Questo lavoro è stato supportato dal National Science Foundation CARRIERA Award (0953583) e l&#39;Istituto Nazionale di Salute NCI / R21-CA116102, NCI / R21-CA125088, NIBIB / R01-EB012065, NCI / R01-CA157766.

In questo protocollo, un oligonucleotide (RBMB1) è stato marcato a suo 5&#39;-end con un colorante reporter CF640R e ha la sequenza: 5&#39;-mCmUmUmC mGmUmC mCmAmC Mamama mCmAmC mAmAmC mUmCmC mU mGmAmAmG mGmAmC mGmGmC mAmGmC mGmUmG mCmAmG mCmUmC Mumu-3 &#39;. Domini di auto-complementari, che guidano la formazione della struttura tornante, sono in grassetto. Il secondo oligonucleotide (RBMB2) è stato marcato a 3&#39;-end con un quencher Iowa Nero RQ-Sp e ha la sequenza: 5&#39;-mGmAmG mCmUmG mCmAmC mGmCmU mGmCmC mGmUmC-3 &#39;. 1 Preparazione di RBMBs <ol><li> Eseguire una rotazione rapida delle provette contenenti le RBMB1 e RBMB2 oligonucleotidi, per garantire l&#39;oligonucleotide essiccato è al fondo della provetta e risospendere in DNasi e acqua RNase-free ad una concentrazione finale di 100 mM. Ad esempio, un campione di 10 nmole di oligonucleotide deve essere risospeso in 100 ml di acqua. </li><li> Measure l&#39;esatta concentrazione di campioni RBMB1 e RBMB2 azionari mediante spettroscopia UV-vis. <ol><li> Mescolare 3 ml di campione RBMB con 117 microlitri DPBS (senza calcio e magnesio) in una provetta. </li><li> Blank lo spettrofotometro con DPBS e misurare l&#39;assorbanza 200-800 nm. Nota: picco di assorbanza a 260 nm e 650 nm dovrebbe essere visibile. </li><li> Calcolare la concentrazione archivio dei campioni RBMB basato su l&#39;assorbanza a 260 nm (o 650 nm per RBMB1), usando l&#39;equazione: Archivio Concentrazione (M) = A 260 * fattore di diluizione coefficiente / di estinzione dove A 260 è l&#39;assorbanza a 260 nm e il fattore di diluizione è 40. Nota: Il coefficiente di estinzione per la RBMB può essere trovato sul foglio delle specifiche fornite dal costruttore oligonucleotide. Il coefficiente di estinzione di CF640R a 650 nm è 103.000. </li></ol></li><li> Mescolare 20 ml di 100 mM RBMB1, 30 ml di 100 mM RBMB2, 6 ml 10x; Tampone fosfato (10x tampone fosfato: 480 mM K 2 HPO 4, 45 mm KH 2 PO 4, 140 mm NaH 2 PO 4, pH 7,2) e 4 microlitri DNasi e acqua RNase-free. Incubare la miscela a temperatura ambiente per 30 min. Nota: Questo è in genere sufficiente per circa 50 studi. </li><li> Preparare una colonna cromatografia liquida con 75 prep grado Superdex di togliere qualunque oligonucleotidi RBMB2 non ibridizzate. Utilizzare un 8 ml (0,7 x 20 cm) colonna di cromatografia liquida con un volume ~ 4 ml letto per purificare il piccolo volume di sonde misti. </li><li> Lavare ed equilibrare il Superdex con ~ 50 ml di tampone fosfato 1x utilizzando una pompa a siringa in esecuzione in un flusso a una portata di 0,6 ml / min. Prima di tutto il liquido entra letto il volume, fermare la pompa a siringa, staccarlo, e lasciare che il liquido restante passare attraverso la colonna per gravità. </li><li> Caricare la miscela RBMB (60 microlitri) sulla colonna cromatografica. <ol><li> Dopo che il campione RBMB ha completamenteentrato nel letto, aggiungere lentamente altri 250 ml di tampone fosfato 1x all&#39;inizio del letto per assicurare che tutto il campione è completamente inserito sulla colonna. </li><li> Riempire la colonna al bordo con tampone fosfato 1x. Chiudere la parte superiore, e avviare la pompa a siringa - siringa deve essere riempito con ~ 50 ml di PBS 1x e correre ad una velocità di flusso di 0,6 ml / min. </li><li> Una volta che il RBMB avvicina al fondo della colonna - campione RBMB in genere può essere facilmente visualizzato per il colore del colorante incorporato nella sonda - raccogliere il deflusso a 2 gocce per provetta da microcentrifuga (1,5 ml). Smettere di raccolta del campione di una volta che il colore all&#39;interno dei tubi microcentrifuga diventa chiaro. </li></ol></li><li> Unire le provette contenenti il ​​campione RBMB colorata - tipicamente 5-6 tubi - e caricare in un dispositivo di filtro centrifugo (10.000 MW cutoff). Centrifugare il campione a 10.000 RCF per 20 minuti o fino a quando il volume desiderato. Nota: Queste velocità e tempi in genereprodurre un volume finale di ~ 30 microlitri. </li><li> Misurare la concentrazione esatta del campione RBMB purificato mediante spettroscopia UV-Vis. <ol><li> Prendere 3 ml di campione RBMB concentrata e mescolare con 117 microlitri DPBS in una provetta. </li><li> Blank lo spettrofotometro con DPBS e misurare l&#39;assorbanza 200-800 nm. Nota: picco di assorbanza a 260 nm e 650 nm dovrebbe essere visibile. </li><li> Calcolare la concentrazione magazzino del RBMB ibridato in base l&#39;assorbanza a 650 nm, usando l&#39;equazione: Archivio Concentrazione (M) = A 650 * fattore di diluizione / coefficiente di estinzione dove A 650 è l&#39;assorbanza a 650 nm, il fattore di diluizione è 40. Nota: Il coefficiente di estinzione per CF640R a 650nm è 103.000 e il coefficiente di estinzione per Iowa nero RQ è ~ 20.000. I coefficienti di estinzione sono additivi e non sono sensibili alla ibridazione. Pertanto, l&#39;esempio stock RBMB ha un coefficiente di estinzione combinata di ufficio intornoy 123.000 a 650 nm. </li></ol></li><li> Etichettare la provetta in modo appropriato con il nome e la concentrazione e conservare a -20 ° C per un uso futuro. </li></ol> 2 Preparazione di Poly-D-lisina rivestito 8-ben Chambered coprioggetti <ol><li> Preparare una soluzione di 0,2 mg / ml di poli-D-lisina sciogliendo 5 mg di poli-D-lisina (polvere liofilizzata, g irradiati) in 25 ml di acqua sterile in un ambiente sterile. </li><li> Aggiungere 200 microlitri della / ml di soluzione di poli-D-lisina 0,2 mg a ciascun pozzetto di una coprioggetti 8 pozzetti a camera, in un ambiente sterile. </li><li> Incubare a temperatura ambiente per 16-18 ore nel cofano coltura cellulare. </li><li> Aspirare il poli-D-lisina e lavare la ben 3 volte con acqua distillata sterile. Nota: Le diapositive camera rivestiti possono essere conservati a 4 ° C. </li></ol> 3 Sonda di consegna Nota: Il sistema cellulare utilizzato deve contenere un costrutto gene integrato