This work was funded by The National Centre for the Replacement, Refinement and Reduction of Animals in Research (G1000121 ID no.94513) and the Oracle Cancer Trust. SE is supported by The Institute of Cancer Research and Cancer Research UK (grant number C309/A8274). We acknowledge NHS funding to the NIHR Biomedical Research Centre.

1. Generazione di riproducibile Spheroids tumorali Sized <ol><li> Lavare monostrati di cellule tumorali con tampone fosfato (PBS, 5 ml per 25 cm 2 o 8-10 ml per un pallone 75 centimetri 2), aggiungere la dissociazione delle cellule enzima (1 ml per 25 cm 2 o 2 ml per 75 cm 2 pallone) e incubare cellule a 37 ° C per 2-5 min. </li><li> Controllare il distacco delle cellule al microscopio e neutralizzare la dissociazione cellulare dell&#39;enzima con mezzo di crescita completo (5 ml per 25 cm 2 o 8 ml per un matraccio 75 centimetri 2). </li><li> Sospensione cellulare Centrifugare a 500 xg per 5 min. </li><li> Rimuovere il surnatante, toccare il tubo e risospendere il pellet cellulare in 1 ml di terreno di coltura completo utilizzando una pipetta P1000. Ciò dovrebbe produrre una sospensione di cellule singole, senza gruppi di cellule. </li><li> Contare le cellule utilizzando un emocitometro e diluire la sospensione cellulare per ottenere 0,5-2 x 10 4 cellule / ml (densità cellulare ottimale deve essere determinato per ciascuna linea cellulare in order per ottenere sferoidi tumorali di 300-500 micron di diametro 4 giorni dopo la semina cella 12,13). </li><li> Trasferire la sospensione cellulare ad un serbatoio sterile e, con una pipetta multicanale, dispensare 200 pl / pozzetto in ultra-low di attacco (ULA) 96 pozzetti piastre inferiori rotonde 12. </li><li> Trasferire le piastre di un incubatore (37 ° C, 5% CO 2, 95% di umidità). Quattro giorni dopo, confermare visivamente tumore formazione sferoide e procedere con il test di invasione 3D. </li></ol> 2. 3D Tumore Spheroid Invasion Assay <ol><li> Scongelare BMM sul ghiaccio. </li><li> Mantenere una serie di puntali con filtro sterili per P10, P200 e P1000 pipette e provette sterili (1,5 ml di volume o maggiore a seconda del volume totale richiesto) a -20 ° C. </li><li> Posizionare le piastre a 96 pozzetti contenenti ULA 4 giorni vecchi sferoidi sul ghiaccio. </li><li> Utilizzando una pipetta multicanale, rimuovere delicatamente 100 l / pozzetto di terreno di crescita dalle piastre sferoidali. Per questo angolo passo le punte verso l&#39;inside parete dei pozzetti U-bottom, evitando il contatto con il fondo del pozzetto e la posizione degli sferoidi; minimizzare il disturbo degli sferoidi. </li><li> Utilizzando punte ghiacciate, trasferire BMM di tubi ghiacciati. Per invasione citochine indotta o per studi di valutazione di droga, aggiungere i reagenti (a 2x la concentrazione finale) per la BMM con punte ghiacciate. Ad esempio, utilizzare il fattore di crescita epidermico (EGF) per stimolare l&#39;invasione delle cellule di carcinoma squamoso CAL S e R CAL. Mescolare bene agitando delicatamente, evitando la formazione di bolle. </li><li> Dispensare delicatamente 100 microlitri della BMM nel pozzetto U-bottom, puntando la punta verso la parete interna del pozzo. Questa fase è la più critica come, per l&#39;analisi di immagine ottimale, sferoidi devono rimanere al centro del pozzo 12. </li><li> Ripetere il passaggio 2.6 per tutti i pozzetti necessari, permettendo 5-6 ripetizioni / condizione. Se necessario, passare a una punta appena raffreddato. NOTA: quando più esperto, &#39;erogazionese BMM usando una pipetta multicanale. </li><li> Usando un ago sterile, rimuovere le bolle, se presente. <ol><li> Utilizzando un microscopio, controllare visivamente che sferoidi sono in una posizione centrale. In caso contrario, centrifugare la piastra a 300 xg per 3 min a 4 ° C. Questo farà sì che sferoidi occupano una posizione centrale in ogni pozzetto. </li></ol></li><li> Trasferire la lastra in un termostato a 37 ° C e consentire al BMM solidificare. </li><li> 1 ora più tardi, con una pipetta multicanale, aggiungere delicatamente 100 ml / pozzetto di terreno di coltura completo. Per invasione o di valutazione farmaco studi citochine indotta, includere citochine o inibitori nel medio (1x concentrazione finale). In alternativa, se i reagenti non sono stati aggiunti al BMM nel passo 2.5, aggiungerli al mezzo a questo punto (3x la concentrazione finale desiderata). </li></ol> 3. Automated Image Acquisition <ol><li> Piatti di scansione sul citometro (per specifiche vedi Tabella di attrezzature e materiali) ad intervalli starting da tempo zero (t0 = giorno del test di invasione istituito, subito dopo il punto 2.10 fino a 72 ore, o 96 ore per invasione linee cellulari tumorali più lente. </li><li> Selezionare l&#39;applicazione &#39;Confluence&#39;. </li><li> Controllare che il sferoide è a fuoco e, se necessario, regolare manualmente e