Gli autori ringraziano la Fondazione Bill e Melinda Gates per il suo sostegno dello sviluppo tecnologico e della formazione.

Nota: Questo protocollo include i volumi e le concentrazioni per 96 pozzetti, strip 8-tubo, e sistemi basati capillari-(volume di reazione 10 microlitri); tuttavia, HRM può essere eseguita anche in sistemi basati piastriformi 384 pozzetti con un volume di reazione 5 microlitri scalando tutti i volumi corrispondentemente. La gamma di rilevazione per la maggior parte dei sistemi è di 10 pg a 10 ng DNA stampo. 1. Preparare Modelli <ol><li> Ottenere campioni Plasmodium falciparum direttamente dal sangue ottenuti da pazienti che partecipano a studi sul campo del sito e memorizzati come sangue intero, globuli rossi pellet, o su carta da filtro. Nota: I campioni possono anche essere cultura adattata a crescere in vitro; alcuni ceppi standard di laboratorio per l&#39;analisi possono essere ordinati dalla Malaria Research and Reference reagente Resource Center (MR4, i campioni possono essere utilizzati direttamente dal pellet globuli rossi o di cultura o estratte dal sangue intero, globuli rossi, o carta da filtro. </li><li> DNA estratto dacarta da filtro o ceppi culturali adattate Nota: HRM è sensibile alla concentrazione di sale; differenze di concentrazione a causa di metodi di estrazione variabili possono influenzare significativamente la temperatura di fusione. Mentre specifici tamponi finali non sono un fattore significativo per il successo, utilizzare un eluizione o risospensione tampone standard comune (ad esempio, acqua, 1x Te [&#39;basso Te&#39; o &#39;il DNA tampone sospensione&#39;: 10 mM Tris-Cl, 0.10 mM EDTA] o 1x TE [10 mM Tris-Cl, 1 mM EDTA]) per tutti i campioni per evitare curve melt anomale o incoerenti. <ol><li> Preparare diluizioni modello di 10 pg -10 ng per ml nella norma Te, TE o acqua per ogni reazione 10 microlitri. </li></ol></li><li> Diretto amplificazione da globuli rossi pellet <ol><li> Determinare parassitemia di globuli rossi usando la microscopia sottile striscio Nota: I metodi per la determinazione parassitemia dei globuli rossi infetti sono disponibili presso i Centers for Disease Control and Prevention (CDC): http:<html> //www.cdc.gov/dpdx/diagnosticProcedures/blood/microexam.html </li><li> Diluire parasitemias superiore a 0,5% 1: 400 in PCR-grade acqua, TE o Te. Utilizzare 3 microlitri per ogni 5- 10 microlitri di reazione. </li></ol></li><li> Controlli Nota: HRM può essere utilizzato per la scansione gene per rilevare variazioni di sequenza in una popolazione 12; tuttavia, la genotipizzazione accurata richiede standard sequenza verificato per contenere il SNP interrogato. Costrutti plasmide o malaria isolati possono essere utilizzati con genotipi noti. Per la maggior parte delle applicazioni, 3D7 (MR4 MRA-151) è usato come controllo wild-type. A causa di conduzione tra la variabilità, includere sempre controlli positivi e negativi. <ol><li> I controlli positivi: Preparare 10 pg - 10 ng per 1 ml diluizioni del plasmide o norme con sequenza verificata SNP genotipi. </li><li> Controllo negativo: acqua pura Usa PCR come controllo no-template (NTC) per le reazioni di amplificazione. </li></ol></li></ol>ve_title &quot;&gt; 2. PCR Amplificazione <ol><li> Preparare miscela di reazione <ol><li> Copertura di olio (opzionale) Mineral. Nota: alcuni sistemi di gestione delle risorse umane sono piattaforme di fusione standalone e non hanno un coperchio riscaldato per evitare la condensazione ed evaporazione del prodotto durante l&#39;amplificazione. <ol><li> Aggiungere 20 ml di olio minerale leggero per ogni piastra ben prima di caricare la miscela di reazione. </li></ol></li><li> Preparare 10x scorte di lavoro di tutti i saggi <ol><li> Fare riferimento alla Tabella 1 per consigliati 10x concentrazioni azionari di lavoro, nonché le concentrazioni finali per HRM genotipizzazione basato su sonda bloccato. </li></ol></li><li> Preparare miscele di reazione <ol><li> Per ogni bene nel piatto o tubo, aggiungere 1 ml 10x lavoro stock avanti e reverse primer e sonde, 4,0-5,0 microlitri 2.5x 2.0x o HRM master mix, 1 modello ml, e di acqua grado PCR per un volume totale di reazione di 10 pl . </li></ol></li><li> Piastre di copertura o tubi <ol><li> Utilizzare lamina ottica seals per l&#39;amplificazione basato piastra, tappi ottici per sistemi basati su nastro, tubi e tappi di plastica per sistemi basati capillari. Assicurarsi che la copertura è completa e piatti e tappi sono completamente sigillato e protetto per evitare l&#39;evaporazione durante l&#39;amplificazione. </li></ol></li><li> Campioni Spin <ol><li> Piastre Spin 3 min a 1.800 xg per eliminare le bolle d&#39;aria e di separare le fasi del petrolio e acquose se si usa olio minerale. </li></ol></li></ol></li><li> Protocollo Amplificazione <ol><li> Posizionare piastre di reazione o tubi in termociclatore. Protocolli bloccati-sonda o MAAB amplificazione standard Run (tabelle 2 e 3 rispettivamente). Notare la differenza di temperatura di ricottura tra questi metodi. </li></ol></li></ol> Analisi 3. HRM <ol><li> Fusione <ol><li> Dopo l&#39;amplificazione PCR, procedere alla fusione di analisi. Per i sistemi di fusione standalone che non sono dotati di amplificazione (ad es., Sistemi BioFire Difesa LightScanner), respostare piatto amplificato dal termociclatore e posto in strumenti HRM. Dall&#39;interfaccia software di sistema, sciogliere il piatto 40-80 ° C per la produzione di entrambi i picchi di fusione della sonda e ampliconi. Nota: per salvare fusione e analisi in tempo, la finestra di fusione può essere ridotto a copertura range di temperatura solo per sondare o regioni amplicone di fusione. Dopo la fusione, piastre e tubi possono essere ri-fuso se necessario e conservato a -20 ° C o 4 ° C. Conservare le provette di vetro solo a 4 ° C per evitare che i tubi di cracking. </li></ol></li><li> Analisi Melt <ol><li> Rimuovere campioni negativi <ol><li> All&#39;interno del software di analisi, togliere dal altri campioni di analisi che non amplificare o che hanno picchi di fusione frastagliate. Nota: Dopo aver selezionato la modalità di analisi di un file di esecuzione individuale, lo strumento raggruppa automaticamente i campioni positivi e negativi. Prima genotipizzazione ogni sottoinsieme, l&#39;utente può modificare manualmente le chiamate. <ol><li> Sia da fusionecurva o picco di fusione vista, fare clic destro su curve da rimuovere per selezionarli. Dopo aver selezionato i campioni mal classificati, andare su &quot;Nuova chiamata&quot;, selezionare il gruppo appropriato e fare clic su &quot;Apply Change&quot;. </li></ol></li></ol></li><li> Normalizzare <ol><li> Dalla derivata negativa della fluorescenza normalizzata rispetto alla temperatura (-dF / dT) (&#39;Curve Difference&#39;) vista, spostare barre normalizzazione per circondare la sonda fondere regione. Nota: La sonda sciogliere regione è la temperatura più bassa delle due regioni di fusione. Le barre di normalizzazione dovrebbero essere alla base dei picchi melt. </li></ol></li><li> Calcolare gruppi <ol><li> Dopo la normalizzazione, selezionare &#39;Calcola gruppi&#39; per assegnare automaticamente i campioni per i gruppi. Se necessario, i campioni-assegnare nuovamente manualmente per gruppi specifici. Nota: alcuni software di analisi ha soglie di alta sensibilità che non possono essere modificati; in questi casi, la software potrebbe assegnare i campioni a diversi gruppi che appartengono visivamente ad un altro. </li></ol></li><li> Assegnare genotipi <ol><li> Assegnare genotipi per ogni gruppo sulla base di standard (controlli positivi). <ol><li> Dopo che l&#39;utente conferma che i gruppi calcolati siano corretti (se non, che i cambiamenti corrette sono state apportate nella scheda Raggruppamento selezionando campioni erroneamente classificati e selezionando il gruppo destro dal menu a casella accanto a &quot;Nuova chiamata&quot;), selezionare &quot;Modifica nomi di gruppo &quot;sotto la scheda&quot; Raggruppamento &quot;. </li><li> Inserire i genotipi delle norme in area colorata corrispondente (ad esempio, se 3D7 standard ha conosciuto un genotipo ed è nel gruppo rosso, il gruppo rosso ha genotipo A). Premere il tasto &quot;OK&quot; e salvare i risultati. </li></ol></li></ol></li><li> Esportazione dei risultati <ol><li> Esportare il genotipo chiama come un foglio di calcolo per ulteriori analisi campione di popolazione. </li></ol></li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> World Health Organization report 2013. , 1-286 (2013).