The opinions or assertions contained herein are the private views of the authors and are not to be construed as official or as reflecting the views of the Department of the Army or the Department of Defense. This research was performed while the authors Alberto Mu&#241;iz, Ramesh R Kaini, Whitney A Greene and Jae-Hyek Choi held a National Research Council Postdoctoral Research Associateship at the USAISR. This work was supported by U.S. Army Clinical Rehabilitative Medicine Research Program (CRMRP) and Military Operational Medicine Research Program (MOMRP).

1. Preparazione dei reagenti Cultura e piastre di coltura <ol><li> Preparare cellule staminali mezzo di coltura privo di alimentatore aggiungendo 100 ml di integratore senza siero 5x a 400 ml di cellule staminali medio basale. Il medium è stabile a 4 ° C per 2 settimane ed a -20 ° C per 6 mesi. </li><li> Aggiungere 10 mM soluzione di rho-associata, avvolto-coil contenente la proteina chinasi (Rock) inibitore di disponibile in commercio corpo embrioide (EB) di media formazione (Y-27362). </li><li> Preparare medio differenziazione aggiungendo 0,1 mm β-mercaptoetanolo, 0,1 mm aminoacidi non essenziali, 2 mM L-glutammina, il 10% la sostituzione siero knockout (KSR) e 10 mg / ml di gentamicina per Modified Eagle Medium / Nutrient miscela di Dulbecco F-12 (DMEM / F12). </li><li> Preparare iPS-RPE medio aggiungendo 1x N1 supplemento, 0,1 mm aminoacidi non indispensabili, 250 mg / ml taurina, 13 ng sale di sodio / ml triiodo-L-thyronine, 20 ng / ml idrocortisone, 5 mg / ml gentamicina, e il 15% siero fetale bovino (FBS) &lt;sup&gt; 21 per Minimum Essential Media Eagle (MEM). Regolare il pH a 7,4. </li><li> Preparare sodio sale stock soluzione triiodo-L-thyronine. Sciogliere 1 mg di sale sodico triiodo-L-thyronine in 1 N di idrossido di sodio agitando delicatamente. Aggiungere 49 ml di MEM per fare 50 ml di 20 ug / ml di sale sodico triiodo-L-tironina. Preparare aliquote e congelare a -20 ° C fino al momento dell&#39;uso. Utilizzare volume appropriato per raggiungere la concentrazione desiderata in terreno di coltura. </li><li> Preparare soluzione stock idrocortisone. Solubilizzare 1 mg di idrocortisone in 1 ml di etanolo al 100% agitando. Aggiungere 19 ml di MEM per fare 20 ml di 50 mg / ml di idrocortisone soluzione madre. Aliquotare e congelare a -20 ° C fino al momento dell&#39;uso. Utilizzare volume appropriato per raggiungere la concentrazione desiderata nel terreno di coltura. </li><li> Preparare una soluzione di lavoro di dispasi di 1 mg / ml in DMEM / F12. </li><li> Preparazione delle lastre matrici rivestite <ol><li> Preparare matrice proteina estratta da Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) moucellule di sarcoma di Se in DMEM / F12 a 0,08 mg / ml. Coat ciascun pozzetto di una piastra da 6 pozzetti con 1 ml di soluzione di matrice. Incubare le piastre rivestite a temperatura ambiente per 1 ora. </li><li> Dopo l&#39;incubazione 1 ora, aspirare l&#39;eccesso DMEM / F12. Aggiungere 0,5 ml di staminali mezzo di coltura cellulare senza alimentatore per evitare l&#39;essiccazione dei pozzetti. Le piastre rivestite matrice sono pronte per l&#39;uso. </li></ol></li><li> Preparare micropiastra, sciacquando ogni pozzetto con 2 ml di DMEM / F12. Rimuovere DMEM / F12 e aggiungere 0,5 ml di media formazione EB integrato con inibitore Rock a ciascun bene. Centrifugare la piastra a 2000 xg per 5 minuti per rimuovere eventuali bolle d&#39;aria. </li><li> Preparare tampone colorazione FACS mescolando 2% FBS, e il 0,09% di sodio azide in tampone fosfato (PBS). Regolare il buffer a pH 7,4. </li><li> Preparare la soluzione neutralizzante tripsina aggiungendo 10% FBS per DMEM / F12. </li></ol> 2. iPS Cultura <ol><li> Prima della semina delle cellule iPS, caldo staminali coltura cellulare mezzo privo di alimentatore a 37 ° C, e hanno la matrix rivestito piatti pronti. </li><li> Scongelare rapidamente le cellule iPS IMR90-1 in un bagno di 37 ° C dell&#39;acqua. Quindi rimuovere la crio-vial dal bagnomaria e pulire il flacone con il 70% di etanolo. Trasferire le cellule in una provetta conica da 15 ml usando una pipetta 2 ml per minimizzare rottura dei grumi di cellule. </li><li> Aggiungere 5 ml di caldo cellule staminali mezzo di coltura privo di alimentatore per le cellule goccia a goccia e mescolare delicatamente. Centrifugare le cellule a 300 xg per 5 minuti a RT e rimuovere il surnatante. </li><li> Risospendere attentamente le grumi di cellule in 2 ml di cellule staminali mezzo di coltura privo di alimentatore e seminare i grumi di cellule nei pozzetti della piastra a matrice rivestita. Porre la piastra in un incubatore a 37 ° C con 5% di CO 2, 95% di umidità. </li><li> Modificare il terreno di coltura di cellule iPS quotidiana. Osservare colonie indifferenziate cinque a sette giorni dopo la semina. Controllare colonie indifferenziate che sono pronti per il passaggio (colonie con un centro denso) sotto un microscopio ottico. </li></ol> 3. Passaging di cellule iPS <ol><li> Per il passaggio delle cellule iPS prima di iniziare, scaldare la soluzione dispasi, DMEM / F12 e terreno di coltura di cellule staminali senza alimentatore a 37 ° C a bagnomaria. </li><li> Prima passaging cellule iPS, rimuovere le aree di differenziazione raschiando l&#39;area e di aspirazione del mezzo. Lavare accuratamente le cellule iPS con 2 ml DMEM / F12. </li><li> Aggiungere 1 ml di 1 mg / ml dispasi a ciascun pozzetto ed incubare a 37 ° C per 7 minuti. Aspirare il dispasi e lavare delicatamente le colonie di cellule con 2 ml di DMEM / F12 due volte. Dopo il risciacquo, aggiungere 2 ml di terreno di coltura di cellule staminali senza alimentatore di ogni bene. </li><li> Con una pipetta 5 ml raschiare delicatamente le colonie della piastra per formare grumi di cellule. Trasferire i grumi di cellule staccate di un tubo da 15 ml. Aggiungi staminali sufficienti terreno di coltura cellulare senza alimentatore per seminare il prossimo passaggio di cellule. </li></ol> 4. Generazione di EBs Uso micropiastra <ol><li> Preparazione di una sospensione di cellule singole cellule iPS <ol><li> Rimuovere il medium dalle cellule iPS e lavare le cellule iPS con 2 ml di DMEM / F12. Aggiungere 750 ml di accutase alle cellule iPS in ogni pozzetto della piastra 6-bene. Incubare le cellule a 37 ° C e 5% CO 2 per permettere alle cellule di staccarsi dalla piastra (circa 5-10 min). </li><li> Utilizzare una pipetta di dissociare delicatamente eventuali cellule residue e di staccare tutte le cellule residue sulla superficie della piastra. Trasferire le cellule in una provetta conica da 50 ml. Lavare la piastra con 5 ml di DMEM / F12 e combinare la sciacquato DMEM / F12 con le cellule nel tubo conico. Passare la sospensione cellulare attraverso un colino cella di 40 micron per eliminare eventuali grumi di cellule residue. </li><li> Centrifugare le cellule a 300 xg per 5 min a temperatura ambiente per rimuovere l&#39;accutase. Risospendere il pellet di cellule in medium formazione EB in modo che la concentrazione cellulare è di circa 0,5-1,0 x 10 7 cellule / ml. </li><li> Determinare il numero di cellule vitali contando le cellule con Trypan Blue e un emocitometro. </li></ol></li><li> Adjusting densità delle cellule in pozzetti per formare EB dimensioni controllato <ol><li> Regolare il numero di cellule in ciascun pozzetto della micropiastra per generare le dimensioni EB desiderati. Aggiungere le cellule nei pozzetti delle piastre preparate in fase 1.9, Distribuire uniformemente le cellule pipettando delicatamente le cellule più volte. NOTA: Il numero di cellule necessarie per pozzetto = desiderato numero di celle per EB x numero di pozzetti per pozzetto. </li><li> Regolare il medium formazione EB integrato con inibitore Rock in pozzi per un volume finale di 2,0 ml. Ridistribuire le cellule pipettando delicatamente ogni bene. Centrifugare le piastre micropozzetti a 100 xg per 3 min. Posizionare le piastre in un incubatore a 37 ° C con 5% di CO 2 e il 95% di umidità per 24 ore. </li></ol></li><li> EBs raccolta dei micropiastra <ol><li> Harvest EBs da pozzetti pipettando medie pozzo su e giù con un 1 ml micropipettatore per rimuovere la maggior parte EBS. Passare la sospensione EB attraverso una cella di 40 micron invertitofiltro in cima ad una provetta conica da 50 ml per rimuovere le cellule singole. </li><li> Lavare la micropiastra 5 volte con 1 ml di DMEM / F12 per rimuovere tutti i EBs. Raccogliere lavaggi e passare sopra il filtro cellulare invertita. Girare il filtro cella destra fino a un nuovo tubo conico da 50 ml. Raccogliere EBS mediante lavaggio con media formazione EB. Contare EBs per determinare la resa. </li></ol></li></ol> 5. placcatura EBs e avvio di differenziazione <ol><li> Piastra EBS sulla matrice proteica rivestito sei pozzetti (come al punto 1.8.1) con una densità di &lt;1.000 EBs / bene in mezzo formazione EB più inibitore della roccia 10 micron. Incubare EBS a 37 ° C con il 5% di CO 2 e il 95% di umidità per 24 ore. </li><li> 24 ore dopo la placcatura EB, sostituirlo con il mezzo di differenziazione per avviare la differenziazione. Cambiare metà del terreno di differenziamento a giorni fino a quando le cellule vengono raccolte per ulteriori analisi. </li><li> Raccogliere i campioni a giorno 6, 17, 29 e 60 per condurre RT-PCR, immunocytochemistry e FACS di convalidare l&#39;espressione di geni caratteristici RPE e proteine. </li></ol> 6. RNA Estrazione e PCR <ol><li> Estratto RNA da campioni EB secondo le istruzioni fornite nel kit disponibile in commercio. Determinare la concentrazione di RNA utilizzando uno spettrofotometro. </li><li> Eseguire la trascrizione inversa a 100 ng di RNA totale secondo disponibile in commercio RNA a cDNA kit trascrizione inversa. </li><li> Eseguire PCR con 10 ng di cDNA utilizzando i seguenti primer (tabella 1) ad una concentrazione di 10 mmol / 10 ng di cDNA. Impostare la PCR come segue: denaturare il DNA a 95 ° C per 5 min, amplificare con 35 cicli a 95 ° C per 15 sec, 60 ° C per 30 