The authors would like to thank David Gray from the Dundee Drug discovery unit for kindly donating firefly luciferase inhibitory compounds DDD00001434, DDD0001477, DDD00000635 and DDD00023047; Tibor Harkani (Medical University of Vienna) for the suggestion of oxaloacetate as a test compound; and Charlie Dear (University of Aberdeen) for illustrations. This work was funded by a BBSRC Pathfinder award (BB/FOF/PF/4/11) and the University of Aberdeen.

NOTA: Eseguire tutte le operazioni in condizioni sterili (armadio flusso laminare) e con materiali pre-sterilizzati in autoclave (126 ° C, 11 min). Una piastra LB con striato fuori E. coli OP50 conservato a 4 ° C è necessaria, striscia fuori su piatti LB freschi e restreak ogni mese. 1. batterica alimentare (Escherichia coli OP50) Preparazione <ol><li> Giorno 1. Inoculare 2 x 5 ml LB in due bottiglie universali con una singola colonia di E. coli OP50 e posto a scuotere incubatore a 37 ° C (220 rpm) per 8 ore. </li><li> Dopo 8 ore di incubazione, utilizzare 2 ml di E. coli OP50 LB cultura a inoculare ciascuna di 3 x 200 ml LB. Luogo palloni in scuotendo incubatore (220 rpm) O / N (17 ore) a 37 ° C. </li><li> Pesare 20 x 50 ml provette da centrifuga e scrivere peso sul tubo. </li><li> Giorno 2. Utilizzando una pipetta sierologica, un&#39;aliquota 30 ml di O / N E. cultura coli OP50 in pre pesava provette. Centrifugare a 7.741 xg, 10 ° C, 8 min. </li><li> Decantare attentamente il supernatante, mantenere la provetta capovolta con coperchio e lasciare riposare per qualche minuto. Usando una pipetta, rimuovere tutto il supernatante eccesso che possono essere raccolti nel coperchio. Pesare il tubo e calcolare il peso del pellet. </li><li> Calcolare il volume necessario per fornire una sospensione di 30 g / L e marcare questo volume sul tubo. Tubi Data, etichette e posto a -20 ° C per l&#39;uso entro 1-3 mesi a - 80 ° C, se la conservazione per più di 3 mesi. </li><li> Preparare sospensione batterica per la coltivazione di nematodi; consentire pellet batterico per scongelare e aggiungere volume richiesto di S mezzo completo 11,12 a ciascuna provetta, vortex delicatamente per risospendere pellet, contenuti piscina di tubi diversi per ottenere il volume richiesto. Lavorare in condizioni di sterilità. </li></ol> 2. Preparazione degli standard di droga in un formato piastra a 96 pozzetti NOTA: Se si utilizza una libreria di droga, le piastre di droga sono forniti a un singoloconcentrazione del composto in DMSO. Screening primario proverà composti ad un&#39;unica concentrazione. Seguire le istruzioni per la preparazione del piatto di droga per il test composto di conferma in una serie di operazioni di concentrazione tra 0-160 micron, selezionati dopo la significatività statistica a 10 micron. I passaggi riportati di seguito possono essere adattati per testare altre concentrazioni. ATTENZIONE! Seguire le necessarie precauzioni per la manipolazione farmaci (generalmente Maschera per il viso, occhiali di sicurezza, guanti sono obbligatori). <ol><li> Preparare piatto farmaco con standard per lo screening di conferma lavoro: pesare la quantità necessaria di composto in provette sterili 1,7 ml microcentrifuga e preparare composti 16 mM in DMSO (cioè, 100x concentrata rispetto alla concentrazione superiore desiderata per l&#39;esposizione). </li><li> In serie diluire 16 magazzino mm 1: 2 in DMSO per ottenere 8, 4, 2, 1, 0.5 e standard di 0,25 mm (condizioni sterili). Questi sono concentrate 100x e saranno diluiti fino a concentrazioni finali di 0 (solo veicolo),2.5, 5, 10, 20, 40, 80 e 160 mM (in 1% DMSO) durante l&#39;esposizione al farmaco. </li><li> In una cappa a flusso laminare, posizionare 20-50 ml per pozzetto di standard composti all&#39;interno di una colonna di una piastra a 96 pozzetti, per esempio la posizione piastra A1: 16 mM, B1: 8 mM, C1: 4 mM, D1: 2 mM, E1: 1 mm, F1:, 0,5 mM G1: droga 0,25 mm e H1: DMSO. Utilizzare diverse colonne per la serie di diluizione di diversi farmaci. </li><li> Veicolo Aliquotare dei pozzetti di colonna 12 nella piastra di droga. NOTA: Ciò faciliterà test di controllo del veicolo giù colonne Oltre ai test lungo fila H, assicurando tale veicolo è testato in posizioni rappresentativi dell&#39;intera piastra. NOTA: Ogni piatto droga per lo screening di conferma detiene serie di diluizioni per un massimo di 11 farmaci diversi da testare più il controllo del veicolo. </li><li> Etichetta e lamina di tenuta, coprire con pellicola e posto a -20 ° C fino al momento. </li></ol> 3. Esperimenti nematodi NOTA: Eseguire tutte le fasi under condizioni di sterilità, in modo asettico e con pre sterilizzati materiali e reagenti. Mantenere C. elegans Ceppi sistematicamente su piastre NGM con E. coli OP50. 12 tempi suggeriti per le diverse fasi di protocollo sono forniti nella tabella 1. <ol><li> Giorno 1 compito: istituito coltura liquida di ceppo biosensore per la successiva sincronizzazione. <ol><li> Raccogliere nematodi da una piastra NGM 6 centimetri (con un sacco di giovani larve dove il cibo è appena esaurito) in 2 ml S completa e trasferimento a pallone con 30 g / L E. coli OP50 in S completa (volume totale 30 ml in un pallone di vetro della capacità di 250 ml conica). Incubare 3 giorni a 20 ° C, 160 rpm. </li></ol></li><li> Giorno 4 compito (consentire circa 30-35 min): cultura candeggina per raccogliere uova e sincronizzare popolazione verme. Effettuare tutte le fasi di centrifugazione per 1 minuto, 600 x g. <ol><li> Preparare la soluzione di candeggina al momento dell&#39;uso: per ogni 16 ml di 0,156 M KOH / NaOH aggiungere 4 ml di candeggina. </li><li> Versare 2 x 14 mlcultura verme in 15 tubi centrifugazione coniche ml. Lasciare worm di stabilirsi per gravità (3 min). Rimuovere e gettare liquidi nematodi sopra stabiliti. Aggiungere 5 ml di soluzione di candeggina per ogni provetta e avviare il timer. Combina i volumi in un tubo. </li><li> Capovolgere il tubo delicatamente per 2 minuti, controllare sotto stereoscope per la rottura di vermi e il rilascio di uova in sospensione. Quando più uova vengono rilasciati o in un tempo massimo di 2 min in soluzione di candeggina, centrifuga. </li><li> Rimuovere con attenzione il surnatante. Lavare 1x pellet con 14 ml S completo e centrifugare. </li><li> Gettare il surnatante, aggiungere soluzione di candeggina 10 ml e avviare il timer (questa seconda fase candeggina assicura che la maggior parte delle carcasse vite senza fine si disintegrano e non più sono visti sotto stereoscope). Dopo un tempo massimo in soluzione di candeggina di 2 min, centrifuga. </li><li> Lavare pellet 3x in S completo, decantare delicatamente surnatante e risospendere pellet in 14 ml S completi dopo ogni centrifugazione. Dopo il lavaggio finale, risospendere pellet uovo in 14 ml S complete. </li><li> Trasferire il volume di un pallone di vetro conica. Incubare 18-24 ore a 20 ° C, 160 rpm. NOTA: Raccolto uova si schiudono O / N e arrestano lo sviluppo al primo stadio larvale (L1) a causa della mancanza di cibo, di conseguenza, essi saranno tutti nella stessa fase della crescita. </li></ol></li><li> Giorno 5 compito: istituito culture verme sincronizzati per le prove di droga. NOTA: Worms sospese nel medio fame tendono ad aderire alle superfici plastiche idrofobe quali puntali per pipette e tubi. 0,01% di Tween-20 è un tensioattivo utilizzato qui per renderizzare superfici plastiche più idrofilo e consentire una maggiore accuratezza nel conteggio (0,01% Triton-X100 può anche essere usato). Quando nematodi sono nel mezzo INTEGRATO batterica, che non tendono ad aderire alla plastica. <ol><li> Determinare il numero di L1 tratteggiate di nel pallone, tenere pallone su piattaforma (160 rpm) agitando. <ol><li> Prendere 3x 100 campioni microlitri dalla boccetta (utilizzare una punta pulita ogni volta) in 1,7 ml microprovette separati con 900 ml di liquido medium 0,01% Tween-20. NOTA: Aspire 100 campione microlitri nella punta pulita solo una volta. Poi, quando l&#39;erogazione, pipetta su e giù un paio di volte nel mezzo interpolazione integrato per rilasciare eventuali worm che aderiscono alla punta. </li><li> Contare i nematodi a 4x 10 gocce microlitri da ogni provetta di diluizione triplicato. Calcolare