We thank Dr. John Risinger and Memorial Health University Medical Center, Inc. for generously providing the ACI-23 cell line. The authors acknowledge financial support through the Postdoctoral Research Training (PRAT) Award to C. House from The National Institute for General Medical Sciences.

1. Cultura tradizionale Ovarian Cancer Cell Lines (aderenti Conditions) NOTA: Tutte manipolazione di cellule e dei media dovrebbe avvenire in una cappa coltura tissutale sterile <ol><li> Preparare terreni di coltura cellulare tradizionale. Utilizzare 1: 1 DMEM: F12 (+ L-glutammina, + HEPES 15 mm) e integrare con il 10% di calore inattivato siero fetale bovino e 1% di penicillina / streptomicina. Soluzione Filter utilizzando 0,45 micron filtro a vuoto. </li><li> Preparare un polistirene 75 centimetri fiasco cultura tradizionale 2 tessuto etichettato con il nome, la data e il numero di passaggio della linea cellulare del interest.Remove flaconcino di cellule da ultra low freezer o in azoto liquido. Scongelare mettendo in 37 ° C bagnomaria per 5 min. </li><li> Sospensione Trasferimento da flacone in un tubo da centrifuga da 15 ml contenente 3 ml mezzi di coltura cellulare tradizionale (preparata in precedenza). Sospensione Centrifugare a 4 ° C per 5 min a 400 x g. Nel frattempo, aggiungere 16 mezzi di coltura cellulare tradizionali ml a pallone. </li><li>Aspirare il surnatante. Utilizzando 2 ml di coltura cellulare cellule supporti pipette tradizionali su e giù per allentare pellet e sospensione trasferimento a boccetta. Delicatamente pallone roccia per distribuire uniformemente pallone cells.Place in umidificata incubatore coltura cellulare impostato a 37 ° C e 5% di CO 2. Monitorare le cellule tutti i giorni fino a raggiungere l&#39;80% di confluenza. </li><li> Una volta che le cellule sono l&#39;80% confluenti dividere la cultura 1: 2 in cappuccio coltura cellulare. Aspirare il surnatante e lavare con fosfati calda salina tamponata (senza calcio e magnesio) (PBS). Aggiungere 1,5 ml tripsina 0,25% -EDTA e incubare 3-5 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Preparare 2 nuovi polistirolo 75 centimetri 2 palloni e aggiungere 16 ml di mezzi di coltura cellulare tradizionale per ogni pallone. Risospendere le cellule in 4 ml trypsinized media tradizionali coltura cellulare e volumi uguali aliquote a ciascuno dei nuovi flaconi. </li><li> Inserire palloni in coltura cellulare incubatore umidificato impostati a 37 ° C e 5% CO 2. Monitorare le cellule tutti i giorni fino a raggiungere l&#39;80% di confluenza. Continuare a dividere le celle ecultura o congelare e conservare a -80 o in azoto liquido. </li></ol> 2. Generazione di multicellulare Spheroids da ovariche linee di cancro cella utilizzando galleggianti o aderenti Cells NOTA: Tutte manipolazione di cellule e dei media dovrebbe avvenire in una cappa coltura tissutale sterile. Dopo coltura linee cellulari sotto i metodi di coltura tradizionali per 2 - 3 passaggi (sezione 1) procedere con le seguenti operazioni. <ol><li> Preparare supporti di cellule staminali. Utilizzare 1: 1 DMEM: F12 (+ L-glutammina, + HEPES 15 mM) e integrare con 1% di penicillina / streptomicina (ad una concentrazione finale di 100 U / ml di penicillina e 100 ug / ml di streptomicina), 1% di siero rimontaggio knockout , 0,4% di albumina sierica bovina, e 0,1% di insulina transferrina selenio. Soluzione Filter utilizzando 0,45 micron filtro a vuoto. </li><li> Supporto di cellule staminali Supplemento con fattore umano ricombinante di crescita epidermico (EGF) e del fattore di crescita ricombinante base di fibroblasti umani (FGF) per una concentrazione finale di 20 ng / ml e 10 ng / ml, rispettivamente. NOTA: I fattori di crescita dovrebbero essere aggiunti fresco al supporto di cellule staminali a destra prima dell&#39;uso. </li><li> Creare cultura floater TIC. Rimuovere pallone di 80% di cellule confluenti coltivate in condizioni tradizionali di coltura aderenti. Raccogliere i media e tutte le cellule galleggianti (singole e aggregati), lasciando la popolazione aderenti alle spalle, e trasferimento in tubo da 50 ml centrifuga in polipropilene. Sospensione Centrifugare a 4 ° C per 5 min a 400 x g. NOTA: le celle galleggianti e aggregati sono evidenti 24-72 ore dopo cellule aderenti sono attaccati al pallone sotto cultura tradizionale. Da un 80% confluenti piastra recupero di circa 1.0 - 5.0 x 10 5 cellule vitali galleggianti può prevedere, a seconda della linea cellulare. In questo studio il numero medio di cellule galleggianti raccolti da una coltura confluente aderente 80% era: 5,0 x 10 5 per ACI-23, 4,8 x 10 5 per OVCAR5, 3,5 x 10 5 per CAOV3, e 1,0 x 10 5 per TGS- 3. Dopo il trasferimento, multicellformazione sferoide colare nella cultura TIC tradizionale e floater si verifica nel giro di pochi giorni, anche se questo è un po linea cellulare dipendente. Ad esempio, ACI-23 cellule formano aggregati più facilmente rispetto alle cellule CAOV3. </li><li> Nel frattempo, preparare un basso attaccamento polistirolo superficie 75 centimetri 2 pallone di coltura di tessuto ultra etichettato con il nome, la data e il numero di passaggio della linea cellulare. Aggiungere 10 ml staminali supporti cellulari integrati con fattori di crescita per il pallone. </li><li> Una volta centrifugazione è completa, i media e il trasferimento Aspirare pellet a basso pallone di attacco aggiungendo 6 ml staminali supporti cellulari e pipettando su e giù per allentare pellet. Inserire palloni in coltura cellulare incubatore umidificato impostati a 37 ° C e 5% CO 2. Monitorare le cellule ogni 2 - 3 giorni di tempo per osservare la formazione sferoide. </li><li> Creare cultura TIC tradizionale. Rimuovere pallone di 80% di cellule confluenti coltivate in condizioni tradizionali di coltura aderenti. Supporti Aspirare e lavare con caldo PBS. Aggiungere 1,5 ml di tripsina 0,25% EDTA e incubare 3-5min a RT. </li><li> Preparare un basso attaccamento polistirolo superficie 75 centimetri 2 pallone di coltura di tessuto ultra etichettato con il nome, la data e il numero di passaggio della linea cellulare. Aggiungere 10 ml staminali supporti cellulari, integrati con EGF e FGF, come descritto, al pallone. </li><li> Aggiungere 6 ml staminali supporti cella a pallone con la tripsina. Soluzione di cellule Pipettare su e giù e tentare di allentare le cellule dalla superficie fiasco. Trasferire tutto il volume delle cellule di pallone attacco ultra low contenente i 10 ml staminali supporti cellulare. Inserire pallone in coltura cellulare incubatore umidificato impostato 37 ° C e 5% CO 2. </li><li> Supplemento culture TIC ogni 48-72 ore con un ulteriore 2 ml staminali supporti cellulari e EGF fresco e FGF per concentrazioni finali di 20 ng / ml e 10 ng / ml, rispettivamente. </li><li> Monitorare le cellule fino a 60 - a raggiungere l&#39;80% di confluenza. Culture Split mettendo volumi uguali in 2 nuovi palloni ultra bassa di attaccamento e l&#39;aggiunta di supporto di cellule staminali fresche per ottenere un volume finale di 18 ml. Alternativaly, centrifugare l&#39;intera sospensione a 4 ° C per 5 min a 400 x g. Risospendere le cellule in mezzi cellule staminali integrate con EGF e FGF e distribuiscono equamente in nuove bottiglie ultra-low di fissaggio. Le cellule non devono essere dissociate in sospensioni di cellule singole per passaging. NOTA: A questo punto le culture possono continuare ad essere diviso e colta, congelato, o sperimentalmente manipolato per l&#39;analisi. A 60 - 80% di confluenza le seguenti concentrazioni di cellule sono state recuperate per ACI-23: 8.0 x 10 6 per tradizionale Adherent, 4,0 x 10 6 per tradizionale TIC, e 5,0 x 10 6 per culture Floater TIC. Anche se potrebbe essere la linea cellulare dipendente, abbiamo scoperto