</li><li>Hayton, K., Su, X. -. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drug+resistance+and+genetic+mapping+in+Plasmodium+falciparum.">Drug resistance and genetic mapping in Plasmodium falciparum.</a> Current genetics. 54 (5), (2008).</li><li>Neafsey, D. 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F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Harnessing+genomics+and+genome+biology+to+understand+malaria+biology.">Harnessing genomics and genome biology to understand malaria biology.</a> Nature Reviews Genetics. 13 (5), 315-328 (2012).</li><li>Manske, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+Plasmodium+falciparum+diversity+in+natural+infections+by+deep+sequencing.">Analysis of Plasmodium falciparum diversity in natural infections by deep sequencing.</a> Nature. 487 (7407), 375-379 (2012).</li><li>Auburn, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+within-host+Plasmodium+falciparum+diversity+using+next-generation+sequence+data.">Characterization of within-host Plasmodium falciparum diversity using next-generation sequence data.</a> PLoS ONE. 7 (2), e32891 (2012).</li><li>Daniels, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+general+SNP-based+molecular+barcode+for+Plasmodium+falciparum+identification+and+tracking.">A general SNP-based molecular barcode for Plasmodium falciparum identification and tracking.</a> Malaria Journal. 7, 223 (2008).</li><li>Daniels, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+surveillance+detects+both+clonal+and+epidemic+transmission+of+malaria+following+enhanced+intervention+in+Senegal.">Genetic surveillance detects both clonal and epidemic transmission of malaria following enhanced intervention in Senegal.</a> PLoS ONE. 8 (4), e60780 (2013).</li><li>Daniels, R. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=field-deployable+method+for+genotyping+and+discovery+of+single-nucleotide+polymorphisms+associated+with+drug+resistance+in+Plasmodium+falciparum.">field-deployable method for genotyping and discovery of single-nucleotide polymorphisms associated with drug resistance in Plasmodium falciparum.</a> Antimicrobial agents and chemotherapy. 56 (6), 2976-2986 (2012).</li><li>Olbadia, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clonal+outbreak+of+Plasmodium+falciparum+in+eastern+Panama.">Clonal outbreak of Plasmodium falciparum in eastern Panama.</a> The Journal of infectious diseases. , (2014).</li><li>Montgomery, J., Wittwer, C. T., Palais, R., Zhou, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+mutation+scanning+and+genotyping+by+high-resolution+DNA+melting+analysis.">Simultaneous mutation scanning and genotyping by high-resolution DNA melting analysis.</a> Nature protocols. 2 (1), 59-66 (2007).</li><li>Mharakurwa, S., Daniels, R., Scott, A., Wirth, D. F., Thuma, P., Volkman, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pre-amplification+methods+for+tracking+low-grade+Plasmodium+falciparum+populations+during+scaled-up+interventions+in+Southern+Zambia.">Pre-amplification methods for tracking low-grade Plasmodium falciparum populations during scaled-up interventions in Southern Zambia.</a> Malaria Journal. 13, 89 (2014).</li></ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Continua HRM è un&#39;analisi fase di post-PCR; Pertanto, il campione e la configurazione del test è simile ai protocolli PCR standard, con l&#39;inserimento aggiuntivo di un colorante intercalante fluorescente utilizzato per monitorare la transizione dal doppio filamento di DNA a singolo filamento durante la fase di fusione ad alta risoluzione. Il singolo fattore più importante per l&#39;analisi HRM di successo è un prodotto robusto PCR. Disegno Assay è la chiave, e diversi strumenti ottimizzati per la progettazione del test HRM sono disponibili in commercio e online il 13. Lunghezze ampliconi di 80-150 coppie di basi con accompagnamento ~ 20 coppia di basi bloccate sonde centrati sul SNP o SNP di lavoro interesse migliore per differenziare SNP così come aplotipi di più SNPs nella regione della sonda. Sonde possono essere bloccati utilizzando un &#39;C3 distanziatore o una coppia disadattamento di base 2 al 3&#39; 3 fine, che impediscono l&#39;estensione durante l&#39;amplificazione. Le sonde possono essere progettati per abbinare il filo Watson o Crick modello; la sceltadipende dalla verifica empirica per determinare quale sonda il design produce picchi di fusione accettabili. Eccesso avanti o indietro primer vengono utilizzati per la produzione del prodotto a singolo filamento di amplificazione che annealing alle sonde bloccati. Se la sonda contiene la sequenza filamento in avanti, poi invertire primer viene utilizzato in eccesso, tipicamente in un rapporto 1: 5, e viceversa per sonde corrispondenti al filamento opposto. Allo stesso modo, HRM funziona meglio con sufficiente e robusto prodotto della PCR. Ottimizzazione reazione PCR richiede gradiente PCR e agarosio gel o analisi Bioanalyzer per determinare temperature ottimali di ricottura. Concentrazione modello può essere aumentato utilizzando metodi come la pre-amplificazione, di parte l&#39;amplificazione multiplex di tutti gli obiettivi con bassa concentrazione di primer e numeri ciclabili per aumentare la concentrazione modello 13. Solo una manciata di strumenti sono compatibili con MAAB. Le proprietà termiche dei tubi capillari di vetro usati in questi sistemi facilitano questo metodo. Il piccolo diametro interno dei capillari nonché il rapido trasferimento di calore attraverso il vetro offrono il controllo della temperatura più rigorose di plasticware PCR standard, che ha tassi più lenti di transizione tra ricottura e denaturazione cicli a causa delle proprietà termiche isolanti dei materiali plastici. Con questo metodo, sensibilità di rivelazione può essere ridotta da 2-5% a meno dell&#39;1% di un allele mutante in una miscela di wild-type e mutante alleli 10. HRM è uno strumento facile, efficiente e economica per la genotipizzazione SNP in una varietà di impostazioni e numerose applicazioni, dalla sorveglianza delle malattie infettive per la scansione di varianti del gene del cancro. Diversi altri strumenti, come il Roche Nano e sistemi LightCycler (480 e 96), nonché la Eco Real-time offre il sistema PCR HRM oltre all&#39;amplificazione standard in tempo reale, e funzionalità di copia-numero. Utilizzando macchine alto-throughput, costa HRM barcoding less di $ 0.50 per test nelle nostre mani, compresi tutti i reagenti e materiali di consumo. Nel contesto descritto, le applicazioni sul campo consentono in tempo reale di sorveglianza di popolazione per i cambiamenti associati con il lavoro di controllo della malaria, tra cui ridotto la diversità demografica, l&#39;individuazione di tipi di parassiti importati, e la comparsa e la diffusione di SNPs associati alla sensibilità ai farmaci ridotta. Perfezionamenti al metodo offrono sensibilità aggiuntivo utile per informare i progressi verso l&#39;eliminazione della malaria e l&#39;eradicazione.