il valore medio e stimare il numero di vermi presenti nel pallone vetro conico. </li></ol></li><li> Calcolare il volume della sospensione nematode covato richiesto per costituire una cultura 2 x 20 ml con 10 nematodi a 10 ml. Aumentare il volume calcolato del 10% per tenere conto di alcuni conseguente perdita nematode durante le fasi di centrifugazione. </li><li> Volume di decantare richiesto in 2 x 15 ml tubi centrifugazione (pre-pesato). Pesare i tubi per ottenere volume effettivo erogato, vortice delicatamente e regolare di indirizzare il volume, rimuovendo il volume in eccesso con una pipetta da 5 ml (solo la punta sterile deve entrare il tubo). </li><li> Portare il volume a 14 ml con S freschi complete per statoh nematodi. Centrifugare (1 min, 600 g). Rimuovere e scartare il surnatante con attenzione a non disturbare il pellet nematode. </li><li> Aggiungere 5 ml di S completo di 30 g / L E. coli OP50 ai nematodi pellet. Trasferire i 5 ml in ciascuna provetta in un pallone di vetro conica contenente 15 ml S completi di 30 g / L E. coli OP50. Annotare nematodi tempo sono stati forniti con il cibo. </li><li> Agitare delicatamente pallone (160 giri al minuto), prendere 9 x 10 gocce microlitri su vetrini microscopici (utilizzano punte fresche ogni volta) per contare nematodi e confermare medio di circa 10 (± 2) ogni 10 ml. </li><li> Mettere fiaschi nematode a scuotere incubatore a 20 ° C, 160 rpm per 42-44 ore. </li></ol></li><li> Giorno 7 compito: trasferimento di nematodi a 96 pozzetti e avviare l&#39;esposizione al farmaco. <ol><li> Unire le culture nematodi in un unico pallone, tenere vorticoso fiasco delicatamente e mettere 3 x 4 ml di coltura nematode in 60 ml trogolo sterile. Mettere depressione su una piattaforma di scuotimento (160 rpm). </li><li> Utilizzare 8 channel pipetta di aliquota 25 microlitri nematodi sospese per pozzetto di 96 micropiastre bene neri con fondo trasparente piatta (per l&#39;adozione di entrambe le letture di luminescenza e fluorescenza, o placche bianche per luminescenza solo). Coprire con il coperchio piatto e mettere da parte. <ol><li> Dopo messa a punto di ogni 2 piastre, posizionare un altro 2 x 2,5 ml nematodi in depressione per sostituire volume perso (tenere un &#39;volume morto&#39; in depressione di circa 7 ml). </li><li> Istituito 13/14 piatti con nematodi. 11 piastre nematodi saranno tenuti a testare due piastre di droga a 96 pozzetti. La piastra nematode 12 th verrà caricata esclusivamente con veicolo come controllo. La piastra di 13 ° sarà utilizzato per stabilire fluorescenza di fondo il giorno 8 (vedi sotto). Una piastra supplementare può essere preparata per l&#39;uso si dovessero verificare errori durante set up. </li></ol></li><li> Aliquota 74 ml di S completi per ogni piatto bene e posto in una camera umida (vedere l&#39;elenco dei materiali) in un incubatore tremante (20 ° C, 160 giri al minuto) untIl pronto a composti in esame aliquota al momento dello sviluppo prescelto (ad esempio, 45 hr 30 min dopo cibo disponibile). [Volume per pozzo è ora 99 microlitri]. </li><li> Scongelare piatto droga (s) di prova. </li><li> Utilizzare pipetta multicanale per impostare piastre di nematodi con la droga, cambiando punte ogni volta. Lasciare 5 min per 96 pozzetti per aliquotando droga. <ol><li> Prendere 1 ml dal 1 ° colonna della piastra di droga e aggiungere alle colonne 1-5 di un piatto contenente nematodi; ripetere da 2 colonne ° nella piastra di droga in colonne 8-12 del piatto contenente nematodi. Aggiungere 1 ml di veicolo per colonne 6 e 7 della piastra nematode. NOTA: Il volume totale per pozzetto nella piastra nematode sarà 100 microlitri conseguente diluizione 1: 100 di composto / veicolo. </li><li> Ripetere processo aggiungendo 1 ml di / 4 esima colonna 3 ° della piastra farmaco per colonne 1-5 / 8-12 della seconda piastra nematode; aggiungere veicolo colonne 6 e 7 della piastra nematode.</li><li> Continuare a testare colonne a piatti droga rimanenti. Impostare un minimo di un piatto nematodi con veicolo in tutti i pozzetti campionando dalla colonna 12 della piastra di droga. Luogo piastre posteriori in camere umide scuotendo incubatore (20 ° C, 160 rpm) per 20-22 ore (vedere nota per il giorno 8). </li></ol></li><li> Part-preparare il buffer luminescenza per giorno seguente: aggiungere DMSO e il 10% Triton-X-100 al volume richiesto di S completa per ottenere 1% DMSO e 0,15% Triton X-100. Lasciare 5 ml per piastra di lettura per luminescenza, oltre a 1 ml per adescamento luminometro iniettore. </li></ol></li><li> Giorno 8 compito: Leggi endpoint sperimentali - fluorescenza e bioluminescenza. (Letture di fluorescenza GFP sono raccomandati come un mezzo per normalizzare i dati bioluminescenza.) NOTA: Obiettivo di leggere gli endpoint per 66-67 ore dopo cibo fornito ai nematodi, al fine di evitare che una significativa produzione di progenie nelle condizioni sperimentali descritte. <ol><li> Impostare piatto da utilizzare come sfondo per le letture di controllo GFP. Combine così contenuti da 13 piastra in una provetta da 15 ml. Lasciare nematodi a stabilirsi (2-3 minuti). Utilizzare il surnatante per caricare una micropiastra (nera con fondo trasparente) con 100 ml sospensione batterica per bene. <ol><li> Osservare piastra di controllo sfondo al microscopio annotare i pozzi dove nematodi possono essere visti. Escludere queste dalla stima sfondo utilizzato nella successiva analisi dei dati. </li></ol></li><li> Leggi di fluorescenza di ogni piastra a 96 pozzetti, compreso il controllo di sfondo. (Impostazioni: ottica di fondo del piatto, filtri di eccitazione 485/20; 528/20 emissione). </li><li> Preparare buffer per le letture di luminescenza: aggiungere luciferina (20 mm) al part-preparati tampone (dal giorno precedente), per ottenere buffer di luminescenza con 1% DMSO (1x), Triton-X100 (3x) e 0,3 luciferina mM 0,15% (3x ). Prime luminometro iniettore 6x con 150 microlitri di buffer luminescenza. <ol><li> Passo precedente si assume 1% DMSO come veicolo durante l&#39;esposizione al farmaco. Quando il veicolo è l&#39;acqua, regolare la concentration di DMSO in tampone luminescenza al 3% (cioè, 3x). </li></ol></li><li> Lavorare con una piastra alla volta. Dispensare 50 microlitri di buffer luminescenza per pozzetto. (150 ml di volume finale di bene, la diluizione 3x di tampone luminescenza: 1% DMSO, 0,05% Triton-X100 e 0,1 mm luciferina concentrazioni finali.) Luogo immediatamente a scuotere piattaforma e avviare il timer. <ol><li> Dopo 3 minuti a piattaforma (160 rpm) tremante, leggere luminescenza (1 sec per misura). </li></ol></li></ol></li></ol> Analisi 4. I dati <ol><li> Sottrarre fondo media GFP leggere dai risultati di fluorescenza. Dividere bioluminescenza da rispettivi lettura GFP. <ol><li> Quando viene rilevato un valore elevato per GFP nematodi esposti ad un composto, misurare la fluorescenza del composto sul proprio per tenere conto di alcuna fluorescenza composto. Se superiore alla media, utilizzare questo come sfondo invece. </li></ol></li><li> Bioluminescenza Express, GFP normalizzata bioluminescenza unnd Dati GFP fluorescenza come percentuale del valore medio per il controllo del veicolo in ciascuna piastra. </li><li> Tracciare valori medi e barre di errore per ogni concentrazione. </li><li> Test per la significatività statistica utilizzando 2-analisi della varianza (ANOVA) con effetti di &#39;Concentrazione&#39;, &#39;Experiment&#39; e la loro interazione (ogni punto i dati si riferiscono a un singolo bene), e utilizzare il test di Dunnett come test post-hoc (vs . controllo del veicolo). NOTA: se l &#39;&quot;esperimento&quot; o termini &quot;interazione&quot; sono significative, ulteriori esperimenti possono essere richiesti per confermare la risposta. Qualora non la variabilità tra esperimenti emerge dall&#39;osservazione di trame di dati, un One-way ANOVA può essere eseguita su dati raccolti da esperimenti indipendenti. <ol><li> Per l&#39;analisi statistica della piastra (s) con un solo veicolo, selezionare tutti i pozzetti nelle colonne 6 -7 e tutti i pozzetti, fila H come gruppo di controllo (queste sono le posizioni abitualmente assegnati a veicolo durante il test composto). </li&gt; </ol></li></ol>

