Name: three-dimensional (3d) tumor spheroid invasion assay
Uploaded: 2015-05-01T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 19 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Three-Dimensional 3D Tumor Spheroid Invasion Assay at JoVE.com

This work was funded by The National Centre for the Replacement, Refinement and Reduction of Animals in Research (G1000121 ID no.94513) and the Oracle Cancer Trust. SE is supported by The Institute of Cancer Research and Cancer Research UK (grant number C309/A8274). We acknowledge NHS funding to the NIHR Biomedical Research Centre.

1. Generazione di riproducibile Spheroids tumorali Sized <ol><li> Lavare monostrati di cellule tumorali con tampone fosfato (PBS, 5 ml per 25 cm 2 o 8-10 ml per un pallone 75 centimetri 2), aggiungere la dissociazione delle cellule enzima (1 ml per 25 cm 2 o 2 ml per 75 cm 2 pallone) e incubare cellule a 37 ° C per 2-5 min. </li><li> Controllare il distacco delle cellule al microscopio e neutralizzare la dissociazione cellulare dell&#39;enzima con mezzo di crescita completo (5 ml per 25 cm 2 o 8 ml per un matraccio 75 centimetri 2). </li><li> Sospensione cellulare Centrifugare a 500 xg per 5 min. </li><li> Rimuovere il surnatante, toccare il tubo e risospendere il pellet cellulare in 1 ml di terreno di coltura completo utilizzando una pipetta P1000. Ciò dovrebbe produrre una sospensione di cellule singole, senza gruppi di cellule. </li><li> Contare le cellule utilizzando un emocitometro e diluire la sospensione cellulare per ottenere 0,5-2 x 10 4 cellule / ml (densità cellulare ottimale deve essere determinato per ciascuna linea cellulare in order per ottenere sferoidi tumorali di 300-500 micron di diametro 4 giorni dopo la semina cella 12,13). </li><li> Trasferire la sospensione cellulare ad un serbatoio sterile e, con una pipetta multicanale, dispensare 200 pl / pozzetto in ultra-low di attacco (ULA) 96 pozzetti piastre inferiori rotonde 12. </li><li> Trasferire le piastre di un incubatore (37 ° C, 5% CO 2, 95% di umidità). Quattro giorni dopo, confermare visivamente tumore formazione sferoide e procedere con il test di invasione 3D. </li></ol> 2. 3D Tumore Spheroid Invasion Assay <ol><li> Scongelare BMM sul ghiaccio. </li><li> Mantenere una serie di puntali con filtro sterili per P10, P200 e P1000 pipette e provette sterili (1,5 ml di volume o maggiore a seconda del volume totale richiesto) a -20 ° C. </li><li> Posizionare le piastre a 96 pozzetti contenenti ULA 4 giorni vecchi sferoidi sul ghiaccio. </li><li> Utilizzando una pipetta multicanale, rimuovere delicatamente 100 l / pozzetto di terreno di crescita dalle piastre sferoidali. Per questo angolo passo le punte verso l&#39;inside parete dei pozzetti U-bottom, evitando il contatto con il fondo del pozzetto e la posizione degli sferoidi; minimizzare il disturbo degli sferoidi. </li><li> Utilizzando punte ghiacciate, trasferire BMM di tubi ghiacciati. Per invasione citochine indotta o per studi di valutazione di droga, aggiungere i reagenti (a 2x la concentrazione finale) per la BMM con punte ghiacciate. Ad esempio, utilizzare il fattore di crescita epidermico (EGF) per stimolare l&#39;invasione delle cellule di carcinoma squamoso CAL S e R CAL. Mescolare bene agitando delicatamente, evitando la formazione di bolle. </li><li> Dispensare delicatamente 100 microlitri della BMM nel pozzetto U-bottom, puntando la punta verso la parete interna del pozzo. Questa fase è la più critica come, per l&#39;analisi di immagine ottimale, sferoidi devono rimanere al centro del pozzo 12. </li><li> Ripetere il passaggio 2.6 per tutti i pozzetti necessari, permettendo 5-6 ripetizioni / condizione. Se necessario, passare a una punta appena raffreddato. NOTA: quando più esperto, &#39;erogazionese BMM usando una pipetta multicanale. </li><li> Usando un ago sterile, rimuovere le bolle, se presente. <ol><li> Utilizzando un microscopio, controllare visivamente che sferoidi sono in una posizione centrale. In caso contrario, centrifugare la piastra a 300 xg per 3 min a 4 ° C. Questo farà sì che sferoidi occupano una posizione centrale in ogni pozzetto. </li></ol></li><li> Trasferire la lastra in un termostato a 37 ° C e consentire al BMM solidificare. </li><li> 1 ora più tardi, con una pipetta multicanale, aggiungere delicatamente 100 ml / pozzetto di terreno di coltura completo. Per invasione o di valutazione farmaco studi citochine indotta, includere citochine o inibitori nel medio (1x concentrazione finale). In alternativa, se i reagenti non sono stati aggiunti al BMM nel passo 2.5, aggiungerli al mezzo a questo punto (3x la concentrazione finale desiderata). </li></ol> 3. Automated Image Acquisition <ol><li> Piatti di scansione sul citometro (per specifiche vedi Tabella di attrezzature e materiali) ad intervalli starting da tempo zero (t0 = giorno del test di invasione istituito, subito dopo il punto 2.10 fino a 72 ore, o 96 ore per invasione linee cellulari tumorali più lente. </li><li> Selezionare