sec, 72 ° C per 1 min, seguito da un ciclo finale a 72 ° C per 10 min. Eseguire il prodotto di PCR su un gel di agarosio 1%. </li></ol> 7. Immunocitochimica <ol><li> Lavare EBS con PBS due volte a RT. Fissare EBS a RT in 4% paraformaldehyde per 10 min. Risciacquare una volta con PBS a temperatura ambiente. Conservare i campioni in PBS a 4 ° C fino a quando usati per la colorazione. </li><li> Il giorno colorazione, trattare le cellule fissate con fissaggio e permeabilizzazione reagenti. Incubare i campioni con soluzione bloccante (siero di capra 10% in soluzione permeabilizzazione) per 1 ora a RT. </li><li> Eseguire immunochimica in siero di capra 10% in soluzione permeabilizzazione utilizzando i seguenti anticorpi primari alle diluizioni indicate: anti-Pax6 (1,10), anti-RX (1: 200), anti-MITF (1,30), e anti- ZO1 (1: 100). Incubare i campioni con corrispondenti anticorpi O / N a 4 ° C. </li><li> Il giorno seguente, rimuovere l&#39;anticorpo primario dalle cellule e lavare i campioni tre volte con PBS. Incubare campioni con anticorpi secondari coniugati fluoroforo per 1 ora a RT. </li><li> Rimuovere l&#39;anticorpo secondario dalle cellule e lavare i campioni per tre volte in PBS. Montare il coperchio scivola su vetrini con DAPI contenente mezzo di montaggio e lasciare i campioni per impostare O / N in una camera oscura.Utilizzare un microscopio a fluorescenza per visualizzare la colorazione. </li></ol> 8. colorazione per l&#39;analisi FACS <ol><li> Lavare le EBs coltivate in PBS due volte. Incubare EBS con 0,5 ml di 0,25% tripsina per 5-10 minuti per fare una sospensione singola cella. Neutralizzare la tripsina con soluzione di tripsina neutralizzante (1 ml / pozzetto). </li><li> Trasferire la sospensione singola cella di un tubo da 15 ml e centrifugare a 600 xg per 10 min. </li><li> Eliminare il supernatante e aggiungere 10 ml di DMEM / F12 alle cellule nel tubo. Capovolgere delicatamente per mescolare le cellule. Centrifugare a 600 x g. Dopo centrifugazione, scartare il surnatante e risospendere le cellule in tampone colorazione FACS. </li><li> Contare il numero totale di cellule. Centrifugare a 600 xg per 10 min. Dopo centrifugazione scarto surnatante. Fissare le cellule immediatamente aggiungendo 0,5 ml di 4% paraformaldeide. Mescolare bene vortexando gentilmente. Incubare le cellule a 4 ° C per 20 min. </li><li> Centrifugare a 600 xg per 10 min e rimuovere lasurnatante. Vortex delicatamente per disturbare il pellet. Permeabilize le cellule aggiungendo 1 ml di soluzione di permeabilizzazione raffreddata. Vortex delicatamente per miscelare e incubare in ghiaccio per 30 min. </li><li> Centrifugare a 600 xg per 10 min e rimuovere il surnatante. Aggiungere 3 ml di FACS buffer di colorazione e risospendere. Ripetere questo passaggio per un&#39;altra volta. Risospendere le cellule in tampone colorazione FACS ad una concentrazione finale di 5 x 10 6 cellule / ml. </li><li> Trasferire 100 ml di sospensione cellulare (0,5 x 10 6 cellule) per ciascuna tubi microcentrifuga e aggiungere il volume consigliato di anticorpo primario. Per Pax6, aggiungere 5 ml di PE anti-Pax6 in 100 ml di sospensione cellulare. Per MITF, aggiungere 5 ml di anti-MITF in 100 ml di sospensione cellulare. </li><li> Mescolare e incubare a temperatura ambiente per 60 min. Aggiungere 3 ml di tampone colorazione FACS. Mescolare e centrifugare a 600 xg per 10 min. Rimuovere il surnatante e ripetere 8.16 per altre due volte. </li><li> Per MITF colorazione, incubare le cellule in Antibo secondariody, capra anti-topo Alexa Fluor 488 a una diluizione di 1: 2.000 per 1 ora a 4 ° C. Per Pax6 colorazione, evitare questo passaggio. </li><li> Lavare le cellule con 5 ml di tampone FACS colorazione e centrifugare a 600 xg per 10 min. Ripetere la procedura per altre due volte. </li><li> Risospendere le cellule in 500 ml di FACS buffer di colorazione e vortex delicatamente per disturbare il pellet. I campioni sono pronti per l&#39;analisi di citometria di flusso. </li></ol> Isolation 9. iPS-RPE e Cultura <ol><li> Al giorno 29, con attenzione tagliare intorno alle colonie pigmentate selezionati dalla piastra di coltura con un puntale 200 microlitri. Trasferire le colonie galleggianti ad un tubo da 15 ml. Centrifugare le colonie a 600 xg per 10 minuti a RT e rimuovere il surnatante. </li><li> Risospendere le colonie di cellule in 10 ml di DMEM / F12 e centrifugare a 600 xg per 10 min. Rimuovere il surnatante. </li><li> Preparare una sospensione di cellule singole incubando le colonie con 2 ml di 0,25% tripsina a 37 ° C per 7-10 min. Vortice delicatamente la sospensione cellulare dissociare le colonie. </li><li> Neutralizzare la tripsina aggiungendo 2 ml di iPS-RPE medie. Centrifugare a 600 xg per 10 minuti e scartare il surnatante. Risospendere le singole cellule in 2 ml di IPS-RPE medie. Trasferire le cellule in una matrice proteica rivestito 6 pozzetti e posto in un incubatore a 37 ° C, 5% CO 2 e il 95% di umidità. </li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