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W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+Pol+II+Accumulates+at+Promoters+of+Growth+Genes+During+Developmental+Arrest.">RNA Pol II Accumulates at Promoters of Growth Genes During Developmental Arrest.</a> Science. 324, 92-94 (2009).</li><li>Maxwell, C. S., Antoshechkin, I., Kurhanewicz, N., Belsky, J. A., Baugh, L. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nutritional+control+of+mRNA+isoform+expression+during+developmental+arrest+and+recovery+in+C.+elegans.">Nutritional control of mRNA isoform expression during developmental arrest and recovery in C. elegans.</a> Genome Res. 22, 1920-1929 (2012).</li><li>Cressman, C. P., Williams, P. 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Gli autori non hanno nulla da rivelare

L&#39;organismo modello C. elegans fornisce un potente sistema sperimentale. E &#39;facile da cultura e produce abbondante prole geneticamente identico ad un ciclo di vita di 3,5 giorni da uovo ad adulto riprodurre (via fasi larvali giovanili L1 fino alla L4). Grazie alle sue ridotte dimensioni, può essere coltivata facilmente in piastre a 96 pozzetti, facilitando lo screening composto. Vi presentiamo un protocollo di screening fenotipico sulla base di ceppi di C. elegans che fungono da sensori in vivo dei livelli di energia. 14 Il protocollo è applicabile a qualsiasi laboratorio, anche se è necessario un luminometro piastra a 96 pozzetti e un armadio sterile. È importante prevenire la contaminazione in saggi utilizzando buona tecnica di laboratorio. Se si opera manualmente, il numero massimo di lastre nematodi ottenibile è 13 per esperimento permettendo la sperimentazione di droga 2x piastre da 96 pozzetti e comprendente due piastre veicolo. I risultati rappresentativi sono presentati per il complesso I mitocondriale inibitore rotenone, il generatore paraquat superossido, il ciclo dell&#39;acido citrico ossalacetato intermedio e quattro composti con nota attività inibitoria lucciola luciferasi. I primi due composti hanno portato ad una diminuzione della bioluminescenza come previsto, mentre ossalacetato ha portato ad un miglioramento, che può derivare dalla maggiore produzione di ATP. I set di dati ossalacetato dimostrano anche la variabilità intrinseca in esperimenti sulla base di luciferasi di lucciola come reporter. Un minimo di tre esperimenti indipendenti sono consigliabili per accertare la robustezza delle risposte ai composti sconosciuti. Inibizione dell&#39;attività lucciola luciferasi era identificabile con un metodo in vitro utilizzando un kit commerciale. 3 Uno dei composti determinato un notevole aumento fluorescenza GFP coerente con l&#39;inibitore aumentare i livelli di GFP-tag lucciola luciferasi legandosi all&#39;enzima di luciferasi attiva sito, e rendendolo più stabile. 15 In alcuni casi(non in questo caso particolare) ciò può portare ad un aumento dei livelli di bioluminescenza quando l&#39;inibitore viene spostato da eccesso di substrato. 15 è, quindi, importante non interpretare i risultati erroneamente da composti che interagiscono con l&#39;enzima lucciola come diminuzione o aumento dei livelli di ATP / funzione mitocondriale. Le variazioni del segnale di luminescenza molto spesso sono correlate con le misure aggiuntive di salute come il movimento, sviluppo e crescita. Come esempio, un composto è un inibitore luciferasi indagato se viene rilevato un drastico calo segnale bioluminescenza ma vermi sono indistinguibili dai controlli di osservazione microscopica. Un aumento di fluorescenza GFP, non spiegato dalla crescita o autofluorescenza composto, può anche puntare a un inibitore. Un certo numero di inibitori luciferasi 15 sono noti e sono stati inseriti in PubChem. Pertanto, in prima istanza, è buona norma consultare le informazioni sugli inibitori luciferasi detenuti da PubChem; seguito da tressante degli effetti composti in test in vitro con l&#39;enzima purificato 3 e / o la conferma degli effetti sulla funzione mitocondriale con mezzi supplementari. 16,17 Misure GFP fluorescenza consentono il rilevamento di livelli di luciferasi lucciola (e il potenziale rilevamento di alcuni inibitori enzimatici luciferasi come discusso sopra) facendo un forte caso per misurare questo endpoint accanto bioluminescenza, ove possibile. Normalizzazione delle letture bioluminescenza per GFP è anche un mezzo di contabilizzazione delle variazioni di numeri senza fine tra i pozzi (anche se questo può essere ottenuto anche con l&#39;inclusione di molteplici replicati tecnici). Per una maggiore sensibilità, è importante per sottrarre fluorescenza di fondo dalle letture. Il protocollo valuta contributo della sospensione batterica alla fluorescenza di fondo, tuttavia nematode autofluorescenza non è rappresentato (una limitazione del test corrente, particolarmente critico per qualsiasi stu invecchiamentomuore dato che i nematodi autofluorescenza aumenta con l&#39;età). Autofluorescenza di composti in esame dovrebbe essere valutata anche in parallelo. GFP normalizzazione sembrerebbe indispensabile dove i ricercatori desiderano adattarsi protocollo di confrontare piscine ATP cellulari in diversi mutanti genetici o dopo silenziamento di geni diversi, al fine di controllare eventuali differenze di deformazione a livello di espressione del transgene bioluminescenza. I parametri critici all&#39;interno del protocollo includono lo stadio di sviluppo in cui viene iniziata l&#39;esposizione, la durata dell&#39;esposizione, e ottenendo un numero simile di nematodi nei diversi pozzetti. L&#39;esposizione può iniziare in qualsiasi stadio di sviluppo dei nematodi, tuttavia fase L3 o più è preferibile. Da questo punto in poi, nematodi dipendono fosforilazione ossidativa per lo sviluppo in età adulta, come evidenziato da un aumento molto significativo contenuto di mtDNA, consumo di ossigeno e livelli di ATP. 18,19,20 L&#39;attuale protocollo avvia manifestazioniUre allo stadio L4. La ragione per aliquotando nematodi a piastre da 96 pozzetti solo in questa fase (piuttosto che quando sono stati forniti con il cibo alla fase L1), è che anche se le piastre sono posti in camere umide per minimizzare l&#39;evaporazione, un grado di evaporazione avviene ancora in il nostro incubatore agitazione, visto come molto piccole gocce formano sui coperchi (questo potrebbe non essere un problema con altri incubatori tremanti). Aliquotandolo nematodi a piastre appena prima dell&#39;aggiunta standard droga, la concentrazione effettiva di farmaco non è influenzata da qualsiasi piccola variazione di volume per evaporazione. Caricamento di una piastra nematode con veicolo è utile solo per controllare che i nematodi sono stati equamente distribuiti tra i pozzetti. Eventuali differenze significative trovati per il veicolo unico piatto sarebbe indicativo di scarsa tecnica nel dispensare i nematodi a pozzetti. La durata dell&#39;esposizione è un fattore importante da considerare. Se gli effetti sullo stato di energia indipendente della crescita sono di interesse, proprotocollo può essere modificato per ospitare esposizioni più brevi (da risposte quasi immediate a, per esempio, 2 hr). D&#39;altra parte, l&#39;ingresso di composti in C. tessuti elegans possono richiedere un certo tempo. Per esempio 12-24 ore sono tenuti a raggiungere concentrazioni interne massime di resveratrolo e 5-fluoro-2&#39;-deossiuridina (FUDR). 21 Di conseguenza, di un&#39;esposizione più lunga (da 18 a 24 ore) può essere giustificabile per massimizzare i livelli di esposizione. Il tempo di esposizione deve essere limitata a volte che non permettono livelli significativi di riproduzione avvengano nel pozzo. Si raccomanda che il tempo di sviluppo totale di nematodi è tenuta sotto 66-67 ore. Anche se conveniente, nematodi sono gravida da allora e hanno avviato egglaying. Tuttavia abbiamo trovato letture bioluminescenza da preparazioni a base di uova trascurabile (non mostrato). L&#39;espressione del transgene guidato sur-5 promotore viene dapprima rilevata solo due a due ore e mezzo dopo la fecondazione nella fase 100 cella 22 ed il cguscio d&#39;uovo hitinous rischia di limitare l&#39;ingresso di luciferina. Altri hanno trovato che le uova embrionate non hanno contribuito in modo significativo al metabolismo degli adulti gravido. 23 Tuttavia, le condizioni che consentano una significativa produzione di prole sono da evitare. Se si preferisce, la scala cronologica sperimentale può essere spostato indietro: abbiamo già avviato l&#39;esposizione a una tossina ambientale presso il tardo L3 fase larvale (36 ore) e svolto bioluminescenza e GFP misurazioni a 55 ore 2 sfondi alternativa, genetiche che sono condizionalmente sterili. può essere usato per prevenire la produzione di progenie, ad esempio la fer-15 (b16) II; fem-1 (hc17) IV doppio mutante che può essere mantenuta a 15 ° C, ma è sterile a 25 ° C. 24 L&#39;uso di FUDR per indurre la sterilità non è raccomandata in quanto può di per sé influenzare il metabolismo dei nematodi. 25 Il test potrebbe essere eseguita anche in ceppi con cuticole più permeabili, come parziale perdita di function bus-8 mutanti che sono multidrug-sensibili a causa di aumentare la permeabilità dei farmaci. 26 Ciò faciliterà le esposizioni più brevi e le concentrazioni di composti minori. Le condizioni per l&#39;aggiunta di luciferina di questi nematodi Potrebbe anche essere necessario regolare ovvero, 1% DMSO e 0,05% Triton-X100 nel buffer luminescenza non può essere richiesto di migliorare la disponibilità luciferina. Il protocollo utilizza 1% DMSO come veicolo per la consegna composto. Anche se non letali, questa concentrazione di DMSO ha alcuni effetti biologici come abbiamo discusso in una precedente pubblicazione. 3 Molte delle librerie farmaco disponibile è redatto in 100% DMSO, a concentrazioni che saranno adatti per dosaggi cellulari dopo la diluizione del veicolo al 0,1%. Le concentrazioni più elevate composti sono tenuti a ottenere risposte in C. elegans rispetto alle cellule umane, in modo tale che spesso non è possibile condurre saggi a inferiore all&#39;1% DMSO. Ancora una volta, l&#39;uso di ceppi conpiù cuticole permeabili possono portare a test con concentrazioni più basse di veicolo. Le concentrazioni di DMSO superiore all&#39;1% non sono raccomandati. Un tempo impostato incubazione con luciferina prima lettura dovrebbe essere rispettata. Come precedentemente illustrato, luminescenza raggiunge i suoi livelli massimi nel secondo minuto dopo l&#39;aggiunta luciferina, rimanendo relativamente stabile per i primi 5 minuti, seguito da una lenta diminuzione graduale luminescenza nel prossimo 30 min 1. Risposte cinetica per una particolare sostanza chimica può essere effettuata durante la fase iniziale di 30 minuti dopo l&#39;erogazione iniziale di luciferina. Il protocollo prevede una fase di inedia dopo la raccolta delle uova per ottenere la sincronizzazione della popolazione di nematodi. Si consiglia la sincronizzazione delle popolazioni di prova nematode da diversi stadi di sviluppo si differenziano per livelli di ATP cellulare e possono rispondere in modo diverso ai composti di prova. Effettuando la fame in S completomedio rispetto a M9, i nematodi cova sono dotati di una fonte di carbonio (etanolo), in modo che le larve non sviluppano ma non sono completamente affamate. 27,28 È stato anche dimostrato che arrestato L1 del sono innescato di risposta rapida e cibo normale crescita L1 viene raggiunta entro 3 ore dopo il cibo diventa disponibile. 29 Tuttavia, la possibilità che la fase inedia può alterare il metabolismo di C. elegans non può essere escluso. 30 Per questo motivo la lunghezza di fame non deve superare 24 ore (18 ore è sufficiente per la sincronizzazione). Alcuni laboratori possono avere la possibilità di utilizzare una Copas Biosorter per la sincronizzazione età scavalcando il passo inedia del tutto. Altri laboratori possono avere una preferenza per l&#39;espansione della popolazione di nematodi su terreni solidi (piastre NGM con OP50) prima di sbiancamento (passo 3.1) e questo funziona bene anche. Usiamo S medio durante l&#39;esposizione composto come mezzo standard per nematode coltura, however altri mezzi possono essere selezionati, per esempio K medio o EPA moderatamente acqua dura vengono spesso utilizzati per gli studi ecotossicologici. 31,32 Il protocollo fornisce un mezzo per lo screening e per individuare i candidati per ulteriori test in termini di effetti sulla funzione mitocondriale. Nella fase di screening primario, è probabile che alcuni composti saranno state perse a causa di una sola concentrazione in fase di test, pertanto schermi di droga non devono essere considerate esaustive. Hits possono essere convalidati con l&#39;uso di tecniche di valutazione diversi aspetti della funzione mitocondriale per il consumo ad esempio ossigeno, C. elegans Ceppi con GFP esprimere mitocondri, macchie di potenziale di membrana mitocondriale e / o misurazioni ROS. 16,33,34 La maggior rilievo della metodologia è di avere un mezzo per lo screening gran numero di composti e / o le condizioni a livello organismal multicellulare, e soprattutto per poter usufruire di the trattabilità genetica di C. elegans per indagare meccanismi di azione. La tecnica può aiutare ad accelerare e trovare nuovi percorsi alla scoperta di composti e obiettivi interessanti. Si prevede che la combinazione del sensore con sfondi genetiche associate con la malattia umana per lo screening di librerie di composti in un contesto rilevante malattia avrà molto da offrire.