l&#39;applicazione &#39;Confluence&#39;. </li><li> Controllare che il sferoide è a fuoco e, se necessario, regolare manualmente e fissare il &#39;Fuoco partì-&#39;. </li><li> In &quot;impostazioni di campionamento&quot;, selezionare la scansione un campo centrale visivo (FOV). Dopo BMM Inoltre, sferoidi tumorali dovuti rimanere in una posizione centrale, quindi non vi è alcuna necessità di eseguire la scansione dell&#39;intero bene. </li><li> Nel software, definiscono i pozzetti da analizzare evidenziandoli sulla mappa piatto. Clicca su &#39;Start Scan&#39;. NOTA: La scansione viene salvato e può essere rivisto in seguito off-line automaticamente. </li></ol> 4. Automated Image Analysis <ol><li> Seleziona l&#39;applicazione &#39;Confluence&#39;. </li><li> Nella scheda &#39;Analysis&#39;, regolare applicImpostazioni ation (ad esempio, &quot;precisione&quot;: basso, normale, alto, &quot;soglia di intensità&quot;: 1 - 15) per produrre una segmentazione precisa intorno alla sferoide, inclusi i processi cellulari e invadopodi estendono nel BMM (vedi Figura 1). Regolare le impostazioni per ogni linea di cellule tumorali e / o in vari momenti. Misure di applicazione La &#39;Confluence&#39; la% della superficie ben coperto dalle cellule invasori, nel FOV selezionato. </li><li> Verificare che le impostazioni di analisi sono appropriate (ad esempio, la segmentazione è preciso) per gli altri spheroids nella piastra cliccando su alcuni pozzi diversi. Se la segmentazione non delinea con precisione uno sferoide, regolare ulteriormente le impostazioni dell&#39;applicazione. </li><li> Clicca su &#39;Start&#39; analisi &#39;. </li><li> Nella scheda &#39;Risultati&#39;, controllare più pozzi per verificare la qualità dell&#39;analisi. Export &#39;Bene dati a livello di&#39; a un foglio di calcolo. </li><li> Ripetanalisi t per tutti i punti temporali. Calcolare la media% di confluenza per pozzi replicati e invasione del terreno (% confluenza) contro il tempo in un grafico a barre, con grafici scientifici e software statistico di scelta. </li></ol> 5. Manuale Image Acquisition <ol><li> Registrare un&#39;immagine per ciascun sferoide tumore ad intervalli partire da t = 0 fino a 72-96 ore, a seconda della velocità di invasione della linea cellulare in questione, utilizzando un microscopio invertito (per una piastra a 96 pozzetti questo richiede circa 20 - 30 min). Utilizzare un obiettivo 10X. Utilizzare un obiettivo 4X quando un&#39;area invasa è troppo grande per essere completamente catturato all&#39;interno del campo di vista 10X. </li><li> Salvare ogni singola immagine acquisita. </li><li> Per la calibrazione, prendere le immagini di uno stadio reticolo (1 mm) utilizzando entrambi gli obiettivi 10X e 4X (e salvare le immagini). </li></ol> 6. Manuale Image Analysis <ol><li> Aprire le immagini palco reticolo nel software di analisi delle immagini di scelta. </li><li> Inserisci il gratmisurazioni icule, le unità (micron), gli obiettivi usati (10X o 4X) e di eseguire la calibrazione. Questo passaggio è necessario solo una volta. Per la successiva analisi delle immagini, è sufficiente ricaricare le impostazioni di calibrazione necessarie. </li><li> Aprite le immagini del saggio di invasione e selezionare le impostazioni di calibrazione in funzione dell&#39;obiettivo del microscopio (10X o 4X) usata per ottenere le immagini. <ol><li> In alternativa, importare immagini ottenute su un citometro di imaging (fase 3) e analizzare manualmente, come descritto per le immagini ottenute con un microscopio invertito (vedere i risultati mostrati in Figura 3 e Figura 4). </li></ol></li><li> Misurare l&#39;area coperta da sferoidi. <ol><li> Nel software utilizzato qui per la Rappresentante dei risultati (per specifiche vedi Tabella di attrezzature e materiali), vai su &#39;misura&#39; e selezionare &#39;Count / size&#39;. Abbiamo scelto &#39;File&#39; poi &#39;Carica impostazioni&#39; e selezionare predeterminato assaImpostazioni y. Quindi scegliere &#39;Conte&#39;. Il sferoide dovrebbe poi essere segmentato in modo accurato. </li><li> In alternativa, andare su &#39;Modifica&#39; poi &#39;Disegna / Unisci oggetti&#39; per aprire la finestra &#39;bacchetta magica / Trace&#39;. Usate il cursore bacchetta di cliccare sull&#39;immagine sferoide su ed ottenere la segmentazione. Seleziona &#39;Traccia&#39; (nella finestra &#39;bacchetta magica&#39;) per delineare manualmente la sferoide utilizzando un mouse. </li></ol></li><li> Misure di esportazione di diversi parametri (area, diametro, perimetro ecc) ad un foglio di calcolo. Record sul foglio le informazioni sull&#39;immagine rilevanti (ad esempio, ben il numero, punto di tempo relativo). </li><li> Tracciare l&#39;area media di sferoidi ripetute (invasione) in funzione del tempo con grafica scientifica e software statistico. In alternativa, calcolare la variazione dell&#39;area sferoide ciascun tempo, rispetto alla zona a t = 0. Quindi invasione trama (% t0) in funzione del tempo come gra lineariph. </li></ol>