Nonostante il rinnovato interesse per il controllo della malaria e l&#39;eradicazione, la malaria rimane un onere in tutto il mondo, con quasi la metà della popolazione mondiale a rischio di infezione e di oltre 550.000 decessi ogni anno, in particolare dei bambini in Africa sub-sahariana 1. Questi nuovi programmi di controllo e di eradicazione sono stati sostenuti dalla rinascimento genomica, con un gran numero di parassiti della malaria sequenziato e analizzato per le mutazioni associate con la sensibilità ai farmaci ridotta, una maggiore virulenza, e per caratteristiche della popolazione 2,3. Polimorfismi a singolo nucleotide (SNP) sono tra le varianti genetiche più comunemente identificate 4-7. Metodi di genotipizzazione SNP portatili offrono in loco e la sorveglianza della popolazione in tempo reale e il monitoraggio 8. Oltre alle impronte digitali individuali parassiti, il &#39;codice a barre molecolare&#39; è anche usato per rilevare drammatici cambiamenti temporali nella frequenza dell&#39;allelenonché varianza effettiva dimensione della popolazione e la complessità di infezione 9. Anche se questo insieme di informativa SNP si adatta facilmente a molte piattaforme di genotipizzazione, alta risoluzione sciogliendo (HRM) analisi è particolarmente adatto agli studi, dove il funzionamento e l&#39;individuazione di nuove mutazioni a costi contenuti sensibili e semplici rispetto al sequenziamento e l&#39;altro campo-base approcci sono attraenti in contesti poveri di risorse. HRM inizia con reazione a catena della polimerasi standard (PCR) che incorpora un colorante fluorescente. Post-PCR analisi di fusione determina la temperatura di picco amplicone di fusione; una sola differenza SNP in un breve amplicone può risultare in sostanziale temperatura picco di fusione (Tm) Differenze. Diversi perfezionamenti a questo metodo offre migliore risoluzione genotipizzazione di distinguere SNPs tra cui classe IV (AT) SNPs, e rilevare minori alleli mutanti in campioni con più alleli presenti (polyginfezioni enomic). Innanzitutto, i saggi incorporano brevi sonde centrati sulla regione SNP, oltre a trasmettere e reverse primer che sono presenti a diverse concentrazioni. Queste sonde bloccate non sono amplificati durante la PCR, ma si legano al filamento prodotta in eccesso a causa di concentrazioni dei primer asimmetrici che aumentano la produzione del prodotto probe-template. Questi ampliconi doppio filamento separato, comprensivi di sonda legata al modello filo in eccesso sono ~ 20-30 bp; la loro lunghezza significativamente diminuito rispetto a tutta la amplicone (80-150 bp) portano a differenze molto più grandi Tm associati con base singola o multipla della sonda-template disallineamenti 10. In secondo luogo, l&#39;amplificazione allele mutato bias (MAAB) abbassa la temperatura di ricottura reazione al pregiudizio la reazione verso alleli mutanti presenti a bassi rapporti di infezioni polygenomic. La temperatura di ricottura si trova tra le Tms di perfettamente abbinati (wild-type) e non corrispondenti sonda (mutante)S. A questa temperatura, il legame del allele wild-type è abbastanza stabile che l&#39;amplificazione è ostacolato rispetto al suo equivalente disadattamento, polarizzando in tal modo l&#39;amplificazione allele mutante verso il quando entrambi sono presenti in un singolo campione 10. Con questi filtri HRM, questa tecnologia ha permesso di tracciamento di origine e l&#39;identità di parassiti associati alle infezioni epidemiche in Sud America 11 e rilevazione di nuove mutazioni, la differenziazione di più SNP situati immediatamente accanto all&#39;altro in sequenza, e mutazioni presenti in meno di 1 % degli alleli in campioni polygenomic 10. Aumento della sensibilità è particolarmente importante nelle regioni che si avvicinano di stato di pre-eliminazione e quelli a rischio di emergente resistenza ai farmaci. La capacità di identificare rapidamente e facilmente i parassiti importati e SNPs associati con ridotta sensibilità in loco informa gli sforzi di sorveglianza e di controllo sui programmil&#39;efficacia delle loro implementazioni e identifica hotspot per maggiori sforzi di eradicazione della malaria e di eliminazione. Questo protocollo descrive i metodi per la sonda bloccato-based e MAAB per una maggiore sensibilità HRM genotipizzazione.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>LightScanner Master Mix</td>
			<td>BioFire Defense</td>
			<td>HRLS-ASY-0003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light mineral oil</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M5904</td>
			<td>for BioFire Defense plate-based HRM systems</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TE</td>
			<td>Teknova</td>
			<td>T0226</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Te</td>
			<td>Teknova</td>
			<td>T0221</td>
			<td>TE buffer with reduced EDTA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR grade water</td>
			<td>Teknova</td>
			<td>W3330</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmodium falciparum standards</td>
			<td>MR4</td>
			<td>MRA-151, 156, 205, 330</td>
			<td>MR4.org offers free genomic DNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light Scanner Primer Design Software</td>
			<td>BioFire Defense</td>
			<td></td>
			<td>commercial sofware for HRM assay design</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LightCycler 480 High Resolution Melting Master Mix</td>
			<td>Roche</td>
			<td>4909631001</td>
			<td>For use in LightCycler-480, -96, and nano. 2x concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bioanalyzer</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>G2938A</td>
			<td>Agilent 2100 bioanalyzer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LightCycler 2.0</td>
			<td>Roche</td>
			<td>3531414001</td>
			<td>Capillary-based system for MAAB</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LightCycler Nano</td>
			<td>Roche</td>
			<td>6407773001</td>
			<td>Strip tube-based HRM and amplification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LightCycler 96</td>
			<td>Roche</td>
			<td>5815916001</td>
			<td>Strip-tube and plate-based HRM and amplification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LightCycler 480</td>
			<td>Roche</td>
			<td>5015278001</td>
			<td>plate-based HRM (96 and 384-well plates) and amplification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LightScanner-96</td>
			<td>BioFire Defense</td>
			<td>LSCN-ASY-0011</td>
			<td>plate-based HRM (96-well)&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LightScanner-384</td>
			<td>BioFire Defense</td>
			<td>LSCN-ASY-0001</td>
			<td>plate-based HRM (96-well)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plates</td>
			<td>Roche</td>
			<td>4729692001</td>
			<td>96-well plates for HRM (LightCycler</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>384-well plates</td>
			<td>Roche</td>
			<td>4729749001</td>
			<td>384-well plates for HRM (LightCycler)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plates</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>HSP-9665&#160;</td>
			<td>96-well plates for HRM (LightScanner)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>384-well plates</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>HSP-3865&#160;</td>
			<td>384-well plates for HRM (LightScanner)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LightCycler 8-Tube Strips (clear)</td>
			<td>Roche</td>
			<td>6327672001</td>
			<td>strip tubes for HRM (Light Cycler 96 and Light Cycler Nano)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LightCycler Capillaries (20 &#956;l)</td>
			<td>Roche</td>
			<td>4929292001</td>
			<td>capillaries for HRM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optical plate seals</td>
			<td>Roche</td>
			<td>4729757001</td>
			<td>other brands also work</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