che esprime l&#39;RNA con almeno 4 sequenziale binding siti per il RBMB nella regione 3&#39;-non tradotta (UTR). Le sequenze bersaglio dovrebbero essere complementari al loop del RBMB. E &#39;consigliabile che come controllo negativo, la stessa linea cellulare è progettato per esprimere lo stesso costrutto genico, ma senza le ripetizioni in tandem. In questo protocollo, una linea cellulare di fibrosarcoma umano HT1080, è stato progettato per esprimere la GFP RNA con ripetizioni 96-tandem della sequenza bersaglio RBMB nel 3&#39;-UTR. La linea cellulare di controllo è stato progettato per esprimere la GFP wild-type RNA. <ol><li> Cellule piastra in un pallone T25 al 40-50% di confluenza un giorno prima della consegna della sonda. Coltivare le cellule con i media DMEM supplementato con 1% pen / strep e siero fetale bovino al 10% (FBS) e incubare a 37 ° C con il 5% di CO 2. </li><li> Il giorno seguente, accendere la microporator e impostare i parametri microporation a 950 V, 2 impulsi, 25 msec. Nota: Questi parametri sono stati ottimizzati per le cellule HT1080, ma sono cellule di tipo dipendente e possono essere adjusted per altri tipi di cellule, come descritto nelle istruzioni del produttore. </li><li> Riempire il tubo microporation con 4 ml di tampone elettrolitica e posizionarlo sulla stazione microporation. </li><li> Estrarre il campione magazzino di RBMB purificato e sbrinarlo. Diluire diversi microlitri di una concentrazione finale di 12 mM con 1x tampone fosfato. 1 ml è necessario per ogni microporation. </li><li> Pipettare 1 ml di terreno di coltura con FBS ma senza antibiotici in una provetta. Nota: Questo sarà utilizzato per sospendere le cellule immediatamente dopo microporation e può essere annullata, in prossimità del dispositivo microporation, per il momento. L&#39;inclusione degli antibiotici nella cultura dei media diminuirà la vitalità cellulare dopo microporation. </li><li> Rimuovere il supporto di coltura cellulare dalle cellule HT1080 ingegnerizzate (60-80% confluenti), lavare le cellule con 1 ml di Ca 2 + e Mg 2 + DPBS -Free una volta, e incubare con 1 ml di tripsina per 1-2 min. </li><li> Arrestare il trypsinization con l&#39;aggiunta di 1 ml di mezzi DMEM supplementato con siero fetale bovino al 10%, senza antibiotici e rosso fenolo, e trasferire le cellule in due da 1,5 ml provette da microcentrifuga. </li><li> Centrifugare le cellule in provetta a 200 xg per 5 min. Rimuovere il surnatante, risospendere e combinare il pellet di cellule in un volume finale di 1 ml DPBS. </li><li> Prendere 10 ml della sospensione cellulare ben miscelato e contare le cellule. </li><li> Pipettare le cellule su e giù diverse volte per assicurarsi che siano ben distribuiti e trasferire 300.000 cellule con DPBS in una nuova provetta da 1,5 ml microcentrifuga e spin giù a 200 xg per 5 min. </li><li> Rimuovere il surnatante, facendo attenzione a non disturbare il pellet. Risospendere il pellet in 11 microlitri tampone di risospensione e pipettare su e giù diverse volte per garantire che le cellule sono ben disperse. Essere sicuri di non generare eventuali bolle d&#39;aria. Nota: Le bolle d&#39;aria provocano una scintilla durante microporation e compromettere consegna RBMB e la morte cellulare. </li><li> Aggiungere 1 ml di RBMB diluito (12 mM) e mescolare bene pipettando su e giù parecchie volte. Anche in questo caso fare attenzione a non generare eventuali bolle d&#39;aria. </li><li> Aspirare 10 ml di miscela RBMB-cellule, utilizzando la pipetta microporation, e inserire la pipetta nella provetta microporation. Premere il pulsante di avvio per avviare il microporation. Nota: Non ci dovrebbero essere bolle d&#39;aria visibili nella punta. </li><li> Quando lo schermo del microporator mostra completamento, rimuovere la pipetta dalla stazione, espellere la miscela di 10 ml nella provetta che è stato preparato in precedenza, con 1 ml di terreno di coltura con FBS, ma senza antibiotici. Mescolare delicatamente oscillare il tubo da lato a lato diverse volte. </li><li> Spin le cellule a 200 xg per 5 min e lavare le cellule altre due volte, in 1 ml di rosso fenolo terreno di coltura gratuito con FBS, ma senza antibiotici, per rimuovere eventuali RBMBs che non sono stati consegnati nelle cellule. Risospendere con 400 microlitri fenolo terreno di coltura rosso gratuito con FBS, ma senzaantibiotici. </li><li> Piastra le cellule microporated nel poli-D-lisina rivestite coprioggetti 8-bene camerata a 200 ml per pozzetto o alla confluenza desiderata. </li><li> Opzionale: Se è auspicabile immagine nucleo, aggiungere Hoescht 33342 alle cellule ad una concentrazione finale di 0,01 mg / ml. </li><li> Posizionare i coprioggetti camerata in un incubatore di coltura cellulare. Incubare le cellule per 1-2 ore prima di imaging, in modo che le cellule hanno il tempo sufficiente per sistemarsi sulla superficie coprioggetti. Nota: Imaging può essere eseguita appena 30 minuti post-microporation. </li></ol> 4. Image Acquisition <ol><li> Accendere il sistema all&#39;inizio dell&#39;incubazione vivo fase cellula ed equilibrare esso fino a raggiungere 37 ° C, 5% di CO 2, e 75% di umidità. </li><li> Accendere la sorgente luminosa a fluorescenza e microscopio e aprire il software Metamorph. Nota: altri software simili per il controllo del microscopio e acquisizione delle immagini può anche essere usato. </li><li> Applicare olio Immersol alobiettivo. </li><li> Trasferire il coprioggetti camerata con le cellule microporated al sistema top di incubazione dal vivo palco cellulare. Incubare il sistema superiore palco fino a quando la temperatura e CO 2 livelli sono stabilizzati. </li><li> Aprire la scheda Acquisisci, nel software Metamorph. Fare clic sul pulsante Show Live per trovare il campo, regolare la messa a fuoco in luce bianca e fare clic sul pulsante Stop dal vivo. </li><li> Nella scheda Acquisisci, fare clic e aprire il pulsante di scelta rapida acquisizione ruscello, e impostare i parametri di acquisizione filmato desiderati. Acquisire 150 fotogrammi usando il filtro Cy5 / CF640R e salvare le immagini sul disco rigido. </li></ol>