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Tutti gli autori dichiarano assenza di conflitto di interessi in competizione.

I due modelli tumorali qui descritti (glioblastoma e SCCHN) sono stati appositamente selezionati per esemplificare il nostro test 3D come siano clinicamente rilevanti tumori localmente invasivi con un bisogno insoddisfatto per terapie efficaci 12. A seguito di trattamento farmacologico, la valutazione dei cambiamenti in vitro farmacodinamica (PD) biomarker in può essere eseguita facilmente mediante western blot o immunologici del lisati in seguito all&#39;uso di specifici reagenti commercialmente disponibili per consentire il recupero delle cellule da BMM e / o l&#39;analisi di immunofluorescenza di invadere sferoidi tumorali tutto colorazione mount. Questo saggio di invasione è una tecnica utile per la valutazione rapida e riproducibile di invasione delle cellule tumorali in un mezzo semisolido e quindi particolarmente adatto per il futuro in screening di farmaci vitro. Le cellule tumorali invadono la matrice in modo 3D come si diffondono fuori da un &quot;micro-tumorale&quot;, rappresentata dalla sferoidale tumore, e si estendono in un extracellulambiente ar a matrice. La vera tridimensionalità del dosaggio è evidente nella morfologia cellulare, che è diverso dal piatto, morfologia aderente cellule assumono quando si spostano su un substrato solido. Il grado di invasione è facilmente quantificato utilizzando un citometro di imaging, permettendo una lettura-out automatico, oppure utilizzando un microscopio convenzionale in combinazione con software di imaging. Inoltre, questo metodo è adatto per l&#39;imaging fluorescente 13 (per esempio con linee cellulari che esprimono proteine ​​fluorescenti o pre-etichettato con coloranti fluorescenti). Il metodo è semplice da eseguire con la sola fase critica rappresentata dall&#39;aggiunta della BMM, quando vi è un rischio di disturbare la posizione centrale dello sferoide nel U bene. Questo può portare ad analisi di immagine ottimale, con sferoidi in diversi piani focali. E &#39;quindi fondamentale per aggiungere lentamente e con cautela la BMM di ogni bene. Dopo BMM Inoltre, è consigliabile verificare la targasotto un microscopio e se la localizzazione è considerata inaccettabile, questo può essere risolto dolce centrifugazione. Con l&#39;esperienza, questo è raramente necessaria. Anche se questo metodo è molto robusto e riproducibili, variabilità inter-sperimentale potrebbe verificarsi con diversi lotti di BMM. Per evitare ciò, si consiglia di acquistare sufficiente BMM da una singola partita per completare una serie di studi. Una limitazione del metodo (come per tali dosaggi) è la difficoltà nel distinguere tra l&#39;invasione e la proliferazione, che le cellule tumorali probabilmente subiscono durante il periodo di tempo del test. Anche se il tempo di raddoppio delle cellule può essere preso in considerazione, o inibitori del ciclo cellulare come citocalasina D introdotto, non è facile da controllare o chiaramente distinguere tra questi due aspetti diversi della progressione tumorale, in particolare per le cellule tumorali in rapida crescita e per coloro che hanno una più &quot;espansiva&quot;, piuttosto che infiltrante, modello di invasione. Per questo motivosi suggerisce che un saggio di crescita 3D parallelamente viene eseguito per valutare gli effetti specifici di agenti inibitori o stimolatori. Se si eseguono studi di risposta attenta dosi, può essere possibile selezionare concentrazioni che minimizzano gli effetti sulla proliferazione. Per esempio abbiamo dimostrato che l&#39;inibitore HSP90 17-AAG inibisce U-87 MG 3D tumore sferoide invasione già a 24 ore ed a concentrazioni inferiori concentrazione che inibisce la crescita 3D del 50% (GI 50) 12. D&#39;altra parte, il significato di questo test rispetto ad altri test invasione standard (ad esempio, saggi filtro basato o invasione delle singole cellule in matrici 3D 1), è che le cellule tumorali invadono nella matrice circostante dalla sferoidale, che assomiglia a una &quot; micro-tumorale &quot;o&quot; micro-metastasi &quot;, e quindi tiene conto degli aspetti importanti della fisiopatologia di una massa tumorale. Il metodo presentiamo fornisce informazioni sullacomportamento collettivo delle cellule tumorali, quando lasciando inizialmente sferoidi, e anche individualmente, quando singole cellule raggiungono le regioni più lontane nel BMM. Inoltre, le cellule all&#39;interno sferoidi tumorali possono verificarsi ipossia e nutrienti privazione che, attraverso i cambiamenti nell&#39;espressione genica, in grado di promuovere la migrazione e l&#39;invasione; tali caratteristiche sono assenti nelle analisi 2D. Inoltre, tutto questo è disponibile in un formato ad alta produttività attraverso l&#39;utilizzo di piastre a 96 pozzetti specifici e la recente tecnologia di imaging, consentendo un saggio 3D più complesso da essere facilmente utilizzato nella convalida di destinazione e la scoperta di farmaci. Il metodo che presentiamo in grado di ospitare ulteriori applicazioni per affrontare ulteriori aspetti di invasione delle cellule tumorali. In particolare, la complessità supplementare può essere previsto con l&#39;aggiunta di cellule ospiti, come i fibroblasti e / o cellule endoteliali, nel sferoidale stesso o matrice circostante. Questo può anche essere modificato, non solo in termini di rigidità (con l&#39;uso di diversi concentrations di BMM), ma anche in termini di composizione (con l&#39;aggiunta di altri componenti dipendenti dalla specifica del tessuto / organo del modello adottato tumore: ad esempio, per i tumori cerebrali tenascin 16 e collagene per carcinoma mammario 17). Un simile set-up (generazione di sferoidi e di imaging) possono anche essere adattate per valutare invasione tissutale in 3D, dove sferoidi tumorali sono co-coltura con corpi embrionali simile a un tessuto complesso 12 o con altri organoidi specifici delle cellule (ad esempio, per astrociti glioma 18 o cripta colture per i tumori gastrointestinali), ma ulteriore lavoro è necessario per consentire l&#39;analisi automatica delle immagini.