Per realizzare pienamente le potenzialità delle cellule staminali pluripotenti per terapia cellulare, è necessario regolare la loro differenziazione in modo coerente e riproducibile. Questo rapporto descrive i protocolli per formare EB dimensioni controllato utilizzando la tecnologia micropiastre, avviare differenziazione verso RPE e identificare proteine ​​e geni marcatori di RPE. Per sincronizzare la differenziazione in vitro, misure omogenee di EBs erano formate da un numero noto di cellule iPS centrif...

Staminali pluripotenti (iPS) cellule indotti sono un tipo di cellule staminali pluripotenti derivate riprogrammando cellule adulte con fattori estrinseci 1. Al contrario, le cellule embrionali staminali (ESC), un altro tipo di cellule staminali pluripotenti, sono generati dalla massa cellulare interna della blastocisti 2-3. Nonostante le loro diverse origini, le cellule iPS e CES sono paragonabili nella loro illimitata capacità di replicare in vitro e nella loro capacità di differenziarsi in qualsiasi tipo di cellula 4-5. Queste caratteristiche di cellule iPS li rendono candidati ideali per applicazioni in medicina rigenerativa personalizzata. I recenti sforzi di ricerca si concentrano sullo sviluppo di protocolli di differenziazione affidabili per la produzione di cellule adulte specializzate, tra epitelio pigmentato retinico (RPE) 6-11. Per i potenziali applicazioni cliniche delle cellule iPS derivate, una differenziazione diretta di che tipo di cellula specifica indispensabile. Ci sono vari metodipubblicato per la differenziazione diretta di entrambi i CES e iPS cellule in RPE che varia notevolmente nella loro efficienza 6-7, 12-16. Noi ancora non conosciamo molti degli eventi molecolari che governano il destino delle cellule / tessuti durante lo sviluppo o il differenziamento. Negli ultimi anni, sono stati fatti sforzi per sviluppare il protocollo di differenziazione che può imitare lo sviluppo embrionale, per quanto possibile. Durante la fase di blastocisti, la popolazione non impegnati di cellule staminali sono insieme in un microambiente tridimensionale. Così, diverse strategie sono state applicate per rendere le cellule ESC / IPS assemblati insieme e crescere in tre dimensioni. Questi aggregati di cellule staminali sono chiamati corpi embrionali (EBS). Studi hanno dimostrato che EB differenziazione delle cellule staminali imitano fase iniziale di sviluppo dell&#39;embrione e può spontaneamente dar luogo a endoderma primitivo sulla sua superficie esterna. Più tardi, lo sviluppo EB progredisce, fenotipi cellulari differenziate di tutte e tre le linee germinali appaiono 17-18. Therefore, Ebs protocolli di differenziazione basata hanno attirato molta attenzione per la differenziazione in vitro di cellule ESC / IPS e sono un buon candidato per la generazione RPE da cellule staminali pluripotenti 13. EBs possono essere effettuate utilizzando diversi metodi di cellule / iPS ESC. Inizialmente, EBs sono state fatte da raschiando colonie aderenti e il mantenimento in coltura in sospensione non aderente. Tuttavia, questo approccio produce popolazione eterogenea di EB che provoca scarsa riproducibilità. Hanging coltura cellulare goccia e microwell formazione EBs base sono altre tecniche popolari per la formazione EBs che danno EBs omogenee di dimensioni definite che sono altamente riproducibili. Inoltre, la tecnica micropozzetti può produrre gran numero di aggregati con minor sforzo. Differenziazione delle cellule all&#39;interno EBS è regolata da un multiplex di spunti morfogenici dal microambiente extracellulare e intracellulare. A differenza di differenziazione in un monFormato olayer, EBs fornire una piattaforma per complesso insieme di cellule e di segnalazione intercellulare a verificarsi 17. È interessante notare, è stato osservato il numero di cellule staminali pluripotenti utilizzati per realizzare singoli EB influenzare il destino di cellule. Ad esempio, in uno studio differenziazione ematopoietica dei CES umani, è stato osservato che 500 cellule EB promosso differenziamento verso linea mieloide che 1.000 celle EB spinto verso lineage eritroide 20. In un altro studio, EBs piccoli favorito differenziazione endoderma mentre EBs grandi promosse verso neuro-ectoderma differenziazione 11, 17. Questi studi precedenti suggeriscono che il numero di cellule ESC / iPS utilizzati per rendere le singole EB influisce EBS differenziazione in base a qualsiasi tipo di cellule. Tuttavia, a nostra conoscenza, non ci sono studi in corso che hanno chiarito l&#39;impatto di dimensioni EBs nella sua propensione a differenziare verso RPE. L&#39;obiettivo di questo studio è quello di caratterizzare l&#39;influenzaDimensioni EB su indotte pluripotenti staminali (cellule iPS) - retinico pigmentato (iPS-RPE) differenziazione e di individuare il numero di cellulare ottimale per fare EBS per la differenziazione diretta verso RPE lignaggio.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="722">
	<tbody>
		<tr height="36">
			<td height="36" style="height:36px;width:239px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:183px;">Company</td>
			<td style="width:140px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:161px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">mTeSR1 media + 5X supplement</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>5850</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Y-27632 (Rock Inhibitor)</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>72304</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DMEM/F12</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11330-032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">2-Mercaptoethanol</td>
			<td style="width:183px;">Sigma</td>
			<td style="width:140px;">M-7154</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Non essential amino acids</td>
			<td style="width:183px;">Hyclone(Fisher)</td>
			<td>SH30853.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Knockout serum replacement</td>
			<td style="width:183px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:140px;">10828-028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Gentamicin&#160;</td>
			<td style="width:183px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:140px;">15750-060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">L-Glutamine</td>
			<td style="width:183px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:140px;">25030-081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">MEM media</td>
			<td style="width:183px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:140px;">10370-021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">N1 supplement</td>
			<td style="width:183px;">Sigma</td>
			<td style="width:140px;">N-6530-5ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Taurine</td>
			<td style="width:183px;">Sigma</td>
			<td style="width:140px;">T-8691-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Hydrocortisone</td>
			<td style="width:183px;">Sigma</td>
			<td style="width:140px;">H0888-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Fetal bovine serum</td>
			<td style="width:183px;">Hyclone(Fisher)</td>
			<td>SH3008803HI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Triiodo-l-thyronine sodium&#160; salt</td>
			<td style="width:183px;">Sigma</td>
			<td style="width:140px;">T6397</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Sodium hydroxide</td>
			<td style="width:183px;">Sigma</td>
			<td style="width:140px;">S5881</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Dispase</td>
			<td style="width:183px;">Life Technologies</td>
			<td>17105-041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Matrigel</td>
			<td style="width:183px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:140px;">354277</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Phosphate buffered saline</td>
			<td style="width:183px;">Hyclone(Fisher)</td>
			<td>10010-023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Aggrewell 400 plate</td>
			<td style="width:183px;">Stem Cell Technologies</td>
			<td>27940</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">AggreWell medium</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>5893</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Accutase</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>7920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:239px;">BD Cytofix/Cytoperm Fixation/Permeabilization Kit</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>554714</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Mouse Anti-PAX6 antibody</td>
			<td colspan="2">Developmental Studies Hybridoma Bank</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Rabbit Anti- RX antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>Ab23340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Mouse&#160; Anti-MITF antibody</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>MS-772-P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Rabbit Anti-ZO-1 antibody</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>40-2200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">RNeasy plus mini kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>74134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">PCR master mix</td>
			<td>promega</td>
			<td>M7502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">High capacity RNA to c DNA kit</td>
			<td style="width:183px;">Life Technologies</td>
			<td>4387406</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