Lo scopo generale di questa procedura è la quantificazione rapida dello stato energetico di C. elegans in vivo, al fine di utilizzare questo come un endpoint screening composti. Il razionale si basa sull&#39;espressione della luciferasi di lucciola transgenica nel nematode C. elegans 1-3 tramite il plasmide pSLGCV (1 <a href="https://www.addgene.org/49862" target="_blank">https://www.addgene.org/49862).</a> L&#39;enzima luciferasi è fusa alla proteina fluorescente GFP verde e si esprime costitutivamente e ubiquitariamente nel citoplasma (perossisoma luciferasi segnale di targeting è stato rimosso). Questo porta ad emissione di luce quando il substrato luciferina è fornito esogenamente. Come il verme è trasparente, la luce può essere misurata in un luminometro come unità di luce relativa (RLU). Combustibili ATP cellulare la reazione bioluminescenza e la sua disponibilità determina i livelli di luce prodotte. Di conseguenza, luminometria offre un convenient significa valutare livelli di ATP relativi e per estensione la funzione mitocondriale, dal momento che la produzione di ATP si verifica principalmente nei mitocondri. Un legame tra i livelli di funzione e bioluminescenza mitocondriale è stata dimostrata in precedenza attraverso il silenziamento di geni mitocondriali catena di trasporto degli elettroni e concomitante emissione luminosa ridotta. 1 I ceppi bioluminescenza generati sono stati designati PE254 (feIs4) e PE255 (feIs5) 1 (vedi elenco dei materiali) e può essere usato in modo intercambiabile. 3 Una serie di studi hanno utilizzato questi ceppi di sensori a riferire sui livelli di ATP cellulare in vivo in seguito all&#39;esposizione a varie sostanze chimiche xenobiotici come l&#39;azoturo di sodio 1, cadmio 2, delle acque reflue estratto fanghi 3, 5&#39;-fluoro-2-deossiuridina 6, e un nitrosamine specifiche del tabacco 7. Le tensioni sono state anche utili per monitorare gli effetti dell&#39;esposizione a radiazione ultravioletta C <sup&gt; 8 e gli effetti di interruzione della funzione respiratoria mitocondriale. catena di 1,9 Una prima versione del sensore di luminescenza che esprime il gene della luciferasi, senza una fusione GFP (PE39) è stato usato anche nella ricerca di effetti di metalli pesanti e di una delle vie respiratorie . sganciamento 10 ceppi PE254 PE255 e portare la luciferasi: GFP fusione e fluorescenza GFP ha mostrato di aumentare proporzionalmente con la massa nematode, che offre un mezzo conveniente per la normalizzazione dei valori di luminescenza 6,9 Gli effetti di importo differenziale di vermi per bene possono anche essere. preso in considerazione includendo più replicati tecnici nel test (un minimo di 5 pozzi per condizione). 3 Il protocollo offre la possibilità di monitorare in vivo dei livelli di energia (in contrapposizione alla più tecnicamente laboriosa in vitro determinazioni ATP) consente di screening composto e riposizionamento nel contesto fisiologico di un intero muorganismo lticellular. La procedura può essere estesa ad una varietà di ambienti genetici attraversando il transgene cromosomicamente integrato in disponibili ceppi mutanti e / o mettendo a tacere i geni di RNA interferenza; in tal modo, sfruttando appieno C. elegans come organismo modello. Il metodo dovrebbe aiutare a ridurre il fallimento fase tardiva di farmaci candidati a causa di tossicità mitocondriale e dare un contributo alla riduzione della sperimentazione animale superiore.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Orion II Microplate Luminometer</td>
			<td>Berthold Detection Systems</td>
			<td></td>
			<td>with injector and the Simplicity 4.2 Software; transfer data to Excel at the end of plate measurement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FLx800 fluorimeter&#160;</td>
			<td>Biotek</td>
			<td></td>
			<td>with Gen5 Software; transfer data to Excel at the end of plate measurement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ks 130 basic shaking platform</td>
			<td>Ika</td>
			<td>#0002980000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Innova 4349</td>
			<td>New Brunswick Scientific</td>
			<td></td>
			<td>Refrigerated incubator shaker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf centrifuge 5804R</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td>with eppendorf rotor A-4-44&#160; (for 50/15ml tubes)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stripette, Costar</td>
			<td>Corning</td>
			<td>#4489</td>
			<td>Serological pipette</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cellstar 50 ml tubes</td>
			<td>Greiner bio-one</td>
			<td>#227661</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cellstar 15 ml tubes</td>
			<td>Greiner bio-one</td>
			<td>#188261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cellstar 60 mm tissue culture plates&#160;</td>
			<td>Greiner bio-one</td>
			<td>#628160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superfrost Microscope slides</td>
			<td>VWR</td>
			<td>#631-0909</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile spatula</td>
			<td>Corning</td>
			<td>#3007; #3004</td>
			<td>for weighing out chemicals</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.22 mM Millex GP filters</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>#SLGP033RS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Axygen eppendorf tubes 1.5 ml</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>#MCT-150-R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning 96 well assay plate</td>
			<td>VWR</td>
			<td>#3603</td>
			<td>Black plate clear bottom with lid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunc 96 well assay plate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>#236105</td>
			<td>White plate with lid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reservoir reagent 60 mL</td>
			<td>Thermo Scientific Finnpipette</td>
			<td>#9510027</td>
			<td>used as trough for nematodes&#160; in protocol section 4.4.1)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Storage box/damp chamber</td>
			<td>Roche Diagnostics</td>
			<td>#10 800 058 001</td>
			<td>174 x101 x 56.6 mm, used as a damp chamber with wet paper towels; 2X 96-well plates with lids can fit into one, the lower sitting on top of a microplate lid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bleach: Sodium hypochlorite solution 4-4.99% Chlorine content</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>#239305</td>
			<td>Store in aliquots at 4&#176;C,&#160; seal with parafilm to prevent loss of chlorine and cover in foil</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Luciferin, potassium salt</td>
			<td>Biotium Inc</td>
			<td># 10101-2</td>
			<td>Molecular Probes can also be used as supplier; prepare a 20 mM stock in ddH2O, keep at -20 &#176;C in aliquots</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td># P9416</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>CalBiochem</td>
			<td>#317275</td>
			<td>Purity 99.99%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X100</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>#A16046</td>
			<td>Diltute to 10% in ddH20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nystatin</td>
			<td>CalBiochem</td>
			<td>#475914</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C. elegans bioluminescent strains</td>
			<td>Author&#39;s own laboratory</td>
			<td>PE254, PE255</td>
			<td>contain integrated arrays feIs4 and feIs5 [Psur-5::luc+::gfp; rol-6(su1006)] respectively on chromossome V and X; select for homogeneous and strong expression of luc::GFP by fluorescence microscopy (e.g. pick 15 worms) every now and then.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E. coli OP50</td>
			<td>CGC</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>General chemicals</td>
			<td>Sigma Aldrich/Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a screenable in vivo assay for mitochondrial modulators using transgenic bioluminescent caenorhabditis elegans