Lo sviluppo di farmaci antitumorali classica è in gran parte concentrata sull&#39;uso di vitro saggi cellulari in a schermo per gli agenti citotossici che inibiscono la proliferazione delle cellule tumorali e / o promuovono la morte cellulare programmata (apoptosi). Più di recente, gli sforzi si sono spostati verso terapie mirate con lo sviluppo di inibitori delle cause molecolari alla base della proliferazione delle cellule maligne. Nonostante alcuni risultati spettacolari, tali agenti sono spesso associati con il rapido sviluppo di resistenza al farmaco. Dato che è il potenziale invasivo e metastatico delle cellule tumorali che è responsabile della maggior parte dei decessi per cancro, e che malattia recidivante presenta spesso un fenotipo più aggressivo, è logico anche considerare complementari in vitro modelli sperimentali 1,2 per identificare nuovi agenti che inibiscono questi tasti aggiuntivi &quot;caratteristiche&quot; del cancro. Durante la progressione maligna, le cellule tumorali acquisisconola capacità di invadere i tessuti circostanti e / o la diffusione in organi distanti (metastasi). Le cellule tumorali penetrano la membrana basale dalla formazione di invadopodi 3,4. Queste strutture sono arricchiti con filamenti di actina, proteine ​​di adesione specifici e proteinasi e sono collettivamente responsabili per la motilità delle cellule tumorali e la degradazione della matrice extracellulare (ECM) 5. Invadopodi estendono nel ECM e si crede di essere importante per l&#39;invasione delle cellule tumorali e di stravaso anche in canali vascolari, facilitando ematogena (o linfatica) diffusione e metastasi. Metodi standard attuali per valutare l&#39;invasione delle cellule tumorali in vitro sono i seguenti. Transwell o basato Boyden saggi camera 2,6 dove sospensioni di cellule singole sono seminate in cima ad un filtro rivestito con uno spesso strato di proteine ​​ECM-derivato. Cellule poi invadono e muovono nella camera inferiore in risposta ad un chemio-attrattore. Comunemente usato ECMproteine ​​sono collagene di tipo I, o di una membrana simile matrice seminterrato (BMM, ad esempio, Matrigel, derivato dal tumore EHS 7) che riproduce la composizione naturale delle membrane basali. In alternativa alle Boyden tipo camera saggi basati filtro-8, le cellule possono essere seminati su di un gel di ECM (a cui possono essere aggiunti fibroblasti) dove formano un monostrato e quindi singolarmente o collettivamente invadere nel gel. Invasion può essere misurata in termini di numero di cellule che invadono e / o la distanza percorsa dalla superficie del gel 9. Le cellule tumorali possono anche essere completamente incorporati in una matrice o come una sospensione di cellule singole o sferoidi - solitamente poste tra due strati di ECM gel- consentendo alle cellule di invadere dalla massa tumorale nella matrice circostante 2,6,10,11. Il tridimensionale (3D) tumore sferoide invasione test qui descritta fornisce un sistema rapido invasione automatizzabili utilizzando un highly riproducibile, metodo standardizzato 12 in un formato di piastra da 96 pozzetti con uno sferoide per pozzetto. BMM viene aggiunto direttamente a ciascun pozzetto per fornire una matrice semi-solido in cui le cellule tumorali invadono dal corpo sferoidale. Il grado di invasione delle cellule tumorali è monitorata ad intervalli per un periodo di 72-96 ore. Questo metodo fornisce i seguenti vantaggi rispetto ai saggi attuali in vitro invasione citati: il tumore celle sono organizzate in una struttura 3D simulando una micro-regione tumore o un micro-metastasi; sferoidi tumorali sono altamente riproducibili in dimensioni; il saggio di invasione viene eseguita in situ nella stessa piastra come sviluppo del tumore sferoidale, senza la necessità di spostarli piastre secondarie; il metodo, in combinazione con le più recenti tecnologie di analisi automatica delle immagini, permette sia alto contenuto e alto rendimento analisi di invasione delle cellule tumorali. L&#39;analisi delle immagini viene effettuata utilizzando un sistema di imaging citometro, che analizza un 96 pozzettipiastra entro 10 minuti. Utilizzando l&#39;applicazione confluenza, la portata e la velocità dell&#39;invasione raggiunti sia da singole cellule o gruppi di cellule si diffondono dalle sferoidi tumorali e invasori nella matrice può essere misurata in modo dinamico. Per trasmissione inferiore, un metodo alternativo per l&#39;analisi delle immagini viene presentato, basato sull&#39;uso di un microscopio invertito e software di imaging standard.

<table><tbody><tr><td>Corning Matrigel basement membrane matrix</td><td><a href="http://www.corning.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Corning</a></td><td>354234</td><td>Keep at 4 &amp;deg;C to prevent solidification and dispense using cooled pipette tips</td></tr><tr><td>Cultrex basement membrane extract, PathClear</td><td><a href="http://www.trevigen.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Trevigen</a></td><td>3432-005-01</td><td>Keep at 4 &amp;deg;C to prevent solidification and dispense using cooled pipette tips</td></tr><tr><td>Ultra-low attachment 96-well plate</td><td><a href="http://www.corning.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Corning</a></td><td>7007</td><td></td></tr><tr><td>EGF</td><td><a href="http://www.miltenyibiotec.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Miltenyi Biotec</a></td><td>130-093-825</td><td>Add 100 &amp;mu;l 1% BSA (w/v) in water to 100 &amp;mu;g EGF. To 25 &amp;mu;l of this, add 4,975 &amp;mu;l RHB-A medium to give a 5 &amp;mu;g/ml working stock. Aliquot and store at -20 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>RHB-A medium</td><td><a href="http://www.stemcellsinc.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Stem Cells Inc.</a></td><td>SCS-SF-NB-01</td><td>For diluting EGF</td></tr><tr><td>DMEM</td><td><a href="http://www.lifetechnologies.com/" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> GIBCO</a></td><td>31966-021</td><td>Warm in 37 &amp;deg;C water bath before use</td></tr><tr><td>Fetal bovine serum</td><td><a href="http://www.biosera.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Biosera</a></td><td>1001/500</td><td>Heat at 56 &amp;deg;C to inactivate complement before use</td></tr><tr><td>TrypLE</td><td><a href="http://www.lifetechnologies.com/" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> GIBCO</a></td><td>12605</td><td>Cell dissociation solution</td></tr><tr><td>Celigo cytometer</td><td><a href="http://www.nexcelom.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Nexcelom Bioscience</a></td><td>n/a</td><td>Specialist equipment for image capture and analysis. Manual image capture by microscopy and independent image analysis software is an alternative</td></tr><tr><td>IX70 inverted microscope</td><td><a href="http://www.olympus.co.uk/" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Olympus</a></td><td>n/a</td><td>Used with camera for manual image capture</td></tr><tr><td>Retiga Exi Fast 1394 digital camera</td><td><a href="http://www.qimaging.com/" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Qimaging</a></td><td>n/a</td><td>Attached to microscope for manual image capture</td></tr><tr><td>Image-Pro Plus 7.0</td><td><a href="http://www.mediacy.com/" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Media Cybernetics</a></td><td>n/a</td><td>Software used to control camera and microscope for manual image capture</td></tr><tr><td>Image-Pro Analyzer 7.0</td><td><a href="http://www.mediacy.com/" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Media Cybernetics</a></td><td>n/a</td><td>Stand-alone image analysis software for manual measurment of spheroid size</td></tr><tr><td>Excel 2010</td><td><a href="http://www.microsoft.com/" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Microsoft</a></td><td>n/a</td><td>Scientific graphing and statistical software</td></tr><tr><td>Prism 6.0</td><td><a href="http://www.graphpad.com/" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> GraphPad</a></td><td>n/a</td><td>Scientific graphing and statistical software</td></tr></tbody></table>