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B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cyanine+fluorophore+derivatives+with+enhanced+photostability.">Cyanine fluorophore derivatives with enhanced photostability.</a> Nat Methods. 9 (1), 68-71 (2012).</li><li>Kumaraswamy, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent-conjugated+polymer+superquenching+facilitates+highly+sensitive+detection+of+proteases.">Fluorescent-conjugated polymer superquenching facilitates highly sensitive detection of proteases.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 101 (20), 7511-7515 (2004).</li><li>Yang, C. J., Pinto, M., Schanze, K., Tan, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+synthesis+of+an+oligonucleotide-poly(phenylene+ethynylene)+conjugate+with+a+precise+one-to-one+molecular+ratio.">Direct synthesis of an oligonucleotide-poly(phenylene ethynylene) conjugate with a precise one-to-one molecular ratio.</a> Angew Chem Int Ed Engl. 44 (17), 2572-2576 (2005).</li><li>Lu, J., Tsourkas, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+individual+microRNAs+in+single+mammalian+cells+in+situ.">Imaging individual microRNAs in single mammalian cells in situ.</a> Nucleic Acids Res. 37 (14), e100 (2009).</li><li>Raj, A., Peskin, C. S., Tranchina, D., Vargas, D. Y., Tyagi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stochastic+mRNA+synthesis+in+mammalian+cells.">Stochastic mRNA synthesis in mammalian cells.</a> PLoS Biol. 4 (10), e309 (2006).</li></ol>

Dr. Mark Behlke e il dottor Ling Huang sono impiegati da IDT che offre oligonucleotidi per la vendita simile ad alcuni dei composti descritti nel manoscritto. IDT è, tuttavia, non è una società quotata in borsa e che personalmente non possiede azioni / equity in IDT.

La capacità di immagini singole trascritti di RNA ingegnerizzati in cellule viventi utilizzando un microscopio a grande campo convenzionale richiede un segnale luminoso e fotostabile fluorescente per essere associate a ogni trascrizione di RNA e di uno sfondo fluorescente a basso proveniente da sonde fluorescenti non legati. In questo metodo, un segnale fluorescente è ottenuto ibridando multipla (fino a 96) sonde fluorescenti basato oligonucleotidi, cioè RBMBs, su ciascun trascritto di RNA. Tuttavia, solo qu...