che 5-10 giorni in coltura è ottimale per TIC arricchimento come la percentuale di CD133 + ALDH cellule + è basso entro i primi 3 giorni, picchi a 5-10 giorni e diminuisce di nuovo a 14 giorni. </li></ol> 3. Generazione di primaria epiteliale ovarico cancro linee cellulari e pluricellulari Spheroidsda chemioresistente ascite Paziente NOTA: approvazione Institutional Review Board è stato ottenuto per questo protocollo. Tutti manipolazione di cellule e dei media dovrebbe avvenire in una cappa coltura tissutale sterile. <ol><li> Ascite piastra del fluido 1: 1 con mezzi di coltura cellulare tradizionale. Preparare media come descritto nella sezione 1 e aggiungere 10 ml di diversi tradizionali polistirolo 75 palloni cm 2 coltura dei tessuti. </li><li> Liquido ascitico è di solito fornito in 1 L bottiglia vuoto sterile; rimuovere il tappo di vuoto. Aggiungere con cautela 10 ml ascite fluidi a pallone contenente 10 ml di media tradizionali e mettere in coltura cellulare umidificata incubatore impostati a 37 ° C e 5% di CO 2. Lasciare riposare per 72-96 ore, prima di fare un cambiamento multimediale completo. Cambiare i media ogni 2 - 3 giorni fino cellule raggiungono 60 - 80% di confluenza </li><li> Una volta che le cellule raggiungono 60 - 80% di confluenza, dividere 1: 2 come descritto nella sezione 1. culture Inizio TIC come descritto nella sezione 2. NOTA: Gli eritrociti presenti in ASCITes saranno rimossi dopo il primo cambio dei media come sono non-aderenti. Eventuali fibroblasti presenti saranno in gran parte rimossi dopo il trattamento con tripsina in quanto sono più sensibili e alzerà con l&#39;esposizione minima tripsina. Purezza delle cellule di cancro ovarico è stata determinata mediante citometria a flusso utilizzando anticorpi per CA-125 (MUC16). </li></ol> 4. La colorazione di Celle per Citometria a Flusso Conferma di TIC Marcatori <ol><li> Raccogliere culture TIC. Trasferire contenuto del flacone in tubo da 50 ml centrifuga in polipropilene. Sospensioni di centrifugazione per 5 min a 400 x g. Supporti Aspirare e lavare con caldo PBS. Aggiungere 2 ml di soluzione di dissociazione cellulare non enzimatica, incubare 3 - 5 min a 37 ° C, e pipettare su e giù per rompere grumi e dissociare in cellule singole. Aggiungere 4 ml staminali supporti cellulari. </li><li> Raccogliere culture aderenti. Supporti Aspirare e lavare con caldo PBS. Aggiungere 3 ml di soluzione dissociazione cellulare non enzimatica e incubare 3-5 minuti a 37 ° C. Aggiungere 3 ml di cellule tradizionaleterreni di coltura e pipettare su e giù più volte per staccare le cellule dal pallone e raccolgono in provetta da centrifuga. </li><li> Centrifugare sia TIC e sospensioni aderenti per 5 min a 400 x g. Eliminare il surnatante e risospendere ogni pellet in 1 ml di PBS contenente siero bovino fetale 3%. Incubare a RT 30 min. Nel frattempo, contare il numero di cellule vitali mediante trypan blu. Osservare le cellule sotto il microscopio per confermare sferoidi sono dissociate in singole cellule. </li><li> Label 5 x 1,5 ml provette Eppendorf per ciascuna delle seguenti condizioni di coltura: 1) senza macchia (controllo senza macchia per la compensazione), 2) ALDH (singola macchia di controllo positivo di risarcimento), 3) CD133 (singola macchia di controllo positivo di risarcimento), 4 ) ALDH + CD133 (campione sperimentale), e 5) Deab + ALDH (controlli negativi per fluorescenza di fondo in FL-1 e FL-4 canali, rispettivamente). </li><li> Distribuire circa 5 x 10 5 cellule ciascuno per tubi # 1 - 4. sospensioni centrifuga per 5 minuti a 400 x g. Aspirare supernatant e risospendere pellet in 500 microlitri Aldefluor tampone del saggio. Aggiungere 10 ml Deab (inibitore ALDH) per tubo # 5 per il controllo sperimentale negativo. </li><li> Aggiungere 5 ml attivati ​​Aldefluor reagente tubo # 2 di risarcimento controllo positivo e flick a mescolare. Aggiungere 5 ml attivati ​​Aldefluor reagente tubo # 4 per l&#39;analisi sperimentale. Tubo Flick per mescolare e trasferire la metà del volume di cellule dalla provetta # 4 nel tubo # 5 (250 microlitri) che contiene il Deab immediatamente. </li><li> Tubi Flick per mescolare bene. Incubare tutte le provette per 30 - 45 min a 37 ° C al riparo dalla luce. Tubi Flick a metà periodo di incubazione, come le cellule si depositerà sul fondo. Centrifugare tutte le provette per 5 min a 400 x g. Aspirare il surnatante e risospendere le cellule in 500 microlitri Aldefluor tampone del saggio. </li><li> Per tubi con CD133 colorazione (# 3 e # 4), aggiungere CD133-APC 01:11 direttamente in tampone Aldefluor. Incubare 15 min in ghiaccio al riparo dalla luce. Provette CD133 per 5 min a 400 x g. Lavare una volta con500 microlitri Aldefluor tampone. Risospendere le cellule in 500 microlitri tampone Aldefluor rispettivamente. </li><li> Filtro sospensioni in tubi tondi fondo polistirene individuale con tappo filtro cella. Assicurarsi che l&#39;intero volume è filtrato attraverso il tappo. </li><li> Utilizzare un citometro a flusso per analizzare la popolazione cellulare. Utilizzare tubi # 1-3 per impostare i controlli di compensazione. Utilizzando in avanti e parametri laterale scatter, porta le cellule, essendo sicuri di escludere detriti cellulari. Stabilire celle doppie con FL-1 e FL-4 canali, rispettivamente ALDH + e CD133 +. </li><li> Utilizzando un programma di analisi di citometria, confermano le condizioni di coltura migliorato la percentuale di cellule TIC come le culture ricche di TIC dovrebbe avere maggiore colorazione per questi due marcatori. NOTA: Oltre al CD133 e ALDH, altre TIC cancro ovarico markersof può essere analizzato con il numero di marcatori utilizzati in qualsiasi campione dipendono dalle capacità del citometro a flusso. </li></ol> 5. In vivo </em&gt; sottocutaneo Iniezioni di confermare oncogenesi della popolazioni di cellule NOTA: approvazione Institutional Review Board è stato ottenuto per questo protocollo. Distribuire topi nudi atimici femmina 6 - 8 settimane di età in gruppi sperimentali in gabbie di 3 e lasciare acclimatare per alcuni giorni prima di iniezioni. Seguire i topi sotto le linee guida sperimentali umani come da NIH Animal Care and Use Committee; monitorare il peso corporeo, l&#39;aspetto fisico tra cui la perdita di peso o aumento superiore al 20%, aspetto emaciato, diarrea o dermatiti e eutanasia topi che corrispondono a questi criteri da CO 2 asfissia. <ol><li> Raccogliere le culture, come descritto nella sezione 2. Sospendere ogni popolazione di cellule in 1 ml di PBS. Contare cellule vitali utilizzando trypan dosaggio blu. </li><li> Preparare 15 ml provette. Per triplicato misure aggiungono 1,5 x 10 6 cellule vitali diluite in 2 ml di PBS in ogni provetta (5 x 10 5 cellule in un volume di 0,5 ml vengono iniettati sottocute in destra flank di ogni mouse). Preparare 0,5 ml PBS solo per topi di controllo. </li><li> Utilizzando 27 aghi G, subcutaneouslyinject 0,5 ml di sospensione cellulare da culture aderenti tradizionali, culture TIC tradizionali, floater culture TIC, o PBS nel fianco destro di ciascuno dei 3 topi per gruppo. Topi Rientro gabbie originale post-iniezione. </li><li> Pesare topi e misurare eventuali tumori palpabili in due dimensioni due volte weeklyby Vernier pinza, stabilire la lunghezza e la larghezza. NOTA: il tempo di latenza dei tumori è di solito 20-50 giorni a seconda della linea cellulare. </li><li> Calcolare il volume del tumore bagnata con metodi standard (V = (larghezza) 2 x lunghezza / 2). NOTA: Anche se questo studio ha confrontato oncogenesi della TIC contro cellule aderenti per la prima generazione solo passaggio in serie in vivo delle TIC coltivate in condizioni simili è stato completato da altri 11,20. </li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