fissare il &#39;Fuoco partì-&#39;. </li><li> In &quot;impostazioni di campionamento&quot;, selezionare la scansione un campo centrale visivo (FOV). Dopo BMM Inoltre, sferoidi tumorali dovuti rimanere in una posizione centrale, quindi non vi è alcuna necessità di eseguire la scansione dell&#39;intero bene. </li><li> Nel software, definiscono i pozzetti da analizzare evidenziandoli sulla mappa piatto. Clicca su &#39;Start Scan&#39;. NOTA: La scansione viene salvato e può essere rivisto in seguito off-line automaticamente. </li></ol> 4. Automated Image Analysis <ol><li> Seleziona l&#39;applicazione &#39;Confluence&#39;. </li><li> Nella scheda &#39;Analysis&#39;, regolare applicImpostazioni ation (ad esempio, &quot;precisione&quot;: basso, normale, alto, &quot;soglia di intensità&quot;: 1 - 15) per produrre una segmentazione precisa intorno alla sferoide, inclusi i processi cellulari e invadopodi estendono nel BMM (vedi Figura 1). Regolare le impostazioni per ogni linea di cellule tumorali e / o in vari momenti. Misure di applicazione La &#39;Confluence&#39; la% della superficie ben coperto dalle cellule invasori, nel FOV selezionato. </li><li> Verificare che le impostazioni di analisi sono appropriate (ad esempio, la segmentazione è preciso) per gli altri spheroids nella piastra cliccando su alcuni pozzi diversi. Se la segmentazione non delinea con precisione uno sferoide, regolare ulteriormente le impostazioni dell&#39;applicazione. </li><li> Clicca su &#39;Start&#39; analisi &#39;. </li><li> Nella scheda &#39;Risultati&#39;, controllare più pozzi per verificare la qualità dell&#39;analisi. Export &#39;Bene dati a livello di&#39; a un foglio di calcolo. </li><li> Ripetanalisi t per tutti i punti temporali. Calcolare la media% di confluenza per pozzi replicati e invasione del terreno (% confluenza) contro il tempo in un grafico a barre, con grafici scientifici e software statistico di scelta. </li></ol> 5. Manuale Image Acquisition <ol><li> Registrare un&#39;immagine per ciascun sferoide tumore ad intervalli partire da t = 0 fino a 72-96 ore, a seconda della velocità di invasione della linea cellulare in questione, utilizzando un microscopio invertito (per una piastra a 96 pozzetti questo richiede circa 20 - 30 min). Utilizzare un obiettivo 10X. Utilizzare un obiettivo 4X quando un&#39;area invasa è troppo grande per essere completamente catturato all&#39;interno del campo di vista 10X. </li><li> Salvare ogni singola immagine acquisita. </li><li> Per la calibrazione, prendere le immagini di uno stadio reticolo (1 mm) utilizzando entrambi gli obiettivi 10X e 4X (e salvare le immagini). </li></ol> 6. Manuale Image Analysis <ol><li> Aprire le immagini palco reticolo nel software di analisi delle immagini di scelta. </li><li> Inserisci il gratmisurazioni icule, le unità (micron), gli obiettivi usati (10X o 4X) e di eseguire la calibrazione. Questo passaggio è necessario solo una volta. Per la successiva analisi delle immagini, è sufficiente ricaricare le impostazioni di calibrazione necessarie. </li><li> Aprite le immagini del saggio di invasione e selezionare le impostazioni di calibrazione in funzione dell&#39;obiettivo del microscopio (10X o 4X) usata per ottenere le immagini. <ol><li> In alternativa, importare immagini ottenute su un citometro di imaging (fase 3) e analizzare manualmente, come descritto per le immagini ottenute con un microscopio invertito (vedere i risultati mostrati in Figura 3 e Figura 4). </li></ol></li><li> Misurare l&#39;area coperta da sferoidi. <ol><li> Nel software utilizzato qui per la Rappresentante dei risultati (per specifiche vedi Tabella di attrezzature e materiali), vai su &#39;misura&#39; e selezionare &#39;Count / size&#39;. Abbiamo scelto &#39;File&#39; poi &#39;Carica impostazioni&#39; e selezionare predeterminato assaImpostazioni y. Quindi scegliere &#39;Conte&#39;. Il sferoide dovrebbe poi essere segmentato in modo accurato. </li><li> In alternativa, andare su &#39;Modifica&#39; poi &#39;Disegna / Unisci oggetti&#39; per aprire la finestra &#39;bacchetta magica / Trace&#39;. Usate il cursore bacchetta di cliccare sull&#39;immagine sferoide su ed ottenere la segmentazione. Seleziona &#39;Traccia&#39; (nella finestra &#39;bacchetta magica&#39;) per delineare manualmente la sferoide utilizzando un mouse. </li></ol></li><li> Misure di esportazione di diversi parametri (area, diametro, perimetro ecc) ad un foglio di calcolo. Record sul foglio le informazioni sull&#39;immagine rilevanti (ad esempio, ben il numero, punto di tempo relativo). </li><li> Tracciare l&#39;area media di sferoidi ripetute (invasione) in funzione del tempo con grafica scientifica e software statistico. In alternativa, calcolare la variazione dell&#39;area sferoide ciascun tempo, rispetto alla zona a t = 0. Quindi invasione trama (% t0) in funzione del tempo come gra lineariph. </li></ol>