deriving retinal pigment epithelium (rpe) from induced pluripotent stem (ips) cells by different sizes of embryoid bodies

Pluripotent stem cells possess the ability to proliferate indefinitely and to differentiate into almost any cell type. Additionally, the development of techniques to reprogram somatic cells into induced pluripotent stem (iPS) cells has generated interest and excitement towards the possibility of customized personal regenerative medicine. However, the efficiency of stem cell differentiation towards a desired lineage remains low. The purpose of this study is to describe a protocol to derive retinal pigment epithelium (RPE) from iPS cells (iPS-RPE) by applying a tissue engineering approach to generate homogenous populations of embryoid bodies (EBs), a common intermediate during in vitro differentiation. The protocol applies the formation of specific size of EBs using microwell plate technology. The methods for identifying protein and gene markers of RPE by immunocytochemistry and reverse-transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) are also explained. Finally, the efficiency of differentiation in different sizes of EBs monitored by fluorescence-activated cell sorting (FACS) analysis of RPE markers is described. These techniques will facilitate the differentiation of iPS cells into RPE for future applications.

In questo esperimento, le cellule iPS sono state coltivate e differenziate nel lignaggio RPE da EBS. EBs di dimensioni controllati, sono stati formati utilizzando micropiastra. Come si vede nella figura 1 formazione EB era omogeneo nelle micropiastre. Questi EBs stati poi raccolti e piastrate su piastre da 6 pozzetti (Figura 2). RPE può essere identificato con la loro classica esagonale morfologia, pigmentazione, e l&#39;espressione di marcatori RPE. Dopo 1...

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Deriving Retinal Pigment Epithelium RPE from Induced Pluripotent Stem iPS Cells by Different Sizes of Embryoid Bodies

L&#39;obiettivo di questa relazione è quello di descrivere i protocolli per derivare l&#39;epitelio pigmentato retinico (RPE) da staminali pluripotenti indotte (iPS), le cellule con diverse dimensioni di corpi embrionali.

Derivazione retina epitelio pigmentato (RPE) da pluripotenti indotte (IPS) Stem Cells dalle diverse dimensioni delle corpi embrionali

Pluripotent stem cells possess the ability to proliferate indefinitely and to differentiate into almost any cell type. Additionally, the development of ...

deriving-retinal-pigment-epithelium-rpe-from-induced-pluripotent-stem

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Deriving Retinal Pigment Epithelium (RPE) from Induced Pluripotent Stem (iPS) Cells by Different Sizes of Embryoid Bodies

10.5K Views.  U.S. Army Institute of Surgical Research.  L'obiettivo di questa relazione è quello di descrivere i protocolli per derivare l'epitelio pigmentato retinico (RPE) da staminali pluripotenti indotte (iPS), le cellule con diverse dimensioni di corpi embrionali. 

