs), the addition of molecular tools in vaccine preparations such as tracer components to follow up the kinetics of vaccination in vivo, has not been addressed. In addition, the recent generation of mouse models that allow specific depletion of leukocytes during kinetic studies has opened a window of opportunity to understand the basic immune mechanisms underlying vaccine-elicited protection. Here, we describe how the combination of reverse genetics and chimeric mouse models may help to provide new insights into how vaccines work at physiological and molecular levels, using as example a recombinant, cold-adapted, live-attenuated influenza vaccine (LAIV). We utilized laboratory-generated LAIVs harboring cell tracers as well as competitive bone marrow chimeras (BMCs) to determine the early kinetics of vaccine immunity and the main physiological mechanisms responsible for the initiation of vaccine-specific adaptive immunity. In addition, we show how this technique may facilitate gene function studies in single animals during immune responses to vaccines. We propose that this technique can be applied to improve current prophylactic strategies against pathogens for which urgent medical countermeasures are needed, for example influenza, HIV, Plasmodium, and hemorrhagic fever viruses such as Ebola virus.

There is an overall lack of knowledge about how vaccines work. Here we propose the combined use of reverse genetics and bone marrow chimeric mice to gain insight into the early host immune responses to vaccines with a special focus on dendritic cells and T cell immunity.

Intranasale somministrazione di ricombinante Influenza vaccini nei modelli chimerico topo per studiare immunità delle mucose

Vaccines are one of the greatest achievements of mankind, and have saved millions of lives over the last century. Paradoxically, little is known about the ...

Generation of Recombinant Human IgG Monoclonal Antibodies from Immortalized Sorted B Cells

Finding new methods for generating human monoclonal antibodies is an active research field that is important for both basic and applied sciences, including the development of immunotherapeutics. However, the techniques to identify and produce such antibodies tend to be arduous and sometimes the heavy and light chain pair of the antibodies are dissociated. Here, we describe a relatively simple, straightforward protocol to produce human recombinant monoclonal antibodies from human peripheral blood mononuclear cells using immortalization with Epstein-Barr Virus (EBV) and Toll-like receptor 9 activation. With an adequate staining, B cells producing antibodies can be isolated for subsequent immortalization and clonal expansion. The antibody transcripts produced by the immortalized B cell clones can be amplified by PCR, sequenced as corresponding heavy and light chain pairs and cloned into immunoglobulin expression vectors. The antibodies obtained with this technique can be powerful tools to study relevant human immune responses, including autoimmunity, and create the basis for new therapeutics.

Synthesis of human monoclonal antibodies is the first step in studies aimed at unraveling the pathophysiological mechanisms of auto-antibody-mediated immune responses. We have developed a protocol to generate recombinant human immunoglobulin G (IgG) monoclonal antibodies from blood sorted B cells, including B-cell isolation, antibody cloning and in vitro synthesis.

Generazione di ricombinante umano IgG anticorpi monoclonali da immortalizzate cellule ordinati B

Finding new methods for generating human monoclonal antibodies is an active research field that is important for both basic and applied sciences, ...

Nasal Wipes for Influenza A Virus Detection and Isolation from Swine

Surveillance for influenza A viruses in swine is critical to human and animal health because influenza A virus rapidly evolves in swine populations and new strains are continually emerging. Swine are able to be infected by diverse lineages of influenza A virus making them important hosts for the emergence and maintenance of novel influenza A virus strains. Sampling pigs in diverse settings such as commercial swine farms, agricultural fairs, and live animal markets is important to provide a comprehensive view of currently circulating IAV strains. The current gold-standard ante-mortem sampling technique (i.e. collection of nasal swabs) is labor intensive because it requires physical restraint of the pigs. Nasal wipes involve rubbing a piece of fabric across the snout of the pig with minimal to no restraint of the animal. The nasal wipe procedure is simple to perform and does not require personnel with professional veterinary or animal handling training. While slightly less sensitive than nasal swabs, virus detection and isolation rates are adequate to make nasal wipes a viable alternative for sampling individual pigs when low stress sampling methods are required. The proceeding protocol outlines the steps needed to collect a viable nasal wipe from an individual pig.