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Tutti gli autori dichiarano assenza di conflitto di interessi in competizione.

I due modelli tumorali qui descritti (glioblastoma e SCCHN) sono stati appositamente selezionati per esemplificare il nostro test 3D come siano clinicamente rilevanti tumori localmente invasivi con un bisogno insoddisfatto per terapie efficaci 12. A seguito di trattamento farmacologico, la valutazione dei cambiamenti in vitro farmacodinamica (PD) biomarker in può essere eseguita facilmente mediante western blot o immunologici del lisati in seguito all&#39;uso di specifici reagenti commercialmente disponibili per consentire il recupero delle cellule da BMM e / o l&#39;analisi di immunofluorescenza di invadere sferoidi tumorali tutto colorazione mount. Questo saggio di invasione è una tecnica utile per la valutazione rapida e riproducibile di invasione delle cellule tumorali in un mezzo semisolido e quindi particolarmente adatto per il futuro in screening di farmaci vitro. Le cellule tumorali invadono la matrice in modo 3D come si diffondono fuori da un &quot;micro-tumorale&quot;, rappresentata dalla sferoidale tumore, e si estendono in un extracellulambiente ar a matrice. La vera tridimensionalità del dosaggio è evidente nella morfologia cellulare, che è diverso dal piatto, morfologia aderente cellule assumono quando si spostano su un substrato solido. Il grado di invasione è facilmente quantificato utilizzando un citometro di imaging, permettendo una lettura-out automatico, oppure utilizzando un microscopio convenzionale in combinazione con software di imaging. Inoltre, questo metodo è adatto per l&#39;imaging fluorescente 13 (per esempio con linee cellulari che esprimono proteine ​​fluorescenti o pre-etichettato con coloranti fluorescenti). Il metodo è semplice da eseguire con la sola fase critica rappresentata dall&#39;aggiunta della BMM, quando vi è un rischio di disturbare la posizione centrale dello sferoide nel U bene. Questo può portare ad analisi di immagine ottimale, con sferoidi in diversi piani focali. E &#39;quindi fondamentale per aggiungere lentamente e con cautela la BMM di ogni bene. Dopo BMM Inoltre, è consigliabile verificare la targasotto un microscopio e se la localizzazione è considerata inaccettabile, questo può essere risolto dolce centrifugazione. Con l&#39;esperienza, questo è raramente necessaria. Anche se questo metodo è molto robusto e riproducibili, variabilità inter-sperimentale potrebbe verificarsi con diversi lotti di BMM. Per evitare ciò, si consiglia di acquistare sufficiente BMM da una singola partita per completare una serie di studi. Una limitazione del metodo (come per tali dosaggi) è la difficoltà nel distinguere tra l&#39;invasione e la proliferazione, che le cellule tumorali probabilmente subiscono durante il periodo di tempo del test. Anche se il tempo di raddoppio delle cellule può essere preso in considerazione, o inibitori del ciclo cellulare come citocalasina D introdotto, non è facile da controllare o chiaramente distinguere tra questi due aspetti diversi della progressione tumorale, in particolare per le cellule tumorali in rapida crescita e per coloro che hanno una più &quot;espansiva&quot;, piuttosto che infiltrante, modello di invasione. Per questo motivosi suggerisce che un saggio di crescita 3D parallelamente viene eseguito per valutare gli effetti specifici di agenti inibitori o stimolatori. Se si eseguono studi di risposta attenta dosi, può essere possibile selezionare concentrazioni che minimizzano gli effetti sulla proliferazione. Per esempio abbiamo dimostrato che l&#39;inibitore HSP90 17-AAG inibisce U-87 MG 3D tumore sferoide invasione già a 24 ore ed a concentrazioni inferiori concentrazione che inibisce la crescita 3D del 50% (GI 50) 12. D&#39;altra parte, il significato di questo test rispetto ad altri test invasione standard (ad esempio, saggi filtro basato o invasione delle singole cellule in matrici 3D 1), è che le cellule tumorali invadono nella matrice circostante dalla sferoidale, che assomiglia a una &quot; micro-tumorale &quot;o&quot; micro-metastasi &quot;, e quindi tiene conto degli aspetti importanti della fisiopatologia di una massa tumorale. Il metodo presentiamo fornisce informazioni sullacomportamento collettivo delle cellule tumorali, quando lasciando inizialmente sferoidi, e anche individualmente, quando singole cellule raggiungono le regioni più lontane nel BMM. Inoltre, le cellule all&#39;interno sferoidi tumorali possono verificarsi ipossia e nutrienti privazione che, attraverso i cambiamenti nell&#39;espressione genica, in grado di promuovere la migrazione e l&#39;invasione; tali caratteristiche sono assenti nelle analisi 2D. Inoltre, tutto questo è disponibile in un formato ad alta produttività attraverso l&#39;utilizzo di piastre a 96 pozzetti specifici e la recente tecnologia di imaging, consentendo un saggio 3D più complesso da essere facilmente utilizzato nella convalida di destinazione e la scoperta di farmaci. Il metodo che presentiamo in grado di ospitare ulteriori applicazioni per affrontare ulteriori aspetti di invasione delle cellule tumorali. In particolare, la complessità supplementare può essere previsto con l&#39;aggiunta di cellule ospiti, come i fibroblasti e / o cellule endoteliali, nel sferoidale stesso o matrice circostante. Questo può anche essere modificato, non solo in termini di rigidità (con l&#39;uso di diversi concentrations di BMM), ma anche in termini di composizione (con l&#39;aggiunta di altri componenti dipendenti dalla specifica del tessuto / organo del modello adottato tumore: ad esempio, per i tumori cerebrali tenascin 16 e collagene per carcinoma mammario 17). Un simile set-up (generazione di sferoidi e di imaging) possono anche essere adattate per valutare invasione tissutale in 3D, dove sferoidi tumorali sono co-coltura con corpi embrionali simile a un tessuto complesso 12 o con altri organoidi specifici delle cellule (ad esempio, per astrociti glioma 18 o cripta colture per i tumori gastrointestinali), ma ulteriore lavoro è necessario per consentire l&#39;analisi automatica delle immagini.