L&#39;espressione e la regolazione dei trascritti di RNA è un processo complesso e dinamico che è in gran parte responsabile del controllo del comportamento delle cellule e del destino. Anche se l&#39;importanza di RNA in funzione delle cellule dettare è noto da qualche tempo, è spesso difficile tracciare chiare connessioni tra le due, in quanto la maggior parte degli strumenti di analisi di RNA non hanno la risoluzione spaziale e temporale necessaria per acquisire importanti eventi normativi quali la trascrizione scoppio, RNA traffico, e l&#39;elaborazione di RNA localizzata. Questo ha portato l&#39;avvento di diverse tecniche che consentono singoli trascritti di RNA per essere visualizzati in cellule viventi in tempo reale 1. Forse, il più importante di queste tecniche utilizza una proteina di fusione GFP-MS2 di RNA che è stato progettato per contenere ripetizioni in tandem del sito di legame MS2 nel 3&#39;-UTR 2,3 bersaglio. Portando più molecole di GFP in stretta vicinanza, le singole trascritti di RNA appaiono macchie fluorescenti luminositramite microscopia a fluorescenza. Il sistema di GFP-MS2 ha fornito una visibilità senza precedenti sul comportamento RNA, inclusi visualizzazione diretta e misure di trascrizione scoppio 4,5, il rilevamento di localizzazione sub-cellulare unico e lavorazione 6-9, e in tempo reale l&#39;imaging del trasporto dell&#39;RNA 10. Tuttavia, nonostante l&#39;enorme potenziale del sistema GFP-MS2, proteine ​​di fusione GFP-MS2 non legate possono creare un segnale di alta sfondo fluorescente che limita la versatilità e la gamma dinamica di questa tecnica. Diversi approcci sono stati sviluppati per limitare questo segnale di fondo, tra cui compartimentazione subcellulare di non legato GFP-MS2 10, proteina frammento complementazione 11, e proteine ​​leganti RNA alternativi e obiettivi 12. Tuttavia, tutti questi approcci rimangono sensibili alla espressione relativa e totale del bersaglio RNA e proteina di fusione GFP-MS2. Come unlternative ai sistemi GFP-MS2, fari molecolari sono stati utilizzati anche per rilevare trascritti di RNA ingegnerizzati con ripetizioni in tandem del sito di legame complementare nel 3&#39;-UTR 13,14. Beacon molecolari sono sonde oligonucleotidiche-hairpin formando contrassegnate ad una estremità con un quencher e all&#39;altra estremità con un reporter fluorescente. Quando non è vincolata a bersaglio RNA reporter fluorescente e quencher rimanere nelle immediate vicinanze, con un conseguente stato di bassa fluorescente. Dopo l&#39;ibridazione, il reporter fluorescente e quencher sono costrette a parte e fluorescenza viene ripristinato. Simile al sistema GFP-MS2, il legame di molteplici fari molecolari su un singolo risultato di RNA trascritto in un punto luminoso fluorescente che può essere identificato mediante microscopia a fluorescenza; tuttavia, la fluorescenza di fondo dovrebbe essere molto inferiore, a causa della configurazione spento di fari molecolari legati. Sfortunatamente, nonostante il meccanismo di attivazione intelligente che è integrata mdisegno faro olecular, ora vi è una crescente evidenza che non ibridizzate fari molecolari non rimangono nella conformazione tornante quando introdotto in cellule viventi. Di conseguenza, generano un segnale falso-positivo che riduce significativamente il rapporto segnale-bassa. Per ovviare a questo inconveniente, abbiamo recentemente sviluppato una nuova sonda sintetica per l&#39;imaging RNA nelle cellule viventi, raziometriche fari bimolecolari (RBMBs; Figura 1A) 15,16. RBMBs sono composti da due filamenti di oligonucleotidi 2&#39;-O-metil che formano una struttura ibrida con le caratteristiche di entrambe breve hairpin RNA (shRNA) e fari molecolari. Il meccanismo di loop e l&#39;attivazione di fluorescenza è simile al segnale molecolare, mentre il lungo dominio a doppio filamento con una sporgenza 3&#39;-UU è più caratteristico di shRNA. Le caratteristiche shRNA sono progettate per guidare l&#39;esportazione nucleare, che abbiamo trovato aumenti di vita intracellulare per&gt; 24 ore, con il minimo degrado osservabile, eimpedisce non specifico apertura del loop. Come risultato RBMBs presentano uno sfondo segnale-significativamente superiore beacon molecolari. Va notato che RBMBs non possono essere preparati utilizzando oligonucleotidi di DNA, dal momento che le sonde basate sul DNA non possiedono le stesse capacità di esportazione nucleare come sonde di RNA. Strutturalmente, il ciclo RBMB è in genere progettato per essere tra 15 e 21 basi lungo, per creare un equilibrio tra specificità e selettività su RNA ibridazione. Il gambo corto che si forma dai due domini di auto-complementare di solito è progettato per essere 4 basi. Se si seleziona uno stelo più lungo, il tasso di ibridazione tra loop RBMB e RNA bersaglio è rallentato in modo significativo 17,18. Viceversa, quando è selezionata una sequenza più corta radice la temperatura di fusione è spesso troppo bassa per sostenere la struttura stem-loop a 37 ° C, portando ad un elevato segnale di fondo. La specificità del RBMB è anche rossouced come la lunghezza dello stelo si accorcia. Poiché la sequenza del RBMB stem-loop possono anche influenzare le prestazioni RBMB, deve essere attentamente selezionati 19. In particolare, le sequenze di loop ideale dovrebbe avere il minimo struttura secondaria, ibridare a sequenze di RNA con una minima struttura secondaria, evitare siti di legame della proteina, ed evitare fuori-obiettivo vincolante. Le previsioni di entrambi RBMB e struttura secondaria dell&#39;RNA possono essere ottenuti utilizzando software come mfold 20. Complementari siti off-target possono identificato utilizzando un nucleotide base locale Assegnazione Search Tool (BLAST). Tuttavia, a causa delle incongruenze nei previsioni del modello e la difficoltà di identificare i siti di proteine ​​di aspettare, la specificità di tutte le RBMBs deve infine essere convalidato sperimentalmente. Se auspicabile, un colorante di riferimento unquenched insensibile allo stato ibridazione può essere aggiunto al RBMB 15. L&#39;aggiunta di un colorante di riferimento può prOvide un marcatore per la consegna della sonda e possono essere usate per l&#39;imaging raziometrico, se sono necessarie misure più accurate di fluorescenza cellulare totale. I coloranti di riferimento permette misurazioni da regolare per le differenze di fondo a causa di cell-to-cell variazioni nella consegna. Tuttavia, quando l&#39;imaging RNA individuo trascrizioni il colorante di riferimento non è necessaria. In particolare, alcuni coloranti di riferimento possono interferire con l&#39;esportazione di RBMBs dal nucleo, portando ad un segnale di fondo leggermente superiore nel nucleo. Se progettato correttamente, RBMBs possono essere usati per immagine trascritti di RNA in cellule viventi individuo singolo, se l&#39;RNA bersaglio è progettato per contenere almeno quattro siti di legame RBMB (Figura 1B) 16. RBMBs possono essere efficacemente forniti in una vasta gamma di tipi di cellule via microporation, con poco o nessun effetto sulla vitalità cellulare 21, e le misure quantitative di espressione genica possono essereacquisito entro 30 min. Inoltre, la metodologia è abbastanza insensibile a livelli di concentrazione RBMB e RNA bersaglio, dal momento che la fluorescenza da RBMBs non legato viene efficacemente spegne. Qui forniamo una descrizione dettagliata della metodologia utilizzata per preparare e purificare RBMBs, nonché una procedura generale per la fornitura di RBMBs in cellule vive tramite microporation e l&#39;imaging di trascritti di RNA singoli in tempo reale.