Il protocollo qui descritto presenta un metodo efficace e coerente per arricchire le culture per le cellule con caratteristiche di cellule staminali provenienti da linee di cellule di cancro ovarico stabiliti ed è applicabile a campioni primari. Questo metodo arricchisce successo per TIC attraverso una varietà di linee cellulari. Esso consente la tempestiva individuazione delle condizioni che arricchiscono di TIC e / o fenotipo tumorigenico, senza prendere tempo per risolvere fisicamente gli IAT di non-TIC all&#39;interno della popolazione. In questo modo, i livelli relativi di diverse vie di segnalazione possono essere valutati per il loro contributo al fenotipo TIC confrontando culture aderenti tradizionali per Tic culture utilizzando una varietà di test funzionali. Se una popolazione pura TIC è desiderato, l&#39;isolamento può essere facilmente ottenuto incorporando un passo fluorescenza assistita o magnetico classificare in citometria a flusso di protocollo. E &#39;importante tenere a mente, però, che l&#39;espressione di marcatore TICs, come CD133, CD44, o ALDH, possono variare tra linee cellulari o campioni, anche dello stesso tipo di tumore paziente. Ad esempio, abbiamo scoperto che le cellule OVCAR-5 hanno una maggiore espressione di CD44 rispetto al CD133, mentre l&#39;inverso è vero per ACI-23. È quindi pertinente fare affidamento su l&#39;iniziazione del tumore nei topi e citometria a flusso di analisi come definitivo della presenza TIC. A seguito di tale protocollo, l&#39;attività di alta ALDH stata costantemente osservata quando le cellule tumorali ovariche sono state coltivate in condizioni di cellule staminali. È interessante notare che l&#39;espressione CD133 è costantemente superiore a ACI-23 cellule cresciute in condizioni di coltura tradizionali TIC, mentre ALDH è più alta in floater condizioni TIC. In contrasto con le TGS-3 celle ascite primarie mostrano un lieve aumento della CD133 positività in floater condizioni TIC, ma un notevole aumento dell&#39;attività ALDH in condizioni TIC tradizionali. Questi risultati evidenziano l&#39;eterogeneità delle cellule di cancro ovarico e la plasticità comunemente associati con TIC. Per supportare ulteriormente la claim che questi metodi aumentano TIC, è stato osservato anche l&#39;arricchimento di-1-60 TRA cellule positive. TRA-1-60 è un marcatore pluripotenza ed è stato utilizzato per identificare carcinomi embrionali delle ovaie e dei testicoli e il cancro alla prostata TICS 30-32. Anche se i nostri metodi hanno avuto successo con numerose linee cellulari, è possibile che le condizioni TIC standard possono essere più adatto di alcune cellule di cancro ovarico, mentre le condizioni floater modificate meglio arricchiscono di TIC in altre popolazioni di cellule di cancro ovarico. Questo sottolinea ancora una volta l&#39;eterogeneità atteso entro entrambe le linee di cellule di cancro ovarico-paziente derivati ​​e affermati. Oltre ai marcatori di superficie delle cellule ci sono diversi fattori trascrizionali che sono stati indicati per caratterizzare TIC cancro ovarico tra cui Nanog, Sox2, Oct-4 11, anche se questi marcatori non sono specifici di TIC cancro ovarico e piuttosto rappresentano fattori importanti per embrionali pluripotenza delle cellule staminali e difdifferenzia- 33,34. Abbiamo esaminato i cambiamenti nei livelli di proteina di questi fattori e abbiamo scoperto che i livelli di Nanog aumentano in condizioni di coltura TIC, in accordo con gli altri 13,35 e CD133, TRA-1-60, e CD117. Un array di cDNA marker delle cellule staminali umane ha mostrato inoltre un aumento di geni CD133, Nanog, Melk, e PODXL nelle condizioni TIC rispetto alle condizioni tradizionali aderenti. Importante, va notato che, come marcatori di superficie cellulare, fattori trascrizionali associati con tic ovarici possono variare tra linee cellulari e campioni dei pazienti. Abbiamo osservato che le cellule possono essere più tumorigenica ed esprimono livelli elevati di marcatori di cellule staminali se sono intrinsecamente non aderente in vitro (cioè, le cellule non rapidamente attaccano ad una piastra aderenti flottante). Nella cultura, linee cellulari quali ACI-23 hanno tipicamente molte cellule vitali galleggianti e / o cellule che crescono verticalmente in modo tradizionale impilabile sotto condit culturaioni. Sebbene arricchimento successo di tic da cellule galleggianti e aggregati potrebbe essere applicabile a relativamente poche linee cellulari compresi quelli nel presente studio e OVCAR-3 12, i nostri risultati suggeriscono che questo potrebbe rappresentare una popolazione più oncogeno. Pertanto, la raccolta la popolazione &quot;fluttuante&quot; di cellule coltivate in piastre e terreni di coltura dei tessuti normali può servire come un metodo alternativo di TIC arricchimento, per le cellule che si adattano poco ai media di cellule staminali commerciale. L&#39;uso dei vari metodi di coltura presentati in questo manoscritto consentirà pratica arricchimento delle popolazioni TIC e una migliore comprensione di ciò fattori supportare questo fenotipo in celle diverse. Le attuali applicazioni di questo metodo includono caratterizzante che vie di segnalazione sono vitali per sostenere la propagazione di questa popolazione unica di cellule. I risultati di questi studi contribuiranno a chiarire i meccanismi di progressione del tumore e di recidiva.

