L'obiettivo di questo video è dimostrare un protocollo standardizzato per l'isolamento dei cardiomiociti adulti, la cultura a lungo termine e la trasfezione. Isolare e coltivare i cardiomiociti dal topo o dal ratto continua ad essere un metodo essenziale per studiare la biologia autonoma cellulare dei cardiomiociti all'interno del cuore sano e delle malattie. Ci sono diverse domande a cui possiamo rispondere usando cardiomiociti isolati.
Come il potenziale proliferativo. Ci sono cambiamenti nell'espressione genica o espressioni citochine specifiche alla risposta alle lesioni. Sfortunatamente, i cardiomiociti del topo non sopravvivono oltre una settimana in normali condizioni culturali.
Pertanto, in questo video, descriviamo un metodo ottimizzato per isolare i cardiomiociti adulti del topo, trafitti e coltivati ben oltre i 21 giorni, questa tecnica è inizialmente difficile da padroneggiare. Ma con la pratica si può ottenere circa l'80-90% sopravvivere nei cardiomiociti dopo l'isolamento e circa il 100% di efficienza di trasfezione. E la maggior parte di questi cardiomiociti in condizioni corrette può sopravvivere negli ultimi 20 giorni.
Pulire e sterilizzare gli strumenti chirurgici immergendoli in 70% di alcol per 15 minuti e successivamente lavandoli con acqua doppia distillata. Dopo l'acqua, lasciare asciugare gli utensili nell'aria, pulire l'apparato di profusione eseguendo il 70% di alcol due volte per cinque minuti ciascuno. L'aumento della portata aiuterà a pulire i tubi dopo che l'alcol ha risciacquato l'alcol rimanente facendo scorrere acqua distillata doppia per 10 minuti.
impostare tre piatti per pulire il cuore dopo l'escissione. Riempire ciascuno dei piatti con 20 millilitri di tampone di miocita. Aggiungere da due a tre gocce di eparina ad ogni piatto con la pipetta Pasteur e mescolare bene pipettando su e giù più volte.
Prendi una siringa da 10 millilitri e riempila con un buffer di miociti. Rimuovere una qualsiasi delle bolle d'aria dalla siringa e posizionarla nel terzo piatto in posizione angolata, fissarla con del nastro adesivo. Preparare un nodo sciolto con sutura chirurgica e posizionarlo intorno all'ago.
Iniettare il mouse con eparina tramite iniezione IP 20 minuti prima dell'anestesia. Far circolare il tampone di profusione di miociti attraverso l'apparato di profusione ad una portata di tre millilitri al minuto. Dopo cinque minuti, sostituire il tampone di profusione con soluzione enzimatica, saturare la soluzione enzimatica con ossigeno durante il processo, ancora una volta, impostare la soluzione enzimatica su una portata di tre mL al minuto.
Confermare l'anestesia pizzicando e posizionare il mouse sulla piattaforma chirurgica. Sterilizzare la pelle con il 70% di alcol. Aprire con cura il petto, esercitare il cuore e mettere il cuore nel primo piatto.
Togliere il sangue dal cuore stringendo delicatamente, quindi trasferire il cuore al secondo piatto per pulire ulteriormente il sangue dal cuore e rimuovere eventuali tessuti non cardiaci. Successivamente trasferire il cuore al terzo piatto. Trova l'aorta e usa le pinie per mantenerla Peyton più posizionarla intorno all'ago cannulante.
Fissarlo tirando verso il basso il serraggio del nodo pre stretto e quindi facendo un secondo nodo. Per una maggiore stabilità fissare l'ordine e l'posizionare con l'aiuto di una clip. Tagliare qualsiasi filo di sutura in eccesso e infine iniziare la profusione cardiaca usando il buffer di miocita nella siringa per cancellare tutto il sangue rimanente nel cuore.
Rimuovere con cura l'ago calcolatore dalla siringa e agganciarlo all'apparato di profusione. Cerca di evitare che eventuali bolle d'aria andano nel cuore. Poiché ciò può influenzare il flusso della soluzione enzimatica e della digestione.
Spostare la giacca dell'acqua verso l'alto, per fornire un ambiente omogeneo al cuore durante la profusione. Consentire alla soluzione enzimatica di fluire attraverso il cuore con una velocità da due a tre mL al minuto. Lasciare che la soluzione enzimatica fluisa attraverso il cuore per due minuti.