<table><tbody><tr><td>Nuclease-free water</td><td>Life Technologies</td><td>AM9932</td><td>no DEPC-treated</td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Life Technologies</td><td>14190-144</td><td>No Ca&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt; and Mg&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;</td></tr><tr><td>Cary 100 UV-Vis spectrophotometer</td><td>Agilent Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Potassium phosphate dibasic</td><td>Fisher Scientific</td><td>P290-500</td><td></td></tr><tr><td>Potassium phosphate monobasic</td><td>Fisher Scientific</td><td>P284-500</td><td></td></tr><tr><td>Sodium phosphate monobasic</td><td>Fisher Scientific</td><td>S381-500</td><td></td></tr><tr><td>Microcentrifuge tubes</td><td>Eppendorf</td><td>22364111</td><td>1.5 ml</td></tr><tr><td>Chromatography column</td><td>Kimble Chase Life Science</td><td>420400-0720</td><td>0.7 x 20 cm</td></tr><tr><td>Superdex 75 prep grade</td><td>GE healthcare</td><td>17-1044-01</td><td></td></tr><tr><td>Syringe pump</td><td>Braintree Scientific</td><td>BS-300</td><td></td></tr><tr><td>Syringe</td><td>BD</td><td>301035</td><td>60 ml, Luer-lok tip</td></tr><tr><td>Centrifugal filter units</td><td>Millipore</td><td>UFC501096</td><td>MW 10,000 cutoff</td></tr><tr><td>Centrifuge 5418</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Poly-D-lysine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7280-5MG</td><td>lyophilized powder, g-irradiated</td></tr><tr><td>8-well chambered coverglass</td><td>Fisher Scientific</td><td>155409</td><td>Working volume 0.2-0.5 ml</td></tr><tr><td>HT1080</td><td>ATCC</td><td>CCL-121</td><td>Human Fibrosarcoma cell line</td></tr><tr><td>Cell culture flask</td><td>Corning</td><td>430639</td><td>25 cm&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt;</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Life Technologies</td><td>11965084</td><td>High glucose</td></tr><tr><td>DMEM without phenol red</td><td>Life Technologies</td><td>21063029</td><td>High glucose</td></tr><tr><td>Fetal bovine serum</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F2442-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Penecillin/streptomycin</td><td>Life Technologies</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>Life Technologies</td><td>25300054</td><td>0.05% Trypsin-EDTA</td></tr><tr><td>Neon transfection system</td><td>Life Technologies</td><td>MPK5000</td><td></td></tr><tr><td>Neon transfection system kit</td><td>Life Technologies</td><td>MPK1096</td><td></td></tr><tr><td>Hemacytometer</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-671-10</td><td></td></tr><tr><td>Hoescht 33342</td><td>Life Technologies</td><td>H1399</td><td></td></tr><tr><td>IX-81 Inverted fluorescence microscope</td><td>Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SOLA light engine</td><td>Lumencor</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Metamorph</td><td>Molecular Devices</td><td></td><td>Software controlling microscope</td></tr><tr><td>Immersol oil 518F</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-624-66B</td><td></td></tr></tbody></table>

real-time imaging of single engineered rna transcripts in living cells using ratiometric bimolecular beacons

La crescente consapevolezza che sia la regolazione temporale e spaziale dell&#39;espressione genica può avere conseguenze importanti sulla funzione cellulare ha portato allo sviluppo di tecniche diverse per visualizzare i singoli trascritti di RNA in cellule viventi singoli. Una tecnica promettente che è stato recentemente descritto utilizza una sonda basata oligonucleotide-ottica, raziometrico faro biomolecolare (RBMB), per rilevare trascritti di RNA che sono stati progettati per contenere almeno quattro ripetizioni in tandem della sequenza bersaglio RBMB nella regione 3&#39;-non tradotta. RBMBs sono specificamente progettati per emettere un segnale fluorescente su ibridazione di RNA complementare, ma per il resto rimangono spente. L&#39;uso di una sonda sintetica in questo approccio consente fotostabile, rossa spostata, e coloranti organici altamente emissive da utilizzare per l&#39;imaging. Il legame di più RBMBs ai ingegnerizzati RNA trascrizioni risultati in macchie di fluorescenza discreti se visto sotto un microscopio a fluorescenza a livello di campo. Di conseguenza, il movimento dei singoli trascritti di RNA può essere facilmente visualizzato in tempo reale prendendo una serie temporale di immagini fluorescenti. Qui si descrive la preparazione e purificazione di RBMBs, consegna in cellule da microporation e live-cell imaging trascrizioni singoli di RNA.

Poco dopo la microporation delle cellule HT1080 in presenza di RBMBs, singoli trascritti di RNA che sono stati progettati per contenere più siti di legame RBMB nella loro 3&#39;-UTR appaiono macchie fluorescenti luminosi quando ripreso dal grande campo microscopia a fluorescenza (Figura 2). Mentre i singoli trascritti di RNA con siti di legame da un minimo di quattro RBMB possono essere esposte nelle cellule vive, il più siti nel 3&#39;-UTR vincolante RBMB, il più forte il segnale fluorescente. Inolt...