Il cancro ovarico è il tumore maligno ginecologica più letale negli Stati Uniti con la principale causa di morbilità e mortalità essere i altamente ricorrenti, caratteristiche chemioresistenti di questa malattia. Il trattamento primario di solito comprende chirurgia citoriduttiva massima e successiva terapia a base di platino, anche se c&#39;è qualche evidenza a suggerire la terapia neoadiuvante potrebbe essere utile in alcuni casi 1. La maggior parte dei pazienti risponde positivamente al trattamento primario, ma purtroppo la metà sarà recidiva entro 18 mesi 2. La maggior parte delle neoplasie ovariche sono carcinomi epiteliali e possono provenire gli epiteli della superficie del tubo 3,4 ovaio o di Falloppio. Diversi studi sostengono l&#39;esistenza di cellule staminali somatiche nel sistema riproduttivo femminile che presumibilmente aiutare nella riparazione dei tessuti che è necessario dopo l&#39;ovulazione 5,6. L&#39;alta attività proliferativa sia l&#39;ovaio e tube di Falloppio durante Övülzione potrebbe essere un fattore importante per lo sviluppo del cancro ovarico (Gharwan, et al. manoscritto presentato). La derivazione di cellule tumorali che formano non è chiara, ma potrebbe derivare da cellule staminali normali, le cellule progenitrici, o cellule differenziate attraverso mutazioni che li rendono in grado di regolare la divisione o il destino. Queste cellule sono state anche chiamate &quot;cellule staminali del cancro&quot;, o &quot;le cellule tumorali-avvio,&quot; e possano diventare cancerogeni, sferoidi multicellulari in condizioni basse di fissaggio. Anche se il modello gerarchico di sviluppo TIC può essere dinamico, TIC condividono molte delle stesse caratteristiche di cellule staminali normali compreso quiescenza, la resistenza alla chemioterapia, a lungo termine di auto-rinnovamento e la capacità di differenziarsi in vari lignaggi cellulari 7,8. Diversi studi sostengono l&#39;esistenza di TIC nel carcinoma ovarico e gli attuali sforzi sono in corso per chiarire il meccanismo (s), con cui queste cellule sostengono tumorigenesi 9-11. Numerosi indicatori sono stati proposti per identificare TIC ovariche con maggiore tumorigenicità compreso CD133, ALDH1A1, CD117, CD44, e MyD88, anche se l&#39;esatto contributo di ciascun indicatore è chiara e può essere tipo cellulare specifico 11-16. Mentre un indicatore universale o un insieme di marcatori non è stata inequivocabilmente stabilito per TIC ovariche, diversi gruppi hanno isolato TIC ovarici più comunemente selezionando per CD44 +, CD133 + e / o cellule con elevata aldeide deidrogenasi (ALDH) Attività 13,17-21. CD44 è una glicoproteina transmembrana che agisce come un recettore per l&#39;acido ialuronico e regola diversi processi importanti per la progressione del tumore, compreso adesione, proliferazione, migrazione, differenziazione angiogenesi e 22. CD133 è una glicoproteina transmembrana la cui funzione non è ancora chiaro, ma gli studi suggeriscono che organizza membrana plasmatica topologia 23. ALDH, un enzima intracellulare che catalizza l&#39;ossidazione di aldeidi, può essere il più universal marcatore di TIC come alta attività è stato identificato in cellule staminali isolate da una varietà di tessuti e molteplici ruoli sono stati attribuiti a ALDH nel sostenere cellule staminali normali e TIC 24. A partire da ora, CD133 e ALDH1 sembrano essere gli indicatori più riproducibili di tic ovarica 13,21. Oltre a comprendere le caratteristiche delle TIC, vi è anche un grande sforzo per identificare i farmaci che colpiscono specificamente questa sottopopolazione. Il tasso di ricaduta elevato associato al cancro ovarico può essere dovuto al fallimento di chemioterapie attuali per sradicare successo TIC. Sebbene la maggior parte del tumore è suscettibile di terapie esistenti, tic si pensa siano resistenti e ad una densità non rilevabile con metodi standard. Chiarire i meccanismi di resistenza alla terapia e di recidiva del tumore sono di vitale importanza per migliorare i tassi di risposta e di sopravvivenza globale dei pazienti con tumore ovarico. Qui, tecniche di coltura sono descritte tha arricchire per IAT di linee cellulari di cancro ovarico consolidati e primari. Le condizioni di coltura qui descritti sono stati utilizzati da diversi gruppi per indurre la propagazione di tic o cellule sferoidali con qualità di cellule staminali 11,12,14,16,20. Sebbene vi siano diversi media di coltura delle cellule staminali e integratori comunemente usati per arricchire TIC / sferoidi abbiamo usato una formula supporto privo di siero con EGF e FGF, ma senza l&#39;aggiunta di B27 o N-2 integratori. Questi integratori, comunemente usati per la coltura delle cellule neuronali e arricchimento per cellule staminali, hanno dimostrato di promuovere un fenotipo mesenchimale 25,26 e rimane qualche incertezza nel campo come se TIC aventi un fenotipo mesenchimale o epiteliali sono più tumorigenica 27-29 . Per ridurre al minimo le incertezze e le variabili abbiamo scelto di utilizzare la formula più comune, dal momento che si tratta di cellule di cancro ovarico epiteliale. Mantenere le cellule in mezzi senza siero in un pallone basso attaccamentofacilita la formazione sferoide e sostiene la diffusione di cellule con espressione CD133 e alta attività ALDH. Il nostro lavoro ha inoltre dimostrato che le cellule galleggianti in normali condizioni aderenti possono anche rappresentare una popolazione TIC più oncogeno. Iniezione di cellule cresciute in queste condizioni in topi nudi atimici porta ad una maggiore potenzialità oncogeno rispetto a cellule coltivate in condizioni allegate in presenza di siero. Molte informazioni per quanto riguarda il ruolo delle TIC in iniziazione ovarico cancro, la progressione, la risposta terapeutica, e la ricaduta di malattia può essere acquisita tramite l&#39;uso di queste tecniche.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1066">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:464px;">Name of Reagent/ Equipment</td>
			<td style="width:191px;">Company</td>
			<td style="width:104px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:308px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:464px;">75 cm2 Ultra - Low Attachment Flask</td>
			<td style="width:191px;">Corning</td>
			<td align="right" style="width:104px;">3814</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:464px;">75 cm2 Tissue Culture Flask</td>
			<td style="width:191px;">Sarstedt</td>
			<td style="width:104px;">83.1813.002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:464px;">Aldefluor Kit</td>
			<td style="width:191px;">Stemcell Technologies</td>
			<td align="right" style="width:104px;">1700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:464px;">CD133-APC</td>
			<td style="width:191px;">Miltenyi Biotec Inc.</td>
			<td style="width:104px;">130-090-826</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:464px;">Fibroblast Growth Factor - Basic human recombinant</td>
			<td style="width:191px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:104px;">F0291</td>
			<td>Prepared according to manufacturer&#39;s instructions</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:464px;">Epidermal Growth Factor - human recombinant</td>
			<td style="width:191px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:104px;">E9644</td>
			<td>Prepared by Dissolving 0.2 mg with 1 ml sterile PBS</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:464px;">DMEM:F12 (+L-Glutamine, +5 mM HEPES)</td>
			<td style="width:191px;">Gibco</td>
			<td style="width:104px;">11330-032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:464px;">1X Dulbecco&#39;s Phosphate-Buffered Saline (Without Calcium and Magnesium)</td>
			<td style="width:191px;">Corning cellgro</td>
			<td style="width:104px;">21-031-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:464px;">0.25% Trypsin-EDTA (1X)</td>
			<td style="width:191px;">Gibco</td>
			<td style="width:104px;">25200-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:464px;">Cellstripper Non-enzymatic Cell Dissociation Solution</td>
			<td style="width:191px;">Corning cellgro</td>
			<td style="width:104px;">25-056-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:464px;">Bovine Serum Albumin</td>
			<td style="width:191px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:104px;">A9418-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:464px;">Insulin-Transferrin-Selenium</td>
			<td style="width:191px;">Gibco</td>
			<td style="width:104px;">51500-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:464px;">KnockOut Serum Replacement</td>
			<td style="width:191px;">Gibco</td>
			<td align="right" style="width:104px;">10828010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:464px;">Penicillin/Streptomycin</td>
			<td style="width:191px;">Gibco</td>
			<td style="width:104px;">15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:464px;">Fetal Bovine Serum (Heat Inactivated)</td>
			<td style="width:191px;">Gemini</td>
			<td style="width:104px;">100-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:464px;">Rapid-Flow Sterile Dsiposable Filter Units with CN Membrane (0.45 micron)</td>
			<td style="width:191px;">Nalgene</td>
			<td style="width:104px;">450-0045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:464px;">15 ml Sterile Polypropylene Centrifuge Tube</td>
			<td style="width:191px;">Corning</td>
			<td align="right" style="width:104px;">430052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:464px;">50 ml Sterile Polypropylene Conical Tube</td>
			<td style="width:191px;">Falcon</td>
			<td align="right" style="width:104px;">352098</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:464px;">Trypan Blue 0.4% solution in 0.85% NaCl</td>
			<td style="width:191px;">Lonza</td>
			<td style="width:104px;">17-942E</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vitro enrichment of ovarian cancer tumor-initiating cells