Video: Deriving Retinal Pigment Epithelium RPE from Induced Pluripotent Stem iPS Cells by Different Sizes of Embryoid Bodies

Efficient Derivation of Retinal Pigment Epithelium Cells from Stem Cells

No cure has been discovered for age-related macular degeneration (AMD), the leading cause of vision loss in people over the age of 55. AMD is complex multifactorial disease with an unknown etiology, although it is largely thought to occur due to death or dysfunction of the retinal pigment epithelium (RPE), a monolayer of cells that underlies the retina and provides critical support for photoreceptors. RPE cell replacement strategies may hold great promise for providing therapeutic relief for a large subset of AMD patients, and RPE cells that strongly resemble primary human cells (hRPE) have been generated in multiple independent labs, including our own. In addition, the uses for iPS-RPE are not limited to cell-based therapies, but also have been used to model RPE diseases. These types of studies may not only elucidate the molecular bases of the diseases, but also serve as invaluable tools for developing and testing novel drugs. We present here an optimized protocol for directed differentiation of RPE from stem cells. Adding nicotinamide and either Activin A or IDE-1, a small molecule that mimics its effects, at specific time points, greatly enhances the yield of RPE cells. Using this technique we can derive large numbers of low passage RPE in as early as three months.

Stem cell-derived retinal pigment epithelium (RPE) cells may be used for multiple applications including cell-based therapies for retinal degeneration, disease modeling, and drug studies. Here we present a simple protocol for reproducibly deriving RPE from stem cells.

Derivazione efficiente di cellule retiniche epitelio pigmentato da cellule staminali

No cure has been discovered for age-related macular degeneration  (AMD), the leading cause of vision loss in people over the age of 55. AMD is complex ...

Ricerca

Biologia dello sviluppo

Analysis of Retinoic Acid-induced Neural Differentiation of Mouse Embryonic Stem Cells in Two and Three-dimensional Embryoid Bodies

Mouse embryonic stem cells (ESCs) isolated from the inner mass of the blastocyst (typically at day E3.5), can be used as in vitro model system for studying early embryonic development. In the absence of leukemia inhibitory factor (LIF), ESCs differentiate by default into neural precursor cells. They can be amassed into a three dimensional (3D) spherical aggregate termed embryoid body (EB) due to its similarity to the early stage embryo. EBs can be seeded on fibronectin-coated coverslips, where they expand by growing two dimensional (2D) extensions, or implanted in 3D collagen matrices where they continue growing as spheroids, and differentiate into the three germ layers: endodermal, mesodermal, and ectodermal. The 3D collagen culture mimics the in vivo environment more closely than the 2D EBs. The 2D EB culture facilitates analysis by immunofluorescence and immunoblotting to track differentiation. We have developed a two-step neural differentiation protocol. In the first step, EBs are generated by the hanging-drop technique, and, simultaneously, are induced to differentiate by exposure to retinoic acid (RA). In the second step, neural differentiation proceeds in a 2D or 3D format in the absence of RA.

We describe a technique for using murine embryonic stem cells for generating two or three dimensional embryoid bodies. We then explain how to induce neural differentiation of the embryoid body cells by retinoic acid, and how to analyze their state of differentiation by progenitor cell marker immunofluorescence and immunoblotting.

Analisi di acido retinoico-indotta neurale differenziazione di cellule staminali embrionali di topo a organi embrionali due e tridimensionali

Mouse embryonic stem cells (ESCs) isolated from the inner mass of the blastocyst (typically at day E3.5), can be used as in vitro model system for ...

Differentiating Chondrocytes from Peripheral Blood-derived Human Induced Pluripotent Stem Cells

In this study, we used peripheral blood cells (PBCs) as seed cells to produce chondrocytes via induced pluripotent stem cells (iPSCs) in an integration-free method. Following embryoid body (EB) formation and fibroblastic cell expansion, the iPSCs are induced for chondrogenic differentiation for 21 days under serum-free and xeno-free conditions. After chondrocyte induction, the phenotypes of the cells are evaluated by morphological, immunohistochemical, and biochemical analyses, as well as by the quantitative real-time PCR examination of chondrogenic differentiation markers. The chondrogenic pellets show positive alcian blue and toluidine blue staining. The immunohistochemistry of collagen II and X staining is also positive. The sulfated glycosaminoglycan (sGAG) content and the chondrogenic differentiation markers COLLAGEN 2 (COL2), COLLAGEN 10 (COL10), SOX9, and AGGRECAN are significantly upregulated in chondrogenic pellets compared to hiPSCs and fibroblastic cells. These results suggest that PBCs can be used as seed cells to generate iPSCs for cartilage repair, which is patient-specific and cost-effective.

We present a protocol to generate a chondrogenic lineage from human peripheral blood (PB) via induced pluripotent stem cells (iPSCs) using an integration-free method, which includes embryoid body (EB) formation, fibroblastic cells expansion, and chondrogenic induction.

Differenziare i condrociti da cellule staminali pluripotenti indotte dall&#39;uomo derivato dal sangue

In this study, we used peripheral blood cells (PBCs) as seed cells to produce chondrocytes via induced pluripotent stem cells (iPSCs) in an ...