Lo sviluppo di farmaci antitumorali classica è in gran parte concentrata sull&#39;uso di vitro saggi cellulari in a schermo per gli agenti citotossici che inibiscono la proliferazione delle cellule tumorali e / o promuovono la morte cellulare programmata (apoptosi). Più di recente, gli sforzi si sono spostati verso terapie mirate con lo sviluppo di inibitori delle cause molecolari alla base della proliferazione delle cellule maligne. Nonostante alcuni risultati spettacolari, tali agenti sono spesso associati con il rapido sviluppo di resistenza al farmaco. Dato che è il potenziale invasivo e metastatico delle cellule tumorali che è responsabile della maggior parte dei decessi per cancro, e che malattia recidivante presenta spesso un fenotipo più aggressivo, è logico anche considerare complementari in vitro modelli sperimentali 1,2 per identificare nuovi agenti che inibiscono questi tasti aggiuntivi &quot;caratteristiche&quot; del cancro. Durante la progressione maligna, le cellule tumorali acquisisconola capacità di invadere i tessuti circostanti e / o la diffusione in organi distanti (metastasi). Le cellule tumorali penetrano la membrana basale dalla formazione di invadopodi 3,4. Queste strutture sono arricchiti con filamenti di actina, proteine ​​di adesione specifici e proteinasi e sono collettivamente responsabili per la motilità delle cellule tumorali e la degradazione della matrice extracellulare (ECM) 5. Invadopodi estendono nel ECM e si crede di essere importante per l&#39;invasione delle cellule tumorali e di stravaso anche in canali vascolari, facilitando ematogena (o linfatica) diffusione e metastasi. Metodi standard attuali per valutare l&#39;invasione delle cellule tumorali in vitro sono i seguenti. Transwell o basato Boyden saggi camera 2,6 dove sospensioni di cellule singole sono seminate in cima ad un filtro rivestito con uno spesso strato di proteine ​​ECM-derivato. Cellule poi invadono e muovono nella camera inferiore in risposta ad un chemio-attrattore. Comunemente usato ECMproteine ​​sono collagene di tipo I, o di una membrana simile matrice seminterrato (BMM, ad esempio, Matrigel, derivato dal tumore EHS 7) che riproduce la composizione naturale delle membrane basali. In alternativa alle Boyden tipo camera saggi basati filtro-8, le cellule possono essere seminati su di un gel di ECM (a cui possono essere aggiunti fibroblasti) dove formano un monostrato e quindi singolarmente o collettivamente invadere nel gel. Invasion può essere misurata in termini di numero di cellule che invadono e / o la distanza percorsa dalla superficie del gel 9. Le cellule tumorali possono anche essere completamente incorporati in una matrice o come una sospensione di cellule singole o sferoidi - solitamente poste tra due strati di ECM gel- consentendo alle cellule di invadere dalla massa tumorale nella matrice circostante 2,6,10,11. Il tridimensionale (3D) tumore sferoide invasione test qui descritta fornisce un sistema rapido invasione automatizzabili utilizzando un highly riproducibile, metodo standardizzato 12 in un formato di piastra da 96 pozzetti con uno sferoide per pozzetto. BMM viene aggiunto direttamente a ciascun pozzetto per fornire una matrice semi-solido in cui le cellule tumorali invadono dal corpo sferoidale. Il grado di invasione delle cellule tumorali è monitorata ad intervalli per un periodo di 72-96 ore. Questo metodo fornisce i seguenti vantaggi rispetto ai saggi attuali in vitro invasione citati: il tumore celle sono organizzate in una struttura 3D simulando una micro-regione tumore o un micro-metastasi; sferoidi tumorali sono altamente riproducibili in dimensioni; il saggio di invasione viene eseguita in situ nella stessa piastra come sviluppo del tumore sferoidale, senza la necessità di spostarli piastre secondarie; il metodo, in combinazione con le più recenti tecnologie di analisi automatica delle immagini, permette sia alto contenuto e alto rendimento analisi di invasione delle cellule tumorali. L&#39;analisi delle immagini viene effettuata utilizzando un sistema di imaging citometro, che analizza un 96 pozzettipiastra entro 10 minuti. Utilizzando l&#39;applicazione confluenza, la portata e la velocità dell&#39;invasione raggiunti sia da singole cellule o gruppi di cellule si diffondono dalle sferoidi tumorali e invasori nella matrice può essere misurata in modo dinamico. Per trasmissione inferiore, un metodo alternativo per l&#39;analisi delle immagini viene presentato, basato sull&#39;uso di un microscopio invertito e software di imaging standard.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1218">
	<tbody>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:297px;">Name of Reagent/ Equipment</td>
			<td style="width:161px;">Company</td>
			<td style="width:135px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:227px;">Web address</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:297px;">Corning Matrigel Basement Membrane Matrix</td>
			<td style="width:161px;">Corning</td>
			<td style="width:135px;">354234</td>
			<td>http://www.corning.com 
			Keep at&#160; 4 &#176;C to&#160; prevent solidification and dispense using cooled pipette tips</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:297px;">Cultrex Basement Membrane Extract, PathClear</td>
			<td style="width:161px;">Trevigen</td>
			<td style="width:135px;">3432-005-01</td>
			<td>http://www.trevigen.com 
			Keep at&#160; 4 &#176;C to&#160; prevent solidification and dispense using cooled pipette tips</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Ultra-low attachment 96-well plate</td>
			<td style="width:161px;">Corning</td>
			<td style="width:135px;">7007</td>
			<td>http://www.corning.com</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:297px;">EGF</td>
			<td style="width:161px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td style="width:135px;">130-093-825</td>
			<td>http://www.miltenyibiotec.com 
			Add 100 &#181;l 1% BSA (w/v) in water to 100 &#181;g EGF. To 25 &#181;l of this, add 4,975 &#181;l RHB-A medium to give a 10 &#181;g/ml working stock. Aliquot and store at -20&#186;C</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">RHB-A medium</td>
			<td style="width:161px;">Stem Cells Inc.</td>
			<td style="width:135px;">SCS-SF-NB-01</td>
			<td>http://www.stemcellsinc.com 
			For diluting EGF</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:297px;">DMEM</td>
			<td style="width:161px;">GIBCO</td>
			<td style="width:135px;">31966-021</td>
			<td>http://www.lifetechnologies.com/ 
			Warm in 37 &#176;C waterbath before use</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Fetal Bovine Serum</td>
			<td style="width:161px;">Biosera</td>
			<td style="width:135px;">1001/500</td>
			<td>http://www.biosera.com 
			Heat at 56 &#176;C to inactivate complement before use</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">TrypLE</td>
			<td style="width:161px;">GIBCO</td>
			<td style="width:135px;">12605</td>
			<td>http://www.lifetechnologies.com/ 
			Cell dissociation solution</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:297px;">Celigo cytometer</td>
			<td style="width:161px;">Nexcelom Bioscience</td>
			<td style="width:135px;">n/a</td>
			<td>http://www.nexcelom.com 
			Specialist equipment for image capture and analysis.&#160; Manual image capture by microscopy and independent image analysis software is an alternative</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">IX70 inverted microscope</td>
			<td style="width:161px;">Olympus</td>
			<td style="width:135px;">n/a</td>
			<td>http://www.olympus.co.uk/ 
			Used with camera for manual image capture</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:297px;">Retiga Exi Fast 1394 digital camera</td>
			<td style="width:161px;">Qimaging</td>
			<td style="width:135px;">n/a</td>
			<td>http://www.qimaging.com/ 
			Attached to microscope for manual image capture</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:297px;">Image-Pro Plus 7.0</td>
			<td style="width:161px;">Media Cybernetics</td>
			<td style="width:135px;">n/a</td>
			<td>http://www.mediacy.com/ 
			Software used to control camera and microscope for manual image capture</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:297px;">Image-Pro Analyzer 7.0</td>
			<td style="width:161px;">Media Cybernetics</td>
			<td style="width:135px;">n/a</td>
			<td>http://www.mediacy.com/ 
			Stand-alone image analysis software for manual measurment of spheroid size</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Excel 2010</td>
			<td style="width:161px;">Microsoft</td>
			<td style="width:135px;">n/a</td>
			<td>http://www.microsoft.com/ 
			Scientific graphing and statistical software</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Prism 6.0</td>
			<td style="width:161px;">GraphPad</td>
			<td style="width:135px;">n/a</td>
			<td>http://www.graphpad.com/ 
			Scientific graphing and statistical software</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

three-dimensional (3d) tumor spheroid invasion assay

Invasione di tessuti circostanti normali è generalmente considerata come una caratteristica fondamentale del maligno (al contrario di benigni) i tumori. Per alcuni tipi di cancro, in particolare (ad esempio, i tumori del cervello, il glioblastoma multiforme e carcinoma a cellule squamose della testa e del collo -. SCCHN) si tratta di una causa di grave morbilità e può essere anche in assenza di metastasi a distanza in pericolo di vita. Inoltre, i tumori che hanno recidivato dopo il trattamento, purtroppo, spesso presente con un fenotipo più aggressivo. Pertanto, vi è la possibilità di indirizzare il processo di invasione di fornire nuove terapie che potrebbero essere complementare ad agenti anti-proliferativi standard. Fino ad ora, questa strategia è stata ostacolata dalla mancanza di robusti test riproducibili adatti per un&#39;analisi dettagliata di invasione e per lo screening di stupefacenti. Qui forniamo un metodo di micro-plate semplice (sulla base di uniformi, auto-assemblaggio sferoidi tumorali 3D), che ha un grande potenziale per tale stumuore. Noi esemplificano la piattaforma test utilizzando una linea cellulare di glioblastoma umano e anche un modello SCCHN in cui lo sviluppo della resistenza contro mirata del recettore del fattore di crescita epidermico (EGFR) è associato con una maggiore potenziale matrice invasivo. Forniamo anche due metodi alternativi di quantificazione semi-automatico: uno che utilizza un sistema di imaging citometro e al secondo, che richiede semplicemente la microscopia e immagine di acquisizione standard di analisi di immagine digitale.