methods to increase the sensitivity of high resolution melting single nucleotide polymorphism genotyping in malaria

Nonostante decenni di sforzi per l&#39;eradicazione, la malaria rimane un onere globale. Recente rinnovato interesse per l&#39;eliminazione regionale e l&#39;eradicazione globale è stata accompagnata da una maggiore informazione genomica su Plasmodium specie parassita responsabile della malaria, comprese le caratteristiche delle popolazioni geografiche così come le variazioni associate a ridotta sensibilità ai farmaci antimalarici. Una variazione genetica comune, polimorfismi a singolo nucleotide (SNP), offre un target interessante per parassita genotipizzazione. Questi marcatori sono utili non solo per il monitoraggio marcatori di resistenza ai farmaci, ma anche per il monitoraggio delle popolazioni di parassiti utilizzando marcatori non inferiore a droga o altre pressioni selettive. Metodi di genotipizzazione SNP offrono la possibilità di monitorare la resistenza ai farmaci, nonché per le impronte digitali individuali parassiti per la sorveglianza della popolazione, in particolare in risposta agli sforzi di controllo della malaria nelle regioni avvicinano eliminatlo stato di ioni. Mentre SNPs informativi sono stati identificati, che sono agnostico di specifiche tecnologie di genotipizzazione, ad alta risoluzione di fusione (HRM) analisi è particolarmente adatto studi basati-campo a. Rispetto ai metodi standard fluorescente-probe based che richiedono le singole SNPs in una singola sonda marcata e offrono sensibilità nella migliore delle ipotesi il 10% per individuare SNPs in campioni che contengono più genomi (polygenomic), gestione delle risorse umane offre sensibilità 2-5%. Modifiche HRM, quali sonde bloccate e concentrazioni dei primer asimmetrici nonché l&#39;ottimizzazione di temperature di ricottura per polarizzare amplificazione PCR verso amplificazione allele minore, aumentano ulteriormente la sensibilità di HRM. Mentre il miglioramento sensibilità dipende dal dosaggio specifico, abbiamo aumentato sensibilità di rilevamento a meno dell&#39;1% dell&#39;allele minore. Nelle regioni che si avvicinano eradicazione della malaria, la diagnosi precoce di emergere o di resistenza ai farmaci importati è essenziale per prrisposta ompt. Allo stesso modo, la capacità di rilevare infezioni polygenomic e differenziare i tipi di parassiti importati dai serbatoi locali criptici può informare i programmi di controllo. Questo manoscritto descrive le modifiche alla tecnologia di fusione ad alta risoluzione che aumentano ulteriormente la sua sensibilità per individuare infezioni polygenomic nei campioni dei pazienti.