Evidence suggests that small subpopulations of tumor cells maintain a unique self-renewing and differentiation capacity and may be responsible for tumor initiation and/or relapse. Clarifying the mechanisms by which these tumor-initiating cells (TICs) support tumor formation and progression could lead to the development of clinically favorable therapies. Ovarian cancer is a heterogeneous and highly recurrent disease. Recent studies suggest TICs may play an important role in disease biology. We have identified culture conditions that enrich for TICs from ovarian cancer cell lines. Growing either adherent cells or non-adherent &#8216;floater&#8217; cells in a low attachment plate with serum free media in the presence of growth factors supports the propagation of ovarian cancer TICs with stem cell markers (CD133 and ALDH activity) and increased tumorigenicity without the need to physically separate the TICs from other cell types within the culture. Although the presence of floater cells is not common for all cell lines, this population of cells with innate low adherence may have high tumorigenic potential.Compared to adherent cells grown in the presence of serum, TICs readily form spheres, are significantly more tumorigenic in mice, and express putative stem cell markers. The conditions are easy to establish in a timely manner and can be used to study signaling pathways important for maintaining stem characteristics, and to identify drugs or combinations of drugs targeting TICs. The culture conditions described herein are applicable for a variety of ovarian cancer cells of epithelial origin and will be critical in providing new information about the role of TICs in tumor initiation, progression, and relapse.

Fondata linee di cellule di cancro ovarico e una linea di cellule ascite primario coltivate in condizioni tradizionali aderenti coltura in presenza di siero spettacolo allegato, ciottoli morfologia, che le stesse cellule cresciute in condizioni di coltura TIC visualizzano fluttuante sferoide morfologia, comune nelle popolazioni TIC. Immagini Brightfield visualizzate in Figura 1 A mostrano chiaramente le differenze morfologiche nelle condizioni di coltura. Figura 1B mostra le morfologie differenziate raggiunti dopo replating gli ACI-23 e TGS-3 culture TIC in condizioni aderenti tradizionali. Appena 24 ore dopo la semina di nuovo in condizioni di aderenti, la maggioranza dei sferoidi multicellulari dissocia e allegare alla superficie, simile cellule tipiche aderenti. Per verificare che le condizioni TIC arricchiscono di cellule con marcatori di cellule staminali citometria a flusso analisi è stata effettuata utilizzando due indicatori comuni di tic ovariche - CD133 expression e l&#39;attività ALDH. Trame Dot illustrati nella Figura 2 A evidenziare l&#39;aumento della percentuale di cellule CD133 + in basso attaccamento, condizioni di assenza di siero. Analogamente, l&#39;attività dell&#39;enzima ALDH è maggiore in queste condizioni rispetto alle tradizionali condizioni di coltura aderenti. Anche se le tradizionali culture aderenti contengono cellule CD133 +, la percentuale aumenta in condizioni che migliorano la formazione sferoide. Analisi di un marcatore pluripotenza, TRA-1-60, presta ulteriore supporto che le condizioni TIC arricchiscono di tic, Figura 2 B. La quantificazione in Figura 2 C dimostra che doppia positivi (CD133 + ALDH +) ACI-23 cellule sono in gran parte limitati a colture coltivate in TIC condizioni migliorando. Sono stati esaminati anche cambiamenti nei livelli di proteina di diversi fattori di trascrizione che si verificano nelle cellule ACI-23, dopo cinque giorni di cultura nelle condizioni TIC. Un aumento progressivo ogni del marcatores è visto dal tradizionale al floater condizioni TIC rispetto ai livelli relativamente bassi registrati nella cultura aderenti, Figura 2 D. È interessante notare che una linea cellulare umana ascite coltivato in varie condizioni mostra la più alta fenotipo marcatore nelle condizioni TIC tradizionali con poca o nessuna colorazione presente nelle condizioni TIC floater, Figura 2 E. La tumorigenicità delle condizioni di coltura TIC è stato validato attraverso iniezioni sottocutanee di un numero uguale di cellule vitali ottenute da tutte le condizioni in coorti di topi nudi atimici. Figura 3 dimostra che ACI-23 (A, B) e OVCAR-5 (C), le cellule da culture tradizionali aderenti erano meno oncogeno di quelli delle culture TIC. Si noti che i floater culture TIC prodotte tumori più grandi in un periodo di tempo più breve rispetto ai tradizionali culture TIC aderenti o tradizionali. Questi data suggeriscono che anche con un modesto aumento dei marker TIC ovarici, vi è un drammatico cambiamento fenotipico. Tuttavia con altre linee cellulari (non mostrati) le tradizionali culture TIC erano più tumorigenica rispetto alle tradizionali celle di coltura TIC aderenti e galleggiante. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/52446/52446fig1highres.jpg" /> Figura 1. sviluppo Spheroid in diverse condizioni di coltura. (A) Fondata ovarico linee di cellule di cancro (ACI-23, OVCAR-5 e CAOV3) e le cellule primarie derivate da pazienti ascite (TGS-3), coltivate in fiaschi bassi di attaccamento con senza siero staminali supporti di cellule facilmente formare sferoidi multicellulari. Immagini mostrano condizioni tradizionali di coltura aderenti mantengono epiteliale ciottoli morfologia ACI-23, OVCAR-5, CAOV3 e TGS-3 celle, mentre le stesse cellule sferoidi formate entro 96 ore in condizioni di TIC. Scale bar 100 micron. (B) Dopo 24 ore di esposizionealle condizioni tradizionali di coltura aderenti, le morfologie cultura TIC mostrano un fenotipo differenziato simile morfologia aderenti originale. Bar Scala 100 micron. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52446/52446fig1large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/52446/52446fig2highres.jpg" /> Figura 2. Basso-attaccamento, condizioni di assenza di siero arricchiscono di cellule con marcatori TIC. (A) di citometria a flusso analisi ACI-23 cellule utilizzando APC coniugato anticorpo CD133 dimostra una maggiore percentuale di cellule CD133 + in fiaschi bassi di attaccamento con stelo senza siero supporti cellulari. Citometria a flusso analisi utilizzando Aldefluor spettacoli di analisi maggiore attività ALDH in cellule coltivate in fiaschi bassi di attaccamento con i media di cellule staminali senza siero. Controllo negativo CD133 contiene anticorpi e ALDH con negativocontrollo è il substrato attivato in presenza dell&#39;inibitore ALDH (Deab). (B) Analisi utilizzando FITC coniugato TRA-1-60 anticorpi dimostra più alta percentuale di + cellule TRA-1-60 in floater condizioni TIC in ACI-23 cellule. Controllo negativo non contiene anticorpi. (C) CD133 + ALDH cellule + sono più alti nel tradizionale TIC e Floater condizioni TIC nella linea cellulare ACI-23. Le barre di errore: SEM, N = 6, * p &lt;0.05. (D) analisi Western Blot mostrando aumento dei livelli di proteina di marcatori trascrizionali di cellule staminali nei ACI-23 cellule in coltura in condizioni di TIC per 5 giorni. Lisati cellulari Whole (50 mcg) sono stati analizzati con GAPDH come controllo di caricamento. (E) dot plots rappresentativi di TGS-3 cellule ascite primarie analizzate come in A. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52446/52446fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> Figura 3. Low-attaccamento, condizioni di assenza di siero arricchiscono di celle con maggiore tumorigenicità. (A) 5 x 10 5 valide ACI-23 cellule sono state via sottocutanea iniettato in topi nudi atimici in triplice copia. I topi sono stati pesati e misurati da tumori pinza due volte alla settimana. A = Cultura tradizionale aderente, cultura F = Floater TIC, cultura S = Tradizionale TIC. * P &lt;0,05. (B) Immagini rappresentative di tumori formati da ACI-23 dopo 25 giorni utilizzando cellule cresciute in diverse condizioni di coltura. (C) 5 x 10 5 valide OVCAR-5 cellule sono state via sottocutanea iniettato in topi nudi atimici in triplice copia e monitorati come in A. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52446/52446fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a>

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In vitro Enrichment of Ovarian Cancer Tumor-initiating Cells

Tumor-initiating cells (TICs) may represent a viable therapeutic target for the treatment of ovarian cancer, a highly recurrent and fatal disease. We present a protocol for culture conditions that enrich for this highly tumorigenic population of cells.