The multicellular model organism Caenorhabditis elegans is a small nematode of approximately 1 mm in size in adulthood that is genetically and experimentally tractable. It is economical and easy to culture and dispense in liquid medium which makes it well suited for medium-throughput screening. We have previously validated the use of transgenic luciferase expressing C. elegans strains to provide rapid in vivo assessment of the nematode&#8217;s ATP levels.1-3 Here we present the required materials and procedure to carry out bioassays with the bioluminescent C. elegans strains PE254 or PE255 (or any of their derivative strains). The protocol allows for in vivo detection of sublethal effects of drugs that may identify mitochondrial toxicity, as well as for in vivo detection of potential beneficial drug effects. Representative results are provided for the chemicals paraquat, rotenone, oxaloacetate and for four firefly luciferase inhibitory compounds. The methodology can be scaled up to provide a platform for screening drug libraries for compounds capable of modulating mitochondrial function. Pre-clinical evaluation of drug toxicity is often carried out on immortalized cancerous human cell lines which derive ATP mostly from glycolysis and are often tolerant of mitochondrial toxicants.4,5 In contrast, C. elegans depends on oxidative phosphorylation to sustain development into adulthood, drawing a parallel with humans and providing a unique opportunity for compound evaluation in the physiological context of a whole live multicellular organism.