3D tumore sferoide invasione è valutato attraverso un riproducibile, metodo semplice, automatizzato schematicamente illustrata in figura 1: sferoidi tumorali riproducibile dimensioni sono ottenuti placcatura cellule in ULA 96-pozzetti a fondo sferico. 4 giorni sferoidi post-iniziazione sono incorporati in BMM. Questo fornisce una struttura semi-solido in cui le cellule tumorali invadono e sparsi dello sferoide. Spheroids sono in posizione centrale alla base di ogni bene e di invasione nella BMM è facilmente monitorata ad intervalli a partire da t = 0 fino a 72-96 ore utilizzando un sistema di imaging citometro. Questo può fornire un&#39;analisi immagine completamente automatizzato. Esempi di diversi tipi di invasione delle cellule del cancro sono illustrate nelle figure 2 -. 4 L&#39;altamente maligno multiforme glioblastoma umano (GBM) linea cellulare U-87 MG, forma una struttura 3D sferica stretto e viene qui utilizzato per esemplificare tumori cerebrali nei quali locali invasione è una chiave pericolo di vitacaratteristica. Una volta incorporato in BMM, cellule da sferoidi U-87 MG si sviluppa con un tipico &quot;starburst&quot; invasione modello 12. Le cellule tumorali radialmente estendono nella matrice in cui mantengono una forma 3-dimensionale. Il processo è seguito in un periodo di 72 ore, come mostrato in Figura 2 per U-87 sferoidi MG, quando il grado di invasione delle cellule tumorali, con dettagli dei processi cellulari e invadopodi estendono nella BMM è chiaramente evidente. Completamente automatizzato analisi delle immagini utilizzando un&#39;immagine citometro consente la quantificazione precisa della invasione delle cellule tumorali nel corso del tempo. La quantificazione in figura 2 è ottenuto come illustrato nella figura 1, dove l&#39;analisi automatizzata produce segmentazione attorno alle sporgenze cellulari estendono nella BMM dal 87-U MG corpo sferoidale. Si noti che per questa linea cellulare, il corpo sferoidale tumore è escluso dalla misurazione dell&#39;area invasa. Un modello diverso di invasion è stato visualizzato da linee umani squamose della testa e del collo di cellule tumorali. CAL S e CAL R sono isogenico ma CAL S è sensibile a, e CAL R resistente agli inibitori della chinasi di EGFR tirosin 14. In assenza di EGF, né linea cellulare invaso nel BMM (Figura 3) Tuttavia, poiché la concentrazione di EGF è stato aumentato (a 2,5 ng / ml), gli sferoidi sembrano &#39;germoglio&#39;. Alle concentrazioni elevate di EGF (40 e 80 ng / ml) il grado di invasione è stata ridotta. Questo è coerente con il classico a campana dose-risposta per EGF in termini di invasione che è stato precedentemente riportato 15. In 20 ng / ml EGF, sporgenze simili a dita estruso dal corpo principale di sferoidi CAL R mentre cellule CAL S erano meno invasiva dopo 72 ore (Figura 3). Questa invasione differenza era evidente 48 ore dopo sferoidi sono stati collocati in BMM (contenente 20 ng / ml FEG per distinguere la massima tra le linee cellulari) Ed il meglio dopo 72 ore (Figura 4). Queste immagini sono state acquisite rapidamente utilizzando un citometro di imaging, come per U-87 MG. Tuttavia, in questo caso, per esemplificare un metodo alternativo, il grado di invasione è stata quantificata manualmente utilizzando il software di analisi di immagine stand-alone e si presenta graficamente (figure 3 e 4). Questi risultati mostrano una differenza fenotipica tra cellule farmaco-sensibili e resistenti all&#39;azione che potrebbero essere utilizzati per lo screening per composti che specificamente antagonizzare l&#39;resistente fenotipo invasivo droga. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/52686/52686fig1.jpg" /> Figura 1. Schema di 3D tumore sferoide saggio di invasione. Il flusso di lavoro mostra i passaggi del metodo comporta l&#39;inclusione di immagini rappresentative di sferoidi U-87 MG glioblastoma solo dopo l&#39;incorporazione in BMM (pannello superiore; t = 0) e dopo l&#39;invasione<html> in BMM (pannello inferiore; t = 72 ore) con e senza la segmentazione che misura l&#39;area coperta dalle cellule invasori. Bar = 100 micron. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52686/52686fig1large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/52686/52686fig2.jpg" /> Figura 2. Time-corso di U-87 MG glioblastoma sferoide invasione in BMM. U-87 MG sferoide invasione 3D nel BMM è stato monitorato e quantificato fino a 72 ore utilizzando un sistema di imaging citometro. (A) Immagini rappresentative e (B) quantificazione sono mostrati invasione delle cellule tumorali. Bar = 500 micron. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52686/52686fig2large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> re 3 &quot;src =&quot; / files / ftp_upload / 52686 / 52686fig3.jpg &quot;/&gt; Figura 3. CAL R (resistenza) e CAL S (sensibilità) tumore sferoidale invasione. (A) Immagini rappresentative e (B) quantificazione manuale di EGF dose-dipendente R CAL e CAL S tumore sferoide invasione sono mostrati. Bar = 500 micron. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52686/52686fig2large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/52686/52686fig4.jpg" /> Figura 4. Le cellule da CAL R (resistente) sferoidi sono più invasivi rispetto CAL S (sensibili) sferoidi tumorali quando sono immessi in BMM. Dopo stimolazione EGF CAL R sferoidi tumorali mostrano una invasione più pronunciato rispetto CAL S. (A) Immagini rappresentative e (B) la quantificazione manuale dell&#39;invasione sono mostrati. Bar = 500 micron. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52686/52686fig4large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a>

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Three-Dimensional 3D Tumor Spheroid Invasion Assay

Invasion of surrounding normal tissues is a defining characteristic of malignant tumors. We provide here a simple, semi-automated micro-plate assay of invasion into a natural 3D biomatrix that has been exemplified with a number of models of advanced human cancers.