A due minuti, mescolare in 40 microlitri di una soluzione di cloruro di calcio micromolare alla soluzione enzimatica. Lasciare passare la soluzione enzimatica attraverso il cuore per altri 10-15 minuti. Una volta che il flusso diventa liscio e il cuore inizia a sembrare marrone e morbido, sai che hai una distribuzione uniforme dell'enzima collagenasi per ottenere una corretta digestione del cuore.
Quando pensi che la tua digestione sia completa, tolti il cuore dal sistema di perfusione Langendorff e mettilo in una piastra di Petri di 16 millimetri piena di cinque millilitri di soluzione enzimatica e portalo in un piede di biosicurezza. Rimuovere con cura gli atri e il tessuto adiposo extra. Tritare il cuore in pezzi definiti con l'aiuto di forcep.
Prendi una pipetta Pasteur sterile e taglia la punta a 45 gradi. Utilizzare la pipetta Pasteur per rompere il tessuto cardiaco con una delicata pipettazione su e giù. La digestione ottimale fornisce una sospensione dei cardiomiociti a singola cellula dopo che aggiungere cinque millilitri di soluzione di arresto per fermare l'attività enzimatica per evitare la digestione troppo, Prendere un primo tubo conico da 50 millilitri e posizionare un filtro cellulare sterile di cento micron su di esso.
Passare la sospensione del cardiomiocita attraverso il filtro cellulare per rimuovere eventuali grandi pezzi di tessuto. Infine lavare il colino con soluzione di arresto per raccogliere eventuali resti di cardiomiociti attaccati. Centrifugare la sospensione cellulare a 20 GS per tre minuti e scartare il supernatante.
Sospendere di nuovo i cardiomiociti e 10 millilitri di soluzione di arresto, a intervalli di tre minuti a 10 microlitri di soluzione di cloruro di calcio millimolare quattro volte e mescolare. Dopo la quarta edizione centrifuga la sospensione dei cardiomiociti a 20 GS per tre minuti e scarta il supernatante. Sospendere di nuovo i cardiomiociti nei mezzi di coltura Pre-placcare le cellule in un piatto da 60 millimetri e mettere in incubatrice di CO2 per due o tre ore.
Tra due o tre ore. I principali tipi di cellule contaminanti come le esplosioni di fibre saranno rispettati al servizio del piatto, consentendo il puro isolamento dei cardiomiociti. Dopodiché, prendi il piatto dall'incubatrice e raccogli i cardiomiociti galleggianti in un tubo conico e riproduce i cardiomiociti in una piastra di coltura di 24 pozzi rivestita di laminina.
Da quattro a sei ore sono sufficienti affinché i cardiomiociti aderiscano alla superficie. Quindi la trasfezione potrebbe essere eseguita a sei ore dalla placcatura. Il reagente di trasfezione RNA IMAX è stato utilizzato per trapiantare cardiomiociti con siRNA.
Il supporto di coltura contiene 25 staten di sangue micromolare integrati con il 10% di FBS, che abbiamo trovato più adatto per eseguire la coltura cardiomiocita a lungo termine e indurre l'analisi della proliferazione. Dopo la trasfezione, è possibile visualizzare i cardiomiociti per microscopia utilizzando un micro incubatore su come sono le cellule per l'imaging time-lapse. Queste sono immagini a campo luminoso di cardiomiociti a forma di asta trasfettata a basso e alto ingrandimento.
Qui, puoi vedere l'imaging giorno per giorno, che mostra i cambiamenti nella morfologia del cardiomiocita del topo adulto. Confermiamo che i cardiomiociti sono sani e contrattili nei primi tempi, così come dopo la differenziazione D e la cultura a lungo termine. Ecco un esempio di colorazione immunofluorescente Ki67 che dimostra la proliferazione indotta di cardiomiociti adulti in coltura dopo i siRNA, una trasfezione.
Come potete vedere dai risultati utilizzando questa tecnica, si possono ottenere cardiomiociti adulti sani dal topo e dal ratto e coltarli per uno studio a lungo termine. In conclusione, una volta padroneggiata questa tecnica ci permetterà di studiare i cardiomiociti ben oltre gli attuali protocolli di coltivazione.