The authors present a protocol to collect swine nasal wipes to detect and isolate influenza A viruses.

Panni nasale per l&#39;influenza A rilevazione antivirus e isolamento da Suina

Surveillance for influenza A viruses in swine is critical to human and animal health because influenza A virus rapidly evolves in swine populations and ...

In Vitro Disassembly of Influenza A Virus Capsids by Gradient Centrifugation

Acid-triggered molecular processes closely control cell entry of many viruses that enter through the endocytic system. In the case of influenza A virus (IAV), virus fusion with the endosomal membrane as well as the subsequent disassembly of the viral capsid, called uncoating, is governed by the ionic conditions inside endocytic vesicles. The early steps in the virus life cycle are hard to study because endosomes cannot be directly accessed experimentally, creating the need for an in vitro approach. Here, we describe a method based on velocity gradient centrifugation of purified virions through a two-layer glycerol gradient, which enables analysis of the IAV core and its stability. The gradient contains a non-ionic detergent (NP-40) in its lower layer to remove the viral membrane by solubilization as the virus sediments toward the bottom. At neutral pH, viral cores are pelleted as stable structures. The major core components, matrix protein (M1) and the viral ribonucleoproteins (vRNPs), can be clearly identified in the pellet fraction by SDS-PAGE. Decreasing the pH to 6.0 or lower in the bottom layer selectively removes M1 from the pellet followed by release of vRNPs at more acidic conditions. Viral protein bands on Coomassie-stained gels can be subjected to densitometric quantification to monitor intermediate states of IAV disassembly. Besides pH, other factors that influence viral core stability can be assessed, such as salt concentration and putative viral uncoating factors, simply by modifying the detergent-containing glycerol layer accordingly. Taken together, the presented technique allows highly reproducible and quantitative analysis of viral uncoating in vitro. It can be applied to other enveloped viruses that undergo complex uncoating processes.

In Vitro Disassembly of Influenza A Virus Capsids by Gradient Centrifugation

Disassembly of influenza A virus cores during virus entry into host cells is a multistep process. We describe an in vitro method to analyze the early stages of viral uncoating. In this approach, velocity gradient centrifugation is used to biochemically dissect the steps that initiate uncoating under defined conditions.

In Vitro Smontaggio del virus influenzale A capsids per centrifugazione in gradiente

Acid-triggered molecular processes closely control cell entry of many viruses that enter through the endocytic system. In the case of influenza A virus ...

Rescue and Characterization of Recombinant Virus from a New World Zika Virus Infectious Clone

Infectious cDNA clones allow for genetic manipulation of a virus, thus facilitating work on vaccines, pathogenesis, replication, transmission and viral evolution. Here we describe the construction of an infectious clone for Zika virus (ZIKV), which is currently causing an explosive outbreak in the Americas. To prevent toxicity to bacteria that is commonly observed with flavivirus-derived plasmids, we generated a two-plasmid system which separates the genome at the NS1 gene and is more stable than full-length constructs that could not be successfully recovered without mutations. After digestion and ligation to join the two fragments, full-length viral RNA can be generated by in vitro transcription with T7 RNA polymerase. Following electroporation of transcribed RNA into cells, virus was recovered that exhibited similar in vitro growth kinetics and in vivo virulence and infection phenotypes in mice and mosquitoes, respectively.

This protocol describes the recovery of infectious Zika virus from a two-plasmid infectious cDNA clone.

Salvataggio e caratterizzazione del virus ricombinante da un nuovo mondo Clone infettivo del virus Zika

Infectious cDNA clones allow for genetic manipulation of a virus, thus facilitating work on vaccines, pathogenesis, replication, transmission and viral ...