Chondrogenic Pellet Formation from Cord Blood-derived Induced Pluripotent Stem Cells

Human articular cartilage lacks the ability to repair itself. Cartilage degeneration is thus treated not by curative but by conservative treatments. Currently, efforts are being made to regenerate damaged cartilage with ex vivo expanded chondrocytes or bone marrow-derived mesenchymal stem cells (BMSCs). However, the restricted viability and instability of these cells limit their application in cartilage reconstruction. Human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) have received scientific attention as a new alternative for regenerative applications. With unlimited self-renewal ability and multipotency, hiPSCs have been highlighted as a new replacement cell source for cartilage repair. However, obtaining a high quantity of high-quality chondrogenic pellets is a major challenge to their clinical application. In this study, we used embryoid body (EB)-derived outgrowth cells for chondrogenic differentiation. Successful chondrogenesis was confirmed by PCR and staining with alcian blue, toluidine blue, and antibodies against collagen types I and II (COL1A1 and COL2A1, respectively). We provide a detailed method for the differentiation of cord blood mononuclear cell-derived iPSCs (CBMC-hiPSCs) into chondrogenic pellets.

Here, we propose a protocol for chondrogenic differentiation from cord blood mononuclear cell-derived human induced pluripotent stem cells.

Formazione di pellet condensato da cellule staminali pluripotenti indotte dal sangue

Human articular cartilage lacks the ability to repair itself. Cartilage degeneration is thus treated not by curative but by conservative treatments. ...

Rapid, Directed Differentiation of Retinal Pigment Epithelial Cells from Human Embryonic or Induced Pluripotent Stem Cells

We describe a robust method to direct the differentiation of pluripotent stem cells into retinal pigment epithelial cells (RPE). The purpose of providing a detailed and thorough protocol is to clearly demonstrate each step and to make this readily available to researchers in the field. This protocol results in a homogenous layer of RPE with minimal or no manual dissection needed. The method presented here has been shown to be effective for induced pluripotent stem cells (iPSC) and human embryonic stem cells. Additionally, we describe methods for cryopreservation of intermediate cell banks that allow long-term storage. RPE generated using this protocol might be useful for iPSC disease-in-a-dish modeling or clinical application.

This protocol describes how to produce retinal pigment epithelial cells (RPE) from pluripotent stem cells. The method uses a combination of growth factors and small molecules to direct the differentiation of stem cells into immature RPE in fourteen days and mature, functional RPE after three months.

Rapida, regia di differenziazione delle cellule epiteliali del pigmento retinico da cellule staminali pluripotenti umane embrionali o indotto

We describe a robust method to direct the differentiation of pluripotent stem cells into retinal pigment epithelial cells (RPE). The purpose of providing ...

Engineering Transplantation-suitable Retinal Pigment Epithelium Tissue Derived from Human Embryonic Stem Cells

Several pathological conditions of the eye affect the functionality and/or the survival of the retinal pigment epithelium (RPE). These include some forms of retinitis pigmentosa (RP) and age-related macular degeneration (AMD). Cell therapy is one of the most promising therapeutic strategies proposed to cure these diseases, with already encouraging preliminary results in humans. However, the method of preparation of the graft has a significant impact on its functional outcomes in vivo. Indeed, RPE cells grafted as a cell suspension are less functional than the same cells transplanted as a retinal tissue. Herein, we describe a simple and reproducible method to engineer RPE tissue and its preparation for an in vivo implantation. RPE cells derived from human pluripotent stem cells are seeded on a biological support, the human amniotic membrane (hAM). Compared to artificial scaffolds, this support has the advantage of having a basement membrane that is close to the Bruch&#39;s membrane where endogenous RPE cells are attached. However, its manipulation is not easy, and we developed several strategies for its proper culturing and preparation for grafting in vivo.

We describe a method to engineer a retinal tissue composed of retinal pigment epithelial cells derived from human pluripotent stem cells cultured on top of human amniotic membranes and its preparation for grafting in animal models.

Ingegneria del tessuto di trapianto-adatto del pigmento retinico epitelio derivato da cellule staminali embrionali umane

Several pathological conditions of the eye affect the functionality and/or the survival of the retinal pigment epithelium (RPE). These include some forms ...

Generation of Human Primordial Germ Cell-like Cells at the Surface of Embryoid Bodies from Primed-pluripotency Induced Pluripotent Stem Cells

Primordial germ cells (PGCs) are common precursors of all germline cells. In mouse embryos, a founding population of ~40 PGCs are induced from pluripotent epiblast cells by orchestrated exposures to cytokines, including bone morphogenetic protein 4 (Bmp4). In human embryos, the earliest PGCs have been identified on the endodermal wall of yolk sac around the end of the 3rd week of gestation, but little is known about the process of human PGC specification and their early development. To circumvent the technical and ethical barriers of studying human embryonic PGCs, surrogate cell culture models have been recently generated from pluripotent stem cells. Here, we describe a 13-day protocol for robust production of human PGC-Like Cells (hPGCLCs). Human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) maintained in the primed pluripotency state are incubated in the 4i na&#239;ve reprogramming medium for 48 hours, dissociated to single cells, and packed into microwells. Prolonged maintenance of hiPSCs in the na&#239;ve pluripotency state causes significant chromosomal aberrations and should be avoided. hiPSCs in the microwells are maintained for an additional 24 hours in the 4i medium to form embryoid bodies (EBs), which are then cultured in low-adherence plasticware under a rocking condition in the hPGCLC induction medium containing a high concentration of recombinant human BMP4. EBs are further cultured for up to 8 days in the rocking, non-adherent condition to obtain maximum yields of hPGCLCs. By immunohistochemistry, hPGCLCs are readily detected as cells strongly expressing OCT4 in almost all EBs exclusively on their surface. When EBs are enzymatically dissociated and subjected to FACS enrichment, hPGCLCs can be collected as CD38+ cells with up to 40-45% yield.