Risultati rappresentativi per illustrare il metodo sono stati ottenuti per rotenone (Figura 1), paraquat (figura 2), ossalacetato (figura 3), e 4 composti che sono stati raccolti come inibitori lucciola luciferasi durante lo screening di una libreria di droga 13 (Figura 4). L&#39;esposizione al farmaco è stato avviato nella fase L4 in tutti i casi, ma gli esperimenti di esposizione paraquat sono stati avviati a 41 ore dopo il cibo prima disponibile ai nematodi rispetto a 45-46 ore per gli altri composti. Il protocollo consente un certo grado di flessibilità nella scelta del tempo per l&#39;inizio della esposizione al farmaco e la lunghezza di esposizione. Tuttavia, a fini di screening, impostare tempi dovrebbero essere rispettati selezionato una volta, per la riproducibilità tra esperimenti. Gli endpoint devono essere misurate entro 66-67 ore di tempo di sviluppo, al fine di evitare che ampia la deposizione delle uova e la schiusa della progenie nei pozzi. Linee guida per temporizzazioni sono forniti in Tgrado 1. Rotenone, un complesso mitocondriale I inibitore, ridotto bioluminescenza dopo entrambi relativamente brevi (2 ore) e lunghe esposizioni (24 hr) a un intervallo di concentrazioni (Figura 1). In questo caso, non sono state prese misure GFP, ma il numero di repliche tecnici usati (n = 6) è sufficiente per uniformare eventuali differenze di numeri verme tra pozzetti 3. L&#39;esposizione 24 ore è una finestra di tempo nel quale crescono nematodi, e lo sviluppo più lento a causa di I inibizione complesso è pensato di contribuire alla diminuzione bioluminescenza. Ciò è stato confermato mediante osservazione visiva sotto stereoscope al ritardo nello sviluppo visto, in particolare a concentrazioni di 20 mM e superiori; in aggiunta alcuni letalità fu notata da 40 micron (osservazioni qualitative non quantificati). Nessuna mortalità è stata osservata dopo l&#39;esposizione di 2 ore, ma gli effetti sulla circolazione verme sono stati visti. Un forte calo bioluminescenza rispetto ai controlli occuRred alla concentrazione più bassa di rotenone testato 2,5 pM, per cui effetti non sono stati rilevati facilmente mediante osservazione visiva rapida in 2 ore di esposizione. Questo calo della bioluminescenza è coerente con ridotta ATP cellulare. L&#39;inibizione massima è stata ottenuta con la più bassa concentrazione di rotenone utilizzato (2.5 mM) indicante che qualsiasi esperimenti successivi specificamente destinati rotenone devono essere eseguite tra 0 e 5 mM [intervallo di concentrazione 0-160 mM è stato selezionato come parte di un confronto con altri farmaci inizialmente identificate come aventi effetti significativi a 10 micron (che sarà pubblicato altrove)]. Il paraquat erbicidi colpisce la funzione mitocondriale attraverso aumento di specie reattive dell&#39;ossigeno. Qui, dimostriamo il suo effetto sulla bioluminescenza di C. elegans ceppo PE254 dopo esposizione ad una gamma di concentrazioni per 24 ore (Figura 2). Come il ceppo porta un luc :: fusione GFP, GFP fluorescenza era also misurata come mezzo di normalizzazione. 6,9 Paraquat diminuito bioluminescenza, GFP fluorescenza e bioluminescenza normalizzato significativamente. Il test post-hoc Dunnet indicato che le concentrazioni di paraquat con significative differenze rispetto al controllo del veicolo erano 4 e 8 mm per bioluminescenza e bioluminescenza normalizzato, nonché 2 mM per bioluminescenza normalizzata. L&#39;unica concentrazione di ridurre in modo significativo fluorescenza GFP è stato di 8 mm, concentrazione alla quale gli effetti di crescita e la vite senza fine morti occasionali sono stati osservati (osservazioni qualitative). Il calo bioluminescenza (bioluminescenza e normalizzato) era maggiore di quella della fluorescenza, coerente con riduzione della funzione mitocondriale e effetti sulla produzione di ATP. L&#39;ossalacetato intermedio ciclo dell&#39;acido citrico testato su C. elegans ceppo PE254 ad un&#39;unica concentrazione di 8 mM, ha portato ad un aumento della bioluminescenza (Figura 3). Nessun GFP fluorescenzamisurazioni SNO sono state ottenute o osservazione visiva supplementare svolte; tuttavia tale risposta ad una concentrazione unica meriterebbe ulteriore esposizione di conferma a una serie di concentrazioni, e le osservazioni più dettagliate degli effetti. Un miglioramento della bioluminescenza da questo composto non è sorprendente in quanto si può ipotizzare di portare ad una maggiore attività del ciclo dell&#39;acido citrico, con in definitiva una maggiore produzione di ATP (tuttavia sarebbe preferibile controllare eventuali effetti sui livelli luciferasi valutando fluorescenza GFP in esperimenti successivi). I set di dati ossalacetato mostrati rivelano il grado di variabilità nella risposta visto in esperimenti basati luciferasi. Nella nostra esperienza questa variabilità è una caratteristica del sistema di prova particolarmente per condizioni di esposizione meno dannosi. La lucciola luciferasi composti inibitori DDD00001434, DDD0001477, DDD00000635 e DDD00023047 sono stati testati in vitro, cercando in effetti sul puenzima rified e in vivo utilizzando il C. elegans luc: GFP che esprimono tensione. Non vi era alcuna prova che nessuno dei composti testati causato la morte di nematodi nelle condizioni di esposizione. Tutti i composti 4 influenzati l&#39;attività luciferasica in vitro alle concentrazioni testate 2 e 100 pM 25 (Figura 4A). DDD00001434 ucciso l&#39;attività della luciferasi purificato quasi completamente, che ha fornito una giustificazione credibile per il forte calo in vivo bioluminescenza (Figura 4B). Anche se, in vitro e in vivo non sono direttamente confrontabili, la risposta a DDD00023047 era simile in entrambi i saggi. DDD0001477 e DDD00000635 causato un calo maggiore in vivo che in vitro. Questi composti sono stati forniti ai vermi vivi 22 ore prima del substrato luciferina, ei risultati possono riflettere sul fatto che non erano facilmente spostati dal sito attivo luciferasi quando luciferina divenne available. In alternativa, DDD0001477 e DDD00000635 possono avere un ulteriore effetto sui livelli di ATP cellulare. Questo avrebbe dovuto essere valutata con mezzi che non comportano luciferasi lucciola. Da segnalare è stata la forte valorizzazione del segnale di GFP in vermi vivi esposti al composto DDD00000635. Questo sarà discusso sotto. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/53083/53083fig1.jpg" /> Figura 1. Il complesso I mitocondriale inibitore rotenone diminuito dello stato energetico di C. elegans come misurato da bioluminescenza di ceppo PE254. sincronizzato L4 vermi fase (45-46 ore dopo cibo fornito L1 larve) esposta a 0, 2,5, 5, 10, 20, 40, 80 e 160 mM rotenone in 1% DMSO per 2 hr (breve) o 24 ore (lunga esposizione) letture precedenti di bioluminescenza, rispettivamente a 48 e 69 ore di sviluppo verme dopo i pasti forniti. Bioluminescenza (unità relativa unità leggere, RLU) è stata espressa come percentuale del veicolo (1% DMSValori O). Le barre di errore rappresentano SEM di repliche tecnici per ciascuna concentrazione rotenone (n = 6). Tutte le concentrazioni testate hanno determinato una differenza statisticamente significativa rispetto al controllo del veicolo (p &lt;0.001). <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/53083/53083fig2.jpg" /> Figura 2. Il paraquat ossidativo stress diminuisce lo stato energetico di C. elegans ceppo PE254 in maniera dipendente dalla concentrazione (misurata mediante bioluminescenza). sincronizzato L4 vermi stadio (per comodità in questo caso a 41 ore dopo cibo fornito L1 larve) sono stati esposti a 0, 0,25, 0,5, 1, 2, 4 o 8 paraquat mM per 24 ore. GFP fluorescenza (unità relativa unità Fluorescenza, RFU) è stato utilizzato per normalizzare i dati bioluminescenza (unità RLU), entrambi gli endpoint ottenuti a 65 ore di sviluppo. I dati sono espressi come percentuale di controlli (1% DMSO). Le barre di errore rappresentano SEM di repliche tecnici(n = 5 per diverse concentrazioni; n = 18 per i controlli). One-way ANOVA: *** p &lt;0,001 rispetto al controllo del veicolo. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/53083/53083fig3.jpg" /> Figura 3. Il ciclo dell&#39;acido citrico ossalacetato intermedio (8 mm) migliorato la bioluminescenza di C. elegans ceppo PE254. Sincronizzato L4 vermi fase (45-46 ore dopo il cibo fornito a larve L1) sono stati esposti a preparati al momento ossalacetato mm 8 per 18 ore ± 30 min. Bioluminescenza (unità RLU) è stato letto in un momento dello sviluppo di 63,5 ore ± 1 ora ed è stata espressa come percentuale del controllo del veicolo (DDH 2 O). Diverse colonne rappresentano diversi set di dati di 8 repliche tecniche destinate a diverse piastre da 96 pozzetti all&#39;interno dello stesso esperimento. Le barre di errore rappresentano SEM di repliche tecnici (n = 8). 2 vie-ANOVA con &#39;set&#39; e &#39;la concentrazione&#39; come fattori: ̵6; Set &#39;p&gt; 0.05,&#39; concentrazione &#39;p &lt;0.001 e termine di interazione p&gt; 0,05. La <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/53083/53083fig4ahighres.jpg" width="650" /> B <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/53083/53083fig4bhighres.jpg" width="650" /> Figura 4. Prove di risposte alle 4 composti dalla scoperta di nuovi farmaci biblioteca composto Dundee 13 (C1: DDD00001434, C2: DDD0001477, C3: DDD00000635 e C4: DDD00023047) con nota attività inibitoria su Firefly luciferasi luminescenza. (A) Effetto di composti sull&#39;attività dei purificato lucciola luciferasi (misurata come unità di luce, RLU), espresso come percentuale del controllo del veicolo. Il kit di bioluminescenza CLSII ATP (Roche, Manheim, Germania) è stato utilizzato in base alle istruzioni con la stessa quantità di enzima luciferasi in aliquote di pozzetti (bianco 96-well micropiastre). ATP è stato fornito ad una concentrazione finale di 10 mM e 1 ml di composto (concentrazione finale indicato) o è stato aggiunto DMSO (1%). Segnale di luminescenza è stato integrato per 10 sec. Le barre di errore rappresentano SEM di repliche tecnici (n = 4). Analisi: One-way ANOVA; * p &lt;0,05 o *** p &lt;0,001 rispetto al controllo del veicolo. Differenze tra 25 e 100 micron molto significativi per C1 (DDD00001434; p &lt;0.001), e significativo per C2 e C3 (rispettivamente DDD0001477 e DDD00000635; p &lt;0,05). (B) in vivo misure di bioluminescenza, bioluminescenza normalizzata a fluorescenza GFP e GFP fluorescenza di C. elegans ceppo PE254 in 67 ore di tempo di sviluppo a seguito di esposizione a composti di prova per 22 ore. Le barre di errore rappresentano SEM di repliche tecnici (n = 8). L&#39;analisi statistica (one-way-ANOVA) condotta su dati raccolti da 3 serie di dati (3 xn = 8). * p &lt;0,05 o *** p &lt;0,001 rispetto al rispettivo controllo del veicolo. Differences tra i 25 ei 100 micron solo statisticamente significativa (p &lt;0.05) per bioluminescenza normalizzato a seguito di esposizione a C4 (DDD00023047). <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Ora del giorno </td><td> Giorno 1 </td><td> Giorno 2 </td><td> 3 ° giorno </td><td> Giorno 4 </td><td> 5 ° giorno </td><td> Giorno 6 </td><td> Giorno 7 </td><td> Giorno 8 </td></tr><tr><td> 9-10 </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td> Fase 5 </td></tr><tr><td> 10-11 </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td> Fase 5 </td></tr><tr><td> 11-12 </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td> Fase 4 </td><td> Fase 5 </td></tr><tr><td> 12-13 </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td> Fase 4 </td><td></td></tr><tr><td> 13-14 </td><td&gt; </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 14-15 </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 15-16 </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 16-17 </td><td> Passo 1 </td><td></td><td></td><td></td><td> Fase 3 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 17-18 </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 18-19 </td><td></td><td></td><td></td><td> Passo 2 </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table> Tabella 1. Panoramica delle fasi di protocollo da effettuare in ogni giorno di esperimenti nematode (sezione 3) e ha suggerito timing.

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A Screenable In Vivo Assay for Mitochondrial Modulators Using Transgenic Bioluminescent Caenorhabditis elegans

A protocol is described for in vivo detection of effects of mitochondrial inhibitors in the model organism Caenorhabditis elegans and for identification of potential enhancing compounds. This protocol can be used to screen drug libraries for compounds modulating mitochondrial function.

Un Screenable<em&gt; In Vivo</em&gt; Saggio per mitocondriale modulatori Uso Transgenic Bioluminescent<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

The multicellular model organism Caenorhabditis elegans is a small nematode of approximately 1 mm in size in adulthood that is genetically and ...

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Biology

A Screenable In Vivo Assay for Mitochondrial Modulators Using Transgenic Bioluminescent Caenorhabditis elegans

9.9K Views.  University of Aberdeen. A protocol is described for in vivo detection of effects of mitochondrial inhibitors in the model organism Caenorhabditis elegans and for identification of potential enhancing compounds. This protocol can be used to screen drug libraries for compounds modulating mitochondrial function. 

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Generation of Stable Transgenic C. elegans Using Microinjection

Transgenic Caenorhabditis elegans can be readily created via microinjection of a DNA plasmid solution into the gonad 1. The plasmid DNA rearranges to form extrachromosomal concatamers that are stably inherited, though not with the same efficiency as actual chromosomes 2. A gene of interest is co-injected with an obvious phenotypic marker, such as rol-6 or GFP, to allow selection of transgenic animals under a dissecting microscope. The exogenous gene may be expressed from its native promoter for cellular localization studies. Alternatively, the transgene can be driven by a different tissue-specific promoter to assess the role of the gene product in that particular cell or tissue. This technique efficiently drives gene expression in all tissues of C. elegans except for the germline or early embryo 3. Creation of transgenic animals is widely utilized for a range of experimental paradigms. This video demonstrates the microinjection procedure to generate transgenic worms. Furthermore, selection and maintenance of stable transgenic C. elegans lines is described.