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Real-time Imaging of Single Engineered RNA Transcripts in Living Cells Using Ratiometric Bimolecular Beacons

Ratiometric beacon bimolecolari (RBMBs) possono essere utilizzati per immagini singole trascritti di RNA ingegnerizzati in cellule viventi. Qui, descriviamo la preparazione e purificazione di RBMBs, consegna delle RBMBs in cellule di microporation e l&#39;imaging fluorescente di trascritti di RNA singoli in tempo reale.

In tempo reale Imaging del singolo Engineered RNA trascritti in cellule viventi Utilizzando Ratiometric bimolecolari Beacons

The growing realization that both the temporal and spatial regulation of gene expression can have important consequences on cell function has led to the ...

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Research

JoVE Journal

Biology

11.7K Views.  University of Pennsylvania.  Ratiometric beacon bimolecolari (RBMBs) possono essere utilizzati per immagini singole trascritti di RNA ingegnerizzati in cellule viventi. Qui, descriviamo la preparazione e purificazione di RBMBs, consegna delle RBMBs in cellule di microporation e l'imaging fluorescente di trascritti di RNA singoli in tempo reale. 

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Capture and Identification of RNA-binding Proteins by Using Click Chemistry-assisted RNA-interactome Capture (CARIC) Strategy

A comprehensive identification of RNA-binding proteins (RBPs) is key to understanding the posttranscriptional regulatory network in cells. A widely used strategy for RBP capture exploits the polyadenylation [poly(A)] of target RNAs, which mostly occurs on eukaryotic mature mRNAs, leaving most binding proteins of non-poly(A) RNAs unidentified. Here we describe the detailed procedures of a recently reported method termed click chemistry-assisted RNA-interactome capture (CARIC), which enables the transcriptome-wide capture of both poly(A) and non-poly(A) RBPs by combining the metabolic labeling of RNAs, in vivo UV cross-linking, and bioorthogonal tagging.

Capture and Identification of RNA-binding Proteins by Using Click Chemistry-assisted RNA-interactome Capture CARIC Strategy

A detailed protocol for applying the click chemistry-assisted RNA-interactome capture (CARIC) strategy to identify proteins binding to both coding and noncoding RNAs is presented.

Cattura e identificazione delle proteine RNA-leganti utilizzando clic chimica-assistita RNA-Interactoma (Castaldi) strategia di acquisizione

A comprehensive identification of RNA-binding proteins (RBPs) is key to understanding the posttranscriptional regulatory network in cells. A widely used ...

Ricerca

Biochimica

An In Vitro Single-Molecule Imaging Assay for the Analysis of Cap-Dependent Translation Kinetics

Cap-dependent protein synthesis is the predominant translation pathway in eukaryotic cells. While various biochemical and genetic approaches have allowed extensive studies of cap-dependent translation and its regulation, high resolution kinetic characterization of this translation pathway is still lacking. Recently, we developed an in vitro assay to measure cap-dependent translation kinetics with single-molecule resolution. The assay is based on fluorescently labeled antibody binding to nascent epitope-tagged polypeptide. By imaging the binding and dissociation of antibodies to and from nascent peptide&#8211;ribosome&#8211;mRNA complexes, the translation progression on individual mRNAs can be tracked. Here, we present a protocol for establishing this assay, including mRNA and PEGylated slide preparations, real-time imaging of translation, and analysis of single molecule trajectories. This assay enables tracking of individual cap-dependent translation events and resolves key translation kinetics, such as initiation and elongation rates. The assay can be widely applied to distinct translation systems and should broadly benefit in vitro studies of cap-dependent translation kinetics and translational control mechanisms.

An In Vitro Single-Molecule Imaging Assay for the Analysis of Cap-Dependent Translation Kinetics

Tracking individual translation events allows for high-resolution kinetic studies of cap-dependent translation mechanisms. Here we demonstrate an in vitro single-molecule assay based on imaging interactions between fluorescently labeled antibodies and epitope-tagged nascent peptides. This method enables single-molecule characterization of initiation and peptide elongation kinetics during active in vitro cap-dependent translation.

Un saggio di imaging a singola molecola in vitro per l'analisi della cinetica di traduzione dipendente dal cappuccio

Cap-dependent protein synthesis is the predominant translation pathway in eukaryotic cells. While various biochemical and genetic approaches have allowed ...

Single Cell Analysis Of Transcriptionally Active Alleles By Single Molecule FISH

Gene transcription is an essential process in cell biology, and allows cells to interpret and respond to internal and external cues. Traditional bulk population methods (Northern blot, PCR, and RNAseq) that measure mRNA levels lack the ability to provide information on cell-to-cell variation in responses. Precise single cell and allelic visualization and quantification is possible via single molecule RNA fluorescence in situ hybridization (smFISH). RNA-FISH is performed by hybridizing target RNAs with labeled oligonucleotide probes. These can be imaged in medium/high throughput modalities, and, through image analysis pipelines, provide quantitative data on both mature and nascent RNAs, all at the single cell level. The fixation, permeabilization, hybridization and imaging steps have been optimized in the lab over many years using the model system described herein, which results in successful and robust single cell analysis of smFISH labeling. The main goal with sample preparation and processing is to produce high quality images characterized by a high signal-to-noise ratio to reduce false positives and provide data that are more accurate. Here, we present a protocol describing the pipeline from sample preparation to data analysis in conjunction with suggestions and optimization steps to tailor to specific samples.&#160;

Single molecule RNA fluorescence in situ hybridization (smFISH) is a method to accurately quantify levels and localization of specific RNAs at the single cell level. Here, we report our validated lab protocols for wet-bench processing, imaging and image analysis for single cell quantification of specific RNAs.

Analisi a singola cellula di alleli trascrizionalmente attivi mediante FISH a singola molecola

Gene transcription is an essential process in cell biology, and allows cells to interpret and respond to internal and external cues. Traditional bulk ...