In Arricchimento vitro di Ovarian Cancer Cells-tumorali avvio

Evidence suggests that small subpopulations of tumor cells maintain a unique self-renewing and differentiation capacity and may be responsible for tumor ...

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Medicine

In vitro Enrichment of Ovarian Cancer Tumor-initiating Cells

13.7K Views.  National Cancer Institute. Tumor-initiating cells (TICs) may represent a viable therapeutic target for the treatment of ovarian cancer, a highly recurrent and fatal disease. We present a protocol for culture conditions that enrich for this highly tumorigenic population of cells.

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An In Vitro System to Study Tumor Dormancy and the Switch to Metastatic Growth

Recurrence of breast cancer often follows a long latent period in which there are no signs of cancer, and metastases may not become clinically apparent until many years after removal of the primary tumor and adjuvant therapy. A likely explanation of this phenomenon is that tumor cells have seeded metastatic sites, are resistant to conventional therapies, and remain dormant for long periods of time 1-4.
The existence of dormant cancer cells at secondary sites has been described previously as quiescent solitary cells that neither proliferate nor undergo apoptosis 5-7. Moreover, these solitary cells has been shown to disseminate from the primary tumor at an early stage of disease progression 8-10 and reside growth-arrested in the patients' bone marrow, blood and lymph nodes 1,4,11. Therefore, understanding mechanisms that regulate dormancy or the switch to a proliferative state is critical for discovering novel targets and interventions to prevent disease recurrence. However, unraveling the mechanisms regulating the switch from tumor dormancy to metastatic growth has been hampered by the lack of available model systems.
in vivo and ex vivo model systems to study metastatic progression of tumor cells have been described previously 1,12-14. However these model systems have not provided in real time and in a high throughput manner mechanistic insights into what triggers the emergence of solitary dormant tumor cells to proliferate as metastatic disease. We have recently developed a 3D in vitro system to model the in vivo growth characteristics of cells that exhibit either dormant (D2.OR, MCF7, K7M2-AS.46) or proliferative (D2A1, MDA-MB-231, K7M2) metastatic behavior in vivo . We demonstrated that tumor cells that exhibit dormancy in vivo at a metastatic site remain quiescent when cultured in a 3-dimension (3D) basement membrane extract (BME), whereas cells highly metastatic in vivo readily proliferate in 3D culture after variable, but relatively short periods of quiescence. Importantly by utilizing the 3D in vitro model system we demonstrated for the first time that the ECM composition plays an important role in regulating whether dormant tumor cells will switch to a proliferative state and have confirmed this in in vivo studies15-17. Hence, the model system described in this report provides an in vitro method to model tumor dormancy and study the transition to proliferative growth induced by the microenvironment.

An In Vitro System to Study Tumor Dormancy and the Switch to Metastatic Growth

A modified 3-D in vitro system is presented in which growth characteristics of several tumor cell lines in reconstituted basement membrane correlate with the dormant or proliferative behavior of the tumor cells at a metastatic secondary site in vivo.

Un In Vitro Sistema per studio dormienza tumorale e l&#39;interruttore di crescita metastatica

Recurrence of breast cancer often follows a long latent period in which there are no signs of cancer, and metastases may not become clinically apparent ...

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In vitro Mesothelial Clearance Assay that Models the Early Steps of Ovarian Cancer Metastasis

Ovarian cancer is the fifth leading cause of cancer related deaths in the United States1. Despite a positive initial response to therapies, 70 to 90 percent of women with ovarian cancer develop new metastases, and the recurrence is often fatal2. It is, therefore, necessary to understand how secondary metastases arise in order to develop better treatments for intermediate and late stage ovarian cancer. Ovarian cancer metastasis occurs when malignant cells detach from the primary tumor site and disseminate throughout the peritoneal cavity. The disseminated cells can form multicellular clusters, or spheroids, that will either remain unattached, or implant onto organs within the peritoneal cavity3 (Figure 1, Movie 1). 
All of the organs within the peritoneal cavity are lined with a single, continuous, layer of mesothelial cells4-6 (Figure 2). However, mesothelial cells are absent from underneath peritoneal tumor masses, as revealed by electron micrograph studies of excised human tumor tissue sections3,5-7 (Figure 2). This suggests that mesothelial cells are excluded from underneath the tumor mass by an unknown process. 
Previous in vitro experiments demonstrated that primary ovarian cancer cells attach more efficiently to extracellular matrix than to mesothelial cells8, and more recent studies showed that primary peritoneal mesothelial cells actually provide a barrier to ovarian cancer cell adhesion and invasion (as compared to adhesion and invasion on substrates that were not covered with mesothelial cells)9,10. This would suggest that mesothelial cells act as a barrier against ovarian cancer metastasis. The cellular and molecular mechanisms by which ovarian cancer cells breach this barrier, and exclude the mesothelium have, until recently, remained unknown. 
Here we describe the methodology for an in vitro assay that models the interaction between ovarian cancer cell spheroids and mesothelial cells in vivo (Figure 3, Movie 2). Our protocol was adapted from previously described methods for analyzing ovarian tumor cell interactions with mesothelial monolayers8-16, and was first described in a report showing that ovarian tumor cells utilize an integrin &#x2013;dependent activation of myosin and traction force to promote the exclusion of the mesothelial cells from under a tumor spheroid17. This model takes advantage of time-lapse fluorescence microscopy to monitor the two cell populations in real time, providing spatial and temporal information on the interaction. The ovarian cancer cells express red fluorescent protein (RFP) while the mesothelial cells express green fluorescent protein (GFP). RFP-expressing ovarian cancer cell spheroids attach to the GFP-expressing mesothelial monolayer. The spheroids spread, invade, and force the mesothelial cells aside creating a hole in the monolayer. This hole is visualized as the negative space (black) in the GFP image. The area of the hole can then be measured to quantitatively analyze differences in clearance activity between control and experimental populations of ovarian cancer and/ or mesothelial cells. This assay requires only a small number of ovarian cancer cells (100 cells per spheroid X 20-30 spheroids per condition), so it is feasible to perform this assay using precious primary tumor cell samples. Furthermore, this assay can be easily adapted for high throughput screening.

In vitro Mesothelial Clearance Assay that Models the Early Steps of Ovarian Cancer Metastasis

The mesothelial clearance assay described here takes advantage of fluorescently labeled cells and time-lapse video microscopy to visualize and quantitatively measure the interactions of ovarian cancer multicellular spheroids and mesothelial cell monolayers. This assay models the early steps of ovarian cancer metastasis.

In vitro test Clearance mesoteliali che modella i primi passi di metastasi del cancro ovarico

Ovarian cancer is the fifth leading cause of cancer related deaths in the United States1. Despite a positive initial response to therapies, 70 to 90 ...