three-dimensional (3d) tumor spheroid invasion assay

Invasione di tessuti circostanti normali è generalmente considerata come una caratteristica fondamentale del maligno (al contrario di benigni) i tumori. Per alcuni tipi di cancro, in particolare (ad esempio, i tumori del cervello, il glioblastoma multiforme e carcinoma a cellule squamose della testa e del collo -. SCCHN) si tratta di una causa di grave morbilità e può essere anche in assenza di metastasi a distanza in pericolo di vita. Inoltre, i tumori che hanno recidivato dopo il trattamento, purtroppo, spesso presente con un fenotipo più aggressivo. Pertanto, vi è la possibilità di indirizzare il processo di invasione di fornire nuove terapie che potrebbero essere complementare ad agenti anti-proliferativi standard. Fino ad ora, questa strategia è stata ostacolata dalla mancanza di robusti test riproducibili adatti per un&#39;analisi dettagliata di invasione e per lo screening di stupefacenti. Qui forniamo un metodo di micro-plate semplice (sulla base di uniformi, auto-assemblaggio sferoidi tumorali 3D), che ha un grande potenziale per tale stumuore. Noi esemplificano la piattaforma test utilizzando una linea cellulare di glioblastoma umano e anche un modello SCCHN in cui lo sviluppo della resistenza contro mirata del recettore del fattore di crescita epidermico (EGFR) è associato con una maggiore potenziale matrice invasivo. Forniamo anche due metodi alternativi di quantificazione semi-automatico: uno che utilizza un sistema di imaging citometro e al secondo, che richiede semplicemente la microscopia e immagine di acquisizione standard di analisi di immagine digitale.

3D tumore sferoide invasione è valutato attraverso un riproducibile, metodo semplice, automatizzato schematicamente illustrata in figura 1: sferoidi tumorali riproducibile dimensioni sono ottenuti placcatura cellule in ULA 96-pozzetti a fondo sferico. 4 giorni sferoidi post-iniziazione sono incorporati in BMM. Questo fornisce una struttura semi-solido in cui le cellule tumorali invadono e sparsi dello sferoide. Spheroids sono in posizione centrale alla base di ogni bene e di invasione nella BMM è facilmente monitorata ad intervalli a partire da t = 0 fino a 72-96 ore utilizzando un sistema di imaging citometro. Questo può fornire un&#39;analisi immagine completamente automatizzato. Esempi di diversi tipi di invasione delle cellule del cancro sono illustrate nelle figure 2 -. 4 L&#39;altamente maligno multiforme glioblastoma umano (GBM) linea cellulare U-87 MG, forma una struttura 3D sferica stretto e viene qui utilizzato per esemplificare tumori cerebrali nei quali locali invasione è una chiave pericolo di vitacaratteristica. Una volta incorporato in BMM, cellule da sferoidi U-87 MG si sviluppa con un tipico &quot;starburst&quot; invasione modello 12. Le cellule tumorali radialmente estendono nella matrice in cui mantengono una forma 3-dimensionale. Il processo è seguito in un periodo di 72 ore, come mostrato in Figura 2 per U-87 sferoidi MG, quando il grado di invasione delle cellule tumorali, con dettagli dei processi cellulari e invadopodi estendono nella BMM è chiaramente evidente. Completamente automatizzato analisi delle immagini utilizzando un&#39;immagine citometro consente la quantificazione precisa della invasione delle cellule tumorali nel corso del tempo. La quantificazione in figura 2 è ottenuto come illustrato nella figura 1, dove l&#39;analisi automatizzata produce segmentazione attorno alle sporgenze cellulari estendono nella BMM dal 87-U MG corpo sferoidale. Si noti che per questa linea cellulare, il corpo sferoidale tumore è escluso dalla misurazione dell&#39;area invasa. Un modello diverso di invasion è stato visualizzato da linee umani squamose della testa e del collo di cellule tumorali. CAL S e CAL R sono isogenico ma CAL S è sensibile a, e CAL R resistente agli inibitori della chinasi di EGFR tirosin 14. In assenza di EGF, né linea cellulare invaso nel BMM (Figura 3) Tuttavia, poiché la concentrazione di EGF è stato aumentato (a 2,5 ng / ml), gli sferoidi sembrano &#39;germoglio&#39;. Alle concentrazioni elevate di EGF (40 e 80 ng / ml) il grado di invasione è stata ridotta. Questo è coerente con il classico a campana dose-risposta per EGF in termini di invasione che è stato precedentemente riportato 15. In 20 ng / ml EGF, sporgenze simili a dita estruso dal corpo principale di sferoidi CAL R mentre cellule CAL S erano meno invasiva dopo 72 ore (Figura 3). Questa invasione differenza era evidente 48 ore dopo sferoidi sono stati collocati in BMM (contenente 20 ng / ml FEG per distinguere la massima tra le linee cellulari) Ed il meglio dopo 72 ore (Figura 4). Queste immagini sono state acquisite rapidamente utilizzando un citometro di imaging, come per U-87 MG. Tuttavia, in questo caso, per esemplificare un metodo alternativo, il grado di invasione è stata quantificata manualmente utilizzando il software di analisi di immagine stand-alone e si presenta graficamente (figure 3 e 4). Questi risultati mostrano una differenza fenotipica tra cellule farmaco-sensibili e resistenti all&#39;azione che potrebbero essere utilizzati per lo screening per composti che specificamente antagonizzare l&#39;resistente fenotipo invasivo droga. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/52686/52686fig1.jpg" /> Figura 1. Schema di 3D tumore sferoide saggio di invasione. Il flusso di lavoro mostra i passaggi del metodo comporta l&#39;inclusione di immagini rappresentative di sferoidi U-87 MG glioblastoma solo dopo l&#39;incorporazione in BMM (pannello superiore; t = 0) e dopo l&#39;invasione<html> in BMM (pannello inferiore; t = 72 ore) con e senza la segmentazione che misura l&#39;area coperta dalle cellule invasori. Bar = 100 micron. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52686/52686fig1large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/52686/52686fig2.jpg" /> Figura 2. Time-corso di U-87 MG glioblastoma sferoide invasione in BMM. U-87 MG sferoide invasione 3D nel BMM è stato monitorato e quantificato fino a 72 ore utilizzando un sistema di imaging citometro. (A) Immagini rappresentative e (B) quantificazione sono mostrati invasione delle cellule tumorali. Bar = 500 micron. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52686/52686fig2large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> re 3 &quot;src =&quot; / files / ftp_upload / 52686 / 52686fig3.jpg &quot;/&gt; Figura 3. CAL R (resistenza) e CAL S (sensibilità) tumore sferoidale invasione. (A) Immagini rappresentative e (B) quantificazione manuale di EGF dose-dipendente R CAL e CAL S tumore sferoide invasione sono mostrati. Bar = 500 micron. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52686/52686fig2large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/52686/52686fig4.jpg" /> Figura 4. Le cellule da CAL R (resistente) sferoidi sono più invasivi rispetto CAL S (sensibili) sferoidi tumorali quando sono immessi in BMM. Dopo stimolazione EGF CAL R sferoidi tumorali mostrano una invasione più pronunciato rispetto CAL S. (A) Immagini rappresentative e (B) la quantificazione manuale dell&#39;invasione sono mostrati. Bar = 500 micron. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52686/52686fig4large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a>