A Rapid High-throughput Method for Mapping Ribonucleoproteins (RNPs) on Human pre-mRNA

Sequencing RNAs that co-immunoprecipitate (co-IP) with RNA binding proteins has increased our understanding of splicing by demonstrating that binding location often influences function of a splicing factor.  However, as with any sampling strategy the chance of identifying an RNA bound to a splicing factor is proportional to its cellular abundance.  We have developed a novel in vitro approach for surveying binding specificity on otherwise transient pre-mRNA. This approach utilizes a specifically designed oligonucleotide pool that tiles across introns, exons, splice junctions, or other pre-mRNA.  The pool is subjected to some kind of molecular selection. Here, we demonstrate the method by separating the oligonucleotide into a bound and unbound fraction and utilize a two color array strategy to record the enrichment of each oligonucleotide in the bound fraction. The array data generates high-resolution maps with the ability to identify sequence-specific and structural determinates of ribonucleoprotein (RNP) binding on pre-mRNA.  A unique advantage to this method is its ability to avoid the sampling bias towards mRNA associated with current IP and SELEX techniques, as the pool is specifically designed and synthesized from pre-mRNA sequence. The flexibility of the oligonucleotide pool is another advantage since the experimenter chooses which regions to study and tile across, tailoring the pool to their individual needs.  Using this technique, one can assay the effects of polymorphisms or mutations on binding on a large scale or clone the library into a functional splicing reporter and identify oligonucleotides that are enriched in the included fraction.  This novel in vitro high-resolution mapping scheme provides a unique way to study RNP interactions with transient pre-mRNA species, whose low abundance makes them difficult to study with current in vivo techniques.  



A Rapid High-throughput Method for Mapping Ribonucleoproteins RNPs on Human pre-mRNA

Due to the transient nature of pre-mRNA, it can be difficult to isolate and study in vivo. Here, we present a novel in vitro approach to investigate RNA-protein interactions using a synthetic oligo pool that tiles across selected regions of pre-mRNA.

Un rapido ad alta velocità Metodo per ribonucleoproteine ​​Mapping (RNP) su Human pre-mRNA

Sequencing RNAs that co-immunoprecipitate (co-IP) with RNA binding proteins has increased our understanding of splicing by demonstrating that binding ...

Biologia

Measuring the Kinetics of mRNA Transcription in Single Living Cells

The transcriptional activity of RNA polymerase II (Pol II) is a dynamic process and therefore measuring the kinetics of the transcriptional process in vivo is of importance. Pol II kinetics have been measured using biochemical or molecular methods.1-3 In recent years, with the development of new visualization methods, it has become possible to follow transcription as it occurs in real time in single living cells.4 Herein we describe how to perform analysis of Pol II elongation kinetics on a specific gene in living cells.5, 6 Using a cell line in which a specific gene locus (DNA), its mRNA product, and the final protein product can be fluorescently labeled and visualized in vivo, it is possible to detect the actual transcription of mRNAs on the gene of interest.7, 8 The mRNA is fluorescently tagged using the MS2 system for tagging mRNAs in vivo, where the 3'UTR of the mRNA transcripts contain 24 MS2 stem-loop repeats, which provide highly specific binding sites for the YFP-MS2 coat protein that labels the mRNA as it is transcribed.9 To monitor the kinetics of transcription we use the Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) method. By photobleaching the YFP-MS2-tagged nascent transcripts at the site of transcription and then following the recovery of this signal over time, we obtain the synthesis rate of the newly made mRNAs.5 In other words, YFP-MS2 fluorescence recovery reflects the generation of new MS2 stem-loops in the nascent transcripts and their binding by fluorescent free YFP-MS2 molecules entering from the surrounding nucleoplasm. The FRAP recovery curves are then analyzed using mathematical mechanistic models formalized by a series of differential equations, in order to retrieve the kinetic time parameters of transcription.

RNA polymerase II transcriptional kinetics are measured on specific genes in living cells. mRNAs transcribed from the gene of interest are fluorescently tagged and using Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) the in vivo kinetics of transcriptional elongation are obtained.

Misurazione della Cinetica di Trascrizione mRNA nelle cellule viventi singolo

The transcriptional activity of RNA polymerase II (Pol II) is a dynamic process and therefore measuring the kinetics of the transcriptional process in ...

<meta charset="utf8"></head><body>Marcatura terminale a doppio colore e incapsulamento vescicolare di RNA per studi smFRET-TIRF

Fluorescent End-Labeling and Encapsulation of Long RNAs for Single-Molecule FRET-TIRF Microscopy

Single-molecule F&#246;rster Resonance Energy Transfer (smFRET) excels in studying dynamic biomolecules by allowing precise observation of their conformational changes over time. To monitor RNA dynamics with smFRET, we developed a method to covalently label RNAs at their termini with a FRET pair of fluorophores. This direct end-labeling strategy targets the 5&#39;-phosphate by carbodiimide (EDC)/N-hydroxysuccinimide (NHS) activation and the 3&#39;-ribose by periodate oxidation, which can be adapted to other RNAs regardless of their size and sequence to study them independently of artificial modifications. Furthermore, the 5&#39;-EDC/NHS activation is of general interest to all nucleic acids with a 5&#39;-phosphate. The use of commercially available chemicals eliminates the need to synthesize RNA-specific probes.
Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) microscopy requires the surface-immobilized molecules of interest to be within the evanescent field to be illuminated. A sophisticated way of keeping the RNA molecules within the evanescent field is to encapsulate them in phospholipid vesicles. Encapsulation benefits from the best of both worlds, tethering the molecule to the surface while enabling free diffusion of the molecule. We ensure that each vesicle contains only a single RNA molecule, enabling single-molecule imaging. Upon dual-end labeling and encapsulation of the RNA of interest, smFRET measurements offer a dynamic and detailed view of RNA behavior.