Tridimensionale (3D) Tumore Spheroid Invasion Assay

Invasion of surrounding normal tissues is generally considered to be a key hallmark of malignant (as opposed to benign) tumors. For some cancers in ...

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Research

JoVE Journal

Medicine

Three-Dimensional (3D) Tumor Spheroid Invasion Assay

56.5K Views.  The Institute of Cancer Research. Invasion of surrounding normal tissues is a defining characteristic of malignant tumors. We provide here a simple, semi-automated micro-plate assay of invasion into a natural 3D biomatrix that has been exemplified with a number of models of advanced human cancers.

Video: Three-Dimensional 3D Tumor Spheroid Invasion Assay

Spheroid Assay to Measure TGF-&#946;-induced Invasion

TGF-&beta; has opposing roles in breast cancer progression by acting as a tumor suppressor in the initial phase, but stimulating invasion and metastasis at later stage1,2. Moreover, TGF-&beta; is frequently overexpressed in breast cancer and its expression correlates with poor prognosis and metastasis 3,4. The mechanisms by which TGF-&beta; induces invasion are not well understood.
TGF-&beta; elicits its cellular responses via TGF-&beta; type II (T&beta;RII) and type I (T&beta;RI) receptors. Upon TGF-&beta;-induced heteromeric complex formation, T&beta;RII phosphorylates the T&beta;RI. The activated T&beta;RI initiates its intracellular canonical signaling pathway by phosphorylating receptor Smads (R-Smads), i.e. Smad2 and Smad3. These activated R-Smads form heteromeric complexes with Smad4, which accumulate in the nucleus and regulate the transcription of target genes5. In addition to the previously described Smad pathway, receptor activation results in activation of several other non-Smad signaling pathways, for example Mitogen Activated Protein Kinase (MAPK) pathways6.
To study the role of TGF-&beta; in different stages of breast cancer, we made use of the MCF10A cell system. This system consists of spontaneously immortalized MCF10A1 (M1) breast epithelial cells7, the H-RAS transformed M1-derivative MCF10AneoT (M2), which produces premalignant lesions in mice8, and the M2-derivative MCF10CA1a (M4), which was established from M2 xenografts and forms high grade carcinomas with the ability to metastasize to the lung9. This MCF10A series offers the possibility to study the responses of cells with different grades of malignancy that are not biased by a different genetic background.
For the analysis of TGF-&beta;-induced invasion, we generated homotypic MCF10A spheroid cell cultures embedded in a 3D collagen matrix in vitro (Fig 1). Such models closely resemble human tumors in vivo by establishing a gradient of oxygen and nutrients, resulting in active and invasive cells on the outside and quiescent or even necrotic cells in the inside of the spheroid10. Spheroid based assays have also been shown to better recapitulate drug resistance than monolayer cultures11. This MCF10 3D model system allowed us to investigate the impact of TGF-&beta; signaling on the invasive properties of breast cells in different stages of malignancy.

Spheroid Assay to Measure TGF-&amp;#946;-induced Invasion

An assay to quantitatively measure Transforming Growth Factor (TGF)-&#x03B2;-induced invasion in 3-dimensional collagen gels is described. This assay takes advantage of the MCF10A series of cell lines, which represent different stages of breast cancer development. This method can be adopted to be used with other cell lines and might be used to investigate other potential activators or inhibitors of invasion.

Saggio sferoide Misura TGF-β-indotta Invasion

TGF-&beta; has opposing roles in breast cancer progression by acting as a tumor suppressor in the initial phase, but stimulating invasion and metastasis ...

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Medicina

Human Neuroendocrine Tumor Cell Lines as a Three-Dimensional Model for the Study of Human Neuroendocrine Tumor Therapy

Neuroendocrine tumors (NETs) are rare tumors, with an incidence of two per 100,&#x200A;000 individuals per year, and they account for 0.5% of all human malignancies.1 Other than surgery for the minority of patients who present with localized disease, there is little or no survival benefit of systemic therapy. Therefore, there is a great need to better understand the biology of NETs, and in particular define new therapeutic targets for patients with nonresectable or metastatic neuroendocrine tumors. 3D cell culture is becoming a popular method for drug screening due to its relevance in modeling the in vivo tumor tissue organization and microenvironment.2,3 The 3D multicellular spheroids could provide valuable information in a more timely and less expensive manner than directly proceeding from 2D cell culture experiments to animal (murine) models.
To facilitate the discovery of new therapeutics for NET patients, we have developed an in vitro 3D multicellular spheroids model using the human NET cell lines. The NET cells are plated in a non-adhesive agarose-coated 24-well plate and incubated under physiological conditions (5% CO2, 37 &deg;C) with a very slow agitation for 16-24 hr after plating. The cells form multicellular spheroids starting on the 3rd or 4th day. The spheroids become more spherical by the 6th day, at which point the drug treatments are initiated. The efficacy of the drug treatments on the NET spheroids is monitored based on the morphology, shape and size of the spheroids with a phase-contrast light microscope. The size of the spheroids is estimated automatically using a custom-developed MATLAB program based on an active contour algorithm. Further, we demonstrate a simple method to process the HistoGel embedding on these 3D spheroids, allowing the use of standard histological and immunohistochemical techniques. 
This is the first report on generating 3D spheroids using NET cell lines to examine the effect of therapeutic drugs. We have also performed histology on these 3D spheroids, and displayed an example of a single drug's effect on growth and proliferation of the NET spheroids. Our results support that the NET spheroids are valuable for further studies of NET biology and drug development.

We present a simple agarose overlay platform to grow 3D multicellular spheroids using neuroendocrine cancer cell lines. This method provides a very convenient way to examine the effect of therapeutic drugs on the neuroendocrine tumor cells. It could also help us establish human neuroendocrine tumor spheroids for cancer therapy.

Neuroendocrini umani cella linee tumorali come un modello tridimensionale per lo studio dei diritti dell&#39;uomo e terapia dei tumori neuroendocrini

Neuroendocrine tumors (NETs) are rare tumors, with an incidence of two per 100,&#x200A;000 individuals per year, and they account for 0.5% of all human ...