Primordial germ cells (PGCs) are common precursors of both sperm and eggs. Human embryonic PGCs are specified from pluripotent epiblast cells through interactions of cytokines. Here, we describe a 13-day protocol of inducing human cells transcriptomally resembling PGCs at the surface of embryoid bodies from primed-pluripotency induced pluripotent stem cells.

Cellule staminali pluripotenti indotte generazione umana primordiale delle cellule di germe-come delle cellule sulla superficie dei corpi Embryoid da pluripotenza innescato

Primordial germ cells (PGCs) are common precursors of all germline cells. In mouse embryos, a founding population of ~40 PGCs are induced from pluripotent ...

Generation of 3D Skin Organoid from Cord Blood-derived Induced Pluripotent Stem Cells

The skin is the body&#8217;s largest organ and has many functions. The skin acts as a physical barrier and protector of the body and regulates bodily functions. Biomimetics is the imitation of the models, systems, and elements of nature for the purpose of solving complex human problems1. Skin biomimetics is a useful tool for in vitro disease research and in vivo regenerative medicine. Human induced pluripotent stem cells (iPSCs) have the characteristic of unlimited proliferation and the ability of differentiation to three germ layers. Human iPSCs are generated from various primary cells, such as blood cells, keratinocytes, fibroblasts, and more. Among them, cord blood mononuclear cells (CBMCs) have emerged as an alternative cell source from the perspective of allogeneic regenerative medicine. CBMCs are useful in regenerative medicine because human leukocyte antigen (HLA) typing is essential to the cell banking system. We provide a method for the differentiation of CBMC-iPSCs into keratinocytes and fibroblasts and for generation of a 3D skin organoid. CBMC-iPSC-derived keratinocytes and fibroblasts have characteristics similar to a primary cell line. The 3D skin organoids are generated by overlaying an epidermal layer onto a dermal layer. By transplanting this 3D skin organoid, a humanized mice model is generated. This study shows that a 3D human iPSC-derived skin organoid may be a novel, alternative tool for dermatologic research in vitro and in vivo.

We propose a protocol that shows how to differentiate induced pluripotent stem cell-derived keratinocytes and fibroblasts and generate a 3D skin organoid, using these keratinocytes and fibroblasts. This protocol contains an additional step of generating a humanized mice model. The technique presented here will improve dermatologic research.

Generazione di pelle 3D Organoid dal cordone emoderivati indotta da cellule staminali pluripotenti indotte

The skin is the body&#8217;s largest organ and has many functions. The skin acts as a physical barrier and protector of the body and regulates bodily ...

In Vitro Generation of Somite Derivatives from Human Induced Pluripotent Stem Cells

In response to signals such as WNTs, bone morphogenetic proteins (BMPs), and sonic hedgehog (SHH) secreted from surrounding tissues, somites (SMs) give rise to multiple cell types, including the myotome (MYO), sclerotome (SCL), dermatome (D), and syndetome (SYN), which in turn develop into skeletal muscle, axial skeleton, dorsal dermis, and axial tendon/ligament, respectively. Therefore, the generation of SMs and their derivatives from human induced pluripotent stem cells (iPSCs) is critical to obtain pluripotent stem cells (PSCs) for application in regenerative medicine and for disease research in the field of orthopedic surgery. Although the induction protocols for MYO and SCL from PSCs have been previously reported by several researchers, no study has yet demonstrated the induction of SYN and D from iPSCs. Therefore, efficient induction of fully competent SMs remains a major challenge. Here, we recapitulate human SM patterning with human iPSCs in vitro by mimicking the signaling environment during chick/mouse SM development, and report on methods of systematic induction of SM derivatives (MYO, SCL, D, and SYN) from human iPSCs under chemically defined conditions through the presomitic mesoderm (PSM) and SM states. Knowledge regarding chick/mouse&#160;SM development was successfully applied to the induction of SMs with human iPSCs. This method could be a novel tool for studying human somitogenesis and patterning without the use of embryos and for cell-based therapy and disease modeling.

We present here a protocol for the differentiation of human induced pluripotent stem cells into each somite derivative (myotome, sclerotome, dermatome, and syndetome) in chemically defined conditions, which has applications in future disease modeling and cell-based therapies in orthopedic surgery.

Generazione in Vitro di Somite derivati da umani indotta da cellule staminali pluripotenti indotte

In response to signals such as WNTs, bone morphogenetic proteins (BMPs), and sonic hedgehog (SHH) secreted from surrounding tissues, somites (SMs) give ...

Hemogenic Endothelium Differentiation from Human Pluripotent Stem Cells in A Feeder- and Xeno-free Defined Condition

Deriving functional hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) from human pluripotent stem cells (PSCs) have been an elusive goal for autologous transplants to treat hematological and malignant disorders. Hemogenic endothelium (HE) is an amenable platform to produce functional HSPCs by transcription factors or to induce lymphocytes in a robust manner. However, current methods to derive HE are either costly or variable in yield. In this protocol, we established a cost-effective and precise method to derive HE within 4 days in a feeder- and xeno-free defined condition. The resultant HE underwent an endothelial-to-hematopoietic transition and produced CD34+CD45+ clonogenic hematopoietic progenitors. The potential capacity of our platform for generating functional HSPCs will have broad applications in disease modeling and screening for therapeutic compounds.

Here, we present a protocol to precisely form hemogenic endothelium from human pluripotent stem cells in a feeder- and xeno-free condition. This method will have broad applications in disease modeling and screening for therapeutic compounds.

Differenziazione dell'endotelio endogenico dalle cellule staminali pluripotenti umane in una condizione definita senza alimentatore e Xeno

Deriving functional hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) from human pluripotent stem cells (PSCs) have been an elusive goal for autologous ...