I dati possono essere visualizzati in diversi modi, a seconda del software di analisi e strumento. Tipicamente, un grafico della derivata negativa della fluorescenza normalizzata rispetto alla temperatura (-dF / dT) contro Risultati temperatura è più semplice per visualizzare picchi di fusione e determinare genotipi. Una finestra di fusione completa (40 ° C-80 ° C) si tradurrà in entrambe le regioni ampliconi e sonda di fusione. La Figura 1 mostra un esempio di picchi di fusione normalizzati di entrambe le regioni. Impostazione della finestra di analisi ai soli risultati regione sonda in chiara differenziazione di picchi corrispondenti a specifici SNPs (Figura 2). Analisi basata-Probe mostra chiaramente la presenza di entrambi gli alleli come picchi individuali con temperature di fusione che hanno picchi SNP omozigoti (Figura 3). Figura 4 mostra che Progressivamente riducendo la temperatura di ricottura durante amplificazione (MAAB) risultato in un orientamento verso l&#39;allele mutante (picco lato sinistro) (Figura 4A), con conseguente aumento della sensibilità per l&#39;allele mutante in una popolazione di alleli misti (Figura 4B). <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/52839/52839fig1.jpg" /> Figura 1. sonda e amplicon fusione regioni. Plot la derivata negativa della fluorescenza normalizzato rispetto alla temperatura in un ampio risultati finestra di fusione sia sonda (temperatura bassa) e picchi amplicone di fusione che possono essere analizzati. (Tratto da Daniels et al DOI:. 10,1128 / AAC.05737-11) <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52839/52839fig1large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> Figura 2. sonda picchi di fusione. Partite perfette (tipicamente wild type alleli) provocare picchi di fusione più elevati (rosso), mentre l&#39;inadeguatezza SNP hanno temperature di fusione inferiori (grigio). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52839/52839fig2large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/52839/52839fig3.jpg" /> Figura 3. Polygenomic fusione picchi. Quando sono presenti in un campione entrambi gli alleli, analisi HRM sonda-based rappresenta entrambi gli alleli come le curve di due picchi (arancione), con picchi che corrispondono campioni singolo allele (rosso e grigio). (Tratto da Daniels et al DOI:. 10,1128 / AAC.05737-11) <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52839/52839fig3large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una grande v</a>ersione di questa figura. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/52839/52839fig4.jpg" /> Figura 4. Mutant allele amplificazione polarizzazione (MAAB). A. Abbassando progressivamente la temperatura di ricottura di amplificazione polarizza la reazione picco di fusione verso picco corrispondente mutante (temperatura inferiore) in un campione polygenomic o polyallelic. B. MAAB traduce in sensibilità HRM per rilevare alleli minori presenti a meno dell&#39;1% nei campioni polygenomic o polyallelic. (Parte B adattato da Daniels et al DOI:. 10,1128 / AAC.05737-11) <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52839/52839fig4large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> Tabella 1. Set-up di alta risoluzione reazioni di fusione di amplificazione della sonda-based. <table><tbody><tr><td> Componente </td><td> Volume per reazione (96 pozzetti e capillare) </td><td> Volume per reazione (384 pozzetti) </td><td> Concentrazione finale </td></tr><tr><td> HRM Master Mix </td><td> 4-5 microlitri </td><td> 2-2,5 ml </td><td> 1 x </td></tr><tr><td> 10 x eccesso di primer </td><td> 1 ml </td><td> 0,5 microlitri </td><td> 0.50 micron </td></tr><tr><td> 10 x Altro di primer </td><td> 1 ml </td><td> 0.5μl </td><td> 0,1 micron </td></tr><tr><td> 10x Probe </td><td> 1 ml </td><td> 0,5 microlitri </td><td> 0.40 micron </td></tr><tr><td> Acqua PCR-grade </td><td> 1-2 microlitri </td><td> 0,5-1 microlitri </td><td></td></tr><tr><td> DNA Template </td><td> 1 ml </td><td> 0,5 microlitri </td><td> 0,01-10 ng / ml </td></tr><tr><td></td><td> 10 microlitri </td><td> 5 ml </td><td></td></tr></tbody></table> Tabella 2. Standarad alta risoluzione delle condizioni di fusione di amplificazione d. <table><tbody><tr><td> Temperatura </td><td> Orario </td></tr><tr><td> Tenere </td><td> 95 ° C </td><td> 120 sec </td></tr><tr><td rowspan="2"> 45 cicli </td><td> 95 ° C </td><td> 30 sec </td></tr><tr><td> 68 ° C * </td><td> 30 sec </td></tr><tr><td rowspan="2"> 1 ciclo </td><td> 95 ° C </td><td> 30 sec </td></tr><tr><td> 28 ° C </td><td> 30 sec </td></tr></tbody></table> * Questa temperatura è amplicone-dipendente Tabella 3. Condizioni di amplificazione per mutante allele pregiudizi amplificazione. <table><tbody><tr><td> Temperatura </td><td> Orario </td><td> Cicli </td><td> Rampa </td><td> Modalità di acquisizione </td><td> Modalità di analisi </td></tr><tr><td> Denaturare </td><td> 95 ° C </td><td> 30 sec </td><td> 1 </td><td> 20 </td><td> Nessuna </td&gt; <td> Nessuna </td></tr><tr><td rowspan="2"> Ciclo </td><td> 95 ° C </td><td> 2 sec </td><td rowspan="2"> 55 </td><td> 20 </td><td> Nessuna </td><td rowspan="2"> Quantificazione </td></tr><tr><td> 56 ° C * </td><td> 15 sec </td><td> 20 </td><td> Unico </td></tr><tr><td rowspan="3"> Fusione </td><td> 40 ° C </td><td> 0 sec </td><td rowspan="3"></td><td rowspan="3"> 0.3 </td><td> Nessuna </td><td> Nessuna </td></tr><tr><td> 45 ° C * </td><td> 0 sec </td><td rowspan="2"> Continuo </td><td rowspan="2"> Fusione </td></tr><tr><td> 90 ° C * </td><td> 0 sec </td></tr></tbody></table> * Questa temperatura è amplicone-dipendente e si riduce quando si eseguono MAAB

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Methods to Increase the Sensitivity of High Resolution Melting Single Nucleotide Polymorphism Genotyping in Malaria

Mentre l&#39;analisi alta risoluzione fusione offre la capacità di distinguere tra polimorfismi a singolo nucleotide in una popolazione eterogenea, allele mutante pregiudizi amplificazione può aumentare la sua capacità di individuare alleli presenti a relativamente basse percentuali all&#39;interno di un campione. Questo protocollo descrive miglioramenti che migliorano la sensibilità dell&#39;analisi fusione alta risoluzione.

I metodi per aumentare la sensibilità di High Resolution Melting polimorfismo a singolo nucleotide genotipizzazione a malaria

Despite decades of eradication efforts, malaria remains a global burden. Recent renewed interest in regional elimination and global eradication has been ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

11.4K Views.  Harvard University.  Mentre l'analisi alta risoluzione fusione offre la capacità di distinguere tra polimorfismi a singolo nucleotide in una popolazione eterogenea, allele mutante pregiudizi amplificazione può aumentare la sua capacità di individuare alleli presenti a relativamente basse percentuali all'interno di un campione. Questo protocollo descrive miglioramenti che migliorano la sensibilità dell'analisi fusione alta risoluzione. 

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Protocol for Production of a Genetic Cross of the Rodent Malaria Parasites

Variation in response to antimalarial drugs and in pathogenicity of malaria parasites is of biologic and medical importance. Linkage mapping has led to successful identification of genes or loci underlying various traits in malaria parasites of rodents1-3 and humans4-6. The malaria parasite Plasmodium yoelii is one of many malaria species isolated from wild African rodents and has been adapted to grow in laboratories. This species reproduces many of the biologic characteristics of the human malaria parasites; genetic markers such as microsatellite and amplified fragment length polymorphism (AFLP) markers have also been developed for the parasite7-9. Thus, genetic studies in rodent malaria parasites can be performed to complement research on Plasmodium falciparum. Here, we demonstrate the techniques for producing a genetic cross in P. yoelii that were first pioneered by Drs. David Walliker, Richard Carter, and colleagues at the University of Edinburgh10.