Coculture System with an Organotypic Brain Slice and 3D Spheroid of Carcinoma Cells

Patients with cerebral metastasis of carcinomas have a poor prognosis. However, the process at the metastatic site has barely been investigated, in particular the role of the resident (stromal) cells. Studies in primary carcinomas demonstrate the influence of the microenvironment on metastasis, even on prognosis1,2. Especially the tumor associated macrophages (TAM) support migration, invasion and proliferation3. Interestingly, the major target sites of metastasis possess tissue-specific macrophages, such as Kupffer cells in the liver or microglia in the CNS. Moreover, the metastatic sites also possess other tissue-specific cells, like astrocytes. Recently, astrocytes were demonstrated to foster proliferation and persistence of cancer cells4,5. Therefore, functions of these tissue-specific cell types seem to be very important in the process of brain metastasis6,7.
Despite these observations, however, up to now there is no suitable in vivo/in vitro model available to directly visualize glial reactions during cerebral metastasis formation, in particular by bright field microscopy. Recent in vivo live imaging of carcinoma cells demonstrated their cerebral colonization behavior8. However, this method is very laborious, costly and technically complex. In addition, these kinds of animal experiments are restricted to small series and come with a substantial stress for the animals (by implantation of the glass plate, injection of tumor cells, repetitive anaesthesia and long-term fixation). Furthermore, in vivo imaging is thus far limited to the visualization of the carcinoma cells, whereas interactions with resident cells have not yet been illustrated. Finally, investigations of human carcinoma cells within immunocompetent animals are impossible8.
For these reasons, we established a coculture system consisting of an organotypic mouse brain slice and epithelial cells embedded in matrigel (3D cell sphere). The 3D carcinoma cell spheres were placed directly next to the brain slice edge in order to investigate the invasion of the neighboring brain tissue. This enables us to visualize morphological changes and interactions between the glial cells and carcinoma cells by fluorescence and even by bright field microscopy. After the coculture experiment, the brain tissue or the 3D cell spheroids can be collected and used for further molecular analyses (e.g. qRT-PCR, IHC, or immunoblot) as well as for investigations by confocal microscopy. This method can be applied to monitor the events within a living brain tissue for days without deleterious effects to the brain slices. The model also allows selective suppression and replacement of resident cells by cells from a donor tissue to determine the distinct impact of a given genotype. Finally, the coculture model is a practicable alternative to in vivo approaches when testing targeted pharmacological manipulations.

The organotypic brain slice coculture with carcinoma cells enables visualizing morphological changes by fluorescence as well as bright field (video) microscopy during the process of carcinoma cell invasion of brain tissue. This model system also allows for cell exchange and replenishment approaches and offers a wide variety of manipulations and analyses.

Co-coltura di sistema con un Organotipica cervello Slice e 3D Spheroid delle cellule di carcinoma

Patients with cerebral metastasis of carcinomas have a poor prognosis. However, the process at the metastatic site has barely been investigated, in ...

Quantification of Breast Cancer Cell Invasiveness Using a Three-dimensional (3D) Model

It is now well known that the cellular and tissue microenvironment are critical regulators influencing tumor initiation and progression. Moreover, the extracellular matrix (ECM) has been demonstrated to be a critical regulator of cell behavior in culture and homeostasis in vivo. The current approach of culturing cells on two-dimensional (2D), plastic surfaces results in the disturbance and loss of complex interactions between cells and their microenvironment. Through the use of three-dimensional (3D) culture assays, the conditions for cell-microenvironment interaction are established resembling the in vivo microenvironment. This article provides a detailed methodology to grow breast cancer cells in a 3D basement membrane protein matrix, exemplifying the potential of 3D culture in the assessment of cell invasion into the surrounding environment. In addition, we discuss how these 3D assays have the potential to examine the loss of signaling molecules that regulate epithelial morphology by immunostaining procedures. These studies aid to identify important mechanistic details into the processes regulating invasion, required for the spread of breast cancer.

Quantification of Breast Cancer Cell Invasiveness Using a Three-dimensional 3D Model

This article provides detailed methodologies for the use of three-dimensional (3D) assays to quantify breast cancer cell invasion. Specifically, we discuss the procedures required to set up such assays, quantification, and data analysis, as well as methods to examine the loss of membrane integrity that occurs when cells invade.

Quantificazione del cancro al seno Cellula Invasività Utilizzando una tridimensionale (3D) Modello

It is now well known that the cellular and tissue microenvironment are critical regulators influencing tumor initiation and progression. Moreover, the ...

Assessment of Ovarian Cancer Spheroid Attachment and Invasion of Mesothelial Cells in Real Time

Ovarian cancers metastasize by shedding into the peritoneal fluid and dispersing to distal sites within the peritoneum. Monolayer cultures do not accurately model the behaviors of cancer cells within a nonadherent environment, as cancer cells inherently aggregate into multicellular structures which contribute to the metastatic process by attaching to and invading the peritoneal lining to form secondary tumors. To model this important stage of ovarian cancer metastasis, multicellular aggregates, or spheroids, can be generated from established ovarian cancer cell lines maintained under nonadherent conditions. To mimic the peritoneal microenvironment encountered by tumor cells in vivo, a spheroid-mesothelial co-culture model was established in which preformed spheroids are plated on top of a human mesothelial cell monolayer, formed over an extracellular matrix barrier. Methods were then developed using a real-time cell analyzer to conduct quantitative real time measurements of the invasive capacity of different ovarian cancer cell lines grown as spheroids. This approach allows for the continuous measurement of invasion over long periods of time, which has several advantages over traditional endpoint assays and more laborious real time microscopy image analyses. In short, this method enables a rapid, determination of factors which regulate the interactions between ovarian cancer spheroid cells invading through mesothelial and matrix barriers over time.

Ovarian cancer cell invasion into the mesothelial lining of the peritoneum is a dynamic process over time. Utilizing a real time analyzer, the invasive capacity of ovarian cancer cells in a spheroid-mesothelial cell co-culture model can be quantified over prolonged time periods, providing insights into factors regulating the metastatic process.

Valutazione del cancro ovarico Spheroid attaccamento e l&#39;invasione delle cellule mesoteliali in tempo reale

Ovarian cancers metastasize by shedding into the peritoneal fluid and dispersing to distal sites within the peritoneum. Monolayer cultures do not ...