This video demonstrates the technique of microinjection into the gonad of C. elegans to create transgenic animals.

Generazione di Stabile transgenici C. elegans Utilizzando Microiniezione

Transgenic Caenorhabditis elegans can be readily created via microinjection of a DNA plasmid solution into the gonad 1.  The plasmid DNA rearranges to ...

Ricerca

Biologia

In vivo Bioluminescent Imaging of Mammary Tumors Using IVIS Spectrum

4T1 mouse mammary tumor cells can be implanted sub-cutaneously in nu/nu mice to form palpable tumors in 15 to 20 days. This xenograft tumor model system is valuable for the pre-clinical in vivo evaluation of putative antitumor compounds.
The 4T1 cell line has been engineered to constitutively express the firefly luciferase gene (luc2). When mice carrying 4T1-luc2 tumors are injected with Luciferin the tumors emit a visual light signal that can be monitored using a sensitive optical imaging system like the IVIS Spectrum. The photon flux from the tumor is proportional to the number of light emitting cells and the signal can be measured to monitor tumor growth and development. IVIS is calibrated to enable absolute quantitation of the bioluminescent signal and longitudinal studies can be performed over many months and over several orders of signal magnitude without compromising the quantitative result.
Tumor growth can be monitored for several days by bioluminescence before the tumor size becomes palpable or measurable by traditional physical means. This rapid monitoring can provide insight into early events in tumor development or lead to shorter experimental procedures.
Tumor cell death and necrosis due to hypoxia or drug treatment is indicated early by a reduction in the bioluminescent signal. This cell death might not be accompanied by a reduction in tumor size as measured by physical means. The ability to see early events in tumor necrosis has significant impact on the selection and development of therapeutic agents.
Quantitative imaging of tumor growth using IVIS provides precise quantitation and accelerates the experimental process to generate results.

In vivo Bioluminescent Imaging of Mammary Tumors Using IVIS Spectrum

Mammary tumor cells expressing luciferase are implanted subcutaneously in mice and visualized using optical imaging to monitor tumor growth and development non-invasively in a longitudinal study.

In vivo Bioluminescent Imaging dei tumori mammari che usano lo spettro IVIS

4T1 mouse mammary tumor cells can be implanted sub-cutaneously in nu/nu mice to form palpable tumors in 15 to 20 days. This xenograft tumor model system ...

Generation of Transgenic C. elegans by Biolistic Transformation

The number of laboratories using the free living nematode C. elegans is rapidly growing. The popularity of this biological model is attributed to a rapid generation time and short life span, easy and inexpensive maintenance, fully sequenced genome, and array of RNAi resources and mutant animals. Additionally, analysis of the C. elegans genome revealed a great similarity between worms and higher vertebrates, which suggests that research in worms could be an important adjunct to studies performed in whole mice or cultured cells. A powerful and important part of worm research is the ability to use transgenic animals to study gene localization and function. Transgenic animals can be created either via microinjection of the worm germline or through the use of biolistic bombardment. Bombardment is a newer technique and is less familiar to a number of labs. Here we describe a simple protocol to generate transgenic worms by biolistic bombardment with gold particles using the Bio-Rad PDS-1000 system. Compared with DNA microinjection into hermaphrodite germline, this protocol has the advantage of not requiring special skills from the operator with regards to identifying worm anatomy or performing microinjection. Further multiple transgenic lines are usually obtained from a single bombardment. Also in contrast to microinjection, biolistic bombardment produces transgenic animals with both extrachromosomal arrays and integrated transgenes. The ability to obtain integrated transgenic lines can avoid the use of mutagenic protocols to integrate foreign DNA. In conclusion, biolistic bombardment can be an attractive method for the generation of transgenic animals, especially for investigators not interested in investing the time and effort needed to become skilled at microinjection.

Generation of Transgenic C. elegans by Biolistic Transformation

Transgenic worms are commonly used in C. elegans research. Described is a simple, yet effective, protocol to introduce transgenes into worms using biolistic bombardment with DNA-coated gold particles. The effort involved and results of bombardment compare favorably with microinjection for the generation of transgenic animals.

Generazione di transgenici C. elegans Di Trasformazione Biolistic

The number of laboratories using the free living nematode C. elegans is rapidly growing. The popularity of this biological model is attributed to a rapid ...

Time-lapse Microscopy of Early Embryogenesis in Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans has often been used as a model system in studies of early developmental processes. The transparency of the 
embryos, the genetic resources, and the relative ease of transformation are qualities that make C. elegans an excellent model for early embryogenesis. Laser-based 
confocal microscopy and fluorescently labeled tags allow researchers to follow specific cellular structures and proteins in the developing embryo. For example, 
one can follow specific organelles, such as lysosomes or mitochondria, using fluorescently labeled dyes. These dyes can be delivered to the early embryo by means 
of microinjection into the adult gonad. Also, the localization of specific proteins can be followed using fluorescent protein tags. Examples are presented here 
demonstrating the use of a fluorescent lysosomal dye as well as fluorescently tagged histone and ubiquitin proteins. The labeled histone is used to visualize 
the DNA and thus identify the stage of the cell cycle. GFP-tagged ubiquitin reveals the dynamics of ubiquitinated vesicles in the early embryo. Observations 
of labeled lysosomes and GFP:: ubiquitin can be used to determine if there is colocalization between ubiquitinated vesicles and lysosomes. A technique for 
the microinjection of the lysosomal dye is presented. Techniques for generating transgenenic strains are presented elsewhere (1, 2). For imaging, embryos 
are cut out of adult hermaphrodite nematodes and mounted onto 2% agarose pads followed by time-lapse microscopy on a standard laser scanning confocal 
microscope or a spinning disk confocal microscope. This methodology provides for the high resolution visualization of early embryogenesis.

Time-lapse Microscopy of Early Embryogenesis in Caenorhabditis elegans

This article describes a technique for the visualization of the early events of embryogenesis in the nematode Caenorhabditis elegans.

Microscopia time-lapse di Embriogenesi All&#39;inizio del Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans has often been used as a model system in studies of early developmental processes.  The transparency of the 
embryos, the genetic ...

Visualization of Caenorhabditis elegans Cuticular Structures Using the Lipophilic Vital Dye DiI

The cuticle of C. elegans is a highly resistant structure that surrounds the exterior of the animal1-4. The cuticle not only protects the animal from the environment, but also determines body shape and plays a role in motility4-6. Several layers secreted by epidermal cells comprise the cuticle, including an outermost lipid layer7.
Circumferential ridges in the cuticle called annuli pattern the length of the animal and are present during all stages of development8. Alae are longitudinal ridges that are present during specific stages of development, including L1, dauer, and adult stages2,9. Mutations in genes that affect cuticular collagen organization can alter cuticular structure and animal body morphology5,6,10,11. While cuticular imaging using compound microscopy with DIC optics is possible, current methods that highlight cuticular structures include fluorescent transgene expression12, antibody staining13, and electron microscopy1. Labeled wheat germ agglutinin (WGA) has also been used to visualize cuticular glycoproteins, but is limited in resolving finer cuticular structures14. Staining of cuticular surface using fluorescent dye has been observed, but never characterized in detail15. We present a method to visualize cuticle in live C. elegans using the red fluorescent lipophilic dye DiI (1,1'-dioctadecyl-3,3,3',3'-tetramethylindocarbocyanine perchlorate), which is commonly used in C. elegans to visualize environmentally exposed neurons. This optimized protocol for DiI staining is a simple, robust method for high resolution fluorescent visualization of annuli, alae, vulva, male tail, and hermaphrodite tail spike in C. elegans.

Visualization of Caenorhabditis elegans Cuticular Structures Using the Lipophilic Vital Dye DiI

We present a method to visualize cuticle in live C. elegans using the red fluorescent lipophilic dye DiI (1,1'-dioctadecyl-3,3,3',3'-tetramethylindocarbocyanine perchlorate), which is commonly used in C. elegans to visualize environmentally exposed neurons. With this optimized protocol, alae and annular cuticular structures are stained by DiI and observed using compound microscopy.

Visualizzazione di Caenorhabditis Elegans Strutture cuticola Utilizzando il Dye lipofili Vital, Dii

The cuticle of C. elegans is a highly resistant structure that surrounds the exterior of the animal1-4. The cuticle not only protects the animal from the ...