Genetic crosses in P. yoelii and other rodent malaria parasites are conducted by infecting mice Mus musculus with an inoculum containing gametocytes of two genetically distinct clones that differ in phenotypes of interest and by allowing mosquitoes to feed on the infected mice 4 days after infection. The presence of male and female gametocytes in the mouse blood is microscopically confirmed before feeding. Within 48 hrs after feeding, in the midgut of the mosquito, the haploid gametocytes differentiate into male and female gametes, fertilize, and form a diploid zygote (Fig. 1). During development of a zygote into an ookinete, meiosis appears to occur11. If the zygote is derived through cross-fertilization between gametes of the two genetically distinct parasites, genetic exchanges (chromosomal reassortment and cross-overs between the non-sister chromatids of a pair of homologous chromosomes; Fig. 2) may occur, resulting in recombination of genetic material at homologous loci. Each zygote undergoes two successive nuclear divisions, leading to four haploid nuclei. An ookinete further develops into an oocyst. Once the oocyst matures, thousands of sporozoites (the progeny of the cross) are formed and released into mosquito hemoceal. Sporozoites are harvested from the salivary glands and injected into a new murine host, where pre-erythrocytic and erythrocytic stage development takes place. Erythrocytic forms are cloned and classified with regard to the characters distinguishing the parental lines prior to genetic linkage mapping. Control infections of individual parental clones are performed in the same way as the production of a genetic cross.

Genetic crosses of rodent malaria parasites are performed by feeding two genetically distinct parasites to mosquitoes. Recombinant progeny are cloned from mouse blood after allowing mosquitoes to bite infected mice. This video shows how to produce genetic crosses of Plasmodium yoelii and is applicable to other rodent malaria parasites.

Protocollo per la produzione di un incrocio fra i roditori parassiti della malaria

Variation in response to antimalarial drugs and in pathogenicity of malaria parasites is of biologic and medical importance. Linkage mapping has led to ...

Ricerca

Immunologia e infezioni

Two Methods of Heterokaryon Formation to Discover HCV Restriction Factors

Hepatitis C virus (HCV) is a hepatotropic virus with a host-range restricted to humans and chimpanzees. Although HCV RNA replication has been observed in human non-hepatic and murine cell lines, the efficiency was very low and required long-term selection procedures using HCV replicon constructs expressing dominant antibiotic-selectable markers1-5. HCV in vitro research is therefore limited to human hepatoma cell lines permissive for virus entry and completion of the viral life cycle. Due to HCVs narrow species tropism, there is no immunocompetent small animal model available that sustains the complete HCV replication cycle 6-8. Inefficient replication of HCV in non-human cells e.g. of mouse origin is likely due to lack of genetic incompatibility of essential host dependency factors and/or expression of restriction factors.
We investigated whether HCV propagation is suppressed by dominant restriction factors in either human cell lines derived from non-hepatic tissues or in mouse liver cell lines. To this end, we developed two independent conditional trans-complementation methods relying on somatic cell fusion. In both cases, completion of the viral replication cycle is only possible in the heterokaryons. Consequently, successful trans-complementation, which is determined by measuring de novo production of infectious viral progeny, indicates absence of dominant restrictions.
Specifically, subgenomic HCV replicons carrying a luciferase transgene were transfected into highly permissive human hepatoma cells (Huh-7.5 cells). Subsequently, these cells were co-cultured and fused to various human and murine cells expressing HCV structural proteins core, envelope 1 and 2 (E1, E2) and accessory proteins p7 and NS2. Provided that cell fusion was initiated by treatment with polyethylene-glycol (PEG), the culture released infectious viral particles which infected na&iuml;ve cells in a receptor-dependent fashion.
To assess the influence of dominant restrictions on the complete viral life cycle including cell entry, RNA translation, replication and virus assembly, we took advantage of a human liver cell line (Huh-7 Lunet N cells 9) which lacks endogenous expression of CD81, an essential entry factor of HCV. In the absence of ectopically expressed CD81, these cells are essentially refractory to HCV infection 10 . Importantly, when co-cultured and fused with cells that express human CD81 but lack at least another crucial cell entry factor (i.e. SR-BI, CLDN1, OCLN), only the resulting heterokaryons display the complete set of HCV entry factors requisite for infection. Therefore, to analyze if dominant restriction factors suppress completion of the HCV replication cycle, we fused Lunet N cells with various cells from human and mouse origin which fulfill the above mentioned criteria. When co-cultured cells were transfected with a highly fusogenic viral envelope protein mutant of the prototype foamy virus (PFV11) and subsequently challenged with infectious HCV particles (HCVcc), de novo production of infectious virus was observed. This indicates that HCV successfully completed its replication cycle in heterokaryons thus ruling out expression of dominant restriction factors in these cell lines. These novel conditional trans-complementation methods will be useful to screen a large panel of cell lines and primary cells for expression of HCV-specific dominant restriction factors.

We describe two methods for conditional trans-complementation of hepatitis C virus (HCV) assembly and the completion of the full viral life cycle, which rely on heterokaryon formation. These techniques are suitable to screen for cell lines that express dominant restriction factors, which preclude production of infectious HCV progeny.

Due metodi di Formazione Heterokaryon per scoprire fattori di restrizione HCV

Hepatitis C virus (HCV) is a hepatotropic virus with a host-range restricted to humans and chimpanzees. Although HCV RNA replication has been observed in ...

2D and 3D Chromosome Painting in Malaria Mosquitoes

Fluorescent in situ hybridization (FISH) of whole arm chromosome probes is a robust technique for mapping genomic regions of interest, detecting chromosomal rearrangements, and studying three-dimensional (3D) organization of chromosomes in the cell nucleus. The advent of laser capture microdissection (LCM) and whole genome amplification (WGA) allows obtaining large quantities of DNA from single cells. The increased sensitivity of WGA kits prompted us to develop chromosome paints and to use them for exploring chromosome organization and evolution in non-model organisms. Here, we present a simple method for isolating and amplifying the euchromatic segments of single polytene chromosome arms from ovarian nurse cells of the African malaria mosquito Anopheles gambiae. This procedure provides an efficient platform for obtaining chromosome paints, while reducing the overall risk of introducing foreign DNA to the sample. The use of WGA allows for several rounds of re-amplification, resulting in high quantities of DNA that can be utilized for multiple experiments, including 2D and 3D FISH. We demonstrated that the developed chromosome paints can be successfully used to establish the correspondence between euchromatic portions of polytene and mitotic chromosome arms in An. gambiae. Overall, the union of LCM and single-chromosome WGA provides an efficient tool for creating significant amounts of target DNA for future cytogenetic and genomic studies.

Chromosome painting is a useful method for studying organization of the cell nucleus and evolution of the karyotype. Here, we demonstrate an approach to isolate and amplify specific regions of interest from single polytene chromosomes that are subsequently used for two- and three-dimensional fluorescent in situ hybridization (FISH).

Pittura cromosoma 2D e 3D nelle zanzare della malaria

Fluorescent in situ hybridization (FISH) of whole arm chromosome probes is a robust technique for mapping genomic regions of interest, detecting ...

Establishment and Optimization of a High Throughput Setup to Study Staphylococcus epidermidis and Mycobacterium marinum Infection as a Model for Drug Discovery

Zebrafish are becoming a valuable tool in the preclinical phase of drug discovery screenings as a whole animal model with high throughput screening possibilities. They can be used to bridge the gap between cell based assays at earlier stages and in vivo validation in mammalian models, reducing, in this way, the number of compounds passing through to testing on the much more expensive rodent models. In this light, in the present manuscript is described a new high throughput pipeline using zebrafish as in vivo model system for the study of Staphylococcus epidermidis and Mycobacterium marinum infection. This setup allows the generation and analysis of large number of synchronous embryos homogenously infected. Moreover the flexibility of the pipeline allows the user to easily implement other platforms to improve the resolution of the analysis when needed. The combination of the zebrafish together with innovative high throughput technologies opens the field of drug testing and discovery to new possibilities not only because of the strength of using a whole animal model but also because of the large number of transgenic lines available that can be used to decipher the mode of action of new compounds.

