Esperimenti FRET a singola molecola utilizzando sonde legate alla superficie sono stati eseguiti quasi esclusivamente su molecole immobilizzate in passato. Tuttavia, molte biomolecole si diffondono e possono essere analizzate con il nostro metodo. La combinazione di FRET a singola molecola con il tracking consente di analizzare non solo le tracce temporali di deficit fret delle sonde in movimento, ma anche di indagare aspetti spaziotemporali come il comportamento diffusionale.
Il nostro metodo è compatibile con una varietà di sonde basate su FRET. Ad esempio, potrebbe fornire approfondimenti riguardanti le forze molecolari, le dinamiche conformazionali e la cinetica di legame negli esperimenti sulle cellule vive. Gli esperimenti FRET a singola molecola di alta qualità sono notoriamente difficili da eseguire.
Per una quantificazione affidabile, è importante registrare i dati con un buon rapporto segnale-rumore e tracce a singola molecola di lunghezza sufficiente. Per iniziare la misurazione del campione, eccitare i fluorofori del donatore e dell'accettore per un tempo di illuminazione appropriato durante l'attivazione della fotocamera e attendere che la lettura della fotocamera sia abilitata. Ripetere l'eccitazione del donatore e accettare fluorofori alternativamente.
Scegli il numero di ripetizioni in modo che sia abbastanza grande da garantire la fotosbiancamento di almeno un fluoroforo per sonda all'interno del campo visivo consentendo l'analisi graduale del fotosbiancamento per discriminare i segnali a singola molecola dagli aggregati. Specificate la sequenza di illuminazione per consentire la selezione dei fotogrammi di eccitazione del donatore e dell'accettore, nonché dei fotogrammi per la segmentazione delle immagini dalle sequenze di immagini registrate. Allo stesso tempo, analizza i set di dati registrati utilizzando le stesse impostazioni di illuminazione.
A tal fine, assegnare un identificatore e un modello che corrisponda ai rispettivi nomi di file della sequenza di immagini a ciascun set di dati. Inoltre, definire set di dati specifici per scopi speciali come registrazioni di marcatori fiduciali per la registrazione delle immagini, profili di luce di eccitazione per la correzione del campo piatto e, facoltativamente, campioni solo donatore e solo accettore per determinare i fattori di correzione. Quindi, selezionare i canali di emissione e le immagini raw se entrambi i canali vengono registrati utilizzando una singola telecamera.
Per questo, utilizzare il widget grafico appropriato per selezionare le regioni appropriate per l'emissione di donatori e accettori, quindi localizzare i marcatori fiduciali in entrambi i canali di emissione ed eseguire la registrazione delle immagini. Utilizzare l'interfaccia utente fornita per trovare i parametri appropriati per l'algoritmo di localizzazione per i canali di emissione donatore e accettore. Quindi, impostare i parametri di localizzazione a singola molecola per le sonde FRET dopo l'eccitazione del donatore nella somma delle immagini ottenute dalle emissioni del donatore e dell'accettore, quindi impostare i parametri di localizzazione per le sonde dopo l'eccitazione dell'accettore nel canale di emissione dell'accettore.
Localizzare le sonde FRET in caso di eccitazione del donatore e dell'accettore in modo indipendente in tutti i fotogrammi. I risultati vengono uniti in un'unica tabella contenente il numero di fotogramma originale, le coordinate bidimensionali e un identificatore che fa riferimento al file di immagine di origine. Per tracciare e misurare l'intensità della fluorescenza, scegliere le opzioni appropriate per l'algoritmo Trackpy per collegare le localizzazioni della sonda FRET alle traiettorie.
Successivamente, utilizzando la funzionalità del software di analisi, elaborare i dati di immagine ausiliari da sequenze di immagini. Estrai immagini aggiuntive registrate per facilitare la segmentazione contrassegnata da S nella sequenza di eccitazione. Infine, determinare i profili di luce di eccitazione del donatore e dell'accettore in tutto il campo visivo dalle immagini registrate su un campione densamente etichettato.