A Fluorescent Screening Assay for Identifying Modulators of GIRK Channels

G protein-gated inward rectifier K+ (GIRK) channels function as cellular mediators of a wide range of hormones and neurotransmitters and are expressed in the brain, heart, skeletal muscle and endocrine tissue1,2. GIRK channels become activated following the binding of ligands (neurotransmitters, hormones, drugs, etc.) to their plasma membrane-bound, G protein-coupled receptors (GPCRs). This binding causes the stimulation of G proteins (Gi and Go) which subsequently bind to and activate the GIRK channel. Once opened the GIRK channel allows the movement of K+ out of the cell causing the resting membrane potential to become more negative. As a consequence, GIRK channel activation in neurons decreases spontaneous action potential formation and inhibits the release of excitatory neurotransmitters. In the heart, activation of the GIRK channel inhibits pacemaker activity thereby slowing the heart rate.
GIRK channels represent novel targets for the development of new therapeutic agents for the treatment neuropathic pain, drug addiction, cardiac arrhythmias and other disorders3. However, the pharmacology of these channels remains largely unexplored. Although a number of drugs including anti-arrhythmic agents, antipsychotic drugs and antidepressants block the GIRK channel, this inhibition is not selective and occurs at relatively high drug concentrations3.
Here, we describe a real-time screening assay for identifying new modulators of GIRK channels. In this assay, neuronal AtT20 cells, expressing GIRK channels, are loaded with membrane potential-sensitive fluorescent dyes such as bis-(1,3-dibutylbarbituric acid) trimethine oxonol [DiBAC4(3)] or HLB 021-152 (Figure 1). The dye molecules become strongly fluorescent following uptake into the cells (Figure 1). Treatment of the cells with GPCR ligands stimulates the GIRK channels to open. The resulting K+ efflux out of the cell causes the membrane potential to become more negative and the fluorescent signal to decrease (Figure 1). Thus, drugs that modulate K+ efflux through the GIRK channel can be assayed using a fluorescent plate reader. Unlike other ion channel screening assays, such atomic absorption spectrometry4 or radiotracer analysis5, the GIRK channel fluorescent assay provides a fast, real-time and inexpensive screening procedure.

A real-time screening procedure for identifying drugs that interact with G protein-gated inward rectifier K+ (GIRK) channels is described. The assay utilizes membrane potential-sensitive fluorescent dyes to measure GIRK channel activity. This technique is adaptable for use on a number of cell lines.

Un test di screening a fluorescenza per l&#39;identificazione di modulatori Canali GIRK

G protein-gated inward rectifier K+ (GIRK) channels function as cellular mediators of a wide range of hormones and neurotransmitters and are expressed in ...

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

Research into the molecular and developmental biology of the nematode Caenorhabditis elegans was begun in the early seventies by Sydney Brenner and it has since been used extensively as a model organism 1. C. elegans possesses key attributes such as simplicity, transparency and short life cycle that have made it a suitable experimental system for fundamental biological studies for many years 2. Discoveries in this nematode have broad implications because many cellular and molecular processes that control animal development are evolutionary conserved 3.
C. elegans life cycle goes through an embryonic stage and four larval stages before animals reach adulthood. Development can take 2 to 4 days depending on the temperature. In each of the stages several characteristic traits can be observed. The knowledge of its complete cell lineage 4,5 together with the deep annotation of its genome turn this nematode into a great model in fields as diverse as the neurobiology 6, aging 7,8, stem cell biology 9 and germ line biology 10. 
An additional feature that makes C. elegans an attractive model to work with is the possibility of obtaining populations of worms synchronized at a specific stage through a relatively easy protocol. The ease of maintaining and propagating this nematode added to the possibility of synchronization provide a powerful tool to obtain large amounts of worms, which can be used for a wide variety of small or high-throughput experiments such as RNAi screens, microarrays, massive sequencing, immunoblot or in situ hybridization, among others. 
Because of its transparency, C. elegans structures can be distinguished under the microscope using Differential Interference Contrast microscopy, also known as Nomarski microscopy. The use of a fluorescent DNA binder, DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole), for instance, can lead to the specific identification and localization of individual cells, as well as subcellular structures/defects associated to them.

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

The easiness of maintaining and propagating the nematode C. elegans make it a nice model organism to work with. The possibility of synchronizing worms allows the work with a significant amount of subjects at the same developmental stage, what facilitates the study of one particular process in many animals.

Di base<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; Metodi: sincronizzazione e di osservazione

Research into the molecular and developmental biology of the nematode Caenorhabditis elegans was begun in the early seventies by Sydney Brenner and it has ...

Prostaglandin Extraction and Analysis in Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans is emerging as a powerful animal model to study the biology of lipids1-9. Prostaglandins are an important class of eicosanoids, which are lipid signals derived from polyunsaturated fatty acids (PUFAs)10-14. These signalling molecules are difficult to study because of their low abundance and reactive nature. The characteristic feature of prostaglandins is a cyclopentane ring structure located within the fatty acid backbone. In mammals, prostaglandins can be formed through cyclooxygenase enzyme-dependent and -independent pathways10,15. C. elegans synthesizes a wide array of prostaglandins independent of cyclooxygenases6,16,17. A large class of F-series prostaglandins has been identified, but the study of eicosanoids is at an early stage with ample room for new discoveries. Here we describe a procedure for extracting and analyzing prostaglandins and other eicosanoids. Charged lipids are extracted from mass worm cultures using a liquid-liquid extraction technique and analyzed by liquid chromatography coupled to electrospray ionization tandem mass spectrometry (LC-ESI-MS/MS). The inclusion of deuterated analogs of prostaglandins, such as PGF2 &alpha;-d4 as an internal standard is recommended for quantitative analysis. Multiple reaction monitoring or MRM can be used to quantify and compare specific prostaglandin types between wild-type and mutant animals. Collision-induced decomposition or MS/MS can be used to obtain information on important structural features. Liquid chromatography mass spectrometry (LC-MS) survey scans of a selected mass range, such as m/z 315-360 can be used to evaluate global changes in prostaglandin levels. We provide examples of all three analyses. These methods will provide researchers with a toolset for discovering novel eicosanoids and delineating their metabolic pathways.

Prostaglandin Extraction and Analysis in Caenorhabditis elegans

In this paper, we describe an optimized procedure for extracting and analyzing prostaglandins and other eicosanoids from C. elegans using LC-MS/MS.

Prostaglandina estrazione e l&#39;analisi in<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Caenorhabditis elegans is emerging as a powerful animal model to study the biology of lipids1-9. Prostaglandins are an important class of eicosanoids, ...

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

The folding and assembly of proteins is essential for protein function, the long-term health of the cell, and longevity of the organism. Historically, the function and regulation of protein folding was studied in vitro, in isolated tissue culture cells and in unicellular organisms. Recent studies have uncovered links between protein homeostasis (proteostasis), metabolism, development, aging, and temperature-sensing. These findings have led to the development of new tools for monitoring protein folding in the model metazoan organism Caenorhabditis elegans. In our laboratory, we combine behavioral assays, imaging and biochemical approaches using temperature-sensitive or naturally occurring metastable proteins as sensors of the folding environment to monitor protein misfolding. Behavioral assays that are associated with the misfolding of a specific protein provide a simple and powerful readout for protein folding, allowing for the fast screening of genes and conditions that modulate folding. Likewise, such misfolding can be associated with protein mislocalization in the cell. Monitoring protein localization can, therefore, highlight changes in cellular folding capacity occurring in different tissues, at various stages of development and in the face of changing conditions. Finally, using biochemical tools ex vivo, we can directly monitor protein stability and conformation. Thus, by combining behavioral assays, imaging and biochemical techniques, we are able to monitor protein misfolding at the resolution of the organism, the cell, and the protein, respectively.

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

To study the relationship between protein homeostasis, stress and aging, we monitored changes in protein folding by following protein dysfunction, protein localization in the cell and protein stability at the organismal, cellular and protein levels, using the genetically tractable metazoan Caenorhabditis elegans as a model system.

The folding and assembly of proteins is essential for protein function, the long-term health of the cell, and longevity of the organism. Historically, the ...

Culturing Caenorhabditis elegans in Axenic Liquid Media and Creation of Transgenic Worms by Microparticle Bombardment

In this protocol, we present the required materials, and the procedure for making modified&#160;C. elegans&#160;Habituation and Reproduction media (mCeHR). Additionally, the steps for exposing and acclimatizing C. elegans grown on E. coli to axenic liquid media are described. Finally, downstream experiments that utilize axenic C. elegans illustrate the benefits of this procedure. The ability to analyze and determine C. elegans&#160;nutrient requirement was illustrated by growing N2 wild type worms in axenic liquid media with varying heme concentrations. This procedure can be replicated with other nutrients to determine the optimal concentration for worm growth and development or, to determine the toxicological effects of drug treatments. The effects of varied heme concentrations on the growth of wild type worms were determined through qualitative microscopic observation and by quantitating the number of worms that grew in each heme concentration. In addition, the effect of varied nutrient concentrations can be assayed by utilizing worms that express fluorescent sensors that respond to changes in the nutrient of interest. Furthermore, a large number of worms were easily produced for the generation of transgenic C. elegans using microparticle bombardment.

Culturing Caenorhabditis elegans in Axenic Liquid Media and Creation of Transgenic Worms by Microparticle Bombardment

C. elegans is usually grown on solid agar plates or in liquid cultures seeded with E. coli. To prevent bacterial byproducts from confounding toxicological and nutritional studies, we utilized an axenic liquid medium, CeHR, to grow and synchronize a large number of worms for a range of downstream applications.