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Three-Dimensional 3D Tumor Spheroid Invasion Assay

Invasion of surrounding normal tissues is a defining characteristic of malignant tumors. We provide here a simple, semi-automated micro-plate assay of invasion into a natural 3D biomatrix that has been exemplified with a number of models of advanced human cancers.

Tridimensionale (3D) Tumore Spheroid Invasion Assay

Invasion of surrounding normal tissues is generally considered to be a key hallmark of malignant (as opposed to benign) tumors. For some cancers in ...

three-dimensional-3d-tumor-spheroid-invasion-assay

Research

JoVE Journal

Medicine

Three-Dimensional (3D) Tumor Spheroid Invasion Assay

57.1K Views.  The Institute of Cancer Research. Invasion of surrounding normal tissues is a defining characteristic of malignant tumors. We provide here a simple, semi-automated micro-plate assay of invasion into a natural 3D biomatrix that has been exemplified with a number of models of advanced human cancers.

Video: Three-Dimensional 3D Tumor Spheroid Invasion Assay

Spheroid Assay to Measure TGF-&#946;-induced Invasion

TGF-&beta; has opposing roles in breast cancer progression by acting as a tumor suppressor in the initial phase, but stimulating invasion and metastasis at later stage1,2. Moreover, TGF-&beta; is frequently overexpressed in breast cancer and its expression correlates with poor prognosis and metastasis 3,4. The mechanisms by which TGF-&beta; induces invasion are not well understood.
TGF-&beta; elicits its cellular responses via TGF-&beta; type II (T&beta;RII) and type I (T&beta;RI) receptors. Upon TGF-&beta;-induced heteromeric complex formation, T&beta;RII phosphorylates the T&beta;RI. The activated T&beta;RI initiates its intracellular canonical signaling pathway by phosphorylating receptor Smads (R-Smads), i.e. Smad2 and Smad3. These activated R-Smads form heteromeric complexes with Smad4, which accumulate in the nucleus and regulate the transcription of target genes5. In addition to the previously described Smad pathway, receptor activation results in activation of several other non-Smad signaling pathways, for example Mitogen Activated Protein Kinase (MAPK) pathways6.
To study the role of TGF-&beta; in different stages of breast cancer, we made use of the MCF10A cell system. This system consists of spontaneously immortalized MCF10A1 (M1) breast epithelial cells7, the H-RAS transformed M1-derivative MCF10AneoT (M2), which produces premalignant lesions in mice8, and the M2-derivative MCF10CA1a (M4), which was established from M2 xenografts and forms high grade carcinomas with the ability to metastasize to the lung9. This MCF10A series offers the possibility to study the responses of cells with different grades of malignancy that are not biased by a different genetic background.
For the analysis of TGF-&beta;-induced invasion, we generated homotypic MCF10A spheroid cell cultures embedded in a 3D collagen matrix in vitro (Fig 1). Such models closely resemble human tumors in vivo by establishing a gradient of oxygen and nutrients, resulting in active and invasive cells on the outside and quiescent or even necrotic cells in the inside of the spheroid10. Spheroid based assays have also been shown to better recapitulate drug resistance than monolayer cultures11. This MCF10 3D model system allowed us to investigate the impact of TGF-&beta; signaling on the invasive properties of breast cells in different stages of malignancy.

An assay to quantitatively measure Transforming Growth Factor (TGF)-&#x03B2;-induced invasion in 3-dimensional collagen gels is described. This assay takes advantage of the MCF10A series of cell lines, which represent different stages of breast cancer development. This method can be adopted to be used with other cell lines and might be used to investigate other potential activators or inhibitors of invasion.

Saggio sferoide Misura TGF-β-indotta Invasion

TGF-&beta; has opposing roles in breast cancer progression by acting as a tumor suppressor in the initial phase, but stimulating invasion and metastasis ...