Establishment and Optimization of a High Throughput Setup to Study Staphylococcus epidermidis and Mycobacterium marinum Infection as a Model for Drug Discovery

This video article describes the high throughput pipeline that has been successfully established to infect and analyze large numbers of zebrafish embryos providing a new powerful tool for compound testing and drug discovery using a whole animal vertebrate organism.

Istituzione e Ottimizzazione di un programma di installazione High Throughput per studiare<em&gt; Staphylococcus epidermidis</em&gt; E<em&gt; Mycobacterium marinum</em&gt; Infezione come modello per Drug Discovery

Zebrafish are becoming a valuable tool in the preclinical phase of drug discovery screenings as a whole animal model with high throughput screening ...

Using the Overlay Assay to Qualitatively Measure Bacterial Production of and Sensitivity to Pneumococcal Bacteriocins

Streptococcus pneumoniae colonizes the highly diverse polymicrobial community of the nasopharynx where it must compete with resident organisms. We have shown that bacterially produced antimicrobial peptides (bacteriocins) dictate the outcome of these competitive interactions. All fully-sequenced pneumococcal strains harbor a bacteriocin-like peptide (blp) locus. The blp locus encodes for a range of diverse bacteriocins and all of the highly conserved components needed for their regulation, processing, and secretion. The diversity of the bacteriocins found in the bacteriocin immunity region (BIR) of the locus is a major contributor of pneumococcal competition. Along with the bacteriocins, immunity genes are found in the BIR and are needed to protect the producer cell from the effects of its own bacteriocin. The overlay assay is a quick method for examining a large number of strains for competitive interactions mediated by bacteriocins. The overlay assay also allows for the characterization of bacteriocin-specific immunity, and detection of secreted quorum sensing peptides. The assay is performed by pre-inoculating an agar plate with a strain to be tested for bacteriocin production followed by application of a soft agar overlay containing a strain to be tested for bacteriocin sensitivity. A zone of clearance surrounding the stab indicates that the overlay strain is sensitive to the bacteriocins produced by the pre-inoculated strain. If no zone of clearance is observed, either the overlay strain is immune to the bacteriocins being produced or the pre-inoculated strain does not produce bacteriocins. To determine if the blp locus is functional in a given strain, the overlay assay can be adapted to evaluate for peptide pheromone secretion by the pre-inoculated strain. In this case, a series of four lacZ-reporter strains with different pheromone specificity are used in the overlay.

Competition in Streptococcus pneumoniae is mediated by bacteriocins, small antimicrobial peptides with inhibitory activity towards pneumococcus and other related species.&#160; Here we describe an optimized bacterial overlay assay that allows for the characterization of bacteriocin activity and inhibitory spectrum, bacteriocin-specific immunity, and detection of secreted quorum sensing peptides.

Utilizzando il Overlay saggio misurare Qualitativamente produzione batterica di sensibilità e di pneumococcico batteriocine

Streptococcus pneumoniae colonizes the highly diverse polymicrobial community of the nasopharynx where it must compete with resident organisms.  We have ...

High Resolution Electron Microscopy of the Helicobacter pylori Cag Type IV Secretion System Pili Produced in Varying Conditions of Iron Availability

Helicobacter pylori is a helical-shaped, gram negative bacterium that colonizes the human gastric niche of half of the human population1,2. H. pylori is the primary cause of gastric cancer, the second leading cause of cancer-related deaths worldwide3. One virulence factor that has been associated with increased risk of gastric disease is the Cag-pathogenicity island, a 40-kb region within the chromosome of H. pylori that encodes a type IV secretion system and the cognate effector molecule, CagA4,5. The Cag-T4SS is responsible for translocating CagA and peptidoglycan into host epithelial cells5,6. The activity of the Cag-T4SS results in numerous changes in host cell biology including upregulation of cytokine expression, activation of proinflammatory pathways, cytoskeletal remodeling, and induction of oncogenic cell-signaling networks5-8. The Cag-T4SS is a macromolecular machine comprised of sub-assembly components spanning the inner and outer membrane and extending outward from the cell into the extracellular space. The extracellular portion of the Cag-T4SS is referred to as the &#8220;pilus&#8221;5. Numerous studies have demonstrated that the Cag-T4SS pili are formed at the host-pathogen interface9,10. However, the environmental features that regulate the biogenesis of this important organelle remain largely obscure. Recently, we reported that conditions of low iron availability increased the Cag-T4SS activity and pilus biogenesis. Here we present an optimized protocol to grow H. pylori in varying conditions of iron availability prior to co-culture with human gastric epithelial cells. Further, we present the comprehensive protocol for visualization of the hyper-piliated phenotype exhibited in iron restricted conditions by high resolution scanning electron microscopy analyses.

High Resolution Electron Microscopy of the Helicobacter pylori Cag Type IV Secretion System Pili Produced in Varying Conditions of Iron Availability

Here we describe a method to visualize the oncogenic bacterial organelle known as the Cag Type IV Secretion System (Cag-T4SS). We find that the Cag-T4SS is differentially produced on the surface of H. pylori in response to varying conditions of iron availability.

Ad alta risoluzione microscopia elettronica del<em&gt; Helicobacter pylori</em&gt; Cag secrezione di tipo IV Sistema Pili Prodotto in diverse condizioni di Ferro Disponibilità

Helicobacter pylori is a helical-shaped, gram negative bacterium that colonizes the human gastric niche of half of the human population1,2.  H. pylori is ...

An In Vitro Model for Measuring Immune Responses to Malaria in the Context of HIV Co-infection

Malaria and HIV co-infection is a growing health priority. However, most research on malaria or HIV currently focuses on each infection individually. Although understanding the disease dynamics for each of these pathogens independently is vital, it is also important that the interactions between these pathogens are investigated and understood. 
We have developed a versatile in vitro model of HIV-malaria co-infection to study host immune responses to malaria in the context of HIV infection. Our model allows the study of secreted factors in cellular supernatants, cell surface and intracellular protein markers, as well as RNA expression levels. The experimental design and methods used limit variability and promote data reliability and reproducibility. 
All pathogens used in this model are natural human pathogens (Plasmodium falciparum and HIV-1), and all infected cells are naturally infected and used fresh. We use human erythrocytes parasitized with P. falciparum and maintained in continuous in vitro culture. We obtain freshly isolated peripheral blood mononuclear cells from chronically HIV-infected volunteers. Every condition used has an appropriate control (P. falciparum parasitized vs. normal erythrocytes), and every HIV-infected donor has an HIV uninfected control, from which cells are harvested on the same day. This model provides a realistic environment to study the interactions between malaria parasites and human immune cells in the context of HIV infection.