Heterotypic Three-dimensional In Vitro Modeling of Stromal-Epithelial Interactions During Ovarian Cancer Initiation and Progression

Epithelial ovarian cancers (EOCs) are the leading cause of death from gynecological malignancy in Western societies. Despite advances in surgical treatments and improved platinum-based chemotherapies, there has been little improvement in EOC survival rates for more than four decades 1,2. Whilst stage I tumors have 5-year survival rates &gt;85%, survival rates for stage III/IV disease are &lt;40%. Thus, the high rates of mortality for EOC could be significantly decreased if tumors were detected at earlier, more treatable, stages 3-5. At present, the molecular genetic and biological basis of early stage disease development is poorly understood. More specifically, little is known about the role of the microenvironment during tumor initiation; but known risk factors for EOCs (e.g. age and parity) suggest that the microenvironment plays a key role in the early genesis of EOCs. We therefore developed three-dimensional heterotypic models of both the normal ovary and of early stage ovarian cancers. For the normal ovary, we co-cultured normal ovarian surface epithelial (IOSE) and normal stromal fibroblast (INOF)&nbsp;cells, immortalized by retrovrial transduction of the catalytic subunit of human telomerase holoenzyme (hTERT) to extend the lifespan of these cells in culture. To model the earliest stages of ovarian epithelial cell transformation, overexpression of the CMYC oncogene in IOSE cells, again co-cultured with INOF cells. These heterotypic models were used to investigate the effects of aging and senescence on the transformation and invasion of epithelial cells. Here we describe the methodological steps in development of these three-dimensional model; these methodologies aren't specific to the development of normal ovary and ovarian cancer tissues, and could be used to study other tissue types where stromal and epithelial cell interactions are a fundamental aspect of the tissue maintenance and disease development.

Heterotypic Three-dimensional In Vitro Modeling of Stromal-Epithelial Interactions During Ovarian Cancer Initiation and Progression

We describe methodologies for establishing in vitro heterotypic three-dimensional models comprising ovarian fibroblasts and normal ovarian surface or ovarian cancer epithelial cells. We discuss the use of these models to study stromal-epithelial interactions that occur during ovarian cancer development.

Eterotipica tridimensionale<em&gt; In Vitro</emModellazione&gt; di stromale-epiteliali interazioni Durante iniziazione e la progressione del cancro ovarico

Epithelial ovarian cancers (EOCs) are the leading cause of death from gynecological malignancy in Western societies. Despite advances in surgical ...

Label-free Isolation and Enrichment of Cells Through Contactless Dielectrophoresis

Dielectrophoresis (DEP) is the phenomenon by which polarized particles in a non-uniform electric field undergo translational motion, and can be used to direct the motion of microparticles in a surface marker-independent manner. Traditionally, DEP devices include planar metallic electrodes patterned in the sample channel. This approach can be expensive and requires a specialized cleanroom environment. Recently, a contact-free approach called contactless dielectrophoresis (cDEP) has been developed. This method utilizes the classic principle of DEP while avoiding direct contact between electrodes and sample by patterning fluidic electrodes and a sample channel from a single polydimethylsiloxane (PDMS) substrate, and has application as a rapid microfluidic strategy designed to sort and enrich microparticles. Unique to this method is that the electric field is generated via fluidic electrode channels containing a highly conductive fluid, which are separated from the sample channel by a thin insulating barrier. Because metal electrodes do not directly contact the sample, electrolysis, electrode delamination, and sample contamination are avoided. Additionally, this enables an inexpensive and simple fabrication process.
cDEP is thus well-suited for manipulating sensitive biological particles. The dielectrophoretic force acting upon the particles depends not only upon spatial gradients of the electric field generated by customizable design of the device geometry, but the intrinsic biophysical properties of the cell. As such, cDEP is a label-free technique that avoids depending upon surface-expressed molecular biomarkers that may be variably expressed within a population, while still allowing characterization, enrichment, and sorting of bioparticles.
Here, we demonstrate the basics of fabrication and experimentation using cDEP. We explain the simple preparation of a cDEP chip using soft lithography techniques. We discuss the experimental procedure for characterizing crossover frequency of a particle or cell, the frequency at which the dielectrophoretic force is zero. Finally, we demonstrate the use of this technique for sorting a mixture of ovarian cancer cells and fluorescing microspheres (beads).

Contactless dielectrophoresis (cDEP) achieves sorting and enrichment of particles via their intrinsic dielectric properties. Fluidic electrode channels replace metallic electrodes traditional to DEP, suiting cDEP to non-damaging sterile characterization and sorting of biological particles. We demonstrate how to prepare a cDEP microdevice and conduct cell characterization and sorting experiments.

Isolamento privo di etichetta e di arricchimento delle cellule attraverso Contactless dielettroforesi

Dielectrophoresis (DEP) is the phenomenon by which polarized particles in a non-uniform electric field undergo translational motion, and can be used to ...

Method for Obtaining Primary Ovarian Cancer Cells From Solid Specimens

Reliable tools for investigating ovarian cancer initiation and progression are urgently needed. While the use of ovarian cancer cell lines remains a valuable tool for understanding ovarian cancer, their use has many limitations. These include the lack of heterogeneity and the plethora of genetic alterations associated with extended in vitro passaging.&#160;Here we describe a method that allows for rapid establishment of primary ovarian cancer cells form solid clinical specimens collected at the time of surgery. The method consists of subjecting clinical specimens to enzymatic digestion for 30 min. The isolated cell suspension is allowed to grow and can be used for downstream application including drug screening. The advantage of primary ovarian cancer cell lines over established ovarian cancer cell lines is that they are representative of the original specific clinical specimens they are derived from and can be derived from different sites whether primary or metastatic ovarian cancer.

This study describes a detailed method for isolation and characterization of primary ovarian cancer cells from solid clinical specimens. Ovarian cancer clinical specimens are subjected to enzymatic digestion to obtain viable, fibroblast-free epithelial ovarian cancer (EOC) cells highly suitable for downstream applications.

Metodo per ottenere primarie cellule tumorali ovariche da campioni solidi

Reliable tools for investigating ovarian cancer initiation and progression are urgently needed. While the use of ovarian cancer cell lines remains a ...

Assessment of Ovarian Cancer Spheroid Attachment and Invasion of Mesothelial Cells in Real Time

Ovarian cancers metastasize by shedding into the peritoneal fluid and dispersing to distal sites within the peritoneum. Monolayer cultures do not accurately model the behaviors of cancer cells within a nonadherent environment, as cancer cells inherently aggregate into multicellular structures which contribute to the metastatic process by attaching to and invading the peritoneal lining to form secondary tumors. To model this important stage of ovarian cancer metastasis, multicellular aggregates, or spheroids, can be generated from established ovarian cancer cell lines maintained under nonadherent conditions. To mimic the peritoneal microenvironment encountered by tumor cells in vivo, a spheroid-mesothelial co-culture model was established in which preformed spheroids are plated on top of a human mesothelial cell monolayer, formed over an extracellular matrix barrier. Methods were then developed using a real-time cell analyzer to conduct quantitative real time measurements of the invasive capacity of different ovarian cancer cell lines grown as spheroids. This approach allows for the continuous measurement of invasion over long periods of time, which has several advantages over traditional endpoint assays and more laborious real time microscopy image analyses. In short, this method enables a rapid, determination of factors which regulate the interactions between ovarian cancer spheroid cells invading through mesothelial and matrix barriers over time.

Ovarian cancer cell invasion into the mesothelial lining of the peritoneum is a dynamic process over time. Utilizing a real time analyzer, the invasive capacity of ovarian cancer cells in a spheroid-mesothelial cell co-culture model can be quantified over prolonged time periods, providing insights into factors regulating the metastatic process.

Valutazione del cancro ovarico Spheroid attaccamento e l&#39;invasione delle cellule mesoteliali in tempo reale

Ovarian cancers metastasize by shedding into the peritoneal fluid and dispersing to distal sites within the peritoneum. Monolayer cultures do not ...