Ricerca

Medicina

Fully Human Tumor-based Matrix in Three-dimensional Spheroid Invasion Assay

Two-dimensional cell culture-based assays are commonly used in in vitro cancer research. However, they lack several basic elements that form the tumor microenvironment. To obtain more reliable in vitro results, several three-dimensional (3D) cell culture assays have been introduced. These assays allow cancer cells to interact with the extracellular matrix. This interaction affects cell behavior, such as proliferation and invasion, as well as cell morphology. Additionally, this interaction could induce or suppress the expression of several pro- and anti-tumorigenic molecules. Spheroid invasion assay was developed to provide a suitable 3D in vitro method to study cancer cell invasion. Currently, animal-derived matrices, such as mouse sarcoma-derived matrix (MSDM) and rat tail type I collagen, are mainly used in the spheroid invasion assays. Taking into consideration the differences between the human tumor microenvironment and animal-derived matrices, a human myoma-derived matrix (HMDM) was developed from benign uterus leiomyoma tissue. It has been shown that HMDM induces migration and invasion of carcinoma cells better than MSDM. This protocol provided a simple, reproducible, and reliable 3D human tumor-based spheroid invasion assay using the HMDM/fibrin matrix. It also includes detailed instructions on imaging and analysis. The spheroids grow in a U-shaped ultra-low attachment plate within the HMDM/fibrin matrix and invade through it. The invasion is daily imaged, measured, and analyzed using ilastik and Fiji ImageJ software. The assay platform was demonstrated using human laryngeal primary and metastatic squamous cell carcinoma cell lines. However, the protocol is suitable also for other solid cancer cell lines.

Tumor microenvironment is an essential part of cancer growth and invasion. To mimic carcinoma progression, a biologically relevant human matrix is needed. This protocol introduces an improvement for the in vitro three-dimensional spheroid invasion assay by applying a human leiomyoma-based matrix. The protocol also introduces a computer-based cell invasion analysis.

Matrice a base di tumore umano in un saggio di invasione sferoide tridimensionale

Two-dimensional cell culture-based assays are commonly used in in vitro cancer research. However, they lack several basic elements that form the tumor ...

Ricerca sul cancro

A 3D Spheroid Model as a More Physiological System for Cancer-Associated Fibroblasts Differentiation and Invasion In Vitro Studies

Defining the ideal model for an in vitro study is essential, mainly if studying physiological processes such as differentiation of cells. In the tumor stroma, host fibroblasts are stimulated by cancer cells to differentiate. Thus, they acquire a phenotype that contributes to the tumor microenvironment and supports tumor progression. By using the spheroid model, we have set up such a 3D in vitro model system, in which we analyzed the role of laminin-332 and its receptor integrin &#945;3&#946;1 in this differentiation process. This spheroid model system not only reproduces the tumor microenvironment conditions in a more accurate way, but also is a very versatile model since it allows different downstream studies, such as immunofluorescent staining of both intra- and extracellular markers, as well as deposited extracellular matrix proteins. Moreover, transcriptional analyses by qPCR, flow cytometry and cellular invasion can be studied with this model. Here, we describe a protocol of a spheroid model to assess the role of CAFs&#39; integrin &#945;3&#946;1 and its ectopically deposited ligand, laminin-332, in differentiation and in supporting the invasion of pancreatic cancer cells.

The goal of this protocol is to establish a 3D in vitro model to study the differentiation of cancer-associated fibroblasts (CAFs) in a tumor bulk-like environment, which can be addressed in different analysis systems, such as immunofluorescence, transcriptional analysis and life cell imaging.

Un modello esplosivo 3D come sistema più fisiologico per la differenziazione dei fibroblasti associati al cancro e gli studi sull'invasione in vitro

Defining the ideal model for an in vitro study is essential, mainly if studying physiological processes such as differentiation of cells. In the tumor ...

Characterization of the Effects of Migrastatic Inhibitors on 3D Tumor Spheroid Invasion by High-resolution Confocal Microscopy

Drug discovery and development in cancer research is increasingly being based on drug screens in a 3D format. Novel inhibitors targeting the migratory and invasive potential of cancer cells, and consequently the metastatic spread of disease, are being discovered and considered as complementary treatments in highly invasive cancers such as gliomas. Thus, generating data enabling the detailed analyses of cells in a 3D environment following the addition of a drug is required. The methodology described here, combining spheroid invasion assays with high-resolution image capture and data analysis by confocal laser scanning microscopy (CLSM), enabled detailed characterization of the effects of the potential anti-migratory inhibitor MI-192 on glioma cells. Spheroids were generated from cell lines for invasion assays in low adherent 96-well plates and then prepared for CLSM analysis. The described workflow was preferred over other commonly used spheroid-generating techniques due to both ease and reproducibility. This, combined with the enhanced image resolution attained by confocal microscopy compared to conventional wide-field approaches, allowed the identification and analysis of distinct morphological changes in migratory cells in a 3D environment following treatment with the migrastatic drug MI-192.

The effects of migrastatic inhibitors on glioma cancer cell migration in three-dimensional (3D) invasion assays using a histone deacetylase (HDAC) inhibitor are characterized by high-resolution confocal microscopy.

Caratterizzazione degli effetti degli inibitori espastatici sull'invasione 3D dello spheroid del tumore mediante microscopia confocale ad alta risoluzione

Drug discovery and development in cancer research is increasingly being based on drug screens in a 3D format. Novel inhibitors targeting the migratory and ...

A 3D Spheroid Model for Glioblastoma

Two-dimensional (2D) cell cultures do not mimic in vivo tumor growth satisfactorily. Therefore, three-dimensional (3D) culture spheroid models were developed. These models may be particularly important in the field of neuro-oncology. Indeed, brain tumors have the tendency to invade the healthy brain environment. We describe herein an ideal 3D glioblastoma spheroid-based assay that we developed to study tumor invasion. We provide all technical details and analytical tools to successfully perform this assay.

Here, we describe an easy-to-use invasion assay for glioblastoma. This assay is suitable for glioblastoma stem-like cells. A Fiji macro for easy quantification of invasion, migration, and proliferation is also described.

Un modello spheroid 3D per Glioblastoma

Two-dimensional (2D) cell cultures do not mimic in vivo tumor growth satisfactorily. Therefore, three-dimensional (3D) culture spheroid models were ...