An In Vitro Model for Measuring Immune Responses to Malaria in the Context of HIV Co-infection

Human co-infection is difficult to replicate in vitro. However, human malaria parasites can readily be cultured in vitro, as can freshly isolated human peripheral blood mononuclear cells naturally infected with HIV. This provides an excellent model for studying early immune responses to malaria parasites in the context of HIV co-infection.

Un<em&gt; In Vitro</em&gt; Modello per la misurazione Risposte immunitarie Malaria nel contesto della coinfezione da HIV

Malaria and HIV co-infection is a growing health priority. However, most research on malaria or HIV currently focuses on each infection individually. ...

Methods to Inhibit Bacterial Pyomelanin Production and Determine the Corresponding Increase in Sensitivity to Oxidative Stress

Pyomelanin is an extracellular red-brown pigment produced by several bacterial and fungal species. This pigment is derived from the tyrosine catabolism pathway and contributes to increased oxidative stress resistance. Pyomelanin production in Pseudomonas aeruginosa is reduced in a dose dependent manner through treatment with 2-[2-nitro-4-(trifluoromethyl)benzoyl]-1,3-cyclohexanedione (NTBC). We describe a titration method using multiple concentrations of NTBC to determine the concentration of drug that will reduce or abolish pyomelanin production in bacteria. The titration method has an easily quantifiable outcome, a visible reduction in pigment production with increasing drug concentrations. We also describe a microtiter plate method to assay antibiotic minimum inhibitory concentration (MIC) in bacteria. This method uses a minimum of resources and can easily be scaled up to test multiple antibiotics in one microtiter plate for one strain of bacteria. The MIC assay can be adapted to test the affects of non-antibiotic compounds on bacterial growth at specific concentrations. Finally, we describe a method for testing bacterial sensitivity to oxidative stress by incorporating H2O2 into agar plates and spotting multiple dilutions of bacteria onto the plates. Sensitivity to oxidative stress is indicated by reductions in colony number and size for the different dilutions on plates containing H2O2 compared to a no H2O2 control. The oxidative stress spot plate assay uses a minimum of resources and low concentrations of H2O2. Importantly, it also has good reproducibility. This spot plate assay could be adapted to test bacterial sensitivity to various compounds by incorporating the compounds in agar plates and characterizing the resulting bacterial growth.

Bacterial pyomelanin production results in increased resistance to oxidative stress and virulence. We report on techniques that can be used to determine inhibition of pyomelanin production and assay the resulting increase in sensitivity to oxidative stress in bacteria, as well as determine antibiotic minimum inhibitory concentration (MIC).

Metodi Per inibire batterica Pyomelanin produzione e determinare il corrispondente aumento di sensibilità allo stress ossidativo

Pyomelanin is an extracellular red-brown pigment produced by several bacterial and fungal species. This pigment is derived from the tyrosine catabolism ...

Neutrophil Isolation and Analysis to Determine their Role in Lymphoma Cell Sensitivity to Therapeutic Agents

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of inflammation. They are key players in the innate immune system and play major roles in cancer biology. Neutrophils have been proposed as key mediators of malignant transformation, tumor progression, angiogenesis and in the modulation of the antitumor immunity; through their release of soluble factors or their interaction with tumor cells. To characterize the specific functions of neutrophils, a fast and reliable method is coveted for in vitro isolation of neutrophils from human blood. Here, a density gradient separation method is demonstrated to isolate neutrophils as well as mononuclear cells from the blood. The procedure consists of layering the density gradient solution such as Ficoll carefully above the diluted blood obtained from patients diagnosed with chronic lymphocytic leukemia (CLL), followed by centrifugation, isolation of mononuclear layer, separation of neutrophils from RBCsby dextran then lysis of residual erythrocytes. This method has been shown to isolate neutrophils &#8805; 90 % pure. To mimic the tumor microenvironment, 3-dimensional (3D) experiments were performed using basement membrane matrix such as Matrigel. Given the short half-life of neutrophils in vitro, 3D experiments with fresh human neutrophils cannot be performed. For this reason promyelocytic HL60 cells are differentiated along the granulocytic pathway using the differentiation inducers dimethyl sulfoxide (DMSO) and retinoic acid (RA). The aim of our experiments is to study the role of neutrophils on the sensitivity of lymphoma cells to anti-lymphoma agents. However these methods can be generalized to study the interactions of neutrophils or neutrophil-like cells with a large range of cell types in different situations.

Neutrophils are the most abundant type of white blood cells. The isolation of neutrophils from human blood by density gradient separation method and the differentiation of human promyelocytic (HL60) cells along the granulocytic pathway are described here; to test their role on sensitivity of lymphoma cells to anti-lymphoma agents.

Neutrofili Isolamento e analisi per determinare il loro ruolo nel linfoma a cellule sensibilità agli agenti terapeutici

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of ...

A RAPID Method for Blood Processing to Increase the Yield of Plasma Peptide Levels in Human Blood

Research in the field of food intake regulation is gaining importance. This often includes the measurement of peptides regulating food intake. For the correct determination of a peptide&#39;s concentration, it should be stable during blood processing. However, this is not the case for several peptides which are quickly degraded by endogenous peptidases. Recently, we developed a blood processing method employing Reduced temperatures, Acidification, Protease inhibition, Isotopic exogenous controls and Dilution (RAPID) for the use in rats. Here, we have established this technique for the use in humans and investigated recovery, molecular form and circulating concentration of food intake regulatory hormones. The RAPID method significantly improved the recovery for 125I-labeled somatostatin-28 (+39%), glucagon-like peptide-1 (+35%), acyl ghrelin and glucagon (+32%), insulin and kisspeptin (+29%), nesfatin-1 (+28%), leptin (+21%) and peptide YY3-36 (+19%) compared to standard processing (EDTA blood on ice, p&#160;&#60;0.001). High performance liquid chromatography showed the elution of endogenous acyl ghrelin at the expected position after RAPID processing, while after standard processing 62% of acyl ghrelin were degraded resulting in an earlier peak likely representing desacyl ghrelin. After RAPID processing the acyl/desacyl ghrelin ratio in blood of normal weight subjects was 1:3 compared to 1:23 following standard processing (p&#160;= 0.03). Also endogenous kisspeptin levels were higher after RAPID compared to standard processing (+99%, p&#160;= 0.02). The RAPID blood processing method can be used in humans, yields higher peptide levels and allows for assessment of the correct molecular form.

The RAPID blood processing method can be used in humans and yields higher peptide levels as well as allows for assessment of the correct molecular form. Therefore, this method will be a valuable tool in peptide research.

Un metodo rapido per la lavorazione del sangue per aumentare la resa dei livelli plasmatici del peptide nel sangue umano

Research in the field of food intake regulation is gaining importance. This often includes the measurement of peptides regulating food intake. For the ...