Enrichment for Chemoresistant Ovarian Cancer Stem Cells from Human Cell Lines

Cancer stem cells (CSCs) are defined as a subset of slow cycling and undifferentiated cells that divide asymmetrically to generate highly proliferative, invasive, and chemoresistant tumor cells. Therefore, CSCs are an attractive population of cells to target therapeutically. CSCs are predicted to contribute to a number of types of malignancies including those in the blood, brain, lung, gastrointestinal tract, prostate, and ovary. Isolating and enriching a tumor cell population for CSCs will enable researchers to study the properties, genetics, and therapeutic response of CSCs. We generated a protocol that reproducibly enriches for ovarian cancer CSCs from ovarian cancer cell lines (SKOV3 and OVCA429). Cell lines are treated with 20 &#181;M cisplatin for 3 days. Surviving cells are isolated and cultured in a serum-free stem cell media containing cytokines and growth factors. We demonstrate an enrichment of these purified CSCs by analyzing the isolated cells for known stem cell markers Oct4, Nanog, and Prom1 (CD133) and cell surface expression of CD177 and CD133. The CSCs exhibit increased chemoresistance. This method for isolation of CSCs is a useful tool for studying the role of CSCs in chemoresistance and tumor relapse.

Cancer stem cells (CSCs) are&#160;implicated in tumor relapse due to chemoresistance. We have optimized a protocol for selection and expansion of CSCs from ovarian cancer cell lines. By treating cells with the chemotherapeutic cisplatin and culturing&#160;in a stem cell promoting media we enrich for non-adherent CSC cultures.

Arricchimento per chemioresistente Ovarian Cancer Stem Cells da linee cellulari umane

Cancer stem cells (CSCs) are defined as a subset of slow cycling and undifferentiated cells that divide asymmetrically to generate highly proliferative, ...

Evaluating the Effectiveness of Cancer Drug Sensitization In Vitro and In Vivo

Due to the high level of heterogeneity and mutations inherent in human cancers, single agent therapies, or combination regimens which target the same pathway, are likely to fail. Emphasis must be placed upon the inhibition of pathways that are responsible for intrinsic and/or adaptive resistance to therapy. An active field of investigation is the development and testing of DNA repair inhibitors that promote the action of, and prevent resistance to, commonly used chemotherapy and radiotherapy. We used a novel protocol to evaluate the effectiveness of BRCA2 inhibition as a means to sensitize tumor cells to the DNA damaging drug cisplatin. Tumor cell metabolism (acidification and respiration) was monitored in real-time for a period of 72 hr to delineate treatment effectiveness on a minute by minute basis. In combination, we performed an assessment of metastatic frequency using a chicken embryo chorioallantoic membrane (CAM) model of extravasation and invasion. This protocol addresses some of the weaknesses of commonly used in vitro and in vivo methods to evaluate novel cancer therapy regimens. It can be used in addition to common methods such as cell proliferation assays, cell death assays, and in vivo murine xenograft studies, to more closely discriminate amongst candidate targets and agents, and select only the most promising candidates for further development.

Evaluating the Effectiveness of Cancer Drug Sensitization In Vitro and In Vivo

Here, real-time monitoring of tumor cell metabolism, combined with an in vivo chicken embryo chorio-allantoic membrane (CAM) model of metastasis, are used to evaluate novel anti-cancer targets/agents for their ability to sensitize tumor cells to DNA damaging chemotherapeutics.

Valutare l&#39;efficacia delle Cancer Drug Sensibilizzazione<em&gt; In Vitro</em&gt; E<em&gt; In Vivo</em

Due to the high level of heterogeneity and mutations inherent in human cancers, single agent therapies, or combination regimens which target the same ...

In Vivo and Ex Vivo Approaches to Study Ovarian Cancer Metastatic Colonization of Milky Spot Structures in Peritoneal Adipose

High-grade serous ovarian cancer (HGSC), the cause of widespread peritoneal metastases, continues to have an extremely poor prognosis; fewer than 30% of women are alive 5 years after diagnosis. The omentum is a preferred site of HGSC metastasis formation. Despite the clinical importance of this microenvironment, the contribution of omental adipose tissue to ovarian cancer progression remains understudied. Omental adipose is unusual in that it contains structures known as milky spots, which are comprised of B, T, and NK cells, macrophages, and progenitor cells surrounding dense nests of vasculature. Milky spots play a key role in the physiologic functions of the omentum, which are required for peritoneal homeostasis. We have shown that milky spots also promote ovarian cancer metastatic colonization of peritoneal adipose, a key step in the development of peritoneal metastases. Here we describe the approaches we developed to evaluate and quantify milky spots in peritoneal adipose and study their functional contribution to ovarian cancer cell metastatic colonization of omental tissues both in vivo and ex vivo. These approaches are generalizable to additional mouse models and cell lines, thus enabling the study of ovarian cancer metastasis formation from initial localization of cells to milky spot structures to the development of widespread peritoneal metastases.

In Vivo and Ex Vivo Approaches to Study Ovarian Cancer Metastatic Colonization of Milky Spot Structures in Peritoneal Adipose

We outline a protocol that implements both in vivo and ex vivo approaches to study ovarian cancer colonization of peritoneal adipose tissues, particularly the omentum. Furthermore, we present a protocol to quantitate and analyze immune cell-structures in the omentum known as milky spots, which promote metastases of peritoneal adipose.

In vivo ed ex vivo approcci per studiare il cancro ovarico metastatico colonizzazione delle strutture Lattea Spot in peritoneale adiposo

High-grade serous ovarian cancer (HGSC), the cause of widespread peritoneal metastases, continues to have an extremely poor prognosis; fewer than 30% of ...

Studying Pancreatic Cancer Stem Cell Characteristics for Developing New Treatment Strategies

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) contains a subset of exclusively tumorigenic cancer stem cells (CSCs) which have been shown to drive tumor initiation, metastasis and resistance to radio- and chemotherapy. Here we describe a specific methodology for culturing primary human pancreatic CSCs as tumor spheres in anchorage-independent conditions. Cells are grown in serum-free, non-adherent conditions in order to enrich for CSCs while their more differentiated progenies do not survive and proliferate during the initial phase following seeding of single cells. This assay can be used to estimate the percentage of CSCs present in a population of tumor cells. Both size (which can range from 35 to 250 micrometers) and number of tumor spheres formed represents CSC activity harbored in either bulk populations of cultured cancer cells or freshly harvested and digested tumors 1,2. Using this assay, we recently found that metformin selectively ablates pancreatic CSCs; a finding that was subsequently further corroborated by demonstrating diminished expression of pluripotency-associated genes/surface markers and reduced in vivo tumorigenicity of metformin-treated cells. As the final step for preclinical development we treated mice bearing established tumors with metformin and found significantly prolonged survival. Clinical studies testing the use of metformin in patients with PDAC are currently underway (e.g., NCT01210911, NCT01167738, and NCT01488552). Mechanistically, we found that metformin induces a fatal energy crisis in CSCs by enhancing reactive oxygen species (ROS) production and reducing mitochondrial transmembrane potential. In contrast, non-CSCs were not eliminated by metformin treatment, but rather underwent reversible cell cycle arrest. Therefore, our study serves as a successful example for the potential of in vitro sphere formation as a screening tool to identify compounds that potentially target CSCs, but this technique will require further in vitro and in vivo validation to eliminate false discoveries.

Pancreatic cancer stem cells (CSCs) can be expanded in vitro using the anchorage-independent sphere culture technique, which represents a powerful tool to study CSC biology and can serve as the first step to develop novel CSC-targeting therapies. Here the methodology for expanding, analyzing and targeting of pancreatic CSCs is provided.

Methods Article

In Arricchimento vitro di Ovarian Cancer Cells-tumorali avvio