Three-dimensional Co-culture Model for Tumor-stromal Interaction

Cancer progression (initiation, growth, invasion and metastasis) occurs through interactions between malignant cells and the surrounding tumor stromal cells. The tumor microenvironment is comprised of a variety of cell types, such as fibroblasts, immune cells, vascular endothelial cells, pericytes and bone-marrow-derived cells, embedded in the extracellular matrix (ECM). Cancer-associated fibroblasts (CAFs) have a pro-tumorigenic role through the secretion of soluble factors, angiogenesis and ECM remodeling. The experimental models for cancer cell survival, proliferation, migration, and invasion have mostly relied on two-dimensional monocellular and monolayer tissue cultures or Boyden chamber assays. However, these experiments do not precisely reflect the physiological or pathological conditions in a diseased organ. To gain a better understanding of tumor stromal or tumor matrix interactions, multicellular and three-dimensional cultures provide more powerful tools for investigating intercellular communication and ECM-dependent modulation of cancer cell behavior. As a platform for this type of study, we present an experimental model in which cancer cells are cultured on collagen gels embedded with primary cultures of CAFs.

Here we present a protocol to co-culture in three-dimensions, which is useful for investigating multicellular interactions and extracellular matrix-dependent modulation of cancer cell behavior. In this experimental model, cancer cells are cultured on collagen gels embedded with human cancer-associated fibroblasts.

Tridimensionale Co-cultura Modello di tumore stromale-Interaction

Cancer progression (initiation, growth, invasion and metastasis) occurs through interactions between malignant cells and the surrounding tumor stromal ...

A Cancer Cell Spheroid Assay to Assess Invasion in a 3D Setting

The invasive nature of cancer cell lines is thought to correlate with their metastatic potential. Most traditional assays, however, do not examine these invasive features in a three-dimensional environment and the resulting data suffer from reduced biological applicability. Here an approach is presented to visualize the invasive ability of cell lines in a physiologically relevant setting. The cancer cell spheroid invasion assay first utilizes gravity to generate spheroids within drops of media that hang from the lid of a cell culture dish. Next, these spheroids are embedded in a 3D matrix consisting of a mixture of basement membrane materials and type I collagen. Cancer cell egression from the spheroids into the surrounding matrix is then monitored over time. The method described here can be modified to examine invasion after coculture of different cell types, inclusion of drugs/inhibitors, or alterations in extracellular matrix (ECM) constituents.

This method evaluates cancer cell invasion from spheroids into a surrounding 3D matrix. Spheroids are generated via the hanging drop culture method and then embedded in a matrix comprised of basement membrane materials and type I collagen. Invasion out of the spheroids is subsequently monitored.

Un Cancer Cell Saggio sferoide valutare Invasion in un Ambiente 3D

The invasive nature of cancer cell lines is thought to correlate with their metastatic potential.  Most traditional assays, however, do not examine these ...

Three-dimensional Alginate-bead Culture of Human Pituitary Adenoma Cells

A three-dimensional culture method is described in which primary pituitary adenoma cells are grown in alginate beads. Alginate is a polymer derived from brown sea algae. Briefly, the tumor tissue is cut into small pieces and submitted to an enzymatic digestion with collagenase and trypsin. Next, a cell suspension is obtained. The tumor cell suspension is mixed with 1.2% sodium alginate and dropped into a CaCl2 solution, and the alginate/cell suspension is gelled on contact with the CaCl2 to form spherical beads. The cells embedded in the alginate beads are supplied with nutrients provided by the culture media enriched with 20% FBS. Three-dimensional culture in alginate beads maintains the viability of adenoma cells for long periods of time, up to four months. Moreover, the cells can be liberated from the alginate by washing the beads with sodium citrate and seeded on glass coverslips for further immunocytochemical analyses. The use of a cell culture model allows for the fixation and visualization of the actin cytoskeleton with minimal disorganization. In summary, alginate beads provide a reliable culture system for the maintenance of pituitary adenoma cells.

Three-dimensional culture in alginate beads, due to its simplicity and reproducibility, was chosen to maintain the pituitary adenoma cells. The procedures included an initial enzymatic digestion and mechanical dissociation of the tumor tissue, and the subsequent cell suspension was encapsulated in alginate beads.

Tridimensionale alginato-tallone coltura di cellule umane adenoma ipofisario

A three-dimensional culture method is described in which primary pituitary adenoma cells are grown in alginate beads. Alginate is a polymer derived from ...

Three-Dimensional Culture Assay to Explore Cancer Cell Invasiveness and Satellite Tumor Formation

Mammalian cell culture in monolayers is widely used to study various physiological and molecular processes. However, this approach to study growing cells often generates unwanted artifacts. Therefore, cell culture in a three-dimensional (3D) environment, often using extracellular matrix components, emerged as an interesting alternative due to its close similarity to the native in vivo tissue or organ. We developed a 3D cell culture system using two compartments, namely (i) a central compartment containing cancer cells embedded in a collagen gel acting as a pseudo-primary macrospherical tumor and (ii) a peripheral cell-free compartment made of a fibrin gel, i.e. an extracellular matrix component different from that used in the center, in which cancer cells can migrate (invasion front) and/or form microspherical tumors representing secondary or satellite tumors. The formation of satellite tumors in the peripheral compartment is remarkably correlated to the known aggressiveness or metastatic origin of the native tumor cells, which makes this 3D culture system unique. This cell culture approach might be considered to assess cancer cell invasiveness and motility, cell-extracellular matrix interactions and as a method to evaluate anti-cancer drug properties.

Cancer cells are embedded in a collagen gel and then sandwiched in an acellular fibrin gel to generate a 3D culture system in which the invasiveness and formation of satellite tumors may be monitored.

Three-Dimensional Cultura Assay per esplorare Cancer Cell invasività e formazione di tumori Satellite

Mammalian cell culture in monolayers is widely used to study various physiological and molecular processes. However, this approach to study growing cells ...

Three-Dimensional Printing of a Complex Aortic Anomaly

Complex congenital aortic anomalies include diverse types of malformations that may be clinically asymptomatic or present with respiratory or esophageal symptoms. These anomalies may be associated with other congenital heart diseases. It is hard to identify the accurate anatomic vessel location from two-dimensional imaging data, such as computed tomography. As an additive manufacturing method, three-dimensional (3-D) printing can covert the acquired imaging data into 3-D physical models. This protocol describes the procedure for modeling the volumetric DICOM imaging into 3-D data and printing it as an anatomically realistic 3-D model. Using this model, surgeons can identify the vessel location of complex aortic anomalies, which is helpful for pre-operative planning and intra-operative guidance.

Here, we present a protocol to use three dimensional printed models for pre-operative planning and intra-operative reorganization of complicated vascular locations when handling a congenital aortic anomaly.

Stampa tridimensionale di un'anomalia aortica complessa

Complex congenital aortic anomalies include diverse types of malformations that may be clinically asymptomatic or present with respiratory or esophageal ...