<meta charset="utf8"></head><body>Marcatura terminale fluorescente e incapsulamento di RNA lunghi per microscopia FRET-TIRF a singola molecola

This article describes the dual-color labeling of long RNAs at termini positions and their surface immobilization via encapsulation in phospholipid vesicles for single-molecule FRET TIRF microscopy applications. Combining these techniques enables precise visualization and analysis of RNA dynamics at the single-molecule level.

Marcatura terminale fluorescente e incapsulamento di RNA lunghi per microscopia FRET-TIRF a singola molecola

Single-molecule F&#246;rster Resonance Energy Transfer (smFRET) excels in studying dynamic biomolecules by allowing precise observation of their ...

Metabolic Labeling of Newly Transcribed RNA for High Resolution Gene Expression Profiling of RNA Synthesis, Processing and Decay in Cell Culture

The development of whole-transcriptome microarrays and next-generation sequencing has revolutionized our understanding of the complexity of cellular gene expression. Along with a better understanding of the involved molecular mechanisms, precise measurements of the underlying kinetics have become increasingly important. Here, these powerful methodologies face major limitations due to intrinsic properties of the template samples they study, i.e. total cellular RNA. In many cases changes in total cellular RNA occur either too slowly or too quickly to represent the underlying molecular events and their kinetics with sufficient resolution. In addition, the contribution of alterations in RNA synthesis, processing, and decay are not readily differentiated.
We recently developed high-resolution gene expression profiling to overcome these limitations. Our approach is based on metabolic labeling of newly transcribed RNA with 4-thiouridine (thus also referred to as 4sU-tagging) followed by rigorous purification of newly transcribed RNA using thiol-specific biotinylation and streptavidin-coated magnetic beads. It is applicable to a broad range of organisms including vertebrates, Drosophila, and yeast. We successfully applied 4sU-tagging to study real-time kinetics of transcription factor activities, provide precise measurements of RNA half-lives, and obtain novel insights into the kinetics of RNA processing. Finally, computational modeling can be employed to generate an integrated, comprehensive analysis of the underlying molecular mechanisms.

Total cellular RNA provides a poor template for studying short-term changes in RNA synthesis and decay as well as the kinetics of RNA processing. Here, we describe metabolic labeling of newly transcribed RNA with 4-thiouridine followed by thiol-specific biotinylation and purification of newly transcribed RNA allowing to overcome these limitations.

Marcatura metabolica di RNA recentemente trascritto per Alta Risoluzione profili di espressione genica di RNA di sintesi, trattamento e Decay in coltura cellulare

The development of whole-transcriptome microarrays and next-generation sequencing has revolutionized our understanding of the complexity of cellular gene ...

Method for Labeling Transcripts in Individual Escherichia coli Cells for Single-molecule Fluorescence In Situ Hybridization Experiments

A method is described for labeling individual messenger RNA (mRNA) transcripts in fixed bacteria for use in single-molecule fluorescence in situ hybridization (smFISH) experiments in E. coli. smFISH allows the measurement of cell-to-cell variability in mRNA copy number of genes of interest, as well as the subcellular location of the transcripts. The main steps involved are fixation of the bacterial cell culture, permeabilization of cell membranes, and hybridization of the target transcripts with sets of commercially available short fluorescently-labeled oligonucleotide probes. smFISH can allow the imaging of the transcripts of multiple genes in the same cell, with limitations imposed by the spectral overlap between different fluorescent markers. Following completion of the protocol illustrated below, cells can be readily imaged using a microscope coupled with a camera suitable for low-intensity fluorescence. These images, together with cell contours obtained from segmentation of phase contrast frames, or from cell membrane staining, allow the calculation of the mRNA copy number distribution of a sample of cells using open-source or custom-written software. The labeling method described here can also be applied to image transcripts with stochastic optical reconstruction microscopy (STORM).

Method for Labeling Transcripts in Individual Escherichia coli Cells for Single-molecule Fluorescence In Situ Hybridization Experiments

This manuscript describes a method for labeling individual messenger RNA (mRNA) transcripts with fluorescently-labeled DNA probes, for use in single-molecule fluorescence in situ hybridization (smFISH) experiments in E. coli. smFISH is a visualization method that allows the simultaneous detection, localization, and quantification of single mRNA molecules in fixed individual cells.

Metodo per l'etichettatura di trascrizioni in cellule individuali Escherichia coli per singola molecola di fluorescenza In Situ gli esperimenti di ibridazione

In tempo reale Imaging del singolo Engineered RNA trascritti in cellule viventi Utilizzando Ratiometric bimolecolari Beacons

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Cattura e identificazione delle proteine RNA-leganti utilizzando clic chimica-assistita RNA-Interactoma (Castaldi) strategia di acquisizione

Un saggio di imaging a singola molecola in vitro per l'analisi della cinetica di traduzione dipendente dal cappuccio

Analisi a singola cellula di alleli trascrizionalmente attivi mediante FISH a singola molecola

Un rapido ad alta velocità Metodo per ribonucleoproteine Mapping (RNP) su Human pre-mRNA

Misurazione della Cinetica di Trascrizione mRNA nelle cellule viventi singolo

Marcatura terminale fluorescente e incapsulamento di RNA lunghi per microscopia FRET-TIRF a singola molecola

Marcatura terminale fluorescente e incapsulamento di RNA lunghi per microscopia FRET-TIRF a singola molecola

Marcatura terminale fluorescente e incapsulamento di RNA lunghi per microscopia FRET-TIRF a singola molecola

Marcatura metabolica di RNA recentemente trascritto per Alta Risoluzione profili di espressione genica di RNA di sintesi, trattamento e Decay in coltura cellulare

Metodo per l'etichettatura di trascrizioni in cellule individuali Escherichia coli per singola molecola di fluorescenza In Situ gli esperimenti di ibridazione

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