Per le fasi iniziali di filtraggio, scartare i segnali con funzioni di diffusione del punto sovrapposto in quanto è difficile determinare le loro intensità di fluorescenza in modo affidabile. Nel caso di illuminazione disomogenea, accettare solo segnali situati in regioni ben illuminate all'interno del campo visivo per garantire un buon rapporto segnale-rumore. Se si studia fret intramolecolare, limitare l'analisi a quelle traiettorie presenti dall'inizio della sequenza di immagini.
Quindi, eseguire la correzione del campo piatto, che utilizza i profili della sorgente luminosa di eccitazione ottenuti in precedenza per invertire le variazioni di intensità di fluorescenza dipendenti dalla posizione causate da un'illuminazione disomogenea, quindi calcolare l'efficienza FRET apparente e la stechiometria apparente. Per eseguire un'analisi graduale del fotosbiancamento per discriminare tra singole sonde molecolari e aggregati, trovare parametri appropriati per l'algoritmo di rilevamento del punto di cambiamento sull'eccitazione del donatore e dell'accettore in modo indipendente. Quindi eseguire l'algoritmo di rilevamento del punto di modifica.
Per rimuovere la traccia che mostra un comportamento ambiguo di fotosbiancamento, definire soglie di intensità al di sotto delle quali un fluoroforo è considerato sbiancato, quindi selezionare una delle seguenti opzioni. Opzione uno in cui l'accettore fluoroforo sbianca in un unico passaggio mentre il donatore non mostra sbiancamento parziale. Opzione due in cui il donatore sbianca in un unico passaggio mentre non vi è alcuna rimozione parziale dell'accettore.
Opzione tre in cui uno dei due fluorofori sbianca in un unico passaggio mentre l'altro non sbianca parzialmente. E l'opzione quattro in cui i fluorofori donatori e accettori mostrano fotosbiancamento a fase singola o nessuna fotosbiancamento. Quindi calcolare i fattori di correzione per la perdita di emissioni del donatore nel canale dell'accettore, l'eccitazione diretta dell'accettore, le efficienze di rilevamento e le efficienze di eccitazione.
Quindi, utilizzare i fattori di correzione per calcolare l'efficienza FRET dall'efficienza apparente e la stechiometria dalla stechiometria apparente. Per un ulteriore filtraggio, selezionare solo i punti dati precedenti al primo evento di sbiancamento in ogni traiettoria. Inoltre, per limitare l'analisi alle sonde a singola molecola, accettare solo traiettorie con almeno il 75% dei punti dati entro i limiti di stechiometria appropriati.
Quindi eseguire la segmentazione delle immagini tramite metodi di soglia globali o adattivi sulle immagini ausiliarie appropriate per limitare l'analisi a regioni distinte all'interno del campo visivo. Creare grafici di efficienza rispetto alla stechiometria per verificare che i segnali di stechiometria errata siano stati correttamente identificati e rimossi. Quindi tracciare istogrammi di efficienze FRET per fornire una panoramica consolidata delle distribuzioni di efficienza FRET e raggruppare gli istogrammi per un comodo confronto dei risultati di diversi esperimenti.
Sfruttando le librerie scientifiche Python, è possibile valutare ulteriormente i dati all'interno del notebook, eseguendo, ad esempio, analisi di diffusione. La visualizzazione e il tracciamento dell'evento FRET a singola molecola sono mostrati qui. Gli eventi FRET filtrati sono rappresentati da grafici di efficienza rispetto a quelli stechiometrici in un istogramma di efficienza FRET.
Inoltre, i parametri di mobilità possono essere studiati tracciando un singolo percorso di traiettoria in un grafico XY o un grafico di spostamento quadrato medio. L'output della nostra piattaforma ci consente di identificare ulteriormente le transizioni nelle tracce temporali di efficienza FRET delle sonde mobili. Ad esempio, per valutare i cambiamenti conformazionali delle biomolecole.
Utilizzando un sensore di forza basato su FRET, la piattaforma di analisi ci ha permesso di quantificare gli eventi di forza a singola molecola all'interno della sinapsi immunologica durante la segnalazione precoce delle cellule T.