Monitoring Cancer Cell Invasion and T-Cell Cytotoxicity in 3D Culture

Significant progress has been made in treating cancer with immunotherapy, although a large number of cancers remain resistant to treatment. A limited number of assays allow for direct monitoring and mechanistic insights into the interactions between tumor and immune cells, amongst which, T-cells play a significant role in executing the cytotoxic response of the adaptive immune system to cancer cells. Most assays are based on two-dimensional (2D) co-culture of cells due to the relative ease of use but with limited representation of the invasive growth phenotype, one of the hallmarks of cancer cells. Current three-dimensional (3D) co-culture systems either require special equipment or separate monitoring for invasion of co-cultured cancer cells and interacting T-cells.
Here we describe an approach to simultaneously monitor the invasive behavior in 3D of cancer cell spheroids and T-cell cytotoxicity in co-culture. Spheroid formation is driven by enhanced cell-cell interactions in scaffold-free agarose microwell casts with U-shaped bottoms. Both T-cell co-culture and cancer cell invasion into type I collagen matrix are performed within the microwells of the agarose casts without the need to transfer the cells, thus maintaining an intact 3D co-culture system throughout the assay. The collagen matrix can be separated from the agarose cast, allowing for immunofluorescence (IF) staining and for confocal imaging of cells. Also, cells can be isolated for further growth or subjected to analyses such as for gene expression or fluorescence activated cell sorting (FACS). Finally, the 3D co-culture can be analyzed by immunohistochemistry (IHC) after embedding and sectioning. Possible modifications of the assay include altered compositions of the extracellular matrix (ECM) as well as the inclusion of different stromal or immune cells with the cancer cells.

The presented approach simultaneously evaluates cancer cell invasion in 3D spheroid assays and T-cell cytotoxicity. Spheroids are generated in a scaffold-free agarose multi-microwell cast. Co-culture and embedding in type I collagen matrix are performed within the same device which allows to monitor cancer cell invasion and T-cell mediated cytotoxicity.

Monitoraggio dell'invasione delle cellule tumorali e della citotossicità delle cellule T nella cultura 3D

Significant progress has been made in treating cancer with immunotherapy, although a large number of cancers remain resistant to treatment. A limited ...

Modelli 3D in Biologia del Cancro: Dinamiche di Invasione negli Eterosferoidi

Alternative Strategy to Analyze In Vitro Cell Invasion of 3D Cultures

Spheroid culture is a 3D model that provides an improved replication of the in vivo microenvironment compared to traditional two-dimensional (2D) cultures. Invasion is a cellular outcome of utmost interest in cancer biology. In this protocol, we have devised an alternative strategy for evaluating cancer cell invasion in vitro, employing heterospheroids comprised of oral squamous cell carcinoma (OSCC), cancer-associated fibroblasts (CAF), and monocytes. These heterospheroids aim to mimic the tumor microenvironment (TME), including two relevant non-neoplastic cell types alongside the cancer cells. Each cell type was labeled with vital fluorescent markers emitting in distinct wavelengths before spheroid formation. Once formed, heterospheroids were seeded onto a layer of human leiomyoma-derived extracellular matrix in the upper compartment of a microporous membrane. Invasion was assessed in the z-axis using confocal microscopy. Digital images were obtained in the corresponding fluorescent channels at 10 &#181;m intervals, covering a depth of 90 &#181;m in the z-axis. Analysis was performed using freeware image software by calculating the integrated fluorescence intensity in each image and fluorescence channel. This approach enables a more dynamic analysis of cell invasion patterns in a multilayered context, as well as the examination of spatial co-localization of different cell types during invasion.

Autore in primo piano: Decifrare il crosstalk tra cancro e cellule immunitarie durante la progressione del cancro della testa e del collo

Invasion is a major biological phenomenon in the development and progression of cancer. This process is influenced by non-neoplastic cells and components of the tumor microenvironment. The purpose of this study is to describe an alternative method for analyzing tumor cell invasion in vitro using three-dimensional (3D) cultures.

Strategia alternativa per analizzare l'invasione cellulare in vitro di colture 3D

Spheroid culture is a 3D model that provides an improved replication of the in vivo microenvironment compared to traditional two-dimensional (2D) ...

A Cancer Cell Spheroid Assay to Assess Invasion in a 3D Setting

The invasive nature of cancer cell lines is thought to correlate with their metastatic potential. Most traditional assays, however, do not examine these invasive features in a three-dimensional environment and the resulting data suffer from reduced biological applicability. Here an approach is presented to visualize the invasive ability of cell lines in a physiologically relevant setting. The cancer cell spheroid invasion assay first utilizes gravity to generate spheroids within drops of media that hang from the lid of a cell culture dish. Next, these spheroids are embedded in a 3D matrix consisting of a mixture of basement membrane materials and type I collagen. Cancer cell egression from the spheroids into the surrounding matrix is then monitored over time. The method described here can be modified to examine invasion after coculture of different cell types, inclusion of drugs/inhibitors, or alterations in extracellular matrix (ECM) constituents.

This method evaluates cancer cell invasion from spheroids into a surrounding 3D matrix. Spheroids are generated via the hanging drop culture method and then embedded in a matrix comprised of basement membrane materials and type I collagen. Invasion out of the spheroids is subsequently monitored.

Un Cancer Cell Saggio sferoide valutare Invasion in un Ambiente 3D

The invasive nature of cancer cell lines is thought to correlate with their metastatic potential.  Most traditional assays, however, do not examine these ...

Tridimensionale (3D) Tumore Spheroid Invasion Assay

Riepilogo

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Capitoli in questo video

Saggio sferoide Misura TGF-β-indotta Invasion

Matrice a base di tumore umano in un saggio di invasione sferoide tridimensionale

Un modello esplosivo 3D come sistema più fisiologico per la differenziazione dei fibroblasti associati al cancro e gli studi sull'invasione in vitro

Caratterizzazione degli effetti degli inibitori espastatici sull'invasione 3D dello spheroid del tumore mediante microscopia confocale ad alta risoluzione

Un modello spheroid 3D per Glioblastoma

Monitoraggio dell'invasione delle cellule tumorali e della citotossicità delle cellule T nella cultura 3D

Strategia alternativa per analizzare l'invasione cellulare in vitro di colture 3D

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